Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa keskityttiin painovoima-herkkien proteiinien kahden ihmisen kilpirauhasen syöpäsolulinjoissa (ML-1, RO82-W-1), jotka altistettiin 2D clinostat (CLINO), satunnainen paikannus kone (RPM) ja tavalliseen 1

g

-ehdot. Jälkeen kolmen (3d) – tai seitsemän päivän-kulttuuri (7d) on kaksi laitetta, huomasimme molemmat solutyypit kasvavat kolmiulotteisesti sisällä monisoluisten palloset (MCS) ja myös soluja jäljellä kiinni (AD) viljelmään pulloon, kun taas 1

g

-Säätimet viljelmät muodostetaan vain kiinnittynyt yksisolukerroksia, ellei pohja viljelymaljalla katettiin agaroosi. Tässä tapauksessa sytokiinien IL-6 ja IL-8 helpotti muodostumista MCS molemmissa solulinjoissa käyttäen neste-overlay tekniikkaa 1

g

. ML-1-soluja kasvatettiin RPM tai CLINO vapautuu määriä IL-6 ja MCP-1: n supernatanttia, joka oli merkittävästi kohonnut verrattuna 1

g

-controls. Vapautuminen IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, eotaksiini-1: n ja VEGF lisääntynyt aikariippuvainen, mutta ei merkittävästi vaikuta painovoiman olosuhteissa. Jälkeen 3d RPM tai CLINO, kertyminen F-aktiini ympärillä solukalvon oli havaittavissa AD soluissa molemmissa solulinjoissa. IL-6 ja IL-8 stimulaation ML-1 solujen 3d ja 7d vaikuttanut proteiinin sisällön ß

1-integriini, taliini-1, Ki-67, ja beeta-aktiini annosriippuvaisesti in tarttuneet solut. SS

1-integriinin pitoisuus pieneni merkitsevästi AD ja MCS näytteitä verrattiin 1

g

, kun taas Talin-1 oli korkeampi ilmaistu MCS kuin AD populaatiot. Leviämisen merkki Ki-67 on koholla AD näytteissä verrattuna 1

g

ja MCS näytteitä. SS-aktiini pitoisuus R082-W-1-solujen määrä pysyi ennallaan. ML-1-soluissa ei esiintynyt muutoksia ß-aktiini in RPM kulttuureissa, mutta väheneminen CLINO näytteissä. Niinpä pääteltiin, että simuloitu mikropainovoimassa vaikuttaa sytokiinien in follikulaarinen kilpirauhasen syöpäsoluja, ja tuotanto beta

1-integriinin ja Talin-1 ja ennustaa saman vaikutukset todellisissa mikrogravitaatiota olosuhteissa.

Citation : Svejgaard B, Wehland M, Ma X, Kopp S, Sahana J, Warnke E, et ai. (2015) Yhteinen Vaikutukset Syöpäsolut kohdistama Random sijoittaminen Koneen ja 2D Clinostat. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10,1371 /journal.pone.0135157

Editor: Yoshiaki Taniyama, Osakan yliopisto Graduate School of Medicine, JAPAN

vastaanotettu: 31 tammikuu 2015; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2015; Julkaistu: 14 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Svejgaard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: kirjoittajat kiittää Saksan avaruusjärjestön (DLR, (PO) BMWi projektit 50WB1124 ja 50WB1524), Euroopan avaruusjärjestön (ESA, ESA-CORA-GBF-2011 -005 projekti Device Comparison, ESA-CORA-GBF- 2013-001 projekti kilpirauhasen 3) (PO), Aarhus University, Denmark (PO), Regensburgin yliopistosta (JG), ja DGLRM (Young Fellow Ohjelma EW ja GA) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pitkäaikainen spaceflights aiheuttavat usein haitallisia terveysongelmia ihmisillä. Useat avaruuslentojen vaikutuksia on tutkittu laajasti viime ja tarkistetaan [1-4]. Jotkut niistä voivat johtua tunnettu fysiologia; esim. puute painovoiman stressiä jalkaan lihaksiston johtaa nopeaan menetykseen luuston ja lihasten, ja puute painovoiman vektorin aiheuttaa ongelmia tasapainoa ja silmän liikkeitä [1]. Se oli osoitettu, että kumoamistuomiolla painovoiman vaikuttaa molekyylitason mekanismeja solujen suoraan [3]. Solut altistuvat todellinen tai simuloitu mikrogravitaatiota muuttaa geenin ja proteiinin ilmentyminen käyttäytymiseen [5-7], apoptoosin lisäämiseksi [8, 9], hidastamaan solujen kasvua [10] ja muuttaa solun tukirangan [11-13]. Lisäksi monisoluisista aggregaatit havaittiin, joka muistutti elimet, josta niiden solut oli johdettu [14].

