Krooninen sairaus

tiivistelmä

arvioitiin potentiaalia tutkimuslääkkeen histoni metylaatio kumoavaa ainetta, 3-deazaneplanocin A (DZNep), parantaa kemosensitiivisyys haimasyövän nukleosidi- analogeja (so gemsitabiini). DZNep toi viivästynyttä mutta selektiivinen sytotoksisuus haimasyöpäsoluissa vaikuttamatta normaalin ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) soluja. Co-altistuminen DZNep ja gemsitabiinin aiheuttama sytotoksisia summautuvia tai synergia sekä hyvin ja huonosti eriytetty haiman solulinjoissa lisääntynyt apoptoosin. Sen sijaan DZNep kohdistuva vihamielisyys gemsitabiinihoito vastaan ​​HDPE solut vähennetään merkittävästi sytotoksisuus verrattuna gemsitabiinin-alone hoito. DZNep marginaalisesti riippui puriininukleosidia kuljettajat sen sytotoksisuus, mutta liikenteen riippuvuutta kierrettiin asyyli johdannaisten. Lääkeainealtistukseen tutkimukset paljastivat, että lyhyen pohjamaalauksesta DZNep seurasi gemsitabiinihoidon sijaan co-hoito molempien aineiden tuottamiseksi maksimaalinen Chemosensiti- vasteen sekä gemsitabiini-herkkä ja gemsitabiinin kestävä haiman syöpäsoluja. DZNep nopeasti ja palautuvasti laski trimethylation histoni H3 lysiinin 27 mutta kasvoi trimethylation lysiinin 9 käytettäessä EZH2- ja JMJD1A /2C-riippuvaisella tavalla, vastaavasti. Kuitenkin DZNep voimistumisen nukleosidianalogi Chemosensiti- todettiin ajallisesti kytketty trimethylation muutoksiin lysiiniä 27 eikä lysiiniä 9. Polymeeriset nanopartikkelit suunniteltu kronologisesti release DZNep seurasi gemsitabiini tuotettu lausutaan Chemosensiti- ja annoksesta alentavia vaikutuksia. Yhdessä tuloksemme tunnistaa, että optimoitu DZNep altistus voi presensitize haimasyöpäsoluissa syövän vastaisten nukleosidianalogit läpi käänteinen histoni metylaation korostaen lupaava kliininen apuohjelmia epigeneettiset kääntyminen aineiden tulevaisuudessa haimasyöpä yhdistelmähoitoja.

Citation: Hung SW, Mody H, Marrache S, Bhutia YD, Davis F, Cho JH, et al. (2013) farmakologinen purku histoni Metylointi Presensitizes haimasyöpäsoluissa nukleosidi- Drugs:

In vitro

optimointi ja Novel Nanoparticle Delivery Studies. PLoS ONE 8 (8): e71196. doi: 10,1371 /journal.pone.0071196

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 helmikuu 2013; Hyväksytty: Kesäkuu 27 2013. Julkaistu: 06 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Hung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health [Grant P30GM092378] (SD), National Cancer Institute [Grant 1R03CA161832-01] (RG), Georgia Cancer Coalition (RG), ja OVPR The University of Georgia (SD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Polycomb- ryhmä proteiineja (PCGS) voidaan uudistaa chromatin vaikuttamalla tiiveys, mikä epigeneettiset geenien. Polycomb Sortavat Complex 2 (PRC2), yksi kahden luokan PCG, indusoi histonien metyylitransferaasin aktiivisuus ensisijaisesti trimethylating histoni H3 lysiinin 27 (H3K27me3), joka välittää vaimentaminen tuumorisuppressorigeeneille. Katalyyttinen alayksikkö PRC2 on Enhancer of Zeste Homologi 2 (EZH2), jossa SET-domeeni muodostaa aktiivisen ja histoni H3K27 metylaation [1]. Tutkimukset tukevat EZH2 keskeisenä toimijana kehittymistä ja etenemistä kasvaimia johtuu sen kyvystä muuttaa geeniekspressioiden osallistuvat henkilöt mukaan lukien solusyklikontrollin, solujen vaeltamiseen, ja DNA: n korjaukseen [2]. EZH2 on ratkaisevan tärkeää chromatin ohjaus geneettisen uudelleenohjelmoinnin syövän kantasoluja itseuudistumiseen ja erilaistumista, jotka ovat sekaantuneet chemoresistance [3] – [6].

