Krooninen sairaus

tiivistelmä

β-lapatsoni (β-kierros), NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) kohdistaminen antitumor lääkeaihion vaiheen II kliinisissä kokeissa, on metabolisesti eliminoituu NQO1 välittämä kinonialdehydit vähentäminen ja myöhemmin UDP-glukuronosyylitransferaasien (UGT) katalysoidun glukuronidoitumalla. Tutkimuksessa aikoo tutkia sisäistä yhteyden solun glukuronidaatiota ja farmakokinetiikkaa β-kierros ja sen apoptoottinen vaikutus ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. HT29 S9 fraktiolla korkea glukuronisaatio aktiivisuus β-kierros, jota voidaan estää UGT1A9 kilpaileva estäjä propofolia. UGT1A siRNA käsitelty HT29 S9 jakeet näytetään näennäinen alhaisen glukuronidaatiota aktiivisuutta. Kertymiseen solun β-kierros HCT116-soluissa oli paljon korkeampi kuin HT29, korreloi puuttuminen UGT1A in HCT116-soluissa. Sytotoksinen ja apoptoottinen vaikutus β-kierros HT29 olivat huomattavasti alhaisemmat kuin HCT116-soluissa; Lisäksi, β-kierros käynnistyy aktivointi SIRT1-FOXO1 apoptoottisen reitin havaittiin HCT116-soluissa, mutta ei HT29. Esikäsittely HT29 kanssa UGT1A siRNA tai propofolin merkittävästi vähentynyt β-kierros: n sytotoksisia ja apoptoottiset vaikutukset, johtuen tukahduttaminen glukuronidaatiota tuloksena kertymiseen solun. Lopuksi UGT1A on tärkeä tekijä, kautta vaihtamalla NQO1 laukaisema redoksijaksossa metaboliseen poistamiseen, solunsisäisessä kertyminen β-kierros ja sen jälkeen sen sytotoksisuus ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Yhdessä aiemmista teoksista, ehdotamme, että UGT määritelty solu farmakokinetiikka on tärkeä tekijä siinä apoptoottisen vaikutuksia NQO1 kohdistaminen substraattien toimii kemoterapeuttisten.

Citation: Liu H, Li Q, Cheng X, Wang H, Wang G, Hao H (2015) UDP-glukuronosyylitransferaasin 1A mittaava Solunsisäinen kertyminen ja syövän vaikutusta of β-lapatsoni Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 10 (2): e0117051. doi: 10,1371 /journal.pone.0117051

Academic Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 28 syyskuu 2014; Hyväksytty: 16 joulukuu 2014; Julkaistu: 18 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat nro. 81430091, 81325025 ja 81273586, https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz .html, National Natural Science Foundation of China (HH). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

UDP-glukuronosyylitransferaasien (UGT) ovat merkittävä vaihe II lääkkeitä metaboloivia entsyymejä, jotka katalysoivat glukuronidaatiota lukuisten endogeenisten yhdisteiden, kuten bilirubiinin, sappihapot, kilpirauhashormonin ja steroidihormonien sekä merkittävä eksogeeniset alustoilla terapeuttisten lääkkeiden, karsinogeeneja, ja ympäristömyrkkyjen. UGT pidetään tärkeänä vieroitus järjestelmä sen kykyä edistää aineenvaihduntaa poistamista ja siten biologisen tehokkuudet substraattien [1-3]. Lisäksi polymorfismien UGT geenit liittyvät läheisesti riskiin ja esiintymistä erilaisten sairauksien [4]. Vaikka rooli UGT kemoterapeuttisessa vastus on yleisesti tunnustettu, välinen suora yhteys solunsisäisen lääkeaineen kertymistä kemoterapeuttisten teho vielä selvitettävä [5,6]. Viime aikoina olemme selvitetty, että NQO1 alustan, tanshinone IIA, esittelee kahden elektronin vähentäminen NQO1 tuottamalla erittäin reaktiivinen katekoli aineenvaihduntatuotteen, jotka voidaan nopeasti glukuronidoitua kanssa UGT läsnäoloa. Kuitenkin, jos UGT puuttuvat tai ovat niiden glukuronidaatiota toiminta on estetty, erittäin epävakaa katekoli väli voi kääntyä takaisin tanshinone IIA automaattisesti, jolloin muodostuu redox-sykli kinoni vähentäminen ja auto-oksidaation, jossa suuri määrä reaktiota hapen lajien (ROS ) valmistetaan [7]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että UGT voi toimia kytkentä NQO1 laukaisi apoptoottisia vaikutuksia aineenvaihdunnan poistaminen syöpäsoluja ja voi siten olla mukana luontainen chemoresistance on NQO1 kohdistaminen syöpälääkkeet. Edelleen vahvistaa tätä tärkeä käsite, laajensimme tutkimuksen toiseen NQO1 kohdistaminen aineeseen.

