Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli osoittaa anti-ihosyöpä ja chemopreventive potentiaali 1,1-bis (3′-indolyyli) -1- (p kloorifenyyli metaani) (DIM-D) käyttämällä in vitro -mallia.

Methods

in vitro sytotoksisuuteen ja elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin A431 ihmisen epidermoidikarsinooma solulinjassa ja normaalin ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (NHEK) vastaavasti kristalliviolettivärjäys- värjäystä. Apoptoosin induktion A431-soluissa (DIM-D käsitelty) ja NHEK soluja esikäsitellään DIM-D (2 h) ennen UVB säteilytystä, arvioitiin. Kertyminen reaktiivisen hapen (ROS) DIM-D esikäsitellyt NHEK-solut (2 h) ennen UVB altistuminen määritettiin myös. Immunosytokemia ja western blot analyysi suoritettiin määrittämään lohkaistun kaspaasi 3 ja DNA-vaurioita merkkiaineiden DIM-D käsiteltyjen A431-soluissa ja DIM-D esikäsitellyt NHEK soluja ennen UVB säteilytystä.

Tulokset

IC 50-arvot DIM-D olivat 68,7 ± 7,3, 48,3 ± 10,1 ja 11,5 ± 3,1 uM kun taas epigallokatekiinigallaatti (EGCG) oli 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 ja 56,7 ± 3,1 uM 24, 48 ja 72 tunnin hoitoja vastaavasti. DIM-D osoitti merkitsevästi (p 0,05) suurempi induktio DNA pirstoutuminen A431-soluissa verrattuna EGCG kanssa prosenttiin solukuoleman 38,9. Lisäksi DIM-D alulle korkeammat ilmentymistä A431-soluissa verrattuna EGCG katkaistun kaspaasi 3 (3,0-kertainen vs. 2,4-kertainen muutokset), Nurr1 (2,7-kertainen vs. 1,7-kertaiseksi muutoksia) ja NFKB (1,3-kertainen vs . 1,1-kertaisesti muutoksia). DIM-D myös näytteillä chemopreventive aktiivisuutta UVB-säteilytettyjä NHEK solujen merkitsevästi (p 0,05) vähentää UVB aiheuttamaa ROS muodostumista ja apoptoosin verrattuna EGCG. Lisäksi DIM-D indusoima Nurr1 mutta vähensi ilmentymistä 8-OHdG-pitoisuuksiin merkittävästi UVB-säteilytettyjä NHEK solujen verrattuna EGCG ja UV vain.

Johtopäätös

Tuloksemme viittaavat siihen, että DIM-D osoittaa Nurr1 riippuvainen transaktivaatiota apoptoosin A431-soluissa, ja se suojaa NHEK-solut UVB-indusoidun ROS muodostumisen ja DNA-vaurioita.

Citation: Boakye CHA, Doddapaneni R, Shah PP, Patel AR, Godugu C , Turvallinen S, et al. (2013) kemopreventioon ihosyövän kanssa 1,1-bis (3′-indolyyli) -1 (aromaattinen) Metaani Analog kautta induktio on Orphan tumareseptori, NR4A2 (Nurr1). PLoS ONE 8 (8): e69519. doi: 10,1371 /journal.pone.0069519

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 toukokuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 07 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Boakye et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Center Minority terveys- ja terveys, eroavat avustuksen P20 MD 006738-01 ja SC-1 avustusta 5SC1CA161676-03 National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihosyöpä esiintyvyys on lisääntynyt ja yli 2 miljoonaa uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain Yhdysvalloissa [1]. On arvioitu, että yksi viidestä valkoihoinen amerikkalaiset kehittää ihosyöpä vähintään kerran aikana hänen /hänen elinaikanaan [2]. Melanooma on vakavin muoto ihosyövän ja osuus 5% kaikista ihosyövän tapauksissa Amerikassa, vastaa suurimmasta ihosyöpä kuolemia [3], [4], jotka vaikuttavat arviolta $ 2,36 miljardia euroa vuonna 2010 [5]. Lisääntyvä ihosyövän odotetaan jatkuvan väestön ikääntyessä, suurempia määriä UV-säteilyn saavuttavat maanpinnan ehtymisen vuoksi otsonikerroksen, ja jatkuva käyttö aurinkoa laitteista [6], [7], [ ,,,0],8].

