Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tupakointi on vakiintunut riskitekijä ruokatorven syöpiä. Kyllä liittyvä proteiini 1 (YAP1), keskeinen transkriptiotekijän nisäkkään Hippo polku, on raportoitu olevan onkogeenisen tekijä moniin syöpiin. Tässä tutkimuksessa, löydämme nikotiinin antaminen voi indusoida tumaansiirtymiseen ja aktivointi YAP1 in ESCC. Johdonmukaisesti, havaitsimme tumaansiirtymiseen ja aktivointi YAP1 mukaan knockdovvn CHRNA3, joka on negatiivinen säätelijä nikotiinin signaloinnin keuhkoputken ja ruokatorven syöpäsoluja. Nikotiinin antoa tai CHRNA3 ehtyminen huomattavasti proliferaatio ja migraatio ruokatorven syöpäsoluja. Mielenkiintoista, huomaamme, että YAP1 fyysisesti vuorovaikutuksessa nAChr, ja nAChr-signalointi hajoaa YAP1 sen negatiivinen sääntelyn kompleksi koostuu kanssa α-kateniinin, β-kateniinin ja 14-3-3 sytoplasmassa, mikä säätelyä ja ydinvoiman translokaation YAP1. Tämä prosessi saattaa edellyttää PKC aktivointia, koska PKC spesifinen estäjä Enzastaurin voi estää nikotiinin aiheuttama YAP1 aktivointia. Lisäksi, huomaamme, nikotiinin signalointia myös estää vuorovaikutuksen YAP1 kanssa P63, joka edistää estävää vaikutusta nikotiinin apoptoosiin. Käyttämällä immunohistokemia analyysi havaitsimme säätelyä YAP1 vuonna merkittävä osa ruokatorven syöpään näytteitä. Tasaisen, olemme löytäneet Merkitsevä yhteys YAP1 säätelyä ja tupakointi kliinisen ruokatorven syöpään näytteitä. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että nikotiini aktivoitu nAChr signalointireitin mikä edelleen aktivoi YAP1 tärkeä rooli kehitettäessä ruokatorven syöpään, ja tämä mekanismi saattaa olla yleinen merkitys syövän synnyn tupakoinnin liittyviä syöpiä.

Citation: Zhao Y, Zhou W, Xue L, Zhang W, Zhan Q (2014) Nikotiini aktivoi YAP1 kautta nAChr välitteistä signalointia ruokatorven okasolusyöpä (ESCC). PLoS ONE 9 (3): e90836. doi: 10,1371 /journal.pone.0090836

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 06 helmikuu 2014; Julkaistu: 12 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on tukenut varat 973 National Key Fundamental Research Program of China (2009CB521801) ja National Natural Science Foundation of China (81021061). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tupakointi liittyy lisääntynyt riski sekä squamous-cell carcinoma ja adenokarsinooma ruokatorven [1] – [3]. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, nikotiinin ja sen johdannaiset, kuten NNN (N-nitrosonornicotine) ja NNK ((4-methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanoni) voi ohjata aktivoida nikotiiniasetyylikoliinireseptorien (nAChr) edistää kasvua ja angiogeneesiä ja estää lääkkeen aiheuttama apoptoosin syöpäsoluissa [4]. Nikotiiniasetyylikoliinireseptorien (nAChr), ovat perheen ligandin portin ionikanavia, jotka toimivat suuret säätelijöinä nikotiini- ja acetylcholinergic signaloinnin soluihin. a-nAChr ja β-nAChr ovat yleisimpiä nAChr. Epätasapainoiset ilmaisuja eri alatyyppejä nAChr solujen myötävaikuttaa patogeneesiin sairauksien, kuten syövän [4]. nAChr tiedetään myös säädellä soluadheesiota ja muuttoliikkeen kautta vuorovaikutusta rapsyn ja herparansulphate proteogly voi esimerkiksi agriini [5] – [7].

yli-ilmentyminen ja lisääntynyt ydinvoiman lokalisointi virtahepo koulutusjakson transkriptiotekijän YAP1have havaittu useita eri ihmisen syöpiä, mukaan lukien maksan, paksusuolen syöpien, munasarja- syöpiä, keuhkosyövässä, ja eturauhasen syövät [8]. Ja amplifikaatioita YAP1 geenilokuksen havaitaan kallonsisäinen ependymomas, suun okasolukarsinoomia, ja medulloblastoomien [8]. YAP1 ilmoitettiin olevan syövän ajo-geenin ihmisen hepatosellulaarinen karsinooma (HCC) ja rintasyövän 11q22 amplikonien [9], [10]. Lisäksi YAP1 määritettiin olevan itsenäistä ennustetekijöitä merkkiaine eloonjäämisaste maksasyövän ja ruokatorven okasolusyöpää [11], [12].