Koska markkeri kehittynyt ja etäpesäkkeitä monissa kiinteässä kasvaimet, EZH2 yli-ilmentyminen on raportoitu haimasyöpä, erityisesti niistä, jotka ovat huonosti eriytetty [6], [7]. EZH2 havaittiin voimistuvan onkogeenisten RAS avulla MEK-ERK signaloinnin, joka johtaa downregulation tuumorisuppressoreilla kuten RUNX3 ja p27 (Kip1) [6], [8], [9]. EZH2 ehtyminen johti solusyklin pysähtymisen G1 /S siirtyminen, mikä viittaa proteiini voi tukahduttaa kasvaimen tukahduttamalla p27-geeni [10]. Samoin knockdovvn EZH2 johti vähentynyt merkittävästi solujen lisääntymistä ja invasiivisuus [6], [7], [11] ja herkistyneet haimasyöpäsoluissa doksorubisiinille ja gemsitabiinin, paljastaen potentiaalin EZH2 estäjän-kemoterapeuttisten yhdistelmähoito [6] .

In vivo

tukahduttamalla EZH2 vähentynyt tuumorigeenisyyteen ja estivät haimasyövän etäpesäkkeiden [7]. Kliinisesti positiivinen korrelaatioita ole havaittu EZH2 ilmaisun ja kehittynyt haimasyövän vaiheessa ja arvosana potilailla [11]. Monissa tapauksissa korkeita EZH2 syövän olivat myös merkittävästi liittyy pienentynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja erittäin aggressiivinen tauti. In gemsitabiinia saaneilla potilailla merkittävästi pitempi eloonjäämistä havaittiin potilailla, joilla oli alhainen sijaan korkea EZH2 ilmaisun [12]. Näin ollen, EZH2 voi olla merkittävä prognostinen arvo eloonjäämiseen haimasyövän potilaille [13].

Viime aikoina on osoitettu, että voimakas kemiallisen inhibiittorin S-adenosyylihomokysteiinin hydrolaasi, 3-deazaneplanocin A (DZNep) , moduloi chromatin kautta epäsuora (eli vähentäminen metyyliryhmä saatavuus) esto histoni metyylitransferaasit lukien EZH2 [14], [15]. DZNep, karbosyklisen analoginen adenosiini, hävittää solujen tasot PRC2 komponenttien, samalla kun estetään assosioituneiden H3K27me3 [16]. Vaikka mekanismit ja vaikutukset DZNep on tutkittu lukuisissa kiinteitä kasvaimia ja leukemiaa [2], [3], [14], [15], [17] – [21], vähemmän tiedetään mahdollisuuksia tämän yhdisteen haiman syövän hoitoon. Siitä huolimatta sen nykyinen mahdollisuuksia vähentää EZH2 tasoilla, palataan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), ja estää syövän etenemiseen, tekee siitä erittäin lupaava haarapesäkkeiden agentti [5]. Terapeuttinen potentiaali DZNep yhdessä muiden aineiden, kuten polyfenolit ja histonideasetylaasi estäjiä, on alkanut rohkaisevia tuloksia [14], [15]. Koska yhä enemmän todisteita viittaa siihen, että tulevaisuudessa syöpähoitojen hyödyntävät synergiavaikutuksen saavuttaa eri yhdistelmiä epigenetic kääntyminen ja tavanomaisten antituumoriaineina [22], tutkimme mahdollisuuksia DZNep-gemsitabiinin yhdistelmä parantaa syövän vastaista aktiivisuutta haimasyöpä. Tuloksemme tunnistettu että histoni metylaatio muuttumista DZNep presensitizes haimasyövän soluja gemsitabiinia. Optimointi lääkeyhdistelmän kautta annostus ja toimitustavat suoritettiin edelleen.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Radiolabeled (

3H) gemsitabiinia, adenosiini, tymidiini, ja guanosiini saatiin Moravek Biochemicals ja Radiochemicals (Brea, CA), kun taas kylmä gemsitabiinin oli peräisin ChemieTek (Indianapolis, IN). Adenosiini ja guanosiini ystävällisesti Dr. Chung K. Chu (University of Georgia). Tymidiini, uridiini, nitrobentsyyli merkaptopuriini ribosidia (NBMPR), ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) hankittiin Macron Chemicals (Center Valley, PA), ja bikinkoniini- happo (BCA) proteiini määritysreagenssikoostumusta oli Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Muoviset tavarat soluviljelmässä saatiin Corning (Corning, NY).