Tutkimukset ovat osoittaneet, että jatkuva altistuminen auringonvalolle on tärkeä riskitekijä kehittää sekä nonmelanoma ihosyöpä (NMSC) ja melanooma vuoksi vahingollisten vaikutusten UVB joka rikkoo epidermaalinen kerros ihoa [ ,,,0],9], [10]. Aloittaminen ja eteneminen ihon syövän synnyn liittyy mutkikkaan sarjan solu- ja molekyylitason tapahtumia johtuvat alkuperäisestä reaktiivisten happiradikaalien (ROS) UVB-säteilystä [11], [12], [13] ja tulokset keratinosyyttien DNA-vaurioita ja mutaatio mukaan lukien muodostuminen syklobutaani tymiinidimeeri (CPD). Tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa myös huomattavaa vahinkoa aiheuttanut ihoa lipidien ja proteiinien päälle UVB altistuminen [14], [15].

Monet phytochemicals ja synteettiset analogit on kyky kääntää ja /tai vähentää puhkeamista ja etenemisen ihon syövän synnyn ja angiogeneesissä [16], [17]. Nämä phytochemicals ovat pääasiassa polyfenolit, jotka sisältävät, mutta eivät rajoitu silymarin, epigallokatekiini 3-gallaatti (EGCG), kurkumiini, myrisetiini, kversetiini ja hesperitin. EGCG on runsas polyphenol läsnä vihreän teen uutetta ja on voimakas antioksidantti flavonoidi joka on chemopreventive potentiaalia [18]. EGCG voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin hepatoomasolut indusoimalla p53 ja Fas /FasL apoptoottista reitin vastaavasti [19]. Sytotoksisuus egcg in vitro edellyttää suhteellisen suuria pitoisuuksia [20], jotka eivät ole helposti saavutettu seerumissa ja sekä suun kautta että paikallisesti valmisteet EGCG minimaaliset suojaa photoaging ja UV-induced tulehdusreaktioita iholla [21], [22] , [23].

3,3′-di-indolyylimetaani (DIM) (Fig. S1) on luonnontuote johdettu indoli-3-carbinol (I3C), joka on läsnä cruciferous vihannekset, kuten ruusukaali, parsakaali ja kukkakaali. DIM on herättänyt paljon kiinnostusta syöpätutkimuksessa, koska sen alhaisen toksisuuden ja sytotoksisia vaikutuksia syöpäsolujen in vitro ja tuumorin kasvua in vivo [24]. Esimerkiksi, DIM indusoima solusyklin estäjät, kuten p21 ja p27, ja vaimentua-sykliini-proteiineja, mukaan lukien sykliini-D1 ja myös vähentynyt ilmentyminen selviytymisen ja antiapoptoottisten proteiinien, mukaan lukien surviviini, bcl-2, Bax ja indusoitu poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkoutuminen ( PARP) pilkkominen, mitokondrion sytokromi c release ja prokaspaasi pilkkominen [25], [26], [27]. Sarja uusi synteettinen 1,1-bis (3′-indolyyli) -1- (p-substituoitu fenyyli) metaani analogeja (C-himmenee), ovat myös tehokkaita syövän vastaisia ​​aineita [25], [28], [29] ja niiden toiminta ovat rakenteeltaan riippuvia. P-t-butyylifenyyli ja p-bifenyylijohdannaisia ​​aktivoida peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (PPARy), kun taas substituoimaton p-fenyyli ja p-metoksifenyyli-analogit aktivoivat orporeseptorille NR4A1 (Nurr77 /TR3) [30]. Tutkimukset laboratoriossamme ovat raportoineet synergistisen vaikutuksen välillä 1,1-bis (3′-indolyyli) -1- (p-bifenyyli) metaani (DIM-C-pPhC6H5) ja Dosetakselia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut tehostetun induktion katkaistun PARP, Bax ja N-kadheriinin ja eston fosfo-Akt, sykliini D1 surviviiniperäiset, NF-kB, Mcl-1 ja fosfo JNK2 [29], [31].

jäsen hermo kasvutekijä IB Nurr1 (NR4A2) on toinen NR4a reseptori, joka on liitetty, eri hormonaalista, fysiologisia ja patofysiologisia prosesseja mukaan lukien sydän- ja verisuoni-, neurologiset ja metaboliset sairaudet, tulehdus ja kasvaimen synnyssä. Nurr1 on rooli aivojen toimintaa ja näin ollen on yhdistetty Alzheimerin taudin, skitsofrenian ja Parkinsonin taudin [32]. Nurr1 ilmentyy vahvasti Panc1 ja Pan28 haiman ja jotkut ihmisen virtsarakon syövän solulinjat [28], [33]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, merkitys Nurr1 on chemopreventive potentiaalin 1,1-bis (3′-indolyyli) -1- (p-kloorifenyyli metaani) (DIM-D) ihosyöpää käyttämällä in vitro UVB aiheuttamaa ihon syöpä malli. DIM-D on osoitettu indusoivan Nurr1 riippuvaa transaktivaatiota ja tuloksista Tutkimuksemme osoittavat mahdollista roolia DIM-D /Nurr1 in kemopreventatiivisesti ihosyövän.