Dasgupta et al. raportoitu nikotiini voi aiheuttaa jopa sääntelyn XIAP ja surviviinin (BIRC5) Non-pienisoluinen keuhkosyöpä estämään indusoiman apoptoosin kemoterapeuttiset lääkkeet [13]. Ja nikotiini tiedetään indusoivan CTGF (sidekudoksen kasvutekijä) on ikenen fibroblastien ja säikeet soluja, jotka osaltaan patogeneesiin periodontal fibroosin [14]. Erityisesti, Surviviini ja CTGF ovat kaksi konservoitunutta alavirran geenien säätelee transkriptiotekijä YAP1 on Hippo reitin [8], [15]. Äskettäin, Yu et ai. raportoitu sääntely Hippo-YAP-reitin G-proteiiniin kytketty reseptori signalointi [15]. Ja β2-nAChR ilmoitettiin fyysisesti liittyvän G-proteiiniin, αG proteiini säädelty indusoija neuriittien ulos kasvun 1, ja G-proteiini-aktivoitujen K (+) kanava 1, mikä osoittaa mahdollisen yhteyden nAChr signalointi ja solujen G-proteiinin reittejä [ ,,,0],16]. Lisäksi YAP1 raportoitiin voimistuvan ruokatorven syöpien ja määritetään onkogeenin ruokatorven syöpä [11], [17]. Niinpä yritimme tutkia mahdollisen yhteyden nikotiinialtistus ja YAP1 aktivaation ruokatorven syöpään tässä tutkimuksessa.

Methods

kudosnäytteiden

ESCC kudosnäytteiden 83 potilailla, joilla on patologinen T3 vaiheessa ruokatorven okasolusyöpä kerättiin. Potilaat peräkkäin palvelukseen Kiinan Academy of Medical Sciences Cancer Hospital (Peking, Kiina). Tällä rekrytointi, suostumus saatiin kuhunkin aiheeseen. Suostumukset oli kirjallisesti, kutakin potilasta ilmoitettiin allekirjoittamaan suostumus käyttämällä kudosnäytteiden hankittu leikkaus tutkimustoiminnasta ennen näytteet otettiin. Me säilynyt suostumusta pöydän meidän lääketieteen tietokantaan, ja eettinen komitea /IRB of Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Sciences hyväksyi lupamenettelyssä ja tutkimus.

Soluviljely ja transfektio and Drug Administration

Ihmisen ESCC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa 5% CO2 ja kylläisellä kosteutta. Ruokatorven syöpä solulinjoja KYSE510, KYSE30 toimitti anteliaasti tri Yutaka Shimada (Kyoto University). Sillä lyhytaikaisissa transfektioissa plasmidin ja siRNA, soluja kasvatettiin 60 mm: n levyt 50-90% konfluenssiin ja transfektoitiin 200 p mol siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kolme Stealth siRNA suunnattu CHRNA3 suunniteltiin ja tilattiin Invitrogen, TureClone plasmidiin tGFP-CHRNA3 hankittiin Origene. Solut transfektoitiin tGFP-CHRNA3 plasmidi- tai CHRNA3 siRNA käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. Tuoretta alustaa lisättiin 6 tuntia transfektion jälkeen. Nikotiinin antoa, soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 80 nM nikotiinia 48 tuntia tai kauemmin. Sillä Enzastaurin antoa, Enzastaruin lisättiin väliaineeseen pitoisuuden 500 uM 48 tuntia.

Cell Growth Curve

kasvukäyrä mitattuna xCELLigence RTCA MP E-levy 96 hyvin, 3 × 10

3-soluja lisättiin kuhunkin kuoppaan mukaan protokollan xCELLigence System, solujen kasvunopeus tarkkailtiin 81 tuntia. Solun kasvukäyrät lukea MTT: llä, 100 ui soluviljelmää, joka sisälsi 3 x 10

3-soluja lisättiin 30 kuoppiin 96-kuoppaisella levyllä. 20 ui taanitiosulfonaatin reagenssia (Promega) lisättiin 6 kuoppiin aina 24 tunnin välein 5 päivää, minkä jälkeen 1 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, absorbanssi luettiin 490 nm: ssä mikrolevylukijassa.