β-lapatsoni (β-kierros, 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-naftolia [1,2 -b] pyran-5,6-dioni) on luonnossa esiintyvä naftokinoni päässä lapacho puu (Tabebuia avellanedae), tiedetään olevan erilaisia ​​farmakologisia toimintoja, mukaan lukien antiviraalista, alkueläimiä ja syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [8-11]. On osoitettu, että β-kierroksen esittelee vahva sytotoksisuutta kohti erilaisia ​​eläin- ja ihmisen syövän solulinjoissa [12-14], ja voi synergisesti tappaa syöpäsoluja yhdistettynä paklitakseli (Taxol), ionisoivan säteilyn ja lämmön sokki [15-17 ]. Lukuisat hypoteesit mekanismin β-lap-solukuolema oli ehdotettu ja määriä todisteiden edistänyt β-kierros niin lupaava ehdokas syöpähoitoa varten [10,18-21].

Koska β-kierros on myös pääasiassa eliminoituu NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) ja myöhemmät UGT katalysoivat aineenvaihdunnassa [7,22], oletimme, että ilmaisu ja toimintaa UGT syöpäsoluissa voisi olla myös tärkeä tekijä, että syövän vaikutusta of β-kierros, samanlaisia ​​kuin meidän edellinen tutkimus tanshinone IIA. Ottaen että β-lapatsoni on parhaillaan vaiheen II kliinisissä kokeissa, validointi, onko UGT välitteistä solujen aineenvaihduntaan voivat aiheuttaa luontainen vastus on erittäin tärkeää kehittää edelleen ja sen tulevan kliiniseen käyttöön kemoterapian huume. β-lap-solukuolema leimasi dramaattinen ROS muodostumisen, solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1, laaja DNA vaurioita, ehtyminen NAD

+ /ATP-tasot, hyperactivation poly (ADP -ribose) polymeraasi-1 (PARP-1) ja proteolyyttisen PARP-1 [10]. Tämä tutkimus keskittyy valaisemaan roolista UGT määritettäessä kertymiseen solun, ROS muodostumista, apoptoottinen vaikutus ja SIRT1-FOXO1 reitin aktivaatio β-kierroksen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

Kokeellinen osa

solulinjat ja transfektiot

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HT29 ja HCT116 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). Soluja kasvatettiin McCoyn 5a 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Solut transfektoitiin UGT1A siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA (Invitrogen) käyttäen Lipofectamine-RNAiMAX transfektioreagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan käänteistranskriptio-protokollaa.

Kemikaalit ja reagenssit

β-lapatsoni saatiin Kaakkois Pharmaceuticals, Inc . (Jiangsu, Kiina). Propofoli, N-asetyylikysteiini (NAC), dikumarolityyppisten (DIC), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), glukoosi-6-fosfaattia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, β-nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADP), uridiini-5′-difosfaattiglukuronihapolla (UDPGA), D-sokerihappo hapon 1,4-laktoni, β-D-glukuroni- ja klooritsoksatsonin, ostettiin kaikki yhtiöltä Sigma Aldrich. Diatsepaamia saatiin National Institute for Control of Pharmaceutical ja biologisten tuotteiden (Peking, Kiina).

kvantitatiivinen RT-PCR-määritys

Yhteensä mRNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen) ja käänteistranskriboitiin cDNA mukaan valmistajan protokollan (Takara). qRT-PCR suoritettiin SYBR Esiseos ExTaq II (Takara) reaktiossa tilavuus oli 10 ui. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C 1 min, 40 sykliä 95 ° C 5 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. β-aktiini-geenin käytettiin endogeenista ohjaus.

Western blot -määritys

Western blotting, soluja uutettiin lyysipuskurilla, SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Proteiinit havaittiin käyttäen spesifisiä ensisijaista vastaan ​​suunnattuja vasta-UGT1A (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), SIRT1 (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), Ac-FOXO1 (D-19 , 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), FOXO1 (C29H4, 1: 1000, Cell Signaling, USA), TRAIL (C92B9, 1: 1000, Cell Signal Technology, USA), Bim (C34C5, 1: 1000, Cell Signal Technology, USA), FasL (1: 200, BD Pharmingen, USA) tai BCL-6 (N-3, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteiini ekspressiotasoja normalisoitiin kanssa GAPDH (1: 5000, Shengxing, Kiina). Pesun jälkeen TBST: llä, kaivoa inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1: 10000, KeyGen, Kiina) 1 h. Signaali havaittiin parannettu cheniluminescence (ECL, Millipore).