Materiaalit ja menetelmät

1. Materiaalit

p-substituoidut C-DIM analogit (DIM-C-pPhCl, DIM-D), (DIM-C-pPhCN, DIM-B) ja (DIM-C-pPhBr, DIM-C) olivat syntetisoitiin, kuten on kuvattu [36]. EGCG ostettiin Selleck Chemicals (Houston, TX, USA). A431 ihmisen epidermoidikarsinooma solulinja ja normaaleihin ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (NHEK) hankittiin yhtiöltä Invitrogen (Grand Island, NY, USA). Fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) hankittiin Invitrogen. NR4A2 (Nurr 1) vasta-aine, saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet suunnattu 8-hydroksi deguanosine (8-OHdG-pitoisuuksiin), CCAAT /-enhancer- sitovan proteiinin homologista proteiinia (CHOP), tumatekijä kappa-kevytketjun-tehostajana aktivoitujen B-solujen (NF-KB) ja lohkaistaan ​​kaspaasi 3 oli myös saatu Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

2. Solulinjojen ja soluviljelmissä

A431-solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ravinneseosta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) Invitrogen (Grand Island, NY ) ja antibiootti-antimykootin seosta, joka käsittää penisilliiniä (5000 U /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml), neomysiiniä (0,2 mg /ml), Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 37 ° C: n läsnä ollessa 5% CO

2 ja 95% suhteellisessa kosteudessa. NHEK soluja ylläpidettiin Epilife väliaineessa (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ja pysyivät joko epidermikasvutekijällä täydentää (EDGS) tai ihmisen keratinosyyttien kasvun täydennysosa (HKGS) Invitrogen (Grand Island, NY) ja antibiootti-antimykoottiseosta käsittää penisilliini (5000 U /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml), neomysiiniä (0,2 mg /ml), Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 37 ° C: ssa. Molemmat solulinjat olivat osa viljeltiin kun noin 80-90% konfluentteja 0,25% trypsiini-EDTA (Invitrogen, Grand Island, NY). Soluja viljeltiin 1,12 cm

2 0,4 um huokosia polykarbonaattimembraanille teriä 12 mm x 12-transwell läpäisevä tukilevyt (Corning, NY).

3.

In vitro

Cell Sytotoksisuus ja Elinkykymääritykset

Cell sytotoksisuuden ja solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin A431 ja NHEK-soluissa käyttäen tavanomaista kristalliviolettia fluoresenssi. A431 ja NHEK-solut olivat molemmat siemennettiin 96-kuoppaisille levyille (10

4 solua /kuoppa) ja inkuboitiin yön yli 5% CO

2 37 ° C: ssa. A431-soluja käsiteltiin liuotinkontrolliryhmän (DMSO) ja eri konsentraatioita DIM-B, DIM-C ja DIM-D ja EGCG, vaikka NHEK solut altistettiin UVB (150 J /m

2) 2 h hoidon jälkeen ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tunnin kasvatusväliaineessa. A431 solut huumeiden ja median seosta inkuboitiin 24, 48 ja 72 tuntia. Elinkelpoiset solut kiinnitettiin glutaraldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kristallivioletti pesty; Jäännös liuotetaan kanssa natriumvetyfosfaattia ja absorbanssi mitattiin spektrofotometrillä aallonpituudella 462 nm. Elinkelpoisuuden NHEK-solut käsiteltiin C-himmentää tai egcg ilmaistiin prosentteina absorbanssista ohjaus soluja, jotka pidettiin 100% elinkelpoisia ja IC50-arvot määritettiin seuraavan kaavan mukaan, [(50- alin tapon) /(korkein tapon – alin kill) * (korkein conc. – alin conc.)] + alin väkevää.

4. TUNEL-määritys

A431-soluja käsiteltiin 34,4 uM DIM-D (50 prosenttia IC50-arvo), ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Sitten solut pestiin PBS-puskurilla ja kiinnitettiin 10%: ista formaldehydiä on mikroskooppisen puolin. ApoTag Red

In situ

Apoptosis havaitseminen Kit® (Millipore, Billerica, MA) käytettiin havaitsemiseen apoptoosin mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, kiinteä soluja inkuboitiin 20 ug /ml proteinaasi K -liuosta 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seurasi inkubointi tasapainotuspuskurilla 10 sekuntia. Solut pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin TdT entsyymiä 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan kosteutetussa kammiossa sisällyttäminen konjugoidun nukleotidin 3′-OH-päät DNA: sta. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin anti-digoksigeniini-konjugaattia (rodamiini vasta-aine) liuosta ja vastavärjättiin DAPI. Mikroskooppiset kuvia kiinteiden solujen kalvot visualisoitiin Olympus BX40 valomikroskoopilla varustettu tietokoneohjattu digitaalikamera (DP71, Olympus Center Valley, PA, USA). DNA: n fragmentoituminen on merkitty rodamiini positiivista värjäytymistä (punainen). Käsittelemättömät solut ylläpidettiin kontrollina.