TranswellTM Migration ja Invasion analyysit

Muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin Corningin 80 pm 24 kuopan siirtokuoppaan päällystetyillä 30% matrigeelin (300 ul /kuoppa, Falcon) . Yhteensä 1 x 10

5 solua 100 ul: ssa seerumia lisättiin ylempään kammioon laitteen, ja alempi kammio täytettiin 600 ui elatusainetta, jossa on 20% naudan sikiön seerumia. 6 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, ei-vaeltavat solut poistettiin ylemmältä pinnalta kalvon pumpulipuikolla. Suodattimet kiinnitettiin sitten metanolissa 10 min ajan, värjättiin Giemsa-liuoksella 1 tunti, ja laskettiin. Viisi sattumanvaraisesti mikroskooppikentäs- (x 100) laskettiin per kuoppa, ja keskimääräinen määritettiin.

Vasta-aineet ja Special reagenssit

Rabbit YAP1 vasta-aine, CHRNA3 vasta-aine hankittiin Proteintech Gourp (Chicago, IL 60612, USA), hiiren YAP (63,7), GAPDH-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas 75220U.SA), Phospho-YAP (Ser127) vasta-aine, ja β-kateniinin vasta-aine, β-aktiini-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA 01923), CHRNB4 vasta-aine, CHRNA5 vasta-aine ja 14-3-3-vasta-aine hankittiin Abgent. tGFP vasta-P63-vasta-tGFP leimattu CHRNA3 Tureclonevector ostettiin Origene (Peking, Kiina 101111), α-kateniinin vasta-aine hankittiin Lifetechnologies (Carlsbad, CA 92008). Rekombinantti GST leimattu YAP1 proteiini hankittiin Abnova (Taipei City Taiwan114). PKC estäjä Enzastaurin ostettiin Selleck Chemicals (München, Saksa 81829). Nikotiini oli ostettu Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO 63103).

immunofluoresenssimäärityksellä

KYSE510 solua siirrostettiin lasipeitinlevyille on 6-kuoppalevyllä 24-48 tuntia, solut kiinnitettiin metanolilla 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja pestiin PBS: llä. Inkubaation jälkeen liittyvät vasta-aineella 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, levyt pestiin ja incu1’bated FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä. Oltuaan pestiin PBS: llä, solut värjättiin DAPI ja tutkittiin laserilla-skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems Heiderg GmbH, Am Friedensplatz 3, Saksa).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA KYSE510 soluista uutettiin TRIzolia (Life Technologies (Carlsbad, CA 92008)). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen Superscript II-käänteistranskriptaasin (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (Takara) ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Kaikki näytteet normalisoitiin GAPDH.

-geeni PCR-alukepareja käytettiin tässä tutkimuksessa:

YAP1 (GGCGCTCTTCAACGCCGTCATGAAC /CCTGTCGGGAGTGGGATTT);

CTGF (CCAATGACAACGCCTCCTG /TGGTGCAGCCAGAAAGCTC) ;

Cyr61 (AGCCTCGCATCCTATACAACC /TTCTTTCACAAGGCGGCACTC);

EDN1 (TGTGTCTACTTCTGCCACCT /CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT);

PPP1ReB (GGACACGTTCTCCTTCGAC /AGATTTTAACTCAGCCCGGAT);

surviviinista (CCTGGCTCCTCTACTGTT /CTCTATTCTGTCTCCTCATCC);

GAPDH (GCTGAGAACGGGAAGCTTGT /GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT) B

Western-blottaus, immunosaostus, ja GST pull-down-määritykset

Western blot-analyysi suoritettiin seuraavasti. Solut kerättiin ja sentrifugoitiin korjuuseen. Soluja lysedon jäillä 40 min RIPA-puskurissa (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mMNaCl, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, ja 5 mM EDTA), joka sisälsi Complete Protease Inhibitor seos (Sigma). Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 12,000relative keskipakovoima 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Western blotting, 40 ug kokonais-proteiinia suspendoitiin näytepuskuriin. Immunosaostukseen, lysaatit inkuboitiin primaryantibody seurasi inkubointi proteiini A-agaroosi-helmiä (Invitrogen). Immuunikompleksien pestiin ja suspendedin näytepuskuria. In GST pull-down-määritys, glutationi-helmiä (Sigma), inkuboitiin Escherichia coli-ilmaistuna GST-YAP1or yksin GST: tä 4 tunnin ajan. Glutathionebeads pestiin sitten ja niitä inkuboitiin 4 tuntia lysaattien KYSE510 soluja. Pesun jälkeen proteiini kompleksit suspendoitiin näytepuskuriin. Kaikki proteiinia panostettiin kuhunkin wellof 15% SDS-PAGE. Geelit siirrettiin PVDF-kalvoille (Bio-Rad), blokattiin 5% maito /PBS: ää, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Seuraavat pesun ja inkuboinnin sekundaarisia vasta-aineita 5% maitoa, membraani pestiin ja positiiviset signaalit kehitettiin kemiluminesenssilla reagenssilla (Amersham). Membraani valotettiin lääketieteelliseen röntgenfilmille (Fuji Ltd., Tokio, Japani).