Glukuronidaatio määritys β-kierros S9 Fraktiot

entsyymikinetiikka määritys β-kierroksen (+0,0625-3 uM) glukuronidoitumalla oli suoritettiin HT29 S9 (0,005 mg). HT29-solut otettiin talteen, suspendoitiin uudelleen fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, sonikoitiin ja sentrifugoitiin 9000 g: ssa 20 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin S9 jakeet. Propofolin inhibiitiotutkimusta, propofoli (0-400 uM) oli mukana inkuboitiin β-kierros (0,5 uM) 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Entsyymi kineettinen analyysi suoritettiin edellä kuvatulla menetelmällä, joka perustuu edellisessä raportissa [22].

Solunsisäinen kertyminen ja Glukuronidaatio of β-kierros eläviin soluihin

Solut 80% konfluenssiin oli altistetaan 5 uM β-kierros 10, 20, 30, 60, 90, 120 min. Sekä solut ja viljelyväliaine kerättiin ilmoitettuina ajankohtina. Solut kerättiin ja pestiin kolme kertaa jääkylmällä fysiologisella suolaliuoksella. 300 ui ultrapuhdasta vettä lisättiin kuhunkin kuoppaan ja jäädytys /sulatus kolme kertaa. Kukin näyte lisättiin kolminkertaisesti jääkylmää asetonitriiliä, vorteksoitiin 5 minuuttia ja sentrifugoitiin 18000 rpm: ssä 10 min. Supernatantti saatiin ja analysoitiin LC-MS perustuva menetelmä edellisessä raportissa [22].

ROS määritys ja GSSG-GSH Ratio Assay

Soluja inkuboitiin 10 uM /l DCFH- DA lastaus- väliaineessa 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Jälkeen DCFH-DA poistettiin, solut kerättiin ja 500 ui lyysipuskuria (0,1 NaOH 50% MeOH) lisättiin. Spin 6000 rpm 1 minuutin ajan. Siirrä 200 ui solu- lysaattia mitata fluoresenssin voimakkuus käyttäen fluoresenssilevylukijaa. Herätevalon suodatin asetettiin 488 nm ja emissiosuotimen oli 525 nm. Yhteensä glutationi ja GSSG mitattiin mukaan GSH ja GSSG Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kiina). Absorbanssi muutokset 412 nm: ssä detektoitiin spektrofotometrillä. Määrä GSSG ja GSH saatiin erikseen standardin käyrä ja niiden suhde laskettiin sitten.

Sytotoksisuusmääritys

Solut 80% konfluenssiin altistettiin 0 uM, 1,25 uM, 2,5 uM , 5 uM, 10 uM tai 20 uM β-kierros. Sen jälkeen viljelty 24 tuntia, 20 ui MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. MTT-liuos poistettiin ja 150 ui DMSO: ta lisättiin sitten liuottamiseksi MTT kiteitä. Absorbanssi 570 nm: ssä saatiin spektrofotometrillä sen jälkeen, sekoittamalla levyt 10 minuuttia ravistelijassa.

Apoptosis Assay

Solut 80% konfluenssiin altistettiin 5 uM β-kierroksen 24 tuntia ja pestiin jääkylmällä PBS: llä. Apoptoosi kvantifioitiin käyttäen APO-BrdU Kit (BD Biosciences, USA). Solut värjättiin mukaan valmistajan ohjeita. Merkityt solut analysoitiin virtaussytometrialla FACS Calibur (BD Biosciences, USA).

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Studentin t-testiä tai Mann-Whitney U-testejä suoritettiin käyttäen Prism-ohjelmisto. Tilastollinen arvioe fi de- t-testissä piirretään seuraavasti: * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Tulokset

UGT1A Määrittää β-kierros Glukuronidaatio in HT29 Cell S9 Fraktiot

mukaan edellisessä tutkimuksessa [22], kinoni vähentäminen ja myöhemmin monoglucuronidation tuottaa parin regioisomeerien (M1 ja M2) on vallitseva metaboliareitti β-kierros. Lisäksi UGT1A9 ja UGT2B7 ovat hallitseva isotsyymien vastuussa β-kierroksen glukuronidaatiota [22]. Meillä on siis ensin arvioinut UGT ekspressiotasot sekä HT29 ja HCT116 solulinjoissa. Reaaliaikainen PCR-määrityksissä osoitti, että useita UGT1A geenejä (UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 ja UGT1A9) ovat positiivisesti ilmaistuna HT29 mutta ei HCT116-soluissa, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [7]. Kuitenkin UGT2B7, joka on vallitsevasti vastuussa muodostumista β-kierroksen glukuronidaatiometaboliitti M1 [22], oli havaittavissa sekä HT29 ja HCT116-soluissa. Korkea ilmentymisen taso UGT1A vuonna HT29 ja puuttuminen UGT1A vuonna HCT116-solut tukevat western blot -määritys. UGT1A siRNA väheni jyrkästi mRNA tasoilla useita UGT1A ja yhteensä UGT1A proteiinin ilmentymistä HT29.