Viime vuosina on käynyt ilmi, että tutkimukset käyttäytymistä syöpäsolujen avaruudessa voisi tukea syöpätutkimukseen maapallolla [15]. Nyt on kiinnostavaa verrata roolit erillisten proteiinien solujen sopeutuminen muuttuneisiin ympäristöolosuhteisiin (mikrogravitaatiota). Olemme tunnettu eri riviä ihmisen kilpirauhasen syöpäsoluja kasvatetaan olosuhteissa todellisia ja simuloituja mikropainovoimassa jonka tavoitteena on löytää mahdollisuuksia vähentää syöpäsolujen aggressiivisuus [16-18]. Koska kokeet alla todellinen mikrogravitaatiota eli avaruuslentojen mahdollisuudet ovat harvinaisia ​​ja kalliita [16], suuri osa tutkimuksista suoritettiin käyttäen laitteita, joilla pyritään simuloimaan mikrogravitaatiota maapallolla [3, 19]. Kuitenkin jokainen laite vaikuttaa solujen paitsi laskeutumisen ehkäisyssä, vaan myös ominaisuuksia sen toimintatilan, joka sisältää ohimenevä hypergravity tai tärinän [20]. Siksi katsottiin, että jotkut tehdyt havainnot soluihin viljeltiin mikrogravitaatiota simuloidaan laite ei pelkästään johtua estää solun laskeutumisen mutta myös laitekohtaisiin vaikutuksia [18]. Lisäksi olemme havaittu, että vaikutukset ovat spesifisiä tietyntyyppisiin kilpirauhasen solulinjojen [21]. Tutkiakseen vaikutuksen muuttuneen painovoiman solutasolla, olemme tutkineet erilaisia ​​syöpäsoluja eri laitteissa simuloidaan mikrogravitaatiota mukaan vastaavia protokollia. Ennen kuvaamista, ihmisen kilpirauhassolut FTC-133, ML-1, ja HTU-5 viljeltiin Satunnainen Positioning Machine (RPM, kuvio 1A) [17], mutta vain FTC-133 solujen RPM ja nopeasti pyörivä 2D -Clinostat (CLINO, kuvio 1 B) [18] ja avaruudessa [16, 22, 23]. Kokeet paljastivat useita näkökohtia ja viittasi cytoskeletal proteiineja ja sytokiineja kuten prime kohteina mikrogravitaatiota vaikutuksia [3, 19, 22, 23].

V: Satunnainen Positioning Machine (RPM) ja B: 2D-Clinostat.

tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia simuloitu mikropainovoimassa käyttäen RPM ja CLINO laitteita kahteen ihmisen follikulaarisen kilpirauhassyövän solulinjoissa (ML-1, RO82-W-1) yhdensuuntaisesti joko kolme (3d) tai seitsemän (7 d) päivää, vastaavasti, ennen valitun sytokiinien ja cytoskeletal proteiinit kvantitoitiin. Arvioimaan mahdollisia rooli sytokiinien IL-6 ja IL-8: n ekspressioon valittujen proteiinien kilpirauhassyöpä soluissa, tutkittiin vaikutusta IL-6 ja IL-8 sovellus Ki-67, SS

1- integriini, taliini-1, ja beeta-aktiini-proteiinien kiinnittynyt ML-1-soluissa. Lisäksi olemme keskittyneet roolia sytokiinien IL-6 ja IL-8 ML-1 ja RO82-W-1 pallomainen muodostus käyttäen nestettä overlay tekniikkaa alle 1

g

-ehdot [24]. Sytokiinien ja cytoskeletal proteiineja, joiden luovuttamista tai ilmentyminen muuttunut vastaavasti käsitellään suhteessa niiden erityiset roolit kilpirauhassyöpä.

Methods

Solulinjat

ML-1 solulinjassa.

Yksisolukerroksiset ML-1 follikulaarinen kilpirauhasen syöpäsoluja [25] viljeltiin joko RPM tai clinostat. ML-1 solulinja on peräisin toistuva kasvain huonosti eriytetty follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma (vaihe pT4) 50-vuotiaan naisen [25]. Solulinja on kaksinkertaistaa ajan 4 päivää. Solut vievät glukoosia, erittää tyroglobuliini tyroksiini, ja trijodityroniinin ja ovat tuumorigeenisia nude-hiirissä.

UCLA RO82-W-1-solulinjassa.

RO82-W-1 solulinja oli perustettu Estour

et al

. vuonna 1989 [26]. Solulinjaa ostettiin Sigma-Aldrich Chemie (München, Saksa). Tämä solulinja on johdettu etäpesäkkeiden follikkelipunktio karsinooman naispotilas. Vaikka ensisijainen kasvain RO82-W-1 julkaistiin tyreoglobuliinin (Tg) verenkiertoon, otto I131 oli alle 2% [26]. RO82-W-1-solut ovat Tg-positiivisia, ja ne ovat myös tuumorigeenisia nude-hiirissä [26].