Virtaussytometrinen analyysi

tärkeää, apoptoottisten ja vaurioituneet solut erotettiin virtaussytometrialla. Kvantitatiiviseksi määrittämiseksi solujen prosenttiosuus apoptoosin suoritettiin käyttäen anneksiini V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus (Cliniscience S.A.) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 48 tuntia käsittelyn jälkeen nikotiini, 2 x 10

5-solut leimattiin fluoresoivalla havaitsemiseksi apoptoottisten ja nekroottisten solujen lisäämällä 195 ui anneksiini V: n sitoutumisen puskuria ja 5 ui anneksiini V-FITC kuhunkin näytteeseen. Näytteitä sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa pimeässä 3 min, 10 ui propidiumjodidia (PI; Sigma) lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Ennen sytometrinen analyysi, solususpensiota, johon on lisätty 300 ui anneksiini V-sitomispuskuria. Vähintään 10000 solujen sisällä aidatulla alueella hankittiin ja analysoitiin Cell Quest ohjelmisto.

immunohistokemiallinen värjäys ja arviointi

Kaikki kudokset fiksoitiin 4% neutraloitua formaldehydiä, parafinoitiin. Blocks parafinoidut luovuttajan kudoksesta otettiin näytteet käyttämällä Manuaalinen Tissue ryhmittäjällä 1 väline (Beecher Instruments, Silver Spring, MA, USA). Kaksi ydintä leikattiin kustakin luovutuslohkosta varten TMA lohkoja. Osiot (5 um) kudoksen array lohko leikattiin ja asetettiin polylysiinipohjaisilla pinnoitettu lasi dioja ja käsitellään IHC. Näytteistä käytettävissä seitsemän kudoksen array lohkot valmistettiin, joista jokainen sisältää 30 tapausta, joissa kasvain, normaali ja imusolmukkeesta kudoksia, jos käytettävissä. Kudos microarray liukuu poistettiin parafiini ksyleenillä ja kaltevuus etanolia. Antigeeni haku suoritettiin sijoittamalla levyt korkean paineen liesi on 0,01 mM sitraattipuskuria, pH 6,0, 2,5 min 100 ° C: ssa; ne jäähdytettiin sitten 20 minuuttia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla osio 3% H

2O

2 10 minuuttia, jonka jälkeen huuhdellaan PBS ratkaisu kolme kertaa. Leikkeitä inkuboitiin kaniinin anti-YAP1-vasta-aine (Proteintech) laimennoksena 1:50 4 ° C: ssa yön yli, Levyt inkuboitiin sitten 1 h sekundäärinen vasta-aine. EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) käytettiin visualisoimaan vasta-aineen sitoutuminen, ja dioja myöhemmin vastavärjät- hematoksyliinillä. PBS-vasta värjäys näytettä käytettiin tausta-ohjaus. Kudos array dioja skannattiin ja analysoitiin AperioScanScope CS. Perustuen Immunovärjäyksen intensiteetti, ruokatorven kudoksia jaettiin neljään luokkaan YAP1 negatiivinen (-), heikko positiivisuus YAP1 (+), mediaani positiivisuus YAP1 (+ +), vahva positiivisuus YAP1 (+ + +). Kaikki kokeet suoritettiin, ja toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot analysoitiin SPSS 11.5software. Väliset korrelaatiot alaryhmien värjäys ja tupakoinnin laskettiin Pearsonin χ2 testi.

Tulokset

Nikotiini edistää kasvua ja kulkeutumista ruokatorven syöpä

Nikotiini tiedetään olevan tärkeä riskitekijä ruokatorven syöpään. Edelliset raportit osoittavat, että nikotiini edistää solujen kasvua ja muuttoliike erityyppisissä ihmisen syövissä [4], [18]. Niinpä me testattiin ensin kasvua stimuloivia vaikutuksia nikotiinin ruokatorven syöpään KYSE510 solulinjan xCELLigence RTCA MP E-levy 96 hyvin ja totesi, että nikotiinin anto merkittävästi parannettu kasvuvauhti KYSE510 soluja (kuva 1 A). Lisäksi teimme siirtokuoppaan määritys tutkia vaikutuksia nikotiinin kulkeutumista KYSE510 solu- ja havaitaan myös merkittävää lisäystä muuttoa KYSE510 käsitelty solu nikotiinia (kuva 1 B).