Yhdenmukainen UGT ilmaisun profiili, M2 havaittiin HT29 solussa S9 jakeet, kun M1 on havaittavissa, mikä voidaan selittää puuttumiseen UGT2B7 paksusuolessa syöpäsoluja. Entsyymi kineettinen määritys osoittaa, että β-kierroksen glukuronidaatiota osoitti tyypillisen Michaelis-Menten-kinetiikka in S9 jakeet valmistettu HT29 (Fig. 1A). UGT1A hiljentäminen johti P-kierroksen glukuronidaatiota esto ilmenee, joilla on merkittävä lasku suurin nopeus (V

max) ja luontainen puhdistuma (CL

int, V

max /K

m) arvoja, mutta vähän vaikutusta näennäisen K

m-arvot tuotantoon M2 (Fig. 1 B, taulukko 1). Koska UGT1A9 tietyn alustan [23], propofolin osoitti annoksesta riippuvaa estoa tuotannon M2 HT29 (Fig. 1 C).

HT29 S9 inkuboitiin β-kierros mukaan yksityiskohtia menetelmistä . (A) Tyypillinen Michaelis-Menten kinetiikka β-kierros glukuronoitumalla HT29 S9 jakeet; (B) UGT1A siRNA käsitellään HT29 S9 jakeet merkittävästi vähentää β-kierros glukuronidaatiota; (C) estotehoa propofolin β-kierros glukuronoitumalla HT29 solussa S9 jakeet. Tulokset esitetään keskiarvona ± 3 SEM kolmen erillisen kokeen (*** P 0,001, UGT1A siRNA hoito vs. negatiivisen kontrollin solut).

UGT1A kompromisseja β-kierros Kertyminen Colon syöpäsolut

solujen farmakokineettinen tutkimus suoritettiin sen testaamiseksi, onko UGT1A voi vaikuttaa β-kierros kerääntymistä eläviä soluja. Dynaaminen solunsisäinen taso β-kierros ja sen metaboliitin M2 HT29 ja HCT116-solut tutkittiin eri aikaan pisteen β-kierroksen altistuminen. Kiinnostaa, β-kierros sai erittäin korkealla tasolla 20 min ja sitten laski hitaasti HCT116-soluissa. Sen sijaan, poistaminen β-kierros HT29 oli paljon nopeammin (Fig. 2A). Sekä ala käyrän 0-120 min (AUC

0-120 min) ja suurin pitoisuus (C

max) β-kierros HT29 olivat huomattavasti pienemmät kuin HCT116-soluissa (taulukko 2). Esikäsittely propofolianestesian UGT1A siRNA HT29 johtanut merkittävään korkeampaa β-kierros, osoituksena AUC

0-120 min ja C

max arvot (Fig. 2B, taulukko 2, taulukko 3). Johdonmukaisesti, M2 oli havaittavissa HT29 lähtien β-kierros hoito, mikä osoittaa nopean glukuronisoituvat β-kierros. Solunsisäinen M2 taso oli korkeimmillaan 20 min ja sitten putosi (Fig. 2C), kun taas M2 taso kasvatusväliaineeseen kasvanut jatkuvasti koko ajan (Fig. 2D). Esikäsittely joko propofolianestesian UGT1A siRNA transfektio vähensi M2 muodostumista HT29 sekä viljelyalustaan ​​(Fig. 2C ja 2D, taulukko 2, taulukko 3).

HT29-soluja esikäsiteltiin propofolia (100 uM ) 1 h tai UGT1A siRNA: ssa 24 tuntia. Solut altistettiin p-kierros (5 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina. (A) Solunsisäinen β-kierros taso HCT116 on paljon suurempi kuin HT29; (B) propofolia tai siRNA esikäsittelyä johtavan solunsisäiseen kertymiseen β-kierros HT29; (C) propofolia tai siRNA esikäsittely vähentää solunsisäisiä M2 tasolla HT29; (D) propofolia tai siRNA esikäsittely vähenee M2 tasolla HT29 soluviljelyalustassa. Data näytetään keskimääräisenä 3 ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, propofoli tai UGT1A siRNA esikäsittely vs. kontrolli-solut).