5. Akridiiniorans- /etidiumbromidivärjäyksellä

morfologiset muutokset NHEK soluytimet altistuminen UVB määritettiin arvioida suojaavia vaikutuksia DIM-D ja EGCG alttiina soluissa. Solut ympättiin 96-kuoppalevylle (10

4 solua /kuoppa) ja käsiteltiin 2 tunnin ajan eri pitoisuuksilla liuoksia DIM-D ja EGCG DMSO ennen UVB säteilyaltistuksen annoksella 150 mJ 30 sekunnin ajan. Soluja inkuboitiin sitten kasvatusväliaineessa 24 tuntia ja värjäys suoritettiin akridiini oranssi /etidiumbromidia (AO /EB), kuten on kuvattu [34] ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla. Lyhyesti, ero ottoa nämä kaksi väriä käytettiin selvittämään solujen elinkelpoisuuden. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut pestiin PBS: llä (2X), ja värjättiin seosta akridiini oranssi ja etidiumbromidilla.

6. Määritys solunsisäisen reaktiivisen hapen (ROS) B

fluoresoiva väriaine, 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCF-DA) käytettiin arvioitaessa kertyminen ROS NHEK-soluissa sen jälkeen, kun UVB altistuksen. Solut ympättiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 0,05 x 10

6 solua /kuoppa, käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla DIM-D ja egcg DMSO: ssa 2 h, imettiin ohut PBS lisättiin, ja solut sitten altistettiin UVB-annosta 150 mJ 30 sekunnin ajan. Soluja inkuboitiin sitten 24 tunnin ajan elatusaineessa vain. DCF-DA-liuosta (10 uM) lisättiin soluille (0,05 x 10

6 /ml), ja seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan pimeässä. Solut pestiin PBS: llä (2X) ja fluoresenssin voimakkuus solujen määritettiin fluoresenssimikroskopialla.

7. Immunosytokemiallinen analyysi

Sekä A431 ja NHEK soluja käsiteltiin DIM-D ja EGCG (34,4 uM ja 210,0 uM) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin 10% formaldehydiä ja Cytospin osaksi mikroskooppisen dioja. Analyysi suoritettiin noudattaen protokollaa määritelty SignalStain

TM IHC Kit (Cell Signaling, Beverly, MA). Kiinnitetyt solut sammutettua vaihtelevilla alkoholin ja PBS: ää (3 x), inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi 3, Nurr1 ja 8-OHdG-pitoisuuksiin yli yön 4 ° C: ssa ja detektoitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Solut värjättiin Nova Red tahra ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Mikroskooppinen analyysi kiinteiden solujen toteutettiin Olympus BX40 valomikroskoopilla varustettu tietokoneohjattu digitaalikamera (DP71, Olympus Center Valley, PA, USA).

8. Western blot-analyysi

Proteiinit kerättiin sekä A431 ja NHEK-solut, kuten on kuvattu [33]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun 24 tunnin hoidon DIM-D (17,2 uM) ja EGCG (104,8 uM), soluja käsiteltiin RIPA-puskuria (50 nM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM natriumkloridia, 1,0% Igepal CA-630 ( NP-40), 0,5% natrium- deoxychlorate, ja 0,1% natriumdodekyylisulfaattia) proteaasi-inhibiittori (500 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Proteiinikonsentraatiot määritetään BCA-proteiinimääritysreagenssilla protokollan (PIERCE, Rockford, IL) ja standardi käyrä saatiin aikaan käyttäen naudan seerumin albumiinia, 50 ug supernatantin proteiini kontrolliryhmässä ja kaikki eri käsittely näytteet denaturoitiin keittämällä 100 ° C: ssa 5 minuuttia SDS-näytepuskurissa ja sittemmin elektroforeesi 10% SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille, blokattiin kuoritun maidon 5% tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa tween 20 (10 mM tris-HCI (pH 7,6 ), 150 mM NaCl, ja 0,5% Tween), ja tutkittiin vasta-aineiden Nurr1 (1:400), NFKB (1:500) ja pilkottiin kaspaasi 3 (1:1000) ja A431-solut. Proteiinit havaittiin HRP konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita käyttäen SuperSignal West Pico kemiluminesenssi-liuosta (Pierce, Rockford, IL). Kvantifiointi ja tulosten analysointi suoritettiin Image J ohjelmisto (v1.33u, NIH, USA). Tulokset ilmaistiin prosentteina suhteet proteiinin ilmentymisen p-aktiini (asetettu 100%).

9. Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D vähintään kolme toistoa ja vertailu useita ryhmiä perustettiin yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja kahden ryhmän välillä opiskelijan t-testillä analyysi. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

1. Syövän vastainen aktiivisuus DIM analogien

1,1 vaikutus DIM analogeja A431 ihon syöpäsoluja.

A431-soluja käsiteltiin kolmella eri DIM analogeja, jotka eroavat rakenteellisesti on p-fenyyli (kuva. S1). A431-soluja käsiteltiin DIM-B 24, 48 ja 72 tuntia ja IC50-arvot sytotoksisuuden olivat 56,8 ± 10,7, 30,8 ± 6,6 ja 7,2 ± 1,2 uM (kuvio. 1A). IC50-arvot DIM-C hoidon jälkeen 24, 48 ja 72 h olivat 78,3 ± 16, 50,2 ± 12,2 ja 7,2 ± 1,5 uM ja vastaavat IC50-arvot DIM-D olivat 68,7 ± 27,3, 48,3 ± 10.1and 11,5 ± 3,1 uM hoidon jälkeen 24, 48 ja 72 tuntia. Sen sijaan, IC50-arvot egcg hoidon jälkeen 24, 48 ja 72 h olivat 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 ja 56,7 ± 3,1 uM (Fig. 1 B), joka oli merkittävästi korkeampi kuin havaittu C-himmentää (taulukko 1) . Kaikki kolme DIM johdannaiset osoitti enemmän tehoa kuin EGCG juurikaan eroja niiden tehojen. DIM-D oli kuitenkin valittu jatkotutkimuksiin mallina huume, koska sillä oli enemmän valostabiilius kuin DIM-B ja DIM-C.

(A) Sytotoksisuus profiili (Plot% solukuoleman vs lääkkeen konsentraatio A ) 24 h, B) 48 h ja C) 72 tunnin ajan, missä, DIM-B = DIM-C-pPhCN, DIM-C = DIM-C-pPhBr ja DIM-D = DIM-C-pPhCl). Data edustaa keskiarvoa ± SD. (B) Sytotoksisuus profiilin (Plot% solukuoleman vs lääkkeen pitoisuus) A) 24 h, B) 48 h, C) 72 h varten EGCG A431-soluissa.

1.2 apoptoottista aktiivisuutta DIM-D vastaan ​​A431 soluja.

The effects of DIM-D apoptoosin A431 solut tutkittiin TUNEL menetelmällä käyttämällä virtaussytometria. A431-soluja käsiteltiin DIM-D (34,4 uM) 24 tunnin ajan merkittävästi solukuolema (38,9%) verrattuna DMSO-kontrollin (Fig. 2A). Tutkimme myös vaikutuksia DIM-D ja EGCG DNA pirstoutuminen A431-soluihin käyttäen TUNEL menetelmää mikroskooppianalyysilla (Fig. 2B). Kontrollisoluissa käsitelty PBS, minimaalinen DNA pirstoutuminen havaittiin taas DIM-D huomattavasti DNA pirstoutuminen osoituksena lisääntynyt punaisen fluoresenssin. Vastaavasti EGCG (104,8 pM) kasvoi myös DNA: n fragmentoituminen mutta suhteellisesti vähemmän verrattuna DIM-D (Fig. 2B).

(A) Detection apoptoottisten solujen TUNEL menetelmällä käyttäen virtaussytometrianalyysin. A431-solut värjättiin apoptoottisten solujen FITC TUNEL menetelmällä ennen ja jälkeen 24 tunnin hoidon. (I) Dot plot kuvaa FSC vs. SSC profiilia solujen käsittelyn jälkeen. (Ii) Dot juoni kuvaa profiilia FITC fluoresenssin funktiona FSC solujen käsittelyn jälkeen. Useimmat Tunel-värjättyä apoptoottiset solut ovat hieman pienempiä kuin unstained eläviä soluja. (Iii) Histogrammi kuvaa soluja ennen hoitoa portissa R1. Hyvin harvat apoptoottisia soluja havaitaan. (Iv) Histogrammi kuvaa solujen käsittelyn jälkeen DIM-D (DIM-C-pPhCl) portissa R1. Apoptoottisia soluja (kirkkaasti värjätty TUNEL) havaitaan. (B) Detection apoptoottisten solujen TUNEL-menetelmällä käyttäen mikroskooppista analyysiä. A431-solut värjättiin apoptoottisten solujen kanssa rodamiini TUNEL menetelmää 24 tunnin hoidon. Solut vastavärjättiin Hoechstin värillä (DAPI).