. Nikotiini hallinto stimuloi ruokatorven syöpä KYSE510 soluun mitattiin E-Plateofx CELLigence RTCA MP-järjestelmän. B. Nikotiini hallinto lisäsi hyökkäyksen ja muuttoliike ruokatorven syöpään KYSE30 solujen Transvvell- määrityksissä. C. solunosasijaintia YAP1 tutkittiin konfokaalisella fluoresenssimikroskoopilla. Translokaatio YAP1 (vihreä) sytoplasmasta tumaan havaittiin sen jälkeen, kun nikotiinin annon KYSE510 soluissa 48 tuntia. D. KYSE510 soluja käsiteltiin nikotiinia 48 hs, vähentynyt fosforylaatio YAP1 ja lisääntynyt defosforyloitiin YAP1 havaittiin Western blot -analyysillä. E. Reaaliaikainen PCR tarkastaminen induktion mRNA geenien transkriptionaalisesti aktivoida YAP1 kun nikotiinin annon. F. PKC estäjä Enzastaurin tukossa nikotiinin aiheuttama upregualtion of YAP1 proteiinin tason ja johti vähentämiseen YAP proteiinin taso, erityisesti defosforyloitiin muodossa YAP1 Western blot.

Nikotiini aiheuttaa YAP1 tumaansiirtymiseen ja aktivointi

Up sääntelyä ja lisääntynyt ydinvoiman lokalisointi Hippo koulutusjakson transkriptiotekijän YAP1 raportoitiin olevan riippumaton markkeri elinajan ruokatorven syöpään [11]. Arvioida, onko nikotiinialtistus olisi johtanut siihen, että aktivointi YAP1. Olemme tutkineet solunosasijaintia YAP1 ruokatorven syöpään KYSE510 solu konfokaali immunofluoresenssilla mikroskooppia altistuksen jälkeen nikotiinia. Sen jälkeen, kun soluja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi nikotiinin pitoisuudella 80 nM: ssa 48 tuntia, havaitsimme lisääntynyt tumaansiirtymiseen ja YAP1, kuten ilmenee YAP1 kertyminen tumaan jälkeen solut käsiteltiin Nikotiini (kuvio 1 C). Koska tumaansiirtymiseen ja aktivointi YAP1 säätelee fosforylaatio YAP1 on S127 päällä [8], me sitten mitataan muutokset fosforylaation tason YAP1 ennen ja jälkeen nikotiinikorvaushoitoon. Kuten on esitetty kuviossa 1 D, vähentynyt fosforylaatio YAP1 ja lisääntynyt proteiinin taso defosforyloitiin YAP1 havaittiin sen jälkeen, kun nikotiinin annon. Olemme lisäksi tutkittiin mRNA ilmaisun CTGF, joka on YAP1 kohdennettua alavirtaan geenistä, ja totesi, että mRNA-tasot CTGF nostettiin nikotiinin annon. Emme kuitenkaan eivät havainneet merkittävää voimistumista YAP1 mRNA jälkeen nikotiinin annon (kuvio 1 E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että seuraavista nikotiinin annon YAP1 läpikäy tumaansiirtymiseen ja vuorostaan ​​kopiointia aktivoi alavirran geenien myös CTGF.

PKC on raportoitu vaaditaan nAChR aktivointiin muodostamalla automaattisen positiivista palautetta silmukka aktivointia ja nikotiiniasetyylikoliinireseptorien [19], [20]. On myös tunnistettu YAP1 kinaasi [21]. Näin käsittelimme solut PKC spesifinen estäjä Enzastaurin onko YAP1 aktivointi voidaan estää PKC esto. Havaitsimme, että Enzastaurin hoito oleellisesti estetty YAP1 aktivaation aiheuttama nikotiinia kuten dramaattinen lasku kokonaisproteiinia tason YAP1, erityisesti defosforyloitiin YAP1 (kuva 1 F). Tämä tulos viittaa siihen, että aktivaatio YAP1 aiheuttama nikotiinia välittyy PKC.