UGT1A Poistaa β-kierroksen aiheuttama ROS Formation

Perustuu aiempaan työhön, β-kierroksen läpi NQO1 välittämää kahden elektronin pelkistys, muodostaen erittäin epävakaa katekoli väli- jotka voivat kokea glukuronisaatio läsnäolo UGT tai palanneet p-kierros puuttuessa UGT [22]. Jälkimmäisessä prosessissa, runsaasti ROS tuotettiin joka aloittaa sitten solun apoptoosin [24]. Edelleen vahvistaa suhdetta β-kierros n glukuronidaatiota seurausten lieventämiseksi, tutkimme ROS muodostusta DCF värjäys määritys HT29 ja HCT116-solut käsiteltiin β-kierros. β-kierroksen aiheuttama merkittävä ROS muodostumista HCT116-soluissa, jotka voitaisiin pitkälti torjuttava ROS poistaja N-asetyyli-L-kysteiini (NAC) tai katalaasi mutta ei UGT1A9 estäjä propofolia (Fig. 3A). Kuitenkin β-kierroksen aiheuttama ROS muodostuminen HT29 havaittiin vain hoidetuilla propofolin, joka pienensi myös NAC tai katalaasin (Fig. 3B). Lisäksi, UGT1A siRNA transfektio myös tehostaa merkittävästi ROS tasoilla HT29 (Fig. 3C).

Soluja esikäsiteltiin UGT1A siRNA tai salattu siRNA (negatiivinen kontrolli) 24 tunnin ajan, tai esikäsitelty propofolia (100 uM ) /NAC (5 uM) /katalaasia (4000 U) 1 tunti. Sitten solut altistettiin p-kierros (5 uM) 2 tunnin ajan ja ROS-ainemääritys tai GSSG /GSH-suhde määritys suoritettiin. (A) ROS muodostumista ja GSSG /GSH suhde HCT116-soluissa esikäsitelty propofolin /NAC /katalaasia; (B) ROS muodostumista ja GSSG /GSH suhde HT29 esikäsitelty propofolin /NAC /katalaasia; (C) ROS muodostumista ja GSSG /GSH suhde HT29 esikäsitelty siRNA /NAC /katalaasia. Tulokset esitetään keskiarvona ± 3 SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, β-kierroksen hoito vs. kontrolli solut; # P 0,05, ## P 0,05, $$ P 0,01, $ $ $ P 0,001, katalaasi esikäsittely vs. vastaava β-kierroksen vain).

pelkistettyä glutationia (L-γ-glutamyyli-L-kysteinyyli-glysiini, GSH) on biologinen aktiivinen muoto, joka hapettuu glutationin disulfidi (GSSG) aikana oksidatiivisen stressin, ja suhde GSSG-to-GSH siten tarjoaa yksinkertaisen ja kätevä ilmentyminen solun oksidatiivisen stressin [25,26]. Sitten arvioitiin solujen redox tasapaino testaamalla GSSG /GSH HT29 ja HCT116-solut ja löysi sama muutos suuntaus kuin DCF värjäytymistä määritykset (Fig. 3A, Fig. 3B ja Fig. 3C).

UGT1A Vaikuttaa β- lap aiheuttama Sytotoksisuus in koolonkarsinoomasoluissa

Liiallinen ROS indusoi hapettavaa muutosta solun makromolekyylien, estää proteiinien toimintaa ja edistää solukuolemaa [27]. Koska UGT1A kykeni inhiboimaan ROS muodostumisen, me sitten tutkitaan, onko UGT1A aktiivisuutta vaikutteita β-kierroksen aiheuttama sytotoksisuuden. Tulokset osoittivat, että β-kierroksen näytteillä ilmeinen sytotoksisuuden HCT116-soluissa, jotka purettiin NAC ja katalaasin mutta ei propofolia (Fig. 4A). Sen sijaan, β-kierros sytotoksisuus HT29 oli viikko, mutta voitaisiin parantaa esikäsittely propofoliin (Fig. 4B); NAC ja katalaasin kykenivät kääntää tämän vaikutuksen. Johdonmukaisesti, UGT1A siRNA transfektiot myös parannettu sytotoksista vaikutusta β-kierros HT29, joka oli merkittävästi päinvastaiseksi NAC ja katalaasia (Fig. 4C).

Soluja esikäsiteltiin propofolia (100 uM) 1 h tai UGT1A siRNA: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin kaltevuus pitoisuudet β-kierros (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 uM) 24 tunnin ajan, ja MTT-analyysi suoritettiin. (A) β-kierroksen aiheuttama sytotoksisuuden HCT116-soluissa propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (B) β-kierroksen aiheuttama sytotoksisuuden HT29 propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (C) β-kierroksen aiheuttama sytotoksisuuden HT29 siRNA /NAC /katalaasia esikäsittelyä. Tulokset esitetään keskiarvona ± 6 SEM vähintään kolmen erillisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, propofoli /siRNA esikäsittely vs. β-kierros vain; # P 0,05, # # P 0,01, ### P 0,001, NAC ja propofoli /siRNA esikäsittely vs. propofoli /siRNA vain; $ $ P 0,01, $ $ $ P 0,001, katalaasi ja propofoli /siRNA esikäsittely vs. propofoli /siRNA vain ).