Molemmat solulinjat kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Elatusaine, johon oli lisätty 100 ug /ml streptomysiiniä, 100 U /ml penisilliiniä ja 10% FCS: ää (kaikki Biochrom, Berliini, Saksa).

Koska sekä pahanlaatuiset ihmisen kilpirauhasen follikulaarinen solulinjat oli säilyttänyt kyky syntetisoida Tg ne edustavat arvokkaita malleja tutkia ihmisten follikkelien karsinoomien.

Cell Culture Menettely

24 tuntia ennen kokeita, solujen molempien ympättiin joko slide pulloihin (Thermo Scientific, Roskilde, Tanska), jossa on kasvava alue 9 cm

2 varten CLINO tai T25-pulloihin (Sarstedt, Nümbrecht, Saksa), jossa kasvava ala 25 cm

2 RPM. Solut kunkin dosviljelypulloihin satunnaistettiin viljeltävän staattiseksi vaunun ohjauslaitteista (1

g

-condition) tai yksi laitteista. Vaihekontrasti kuvat otettiin kiinni. Morfologiset kuvia RO82-W-1-soluissa esitetään kuvassa 2. CLINO ja RPM kokeet suoritettiin yksittäisissä yrityshautomoiden 37 ° C: ssa, ja maa valvonta on aina pidetty vieressä kokeiluja samoihin hautomo, lepää staattisessa 1

g

-ehdot. Solut molempien kerättiin talteen 3d päivän ja 7 d.

V: Follikulaarinen kilpirauhassyöpä soluja viljeltiin 3d staattisen 1

g

. Solut lisääntyivät 2D yksikerroksista. B: RO82-W-1 soluja inkuboidaan 3d RPM. Nuolet osoittavat 3D aggregaattien (monisoluisten palloset, MCS). Uppo osoittavat uima 3D rakeita supernatantissa. C: MCS muodostettu CLINO jälkeen 3 päivää. D: RO82-W-1-soluja viljeltiin 7 päivää CLINO. Nuolet osoittavat 3D pallosia. Insertti osoittaa kelluva pallomainen supernatantissa. E: RO82-W-1-soluja viljeltiin 7 päivää staattisen 1

g

-ehdot kasvaa sekä yksisolukerroksena. F: 7-päivän ikäiset MCS muodostettu RPM (nuolet) voitiin havaita ja kiinnittynyt RO82-W-1-soluissa.

Effects of IL-6 ja IL-8 adherenteilla ML-1 soluja kasvatettiin 1

g

– olosuhteet

ML-1 soluja pakastetut varastot viljeltiin T75-pulloissa RPMI 1640 -alustassa, kunnes ne saavuttivat alakonfluenssista (3-5 päivää). Jälkeenpäin solut jatkoviljeltiin 5 T175 ja heti kun he pääsivät alakonfluenssista he alaviljeltiin jälleen 20 T175-pulloissa. Saatuaan subkonfluenteista, soluja käsiteltiin vehikkelillä RPMI 1640-alustassa tai 0,03 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml IL-6: n tai 1 ng /ml, 10 ng /ml, 45 ng /ml tai 100 ng /ml IL-8 pitoisuudet, vastaavasti [27-29]. Olemme myös hakeneet IL-6 ryhmä 0,03 ng /ml ja IL-8 45 ng /ml, koska nämä pitoisuudet julkaistiin supernatantista ML-1-solut 7 päivän kuluttua.

10 T175-pulloihin ( 2 T175 ilman IL-6 tai IL-8 ja 8 T175 eri pitoisuuksia IL-6 tai IL-8) viljeltiin inkubaattorissa (1

g

) 3D, ja toinen joukko 10 T175 varten 7d.

Kun 3d tai 7d väliaineen viljelypulloista on hylätty, solut kaavittiin 10 ml: aan DPBS ja sentrifugoitiin 6000 rpm 15 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin, pelletti liuotettiin 1 ml: aan DPBS ja sentrifugoitiin jälleen 6000 rpm 15 minuutin ajan. Pelletit käytettiin välittömästi proteiinin uuttamalla, Western blot-analyysi beeta-aktiini, ß

1-integriini, taliini-1 ja Ki-67 ja seuraavat tiheysmittaus [17,19]. Tulokset on esitetty kuviossa 3.

Western blot -analyysit ja densitometrinen tiedot esitetään. A, C: beeta-aktiini, 3d ja 7d; B, D: ss

1-integriiniin, 3d ja 7d; E, G: Ki-67, 3 ja 7 päivää; F, H: Talin-1, 3 ja 7 päivää. IL-6 annosta: 0,03 ng /ml; 1 ng /ml; 10 ng /ml ja 100 ng /ml. Annos 0,03 ng /ml, on maksimaalinen määrä IL-6 vapautuu ML-1-solujen supernatantti ja mitataan MAP (tummanharmaa pylväät). IL-8 annosta: 1 ng /ml; 10 ng /ml; 45 ng /ml ja 100 ng /ml. Annos 45 ng /ml on maksimaalinen määrä IL-8 vapautuu ML-1-solujen supernatantissa ja mitataan MAP (tumman harmaat pylväät).