knockdovvn CHRNA3 indusoi myös YAP1 aktivointi

On osoitettu, että CHRNA5 (hermosolujen asetyylikoliinin reseptorin alayksikköä a-5) ja CHRNA3 (hermosolun asetyylikoliinin reseptorin alayksikköä alfa-3) negatiivisena säätelijöinä nikotiinin signaloinnin keuhkoputken syövän ja ruokatorven syöpä soluja [22]. Koska knockdovvn CHRNA3 ja CHRNA5 lisäsi proliferaatiota, migraatiota ja kalsiumin keuhkosyöpään solulinjoista, seurauksena kompensatorinen kokoaminen α7-nAChR on sytoplasman kalvo, joka oli korkeampi läpäisevyys kalsiumia vastauksena nikotiinia. Niinpä käytimme siRNA lähestymistapoja pudotus CHRNA3 in KSYE-510 solua ja sitten tutkittiin vaikutuksia CHRNA3 ehtymisen kasvuun ja kulkeutumista KYSE510 soluja, ja aktivointi YAP1 samoin. Havaitsimme kasvua kasvun ja muuttoliikkeen KYSE510 soluissa CHRNA3 Knockdown, joka on samanlainen kuin nähtävä nikotiinin annon jälkeen (kuvio 2 A, kuva 2 B). Johdonmukaisesti, laskua YAP1 fosforylaation etenkin sen S127 paikalla YAP1 osoitettiin Western blot (kuva 2 C). Konfokaalinen immunofluoresenssilla mikroskooppi myös havaittu tumaansiirtymiseen of YAP1 että KYSE510 soluissa CHRNA3 taintumisen (kuva 2 D). Lisäksi transkription induktio CTGF ja muut YAP1 alavirran geenien havaittiin myös soluissa vaimentaa CHRNA3 (kuvio 2 E).

. Solujen kasvu käyrä mitattiin MTT määritys osoitti siRNA välittämä knockdovvn CHRNA3 lisäsi kasvuvauhti KYSE510 soluja. B. TranswellTM määritys osoitti, että knockdovvn CHRNA3 nousi hyökkäyksen ja kulkeutumista KYSE30 soluja. C. Western blot-analyysi osoitti 3 Stealth siRNA konstrukteja tehokkaasti tippuu alas CHRNA3. Ehtyminen CHRNA3 vähensi fosforyloidun YAP1 ja lisääntynyt Defosforyloitujen YAP1, erityisesti vähentynyt S127 fosforylaation YAP1. D. tarkkailu YAP1 solunosasijaintia kanssa konfokaali fluoresenssimikroskopiaan seuraavat ehtyminen CHRNA3. Translokaatio YAP1 (vihreä) sytoplasmasta tumaan havaittiin sen jälkeen, kun siRNA-välitteisen knockdovvn CHRNA3 in KYSE510 soluissa 48 tuntia. E. Reaaliaikainen PCR osoitti, YAP1 suunnattu geenit aiheuttama CHRNA3 Knockdown sisään KYSE510 solussa.

fyysinen vuorovaikutus nAChr ja YAP1

Tutkimaan edelleen säätelevän roolin nAChr kanssa YAP1 teimme immuunisaostuskokeissa tutkia, nAChr fyysisesti vuorovaikutuksessa YAP1. Kuten kuviossa 3 on esitetty A selvästi vuorovaikutuksessa YAP1 ja CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 havaittu. Vuorovaikutus YAP1 ja CHRNA3 todennettiin eksogeenisesti transfektoitu tGFP-leimatun CHRNA3 in KYSE510 soluissa (kuva 3 B). Lisäksi teimme GST kaatamaan määrityksessä edelleen todentamiseksi vuorovaikutusta YAP1 ja CHRNA3 kanssa eksogeenisesti ilmaistu GST-leimattua YAP1 (Abnova). GST-pull down koe osoitti myös myönteisiä vuorovaikutus endogeenisen CHRNA3 ja GST-YAP1 (kuva 3 C). Seuraavaksi käytimme konfokaali immunofluoresenssilla mikroskoopilla tutkia rinnakkaispaikantumisen välillä CHRNA3 ja YAP1. Olemme havainneet, että sekä CHRNA3 ja YAP1 oli colocalized membraanin alueen ja sytoplasmassa KYSE510 soluja (kuvio 3 D). Yhdessä nämä havainnot viittaavat nAChr liittyä fysikaalisesti YAP1 ruokatorven syöpäsoluja. 14-3-3 on sidosparin YAP1 sytoplasmassa, myös havaittu positiivista vuorovaikutusta 14-3-3 ja CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 kanssa immunosaostuksella määritys KYSE510 solussa (kuvio 3 E).

A. Endogeeninen IP testi osoitti positiivista proteiini vuorovaikutukset YAP1 ja CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5 sisään KYSE510 soluissa. B. Positiivinen vuorovaikutus tGFP-CHRNA3 ja YAP1 havaittiin transfektoiduissa soluissa tGFP-CHRNA3. C. GST Vedä määritys osoitti myönteisen vuorovaikutuksen eksogeenisesti ilmaistu GST-YAP1 kanssa CHRNA3 in KYSE510 solussa. D. Konfokaaliset immunofluoresenssimikroskoopilla havaittu rinnakkaispaikantumisen of YAP1 ja CHRNA3 in KYSE510 solussa. KYSE510 solut ilmennettiin tilapäisesti tGFP merkitty CHRNA3 of TureClone vektorin (Origene). YAP1 leimattiin punaisella-FITC konjugoitua vuohen anti kaniinin IgG. Solujen tumat näkyviksi DAPI. E. endogeeninen IP havaittu positiivista vuorovaikutusta 14-3-3 ja CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5.