UGT1A toiminta aiheuttaa resistanssi β-kierroksen aiheuttama apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa

Solun apoptoottisen kuoleman arvioitiin TUNEL värjäys määrityksessä edelleen tutkia roolia UGT vuonna β- lap n syöpälääkkeen tehoa. Paksusuolen syövän soluja esikäsiteltiin propofolianestesian UGT1A siRNA estää UGT1A9- aktiivisuutta ja altistetaan sitten 5 uM β-kierroksen 24 tuntia. Tiedot osoittivat, että β-kierroksen indusoi merkittävän apoptoosin HCT116-soluissa, jotka voitaisiin kumota NAC tai katalaasin mutta ei propofolia esikäsittely (Kuva. 5A). Kuitenkin HT29, β-kierroksen aiheuttama apoptoottista kuolemaa oli tuskin havaittiin 24 tunnin kuluttua altistuksesta. HT29 esikäsitelty propofolianestesian UGT1A siRNA ja sitten p-kierros osoitti merkittävää apoptoottista solukuolemaa (kuvio. 5B, kuvio. 5C). Yhdistelmä esikäsittely NAC tai katalaasin kanssa propofolianestesian UGT1A siRNA pitkälti peruutettu apoptoottisen vaikutuksen β-kierroksen yhdessä propofolin esikäsittelyyn tai UGT1A siRNA transfektoimalla HT29 (Fig. 5B, kuvio. 5C), mikä viittaa siihen, määräävä asema UGT vuonna β- lap indusoi apoptoottisen kuoleman.

Soluja esikäsiteltiin propofolia (100 uM) ja 1 h tai UGT1A siRNA: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin p-kierros (5 uM) 24 tunnin ajan ja kerättiin. Apoptoosia arvioitiin TUNEL määrityksessä. (A) Solujen apoptoosin HCT116-soluissa propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (B) Cell apoptoosin HT29 propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (C) Cell apoptoosin HT29 siRNA /NAC /katalaasia esikäsittelyä. Tulokset esitetään keskiarvona ± 3 SEM vähintään kolmen erillisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, β-kierros hoito vs. kontrolli solut; # P 0,05, NAC esikäsittely vs. vastaava β-kierros vain; $ P 0,05, katalaasi esikäsittely vs. vastaava β-kierroksen vain).

UGT1A tukahduttaa β-kierroksen aktivoitujen FOXO1 apoptoottista väylän koolonkarsinoomasoluissa

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että SIRT1-FOXO1 apoptoottista reitin osallistuu β-kierroksen aiheuttama apoptoottisen solukuoleman. β-kierros aiheuttaa NAD

+ ehtyminen, vähentää aktiivisuutta NAD

+ – deasetylaasin silent mating tyypin tiedot asetuksella 2-homologin 1 (SIRT1), mikä vähentää deasetyloiminen Forkhead laatikko O 1 (FOXO1) ja lisääntynyt kertyminen asetyloitu-FOXO1 (Ac-FOXO1) ja siten parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta useita loppupään apoptoottisia tavoitteita. Validoida onko tämän reitin on mukana UGT1A-tukahdutettu apoptoottista vaikutusta β-kierros, tutkimme aktivointi SIRT1-FOXO1 koulutusjakson jälkeen β-kierros altistuksen kanssa tai ilman propofolianestesian UGT1A siRNA esikäsittelyä. Mukaan reaaliaikainen PCR ja western blot analyysit tuloksia, ilmaus SIRT1 suuresti estyy samalla FOXO1, Ac-FOXO1 sekä sen loppupään apoptoottisia kohdeproteiinit (BIM, FasL, TRAIL, ja Bcl-6) olivat kaikki sääteli jälkeen β-kierroksen altistuminen HCT116-soluissa (kuvio. 6A); tämä vaikutus voitaisiin pitkälti revesed NAC tai katalaasin esikäsittely mutta ei propofolia (Fig. 6A). Sen sijaan HT29, β-kierros ei yksin vähentää SIRT1 ilmaisua ja herättävät FOXO1 johtuu nopeasti poistamista β-kierros. Kuitenkin samanlaisia ​​tuloksia kuin havaitut HCT116-soluja löydettiin HT29 esikäsitelty propofolianestesian UGT1A siRNA, joka oli myös torjuttiin NAC tai katalaasin (Fig. 6B, Fig. 6C).