1.3 Vaikutus DIM-D apoptoottisia proteiineja ja Nurr1.

A431-soluja käsiteltiin 34,4 uM DIM-D ja 104,8 uM egcg 24 tuntia ja kokosolulysaateille analysoitiin western blot (kuvio. 3A). DIM-D merkittävästi indusoima pilkkoa (aktivoitu) kaspaasi-3 ja Nurr1 proteiineja ja samanlaiset tulokset havaittiin egcg. Kvantitointi nämä tulokset (Fig. 3B) osoitti, että DIM-D oli voimakkaampi että EGCG indusorina katkaistun kaspaasi-3 (3,0-kertainen vs. 2,4-kertainen) ja Nurr1 (2,7 kertainen vs. 1,7 kertainen), kun taas vaikutukset NFKB (p65) olivat vähäisiä (1,3 kertainen vs. 1,1-kertainen). Expression katkaistun kaspaasi-3 ja Nurr1 merkittävästi indusoi DIM-D ja EGCG (p 0,05). DIM-D (34,4 uM) ja EGCG (104,8 pM) indusoi myös CHOP ilmaisu kuten immunovärjäyksellä A431-solujen käsittelyn jälkeen 24 tuntia (Fig. 3C). Kvantitointi nämä tulokset osoittivat merkittävää kasvua CHOP positiivisesti värjäytyneiden solujen (79%) DIM-D käsiteltyjä soluja verrattuna 67% soluista, jotka värjäytyivät positiivisesti jälkeen egcg hoidon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että anti-ihon karsinogeenisuutta DIM-D on suurempi kuin EGCG samanlaisissa olosuhteissa.

(A) ilmentyminen pilkotun kaspaasi 3, Nurr1 ja NFKB verrattuna kontrolliryhmään β-aktiini in Dim -D ja EGCG käsiteltyjen A431-solujen western blot. Käsittelemättömiä soluja pidettiin kontrollina. (B) Western blot analyysi ilmaisun eri proteiinien lisääntynyt merkittävästi DIM-D käsitellyt solut. (C) ICC peroksidaasia värjäys A431-soluja käsiteltiin DIM-D ja egcg, vastaavasti pro-apoptoottisen proteiinin, CHOP. Ruskea värjäys pidettiin positiivinen tulos. Käsittelemättömiä soluja pidettiin kontrollina. Tiedot lasketaan kolmena kappaleena kokeita ja esitetään keskiarvona, ja virhepalkkeja viittaavat SD, * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna ohjaus.

2. Chemopreventive aktiivisuus DIM-D normaaleilla ihmisen orvaskeden keratinosyyttien (NHEK) solut

2.1 Sytotoksinen vaikutus DIM-D NHEK soluissa.

Jotta vaikutusten tutkiminen DIM-D vastaan ​​normaali ihosoluja, NHEK-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DIM-D (15-140 uM) 24 tunnin ajan, ja tulokset osoittivat, että DIM-D oli minimaalisen toksinen NHEK-solut (Fig. 4A). Vuoden suurin pitoisuus 140 uM, prosentuaalinen solukuolema oli 56,2 ± 1,3 ja pyritään IC50 pitoisuus (68,7 ± 7,3 uM) havaittiin A431-soluissa, NHEK solukuolemaa aleni 48,7 ± 2,1%. Siksi keskittyminen DIM-D 68,7 ± 7,3 uM käytettiin kaikille seuraaville tutkimuksiin. Toisaalta, altistuminen esikäsitelty NHEK-solut UV-säteilylle, vähensi solujen elinkykyä edelleen. Tämä ei kuitenkaan ollut merkittävää kasvaessa prosenttia solukuolemaan 67,5 ± 2,6 ja 65,9 ± 3,1 140 uM ja 68,7 uM (Fig. 4A).

(A) Viivadiagrammi sytotoksisuuden profiilin (Plot% solukuoleman vs lääkkeen pitoisuus) on NHEK käsiteltyjen solujen DIM-D (DIM-C-pPhCl) erilaisilla pitoisuuksilla ja ilman UVB-säteilyltä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. (B) reaktiivisten happiradikaalien (ROS) kanssa DIM-D ja EGCG hoitoa ennen UVB altistumista. Kukin arvo ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. (C) Hydroksyyliluku radikaaleja in vitro solusta-free järjestelmä käsittely DIM-D. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina kontrollista, jossa solu-free järjestelmä ei käsitelty DIM-D. (D) Apoptoosin määritys in NHEK soluissa käsitelty DIM-D (DIM-C-pPhCl) ja EGCG eri pitoisuuksilla.