Liquid-overlay tekniikkaa

Monisoluista kasvain sferoidit tuotettiin avulla neste-overlay tekniikkaa [24]. Kilpirauhassyöpä solut ML-1-solulinjassa ja UCLA RO82-W-1-solulinja kerättiin toisissaan kiinni kasvavia konfluentteja yksisolukerrosten maljattiin agaroosilla pinnoitettu 96-monisyvennyslevyjen (Nunc GmbH, Wiesbaden, Saksa), jonka pitoisuus on 4000 solua /200 ui RPMI 1640-väliaineessa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Soluja stimuloitiin ajoneuvon, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /ml ja 100 ng /ml) ja IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /ml ja 45 ng /ml). Sen jälkeen 3d ja 7d kuvat on otettu, ja tulokset esitetään kuviossa 4.

A1-A7: faasikonstrastimikroskopiatutkimus kuvia jälkeen otetut 3d. ML-1-soluja kasvatettiin agaroosilla-päällystettyihin kuoppiin, vehikkeliä tai erilaisia ​​annoksia IL-6: n tai IL-8: n, vastaavasti. A8: 3 päivän ikäiset pallomainen ja kiinnittynyt ML-1 solujen CLINO. B1-B7: Kuvat otettu jälkeen 3d. RO82-W-1 kilpirauhasen syöpäsoluja kasvatetaan agaroosilla-päällystettyihin kuoppiin, vehikkeliä tai erilaisia ​​annoksia IL-6: n tai IL-8: n, vastaavasti. B8: 3 päivän ikäiset pallomainen ja kiinnittynyt RO82-W-1 solujen CLINO. C1-C7: otetut kuvat jälkeen 7d. ML-1-soluja kasvatettiin agaroosilla-päällystettyihin kuoppiin, vehikkeliä tai erilaisia ​​annoksia IL-6: n tai IL-8: n, vastaavasti. B8: 7 päivän ikäiset pallomainen ja kiinnittynyt ML-1 solupopulaation inkuboinnin jälkeen 2D CLINO. D1-D7: Faasikontrasti- otettujen kuvien jälkeen 7d. RO82-W-1 kilpirauhasen syöpäsoluja kasvatetaan agaroosilla-päällystettyihin kuoppiin, vehikkeliä tai erilaisia ​​annoksia IL-6: n tai IL-8: n, vastaavasti. D8: 7 päivän ikäiset MCS ja tarttuu RO82-W-1-solujen jälkeen kulttuurin CLINO.

Satunnainen Positioning Machine

RPM ostettiin ADS, Alankomaiden entinen Space , Leyden, Alankomaissa (kuvio 1A). Sen rakentaminen ja toiminta on selostettu aikaisemmin van Loon [30]. Se koostuu kahdesta riippumaton pyörivä kehyksiä toisiinsa. Meidän kokeissa RPM oli toiminut ”random mode” (60 ° /s), jossa suunta on muutettu jatkuvasti ja satunnaisesti. Ajan vakavuus vektori maapallon mitätöidään. Kokeiden aikana RPM ladattiin jopa 15 T25 cm

2 pulloissa, jotka oli kiinnitetty maahan levy koneen. Käytännössä kaikki pullot asui etäisyydellä 7,5 cm päässä kierto. Suhteellisen alhaisella nopeudella (60 ° /s) ja RPM, keskipakovoima kokema soluja edes kauimpana kohtia kiertymiskeskipiste oletetaan olevan vähäinen [30].

2D Clinostat

2D CLINO laitteen (valmistaja DLR, Köln, Saksa, kuvio 1 B) koostuu kuudesta aseiden mahdollistaa pyörimisen näytteiden akselin ympäri, joka on kohtisuorassa painovoiman [31]. Jokainen pyörivän varren ladattiin 4 dia pulloja, eli yhteensä 24 pulloja ajoa kohti. On CLINO, vakavuuden vektori satunnaistettu nopea ja jatkuva kierto. Suurta huomiota on varmistettava, että kaikki pullot valittu clinorotation olivat ilmakuplia, jotka muutoin aiheuttaa kaoottinen nesteen liikettä. 2D CLINO pyörivät jatkuvasti nopeudella 60 rpm synnyttää jäljellä kiihtyvyydet etäisyydellä 3 mm ympäri kiertymiskeskipiste on luokkaa 0,012

g

, kun taas solut sijaitsevat etäämmällä kokemusta jopa 0,036

g

[18, 31]. Vaikka painovoiman liittyvä kynnys kilpirauhasen syöpäsoluja on tuntematon, vain solut sijaitsevat etäisyys 3 mm ympäri pyörimisakselin kerättiin analyysien, mikä tarkoittaa, että nämä solut olivat vain hyvin pieni jäännös kiihtyvyys.

pH mittaukset

pH mitattiin Metrohm 827 pH-mittari ei ole enemmän kuin 1 tunnin kuluttua kokeen päättymisestä. Kaikki mittaukset suoritettiin kahdesti, ja näytteet pidettiin suljetussa Eppendorf-putkissa, kunnes mittaus välttää reaktiot ilmakehän kaasujen.

faasikontrastimikroskopiaa

Axiovert 25 mikroskooppi (Carl Zeiss Microscopy, LLC, USA) käytettiin visuaalista havainnointia ja solujen morfologia.