Soluja esikäsiteltiin propofoli (100 uM) ja 1 h tai UGT1A siRNA: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin p-kierros (5 uM) 24 tunnin ajan ja kerättiin. Solujen mRNA-tasot arvioitiin PCR: llä ja proteiini tasoilla western blot määrityksiä. (A) Suhteellinen mRNA ja proteiini tasot HCT116-soluissa propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (B) Suhteellinen mRNA ja proteiini tasot HT29 propofolia /NAC /katalaasia esikäsittely; (C) Suhteellinen mRNA ja proteiini tasot HT29 siRNA /NAC /katalaasia esikäsittelyä. Tulokset esitetään keskiarvona ± 3 SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, propofolin esikäsittely vs. kontrolli soluja, tai UGT1A siRNA esikäsittely vs. salattu siRNA esikäsittelyä; # P 0,05, ### P 0,001, NAC esikäsittely vs. vastaava β-kierros vain, $ P 0,05, $ $ P 0,01, katalaasi esikäsittely vs. vastaava β-kierroksen vain).

keskustelu

β-lapatsoni (β-kierros) on lupaava syöpälääke, jonka vaikutusmekanismi erittäin riippuvainen entsyymi NQO1, flavoproteiinista löytyy yli-ilmennetään erilaisissa syöpäsoluissa [10,28,29] . Aiemmat tutkimukset meidän lab osoitti, että UGT1A9 ja UGT2B7 ovat tärkeimmät kaksi UGT-isoformit, jotka katalysoivat aineenvaihdunnassa β-kierroksen ihmisen maksan ja suoliston S9 inkubaatiot [22]. Vaikka useat raportit ovat antaneet näyttöä glucosylsulfate konjugaatti aineenvaihduntatuote β-kierros, glukuronidaatio on sen hallitseva aineenvaihdunta kuvio. Koska UGT välityksellä glukuronidaatioreitin tilejä monilääkeresistenssin syövän hoidossa [30-32], arvioimme mahdollinen rooli UGT välitteistä solujen aineenvaihduntaa β-kierros määritettäessä sen syöpälääkkeen vaikutuksia ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Pari solulinjat valittiin tutkimuksessamme, yksi korkea UGT1A (HT29) ja toinen ilman UGT1A ilme (HCT116), joka oli mukana myös retkillä on UGT [23,33,34]. Glukuronidaatiometaboliitti M2, mutta ei M1, ja β-kierros havaittiin HT29 ja S9 jakeet, samanlainen kuin ihmisen suoliston S9 tutkimuksessa [22]. Tämä voidaan järkevästi selittää alhainen ilmentyminen UGT2B7 ihmisen ruoansulatuskanavassa [7]. UGT1A9 tyypillinen estäjä propofolianestesian UGT1A siRNA osoittivat voimakas estävä vaikutus M2 muodostumiseen, mikä osoittaa UGT1A9 on tärkein isomuodon β-kierros glukuronoitumalla HT29. Verrattuna HT29 puute UGT1A9 vuonna HCT116-soluissa johtaa merkittävään suurempi AUC-arvo β-kierros ja huomaamaton M2. Joko propofolianestesian UGT1A siRNA esikäsittely huomattavasti tehostettua kertymiseen solun β-kierroksen tukemana aiempaa suurempi C

max ja AUC-arvot. On syytä mainita, että solunsisäiset M2 tasot laskivat aikana kurssin kun taas viljelyväliaineessa kasvanut jatkuvasti, mikä osoittaa poistamista β-kierroksen aineenvaihduntatuotteen soluista solunulkoiseen.