2.2 Hapettumisenestoaineena potentiaali ja apoptoottista aktiivisuutta DIM-D NHEK soluissa .

antioksidanttinen vaikutus DIM-D ja suojaa UV-induced ROS tutkittiin myös NHEK soluissa käsitelty 34,4 uM DIM-D ja 209,6 uM EGCG 24 tunnin ajan. UVB aiheuttama ROS tasoilla NHEK soluissa esikäsitelty DIM-D vähenivät merkitsevästi verrattuna EGCG; tämä osoittaa, että DIM-D on tehokkaampi antioksidantti aktiivisuus kuin EGCG (Fig. 4B). Lisäksi kyky DIM-D kaivella hydroksyyli (OH) radikaalien soluvapaassa in vitro järjestelmässä käytettiin varmistamiseksi, että voimistunut antioksidantti potentiaali DIM-D verrattuna EGCG. Tulokset kuviossa 4C paljasti, että pitoisuuksina, jotka ovat 34,4 uM 280 uM, DIM-D pystyi sammuttaa noin 30%: sta 90% hydroksyyliradikaaleja.

Seuraavaksi apoptoottinen aktiivisuus analysoitiin NHEK-solut, jotka esikäsiteltiin EGCG (17,2 uM ja 68,7 uM) ja DIM-D (8,6 ja 34,4 uM) ennen UVB altistumista. Tehokasta vertailu EGCG ja DIM-D suhteen suojaa apoptoosin, IC 50 ja neljäsosa IC50 pitoisuudet DIM-D oli käytetty EGCG solujen esikäsittely taas puolet vastaavien pitoisuudet käytetään DIM-D esikäsittelyä. Akridiinioranssin /etidiumbromidilla kaksinkertainen värjäys hyödynnettiin apoptoottisen määritystä koska akridiinioranssin väriaine on kyky värjätä tumien elävien solujen vihreän taas etidiumbro väriaine, joka on interkalaatioaine tunkeutunut apoptoottisten tai nekroottisten solujen värjäämiseksi tumansa oranssi. Olemme osoittaneet, että soluissa, jotka oli käsitelty DIM-D, oli merkittävä väheneminen apoptoottisen solukuoleman (punainen värjäys) verrattuna soluihin, käsiteltiin EGCG (Fig. 4D). Ei apoptoottista solukuolemaa ei havaittu kontrolli-soluissa, jotka käsiteltiin joko PBS: ää tai pelkkää vehikkeliä. DIM-D-käsittely aiheutti merkittävää laskua apoptoosin UVB säteilytystä NHEK soluissa. Egcg oli kuitenkin vähäinen suojaa soluja apoptoosia vastaan. Solut esikäsiteltiin EGCG ennen UVB säteilytystä oli selvästi värjättiin punaiseksi etidiumbromidilla. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikka oli väheneminen solujen elinkelpoisuuden DIM-D + UV käsitellyissä soluissa verrattuna DIM-D ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja (kuten kuvassa. 4A); DIM-D-käsittely suhteellisen estää apoptoosin induktio UVB ja siten tehostaa solujen elinkelpoisuus merkittävämmin kuin EGCG.

2.3 Vaikutus DIM-D UVB aiheuttama-oksidatiivisen stressin.

edelleen tutkia, DIM-D estää UV-säteilyn aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja tulehdusta kautta tehostaminen Nurr1 UV-altistuneet ihosolut, tutkimme ilmaus Nurr1 ja 8-OHdG-pitoisuuksiin in NHEK soluissa (Kuva. 5). Jälkeen UVB säteilytyksen, soluja käsiteltiin DIM-D (34,4 uM) ja EGCG (209,6 uM) 24 tunnin ajan ja muodostuu 8-OHdG-pitoisuuksiin määritettiin immunovärjäyksellä (Fig. 5A). UVB merkittävästi lisääntynyt 8-OHdG-pitoisuuksiin, mutta molemmat DIM-D ja egcg vähensi UVB-indusoidun vasteen mikä vahvistaa antioksidantti molempien yhdisteiden. Niiden suhteellinen teho oli ilmeistä immunovärjäyksellä. Vain 3,6% soluja positiivisesti värjättiin DIM-D kohtelun kuin EGCG käsiteltyjen solujen (20% soluista).

(A) immunosytokemi- peroksidaasia värjäys Nurr1 ja 8-OHdG-pitoisuuksiin in NHEK käsitellyissä soluissa himmenevissä D ja EGCG. Läsnäolo ruskea tahra osoitti positiivista värjäytymistä ensisijaisen vasta-aineen. (B) (C) Western blot -analyysi ilmentymisen Nurr1 verrattuna kontrolliryhmään β-aktiini in Dim-D ja egcg käsiteltiin NHEK-solut. Käsittelemättömiä soluja pidettiin kontrollina. Tiedot lasketaan kolmena kappaleena kokeita ja esitetään keskiarvona ± SD, * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna ohjaus.