Western blot -analyysit

Western blot -analyysit, immunoblottaus, ja tiheysmittaus suoritettiin rutiinimenetelmien mukaisesti protokollien [32-37]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin määrittämään antigeenien: Anti-beta-aktiini, ja anti-taliini-1 käytettiin laimennoksena 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA); sekä anti-integriini-beta

1-vasta-aine (Epitomics, Burlingame, USA); Ki-67 hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, USA (laimennus 1: 500); toisen, HRP-kytketty vasta-aine käytettiin laimennoksena 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA). Latauskontrollina glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (ABR-Affinity Bioreagents, Golden, USA; laimennus 1:10 000) käytettiin.

Kalvot analysoitiin ImageJ ohjelmistoa (US National Institutes of Health, Bethesda , MD, USA; https://rsb.info.nih.gov/ij/), sillä densitrometric kvantifiointiin bändejä.

F-aktiinivärjäyksen

F-aktiini visualisoitiin rodamiini-phalloidin värjäytymistä (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ja tumat värjättiin Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), joka on julkaistu aiemmin [36, 37]. Näytteet asennetaan Vectashield (Vector, Burlingame, CA, USA) ja analysoitiin mikroskooppisesti. F-aktiini värjättyä Näytteet tutkittiin käyttämällä Zeiss 510 META ylösalaisin konfokaali laserkeilauksen (Zeiss, Saksa), joka oli varustettu Plan-Apochromat 63 x 1.4 tavoite. Heräte ja emissioaallonpituudet olivat: λexc = 488 nm ja Aem = ≥505 nm FITC. Jälkeenpäin näytteet analysoitiin avulla kuvan analyysin ohjelma Scion Image (versio 1.63 MacOs, Scion Corporation, USA).

sytokiinimittaukset Multi-Analyytti Profilointi teknologia

vapautuminen sytokiineja tutkittiin kautta Multi-Analyytti profilointi (MAP), kuten aiemmin on kuvattu [18, 22]. Kunkin ehdon, viisi supernatantit kerättiin 72 tunnin kuluttua ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes testaus. MAP toteutettiin yhtiön Myriad RBM (Austin, Texas, USA), ne ovat määritelleet Human Sytokiinit valintojen MAP A ja B

Sytokiini mittaus Enzyme immunosorbenttimääritys

IL-6, IL-8 ja MCP-1-proteiinit vapautettiin RO82-W-1-solujen soluviljelmän supernatantit aikana RPM ja CLINO kokeissa havaittiin ELISA-ostettiin R 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

solut follikulaarinen kilpirauhasen syöpä solulinjoja ML-1 ja RO82-W-1 viljeltiin 3d ja 7d RPM, 2D CLINO , ja normaaleissa staattinen laboratoriossa 1

g

-ehdot. Jopa seitsemäntenä päivänä, pH pysyi normaalialueella, riippumatta siitä, onko soluja viljeltiin RPM, alle 1

g

tai CLINO. Kuitenkin solut pysyivät kasvaa yksikerroksinen vain, jos viljely suoritettiin alle 1

g

, kun taas, kun viljellään muuttuneessa painovoiman olosuhteissa, solut jaettiin kahteen populaatioita, joista yksi käsitti soluja jäljellä toisissaan kiinni, kun taas muut sisälsivät soluja, jotka muodostavat 3D aggregaatit samanlaisia ​​kuin on kuvattu FTC-133-soluja [18].

Saimme samanlaisia ​​tuloksia kanssa RO82-W-1 ja ML-1-soluissa. Molemmat solut lisääntyivät, kuten RO82-W-1-soluissa on esitetty kuviossa 2 kiinnipysyväksi yksikerroksinen (kuvio 2A ja 2E) ja monisoluisia pallosia RPM (kuvio 2B ja 2F) ja CLINO (kuvio 2C ja 2D). Ei ollut eroja määrän pallosia kunkin solulinjan, joka syntyi joko RPM tai CLINO. Molemmat laitteet toimitetaan pallosia erikokoisia (max. Halkaisija 0.4 mm) sekä ajankohtina, kuten on esitetty kuviossa 2B, 2C, 2D ja 2F. Irtoaminen AD solujen alkoi aikaisin ja solujen irtoaminen ja sferoidiviljelmiä muodostumista esiintyi myös kuluttua 7 d.