Cell Culture

haimasyövän solulinjoissa (AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, MIA PaCa- 2, ja PANC-1) ja MCF-10A-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) solu pankki. Nämä solulinjat kasvatettiin, laajennettu, ja jäädytettiin välittömästi saapumisen jälkeen. Solut elvytettiin jäädytetystä kannasta käytettiin 10-20 kohtia, enintään ajan 2-3 kuukautta. ATCC käyttää morfologiset, sytogeneettisten ja DNA analyysi luonnehdinta solulinjoissa. Ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) soluihin [23] ystävällisesti saatu Dr. Ming Tsao Ontario Cancer Institute (Toronto, Kanada). L3.6pl solulinja [24] otettiin ystävällisesti saatu Dr. Isiah D. Fidleriltä The University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). HDPE ja L3.6pl solulinjoja käsitellään muina solulinjat ja genotyypattiin DNA sormenjälkien (PowerPlex 16, Promega, Inc.) kohti valmistajan ohjeiden. 293T noomasolulinjasta saatu Dr. J. Michael Thomson The University of Georgia (Athens, GA). Kasvuolosuhteita solulinjoja suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25].

MTT Sytotoksisuusmääritys

Solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua /kuoppa 96 kuoppaiset mikrotiitterilevyn ja kasvatettiin 90-95% konfluenssiin. Hoidon jälkeen, 50 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin 2 tuntia. MTT formatsaanikiteet liuotettiin 100 ul /kuoppa DMSO ravistelemalla levyjä ravistelutasolla. 96-ja skanneria käytettiin mittaamaan spektrofotometrinen absorbanssi aallonpituudella 490 nm. Absorbanssi 650 nm: ssä käytettiin taustan vähentäminen. 50% estävä pitoisuus (IC

50) määritettiin käyttäen GraphPad Prism 5.0 ohjelmisto.

kaspaasi 3 Pitoisuus

Apoptoosi mitattiin käyttäen Fluorimetric kaspaasi 3 Assay Kit Sigma-Aldrich ( Cat. No. CASP3F) kohti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä käsiteltiin DZNep ja /tai gemsitabiinia 72 tuntia. Sitten solut hajotetaan ja inkuboitiin jäillä 15-20 minuuttia. Kun oli lisätty määrityspuskuria, joka sisälsi Ac-DEVD-AMC substraatti, näytteet siirrettiin musta 96-kuoppalevylle, ja fluoresenssi luettiin 10 minuutin välein 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (360 nm eksitaatio, 460 nm emissio). Sopiva tyhjä (reaktioseoksesta), positiivinen kontrolli (kaspaasi 3), ja negatiivinen kontrolli (kaspaasi 3+ kaspaasi 3: n estäjä) tehtiin myös.

.

lääkeinteraktiotutkimuksia

yhdistelmä indeksi tontteja DZNep ja gemsitabiinin arvioitiin käyttäen kehittämä menetelmä Chou ja Talalay ja CalcuSyn ohjelmistojen [26].

Nukleosidiset otto Solut ja

Xenopus

Oosyytit

Nämä menettelyt suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27], [28].

Generation

Xenopus

Munasolut ekspressiorakenteiksi

täyspitkä IMAGE cDNA-kloonit kuljetuksesta (hENT1: klooni ID 3010092, liittymistä BC008954; hENT2: klooni ID 9051840, liittymistä BC143335; hCNT1: klooni ID 8991920 liittymistasausmaksut BC 126204; hCNT3: klooni ID 7939668, liittyminen BC093823) saatiin Open Biosystems (Huntsville, AL) . Alakloonaus geenejä

Xenopus

munasolu ekspressiovektoriin, POX, valmistui käyttäen alukesarjoja nimetty taulukossa 1.