immunosytokemi- analyysi paljasti siitä, että Nurr1 ilme oli huomattavasti vahvempaa verrattuna EGCG ja UV vain (Kuva. 5A). Kvantitointi nämä tulokset osoittivat, että noin 83% soluista oli positiivisesti värjättiin Nurr1 DIM-D käsiteltyjä soluja verrattuna EGCG käsiteltyjen solujen (66%). Nämä tulokset osoittivat selvästi, että DIM-D oli voimakkaampi että EGCG koska indusoi Nurr1. Lisäksi nämä tulokset vahvistettiin Western blot -analyysillä. Tätä tarkoitusta varten NHEK soluja käsiteltiin DIM-D (34,4 uM) ja EGCG (209,6 uM) 24 tunnin ajan ja kokosolulysaateille analysoitiin (kuvio. 5B). NHEK-solut käsiteltiin DIM-D osoitti Nurr1 ekspressio lisääntyi merkitsevästi enemmän DIM-D käsitellyt solut (1,8-kertainen) verrattuna EGCG (1,4-kertainen) (Fig. 5C).

Keskustelu

Huono kliininen tulos nykyisen hoidon mahdollisuuksia on saanut tarvetta kehittää uusia terapeuttisia strategioita hoitoon ihosyöpä. On kiireesti tunnistaa molekyylikohteista käyttämällä ravinnon yhdisteitä, joilla on sekä terapeuttinen sekä kemiallinen estoaktiivisuus. Nurr1 on orpo tumareseptori ja alustavat raportit viittaavat siihen rooli Nurr1 nivelreuma- ja syöpä modulaatio apoptoosin. Lisäksi se on myös osoitettu, että DIM analogit aktivoi orpo tumareseptori Nurr1 ja estää virtsarakon syövän kasvua [28]. Kuitenkaan ole raportteja chemopreventive potentiaalia DIM-D aktivoida Nurr1 ihosyöpää. Siksi ensimmäisessä osassa Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet syövänvastainen tai terapeuttinen vaikutus DIM-D käyttäen A431 ihon syöpäsoluja. Toisessa osassa Tutkimuksemme selvitimme chemopreventive aktiivisuutta DIM-D kautta Nurr1 välitteistä signalointia käyttäen NHEK.

Ensimmäisessä osassa Tutkimuksessamme arvioimme sytotoksista vaikutusta DIM-D A431 ihosoluja. On tärkeää huomauttaa, että DIM-D osoitti sytotoksista vaikutusta näihin soluihin ja solumyrkkyvaikutuksessa oli suurempi kuin EGCG. Samanlainen egcg, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että DIM estää syöpäsolujen kasvua, jotka ovat peräisin kasvainten eturauhasen, rinnan, paksusuolen, kohdunkaula ja haiman [34]. Rooli apoptoosin tutkittiin edelleen määrittämällä ilmentymisen apoptoottisen proteiinin, kuten pilkotaan kaspaasi-3: n A431-soluissa. Western blot-analyysi osoitti merkittävää kasvua ekspression kaspaasi-3 seuraavat DIM-D-käsittely in A431-soluissa. Tutkimme myös DNA pirstoutumista A431-soluissa jälkeen DIM-D-käsittely, koska DNA: n fragmentoituminen on tunnusomaista apoptoosin, joka sitoutuu solut kuolevat. DNA: n fragmentoituminen on erittäin indusoitiin DIM-D verrattuna egcg, mikä vahvistaa, että apoptoosin on tärkeä reitti, joka liittyy syövän vastaista aktiivisuutta näitä yhdisteitä. Tämä oli hyvin korreloi aiempien tutkimus lisääminen syövän vastaista aktiivisuutta, jonka DIM yhdiste ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut [29]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että DIM-D aktivoi Endoplasmakalvosto stressiä haiman ja munasarjasyövän solujen [35], [36]. DIM-D indusoima Endoplasmakalvosto stressiproteiiniepitooppien GRP78 tehostetun ilmentymisen CHOP ja tämä oli liitetty kasvaimen kasvun inhibition [37]. Vastaavasti meidän immunosytokemiallista tutkimukset osoittivat, että DIM-D lisääntynyt ekspressio CHOP A431-soluissa hoidon jälkeen 24 tunnin ajan. Nämä tulokset osoittavat, että DIM-D kykenee sen syöpälääkkeen vaikutuksia kautta moniosaisia ​​molekyylikohteista liittyy solujen eloonjäämistä ja apoptoosin.

yli-ilmentyminen Nurr1 vähenee tulehduksen välittäjäaineita, scavenger-reseptorin ilmentymisen ja alentaa LDL kertyminen makrofageissa [38] , [39]. Tutkimuksessamme ilmentyminen katkaistun kaspaasi-3 lisättiin A431-soluihin sen jälkeen, kun DIM-D-käsittely.