vaikutus IL-6 ja IL-8 ML-1-soluja kasvatettiin 1

g

-ehdot

IL-6 (0,03 ng /ml ja 1 ng /ml) stimulaation lisääntynyt määrä beeta-aktiini ja ß

1-integriinin proteiinin kiinnittynyt mL-1-soluissa. Lisäksi IL-8 (1, 10 ja 45 ng /ml) lisäsi beeta-aktiini-proteiinin pitoisuus näissä soluissa, kun taas vain suuremmilla annoksilla (10-100 ng /ml) koholla valkuaispitoisuus beta

1-integriinin 3 päivän sisällä (kuvio 3A ja 3B).

jälkeen 7d, mikä todettiin beeta-aktiini-proteiinin kaikissa IL-6-käsiteltyjen näytteiden sekä käsitellyt näytteet 1 ja 10 ng /ml IL -8 (kuvio 3C). ß-

1-integriinin proteiini indusoitiin 0,03 ng /ml sekä 10 ng /ml IL-6, kun taas vain 10 ng /ml IL-8 indusoi proteiinin määrä jälkeen 7 päivän stimulaation (kuvio 3D).

lisäksi sekä sytokiinien (IL-6 ja IL-8, kaikki annokset) indusoi korkeus Ki-67-proteiinin pitoisuus jälkeen 3d (kuvio 3E). Jälkeen 7d, kaikki IL-6 annosta sekä 1 ng /ml ja 100 ng /ml IL-8 lisääntynyt määrä Ki-67-proteiinin ML-1-soluissa (kuvio 3G). Sen sijaan taliini-1-proteiinin pitoisuus on selvästi vähennetty IL-6 ja IL-8 hakemuksen väliaineen. Matalia annoksia IL-6, ja kaikki annokset IL-8 olivat tehokkaita (kuvio 3F) aikana 3-päivä-1

g

-experiment. Toinen tulos havaittiin jälkeen 7d. IL-6 stimulaation johti kasvua Talin-1 (kuvio 3H). Samanlainen havainto oli nähtävissä IL-8-käsiteltyjen näytteiden (1, 10 ja 45 ng /ml), ML-1-solulinjassa.

Nämä kokeet määritelty ensinnäkin, optimaalinen IL-6 ja IL-8: annokset ilmentämiseen erillisten proteiinien alle 1

g

-ehdot ja toiseksi, annokset testata niiden vaikutus MCS muodostumista käyttämällä neste-overlay-menetelmällä (katso jäljempänä ja kuvio 4).

vaikutus IL-6 ja IL-8 sferoidiviljelmiä muodostumiseen alle 1

g

-ehdot

kun 3d, ML-1-soluissa näkyi vain löysä soluaggregaatteja, viljeltynä 1

g

-ehdot aga-. 10 ja 100 ng /ml IL-6 ja 1, 10 ja 45 ng /ml IL-8-hoito johti parempaan yhdistäminen ML-1 solujen sferoideja, kun ne viljellään agaroosi-päällystettyihin kuoppiin (Liquid-overlay tekniikka) (kuvio 4A1-4A7). RO82-W-1-soluissa muodostaa suuri epäsäännöllinen aggregaattien jälkeen 3 päivän inkuboinnin agaroosi-päällystettyihin kuoppiin. Sekä sytokiinien paransi muodostumista RO82-W-1 monisoluisten pallosia käyttäen nestettä overlay menetelmällä (kuvio 4B1-4B7).

Kun 7d, ML-1-solut osoittivat epäsäännöllinen muodostettu soluaggregaateiksi aga-. Sytokiini-hoidetuilla ryhmillä sisälsi useita tiheä pallosia viikon kuluttua stimulaation (kuvio 4C). ML-1 pallosia, jotka on muodostettu CLINO olivat samanlaisia ​​kuin neste-overlay palloset käsiteltiin 45 ng /ml IL-8 (kuvio 4C7 ja 4C8).

jälkeen 7d RO82-W-1 solut kasvoivat muodossa tiheä monisoluisten pallosia sekä yhtenä solujen uinti supernatantissa in agaroosi-päällystettyihin kuoppiin. Sytokiinin hakemus väliaineen parantaa hieman koko pallosia (kuvio 4D1-4D7).