dissosiaatio negatiivisen säätelijöitä YAP1 tekijänä nikotiinikorvaushoitoon

transkriptionaalisen aktiivisuuden ja proteiini taso YAP1 tiedetään säätelee negatiivisesti 14-3-3: lla, α-kateniinin ja β-kateniinin [8], [23], [24]. Fosforyloituu YAP1 voi sitoutua p63, ja tällainen yhdistys lisää vakautta p63 ja edesauttaa p63 välittämää lääkkeen aiheuttamista apoptoosin [21]. Niinpä yritimme tutkia vaikutusta nikotiinin vuorovaikutuksesta YAP1 kanssa α-kateniinin, β-kateniinin, 14-3-3, ja p63. Kuten kuviossa 4, vuorovaikutusta YAP1 kanssa α-kateniinin, β-kateniinin, 14-3-3, ja p63 hajotettiin nikotiinin anto (kuvio 4 A), mikä on sopusoinnussa havaintomme, että nikotiini hoito lisäsi ydin- translokaatio ja aktivointi YAP1. Vähentynyt vuorovaikutus YAP1 kanssa 14-3-3, α-kateniinin, β-kateniinin johtaisi lisäystä kokonaisproteiinia tason YAP1. Tasaisen, olemme havainneet merkittävää lisäystä YAP1 proteiinin taso pitkäaikaisessa nikotiinikorvaushoitoon (kuva 4 B). Koska p63 on tärkeä säätelijä apoptoosin, ja muuttunut vuorovaikutus YAP1 ja p63 vaikeuttaisi apoptoottinen vasteita välittävät p63. Johdonmukaisesti, havaitsimme laski apoptoosin KYSE510 käsiteltyjen solujen nikotiinia (kuvio 5).

B. KYSE510 solut altistuvat nikotiinille yli 4 päivä johti säätelyä kokonaisproteiinia tason YAP1, mukaan lukien sekä fosforyloitu YAP1 ja defosforyloitiin YAP1 osoitetaan Western blot -analyysillä.

Nikotiini käsittely laski vanhempi apoptoottisten solut alemmassa oikeassa neljänneksessä.

immunohistokemia analyysi YAP1 kliinisissä näytteissä

on osoitettu, että ruokatorven syöpä potilailla, joiden säätelyä YAP1 oli huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on normaali ilmaus YAP1 [11]. Niinpä käytimme kliinisen ruokatorven syöpä näytteet tutkia korrelaatio ilmen- tymisen lisääntymisen ilmaus YAP1 ja tupakointi. Keräsimme ruokatorven syöpä näytteitä 83 potilaista T3 vaiheessa, mukaan lukien 29 tupakoimattomia ja 54 tupakoitsijoita. Teimme immunohistokemia kokeen analysoida ilmentymistason YAP1 että ruokatorven syöpä näytteet, ja totesi, että syöpäpotilaiden tupakointiin historia osoittivat korkeaa ilmaus YAP1 verrattuna savuttomia potilailla (

P

0,05) (kuvio 6 ja taulukko 1). Niinpä nämä -havaintojen yhtyä havaintomme että YAP1 aktivoitiin nikotiinin anto in vitro. Emme kuitenkaan eivät havainneet merkittävää eroa yleisen eloonjääneiden välillä YAP1-korkea ja YAP1-alhainen ryhmissä, mikä todennäköisesti johtuu näiden syövän näytteet olivat peräisin T3 vaiheessa ruokatorven syöpiä potilaalla.

Levyt skannataan AperioScanScope CS. Kudosnäytteet jaettu 4 luokkaan sen voimakkuudesta YAP1 värjäystä.