Kuten kuvattu yksityiskohtaisesti edellisessä työ, β-kierros aineenvaihdunnan käsittää kaksi vaihetta [22]. Ensimmäinen askel on kahden elektronin pelkistys tuottaa katekoliryhmiä väli, edistää kahden elektronin kinoni vähentäminen entsyymin NQO1. Tämä prosessi voidaan kääntää automaattisesti on ei-entsymaattisesta tilassa, jotka tuottavat suuren määrän ROS [22,24]. In UGT-positiivisia soluja, katekoli väli altistetaan välittömästi glukuronidaation, mikä rikkoi redoksijaksossa suuntaamalla tuotantoa vakaa β-kierroksen glukuronidia [22]. Siksi UGT1A paitsi määrittää intrasellulaarista kertymistä β-kierros, mutta vielä tärkeämpää voi häiritä NQO1 laukaisema redoksijaksossa että on hallitseva mekanismi β-kierroksen herättämään sen antituumoriteholla. Tämä seikka viittaa siihen, että ekspression UGT1A syöpäsoluissa voi olla tärkeä mekanismi taustalla ominaisvastus β-kierros. Tämän hypoteesin testaamiseksi, tutkimme potentiaalista vaikutusta UGT1A in β-lap aiheuttama ROS tuotanto, sytotoksisuus, apoptoosin ja apoptoottisten signaalitransduktion. Kuten oletettu, β-kierros käynnistyy merkittävä ROS tuotanto, solu redox homeostaasin häiriön, ja voimakas sytotoksisuus pitoisuus on hyvin pieni ja lyhyt aika altistumisen HCT116-soluissa. Sen sijaan, ROS ja tuloksena sytotoksisuuden HT29 havaittiin ainoastaan ​​propofolin läsnäolon tai UGT1A siRNA, joka tarjoaa vahvoja todisteita siitä, että UGT1A on tärkeä tekijä in sytotoksista vaikutusta β-kierros.

Seuraava olemme laajentaneet tutkimuksen määrittää mahdollisen vaikutuksen UGT1A häiritsemään apoptoottista solukuolemareittiin aktivoidaan β-kierros. Useita tiloja ja mekanismit β-kierroksen solukuolema kuten apoptoosin, ohjelmoitu kuolion, ja autophage on raportoitu [10,35,36]. Täällä, huomasimme, että β-kierroksen lähinnä aiheuttama tyypillinen apoptoottista kuolemaa ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa. Sirtuin, konservoitunut perheen NAD

+ – riippuvaista deasetylaaseja ja mono-ADP-ribosyltransferases, on havaittu mukana erilaisissa solun prosesseissa, kuten geenien, DNA korjaus, elinikä laajennus ja solujen apoptoosin [37-39]. β-kierros indusoiman apoptoottisen solukuoleman on ominaista dramaattinen NAD

+ vähenemistä ja vähentää SIRT1 toimintaa, mikä johtaa yhä kertymistä asetyloitu-FOXO1 ja sen jälkeen transkription aktivaation sen alavirran apoptoottisten kohdegeenien HCT116-soluissa. Sen sijaan, että toiminto on tyypillinen apoptoottisen reitin in HT29 havaittiin vain propofolilla tai UGT1A siRNA esikäsittelyä. Arvonalentuminen β-kierroksen kykyä aktivoida SIRT1-FOXO1 apoptoottista väylän HT29 johtuen glukuronidaatiota vihjeitä siitä UGT voimakasta ilmentymistä syöpäsoluissa voi vaikuttaa vastauksia moniin lääkeaineet. Lisäksi sekä NAC ja katalaasi hoito pitkälti esti aktivoinnin tämän apoptoottisen solukuoleman signaalia, mikä viittaa siihen, että ROS tuotanto NQO1 laukaisema redoksijaksossa voi olla tärkeä rento tekijä apoptoottisen vaikutuksen β-kierros ja että UGT1A voivat aiheuttaa luontainen resistenssi kautta kääntämiseksi redoksijaksossa.

Yhteenvetona osoitimme, että UGT1A on tärkeä rooli solunsisäisessä keskittymisen ja tuloksena apoptoottista vaikutusta β-kierros koolonkarsinoomasoluissa. Puute UGT toiminnan nostaa esiin mahdollisuuden jatkuvaan redoksijaksossa of β-kierros, jossa liiallinen ROS tuotetaan ja lopulta johtaa apoptoottisen solukuoleman. Päinvastoin, korkea UGT1A toimintaa, erityisesti UGT1A9, voidaan katkaista ja edistää β-kierroksen aineenvaihduntaan poistamista. Tämä tutkimus yhdessä edellisessä työssä vihje, että syöpälääkkeen vaikutuksia NQO1 kohdentamisaineita pitkälti liittyy tasapaino ilmaisun ja toimintaa NQO1 ja UGT1A. Erityisesti tuumorikudokset ovat tavallisesti paljon suurempi NQO1 [40,41], mutta pienempi UGT [5,42] kuin normaaleissa kudoksissa. Tämä ominaisuus antaa β-kierroksen sekä muita NQO1 kohdentamisaineita kuten tanshinone IIA [7,24] ominaisuus erittäin selektiivisesti tappaa syöpäsoluja ja säästävät normaaleissa kudoksissa. Yhdessä edellisessä tutkimuksessa tanshinone II A, nykyinen työ β-kierroksen korostaa entisestään, että UGT lääkkeitä aineenvaihdunta voi edustaa keskeinen mekanismi aiheuttaa luontainen chemoresistance of NQO1 kohdentamisaineita jotka ovat yleensä UGT ”alustoille.