Sferoidit molempien solutyyppien jälkeen muodostettu IL-6 ja IL-8 käsittely osoitti samanlaisen morfologian kuin MCS jälkeen tuotetusta inkuboimalla CLINO (kuvio 4A8, 4B8, 4C8 ja 4D8).

sytokiinivapautuminen ML-1-soluissa

mittaaminen sytokiinien Human Sytokiini valinnat MAP A ja B havaitsimme IL- 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-A: n ja eotaksiini-1 supernatanteista eri soluviljelmissä. Mittasimme noin 32 pg /ml IL-4 ja IL-7 supernatanteissa 3 päivän ikäisiä soluviljelmissä, riippumatta siitä, onko soluja oli inkuboitu RPM, on CLINO tai kiinteän 1

g

-ohjaus. Jälkeen 7 päivän altistuksen jälkeen soluviljelysupernatanttia sisälsi noin 47 pg /ml IL-4 ja noin 43 pg /ml IL-7, riippumatta viljelyolosuhteissa (kuvio 5A ja 5C). Samanlainen ilmiö havaittiin suhteessa IL-8: n ja VEGF-A. Noin 710 pg /ml VEGF-A: n ja 11000 pg /ml IL-8 löydettiin supernatanteissa 3 päivän ikäisiä viljelmiä, riippumatta siitä, onko soluja oli inkuboitu RPM, on CLINO tai alle paikallaan 1

g

-ehdot. Jälkeen 7 päivän altistuksen VEGF-A: n ja IL-8-pitoisuuksia parannettu noin 3000 pg /ml VEGF-A: n ja noin 35000 pg /ml IL-8 havaittiin jälleen ilman merkittävää eroa suhteessa viljelyolosuhteissa (kuvio 5D ja 5F). Yhdessä kuviossa 5A, 5C, 5D ja 5F osoittavat, että sisältö on IL-4, IL-7, VEGF-A: n ja IL-8 viljelmän supernatantit parannettu 7-päivän-näytteiden verrattuna 3- päivä-näytteitä, kun taas merkittävä vaikutus altistamalla solut RPM tai CLINO ei voitu nähdä nämä 4 eri sytokiineja.

V: IL-4, B: IL-6, C: IL 7, D: IL-8, E: MCP-1, F: VEGF-A proteiineille, joita vapautuu ML-1-solujen supernatanttiin, kun 3- ja 7-päivän altistumisen RPM tai 2D Clinostat, määritetään Multi -Analyte profilointi supernatantin. RPM: Satunnainen Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P 0,05

Sen sijaan, kertyminen IL-6 ja MCP-1 eri viljelmien supernatanteissa selvästi riippui viljelyolosuhteista. Vapautuminen 27 ja 33 pg /ml IL-6 löydettiin supernatanteista RPM näytteiden jälkeen 3d ja 7d Viljelyn vastaavasti, kun taas määrä 22,5 pg /ml IL-6 mitattiin asiaa 1

g

-controls (kuvio 5B). Vastaavasti, jonka pitoisuus on 24 ja 36 pg /ml IL-6 löydettiin supernatanteista CLINO jälkeen näytteet 3- ja 7-päivän kokeessa, vastaavasti, kun taas noin määränä 25 pg /ml IL-6 mitattiin asiaankuuluvat 1

g

-controls (kuvio 5B). Lisäksi, monosyytti kemoattraktiivinen proteiini-1 (MCP-1) muuttuivat, kun solujen viljely suoritettiin laitteissa simuloidaan mikrogravitaatiota. Normaaleissa painovoiman olosuhteissa, noin 600 pg /ml MCP-1 havaittiin sen jälkeen, kun 3 päivää ja välillä 700 ja 750 pg /ml sen jälkeen, kun 7 päivää, kun taas MCP-1-pitoisuudet kasvoivat 750-950 pg /ml RPM ja 700 1000 pg /ml on CLINO (kuvio 5E).

lisäksi kuusi sytokiinien kuviossa 5 etsittiin edelleen sytokiinien, kuten on esitetty taulukossa 1. kuitenkin, meillä ei havaitse muita sytokiineja vapautuu supernatantti aikana 3 vuorokauden soluviljelyprosessin missään tilanteessa. Vapautuminen IL-17 ja eotaksinin oli havaittavissa näytteitä viljeltiin 7 päivää CLINO, RPM sekä paikan päällä eivätkä erot pitoisuuksissa noin 1 pg /ml (IL-17) ja 15 pg /ml (eotaksiini) (taulukko 1).

sytokiinien vapautuminen RO82-W-1-soluissa

tutkittiin vapautuminen valitaan sytokiinien supernatantissa RO82-W-1-soluissa sen jälkeen, kun 3 päivän altistuminen RPM tai CLINO laitteita. Määrä IL-6 oli merkittävästi kohonnut 56,9 pg /ml 75,2 pg /ml RPM (kuvio 6A). Samanlainen tulos saatiin IL-8 (kuvio 6B). Ei-merkittävä kasvu sekä sytokiinit mitattiin CLINO-näytteet.

eritystä MCP-1 RO82-W-1-solut oli paljon pienempi kuin julkaisun ML-1-solujen (kuviot 5E ja 6C ). Culture of RO82-W-1 solujen RPM tai CLINO kokonaan pyöristettyjä vapautumista MCP-1 (kuvio 6C).