Keskustelu

Nikotiini on vakiintunut onkogeenisen tekijä patogeneesiin lukuisten syöpien, mukaan lukien ruokatorven syöpä [3], [4]. Ja nikotiini tiedetään edistävän syöpäsolujen lisääntymistä aktivaation kautta katekoliamiinin signalointiryöpyn [4], [25], [26]. Johdonmukaisesti havaitsimme lisääntynyt kasvu ruokatorven syöpäsolujen nikotiinikorvaushoitoon tai knockdovvn CHRNA3. Useat ryhmät ovat raportoineet, että nikotiinialtistus ja tupakointi voivat edistää hankkimista syövän kantasolujen kuten ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon suun syöpä, pään ja kaulan okasolusyöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä [27] – [30]. Mielenkiintoista on, että Nallet-Staubet ai. ovat osoittaneet, että YAP1 ja TAZ edistää invasiivisen ja metastaattisen kapasiteetti melanoomasolujen [31]. Ja Chen et ai. raportoitiin YAP1 tärkeänä välittäjänä TLR4 /Nanog onkogeeninen reitin ylläpitämisessä kasvaimen aloittamista kantasolujen kaltaisia ​​soluja (-lämpökameroissa) väestön poistaminen sytostaattinen TGF-β-signalointi HCC [32]. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa alussa havainto, että YAP1 homologia TAZ tarvitaan yllä itseuudistumiseen ja kasvaimen aloittaminen valmiuksia rintasyövän kantasoluja [33]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että nikotiini hallinto tai CHRNA3 ehtyminen johtavat lisääntymiseen solujen kasvun ja muuttoliike sekä aiheuttaa resistenssiä apoptoosin ruokatorven syöpäsoluissa.

G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptorien (GPCR: t) voidaan aktivoida tai estää Hippo-YAP reitin riippuen kytketyn G-proteiinit. Ja Lysofosfatidihappo (LPA) ja sfingosiini-1-fosfaatti (S1P) on raportoitu olevan alkupään agonisteja tässä signalointireitin aktivoida YAP1 /TAZ kautta säännellään lati kinaasitoiminta moduloimalla aktiinisytoskeletonin dynamiikka [15]. GPCR: t voivat aktivoida kalsium signalointiryöpyn kautta PLC /IP3R /PKC-reitin [34]. Ja kalsiumin signalointi tiedetään säätelevän aktiini dynamiikkaa ja solun liikkuvuus modulaation kautta alavirran Rho GTPaasi signalointireittejä [34], [35]. Täten nikotiini voi aktivoida YAP1 kautta nAChr välittämä kalsiumin. Mielenkiintoista, havaitsimme PKC spesifinen estäjä Enzastaurin onnistui torjunnassaan aktivoitumista YAP1 nikotiinin anto, joka on sopusoinnussa PKC: n roolia voimistavan kalsiumkanavien parantamiseksi kalsiumin [36].

Tässä tutkimuksessa määritimme välisten vuorovaikutusten nAChr ja YAP1, mikä osoittaa nAChr välittämä signalointi voi olla suora vaikutus YAP1 aktivointia, joka tukee lisäksi havaintojen CHRNA3 lokalisoituu YAP1. Lisäksi havaitsimme muuttunut fyysinen assosiaatiot YAP1 ja α-kateniinin /β-kateniinin /14-3-3 kun aktivoinnin YAP1 nikotiinin anto ruokatorven syöpäsolun. Aiemmin on raportoitu α-kateniinin ja β-kateniinin fyysisesti vuorovaikutuksessa YAP1 ja säätelee negatiivisesti YAP1 toimintaa ja sen hajoamistuotteet [23], [24]. Yhdistyksen välinen YAP1 ja α-kateniinin välittyy 14-3-3 ja että IQGAP1 on yksi korkean luottamuksen sidoskumppanien YAP1 [23]. Mielenkiintoista, 14-3-3 vuorovaikutuksessa nAChr ja kytkyitä nAChr erityisiin membraanidomeeneja kautta vuorovaikutuksessa usean alayksikön kompleksi, joka käsittää APC, EB1, IQGAP1 ja MACF, jotka on ankkuroitu mikrotubulusverkoston tukirankansa [37]. 14-3-3 edistää myös eteenpäin kuljetusta N-kadheriinin /β-kateniinin komplekseja ER [38]. Lisäksi β-kateniinin vuorovaikutuksessa rapsyn säännellä kasautumiseen nAChr lihassolujen [39]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme positiivista vuorovaikutusta 14-3-3 ja CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 sisään KYSE510 solussa. Nämä havainnot viittaavat siihen nAChr, 14-3-3, IQGAP1, α-kateniinin ja β-kateniinin voivat muodostaa tukirangan ankkuroitu negatiivinen asetus monimutkainen YAP1, ja 14-3-3 toimii yhteisen sitoutumisen sovitin monimutkainen. Tämä monimutkainen säätelee negatiivisesti YAP1 aktivointi- ja tumaansiirtymiseen ja lieka YAP1 on solun tukirangan sytoplasmassa. Näin ollen, nAChr säädellä aktivointi YAP1 kautta dissosiaation kompleksin vastauksena ylävirran signaalit.

Kiinnostavaa myös havaittu vähentynyt P63 yhdessä YAP1 nikotiinin annon, joka edistää p63 hajoamista ja estää apoptoosia.