: IL-6, B: IL-8 ja C: MCP- 1 proteiineille, joita vapautuu RO82-W-1 kilpirauhassyöpä solujen supernatanttiin jälkeen 3 päivän altistumisen RPM tai 2D CLINO, määritettiin ELISA-tekniikka. RPM: Satunnainen Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P 0,05.

vaikutukset simuloidun mikropainovoimassa on solun tukirangan

Koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että solun tukirangan proteiinit erityyppisten solujen vakava mikrogravitaatiota [11-13, 37, 39-41], suoritimme F-aktiinivärjäyksen soluihin viljelty RPM ja 2D CLINO varten 3d ja 7d. Jälkeen 3 päivää, kertyminen F-aktiini pitkin ulomman solukalvon näkyi ML-1-soluissa sekä RO82-W-1-soluja viljeltiin sen CLINO ja RPM (kuvio 7). Jälkeen 7 päivää, solut olivat täysin kasvaneet yhteen ja overgrew toisiaan. Paksuuntumista ulomman kalvon havaittiin molemmissa olosuhteissa (1

g

ja simuloitu mikrogravitaatiota), mutta oli jyrkempää RPM ja CLINO.

AC: ML-1 3-päivä -koe. V: ML-1-soluissa, 3d, 1

g

-condition: normaalit solut normaali F-aktiinisytoskeletonin B: ML-1-soluissa, 3d, kertyminen F-aktiini ulomman solukalvon (keltaiset nuolet ) jälkeen RPM-altistuksen. Valkoiset Nuoli irrotuksessa solun aggregaattien kiinnittyneiden solujen kerros. C: ML-1-solut, 3d, paksummat kerrokset F-aktiini ulomman solukalvon (keltaiset nuolet). D-F: ML-1 7 päivän kokeilu. D: ML-1-soluissa, 7d, 1

g

-condition: konfluentteja normaaleihin soluihin normaalilla F-aktiinisytoskeletonin. E: ML-1-soluja viljellään RPM 7d paljasti paksumpia kerroksia F-aktiini on ulkokalvon (insert). F: A 7-päivän altistumisen ML-1 solujen CLINO indusoi samanlaisia ​​muutoksia F-aktiinisytoskeletonin. Insertti osoittaa Kaupankäyntitunnus F-aktiini kuitujen solutasolla kalvoja. G-I: RO82-W-1 3 päivän kokeilu. G: normaali F-aktiinisytoskeletonin of RO82-W-1-soluissa. H: MCS muodostuminen (keltaiset nuolet) jälkeen 3 päivän inkubaation RPM. Kertymistä F-aktiini ulomman solukalvon on näkyvissä (keltaiset nuolet). I: RO82-W-1 viljeltiin 3d on clinostat osoittivat, että paksuuntuminen F-aktiini kuidut (nuolet). Aseta: 3D MCS. J-L: RO82-W-1 7 päivän kokeilu. J: F-aktiinisytoskeletonin confluent RO82-W-1-soluja kasvatettiin 1

g

. K, L: MCS muodostumista RO82-W-1-soluissa, kun RPM-(K) ja CLINO-altistus (L). Nuolet osoittavat 3D MCS ja paksuuntumista F-aktiini kuitujen ulomman kalvot.

Western blot-analyysit β-aktiini ML-1-soluissa paljasti lasku sen jälkeen, kun 7d clinorotation (kuvio 8A ), mutta proteiini pysyi ennallaan jälkeen 7d RPM-altistuksen. Altistuminen ML-1 soluja RPM ja clinostat indusoi merkittävän laskun vuoksi β

1-integriinin AD ja MCS solujen jälkeen 7d (kuvio 8B). Talin-1-proteiinin väheni merkittävästi AD-soluissa vain, kun ML-1-soluja inkuboidaan CLINO (kuvio 8C). Ki-67-proteiinia, tumaproteiini, joka liittyy solujen lisääntymisen prosessi, oli merkittävästi koholla AD-soluissa verrattuna MCS ja 1

g

-Säätimet soluja molemmissa laitteissa (kuvio 8D).

Western blot analyysit AD: ML-1-soluissa jälkeen 7 päivän valotuksen RPM ja CLINO. V: ß-aktiini, B: SS

1-integriiniin, C: Talin-1 ja D: Ki-67-proteiineja. Selviä eroja laitteiden välillä löydetään ß-aktiini. Western blot analyysit E-H: RO82-W-1-soluissa jälkeen 7 päivän valotuksen RPM ja CLINO. E: ß-aktiini, F: SS

1-integriiniin, G: Talin-1 ja H: Ki-67-proteiineja. Ei ollut mitään muutosta beeta-aktiini pitoisuus RO82-W-1 soluja viljellään RPM tai CLINO 7d. Määrä SS

1-integriinin ja Ki-67 oli verrattavissa ML-1 viljelmiä kasvatettiin s-μ

g

. * P 0,05.

Ei muutosta beeta-aktiini havaittiin RO82-W-1 soluissa, sen jälkeen 7 päivän-kulttuurin RPM tai CLINO (kuvio 8E). Valkuaispitoisuus beeta-aktiini pysyi vakiona. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.