Western-blottaus

Western blotting oli suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kanin polyklonaalista anti-histoni H3K4TM, H3K9MM, H3K9DM, H3K27MM, H3K27DM, H4K20DM, ja H4K20TM olivat Milliporelta (Bedford, MA), sekä kanin polyklonaalinen anti-TE-vasta-ainetta. Saatu myös Millipore oli hiiren monoklonaalinen anti-histoni H3K9TM, H3K27TM, ja H4K20MM vasta-aineita, samoin kuin hiiren monoklonaalinen anti-EZH2 (klooni BD43) ja anti-SUZ12 (klooni 3C1.2) vasta-aineita. Kanin polyklonaalista anti-JMJD1A ja anti-JMJD2C-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma-Aldrich. Hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine ostettiin myös Sigma-Aldrich, ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet olivat peräisin Bethyl Laboratories (Montgomery, TX).

synteesi Lähtöyhdistenukleosidit ja johdannaiset

Troxacitabine ja sen lipofiilistä aihiolääke, kuten aiemmin on kuvattu (yhdiste 2K [29], yhdiste 6h [30]; C

24H

41N

3 O

5), saatiin tri Chung K . Chu (University of Georgia). Synteesi DZNep analogisen alkoi D-riboosi. D-riboosia, käsiteltiin 2,2-dimetoksipropaani, kun läsnä on katalyyttinen määrä

p

tolueenisulfonihapon antaa isopropylidiini johdannainen, jonka jälkeen suojaamalla primaarinen alkoholi trifenyylimetyylikloridilla. Suojattu laktolia saatettiin sitten reagoimaan vinyylimagnesiumbromidia antaa yhden diastereomericdiol, joka myöhemmin suojata TBDMS ainoastaan ​​allyylihydroksyyli asentoon, jolloin saatiin silyldienol. Sisällyttää toinen kaksoissidos, että renkaan sulkeminen metateesireaktio, suojattu sekundaarinen alkoholi on hapetettu ketoniksi Swern hapetuksella, jota seuraa Wittigin reaktiolla metyylitrifenyylifosfoniumbromidia ja n-BuLi tarjota dieeniä. Silyyliryhmä päässä dieeni poistettiin TBAF: a vähemmän steerisesti vaativa dienol, joka muutettiin sitten cyclopentenol toisen sukupolven Grubbs-katalyyttiä hyvällä saannolla. Voidakseen suorittaa Mitsunobu kytkin, bis-Boc-3-deatsa-adeniini valmistettiin. Mitsunobu kytkentä antoi halutun N-9 isomeeriä päätuotteena. Poistamalla suojaus ryhmien käyttäen 2 N HCI metanolissa tuotti DZNep. Kolme alkoholi ryhmää DZNep suojattiin TBS, joka on substituoitu kahteen amidi aihiolääkkeiden (hiiliketjuja C6-C8) asyloimalla N

6-NH

2-ryhmä. Yhdiste lopulta täysin suojaus TBAF DZNep aihiolääke 1 (C

20H

29ClN

4O

4) ja DZNep Aihiolääke 2 (C

18H

24N

4O

4). Synteesien menettelyt ja fysikaalis karakterisointia yhdisteitä annetaan julkaistu muualla.

nanopartikkeliformulaatiossa

Kaikki kemikaalit hankittiin Sigma Aldrich ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta ellei toisin mainita. PLGA-COOH, joiden sisäinen viskositeetti on 0,18 dl /g hankittiin Lactel. The (5-karboksipentyyli) trifenyylifosfonium- (TPP) kationin syntetisoitiin kirjallisuuden menetelmien mukaisesti [31]. HO-PEG-OH, jossa MW 3350 g /mol ostettiin Sigma Aldrich. DSPE-PEG-COOH, jonka molekyylipaino on 2000 g /mol hankittiin Avanti Polar Lipids. Polyvinyylialkoholi (PVA), jonka keskimääräinen molekyylipaino on 10,000-26,000 ostettiin Alfa Aesar. Tislattua vettä puhdistettiin läpi Millipore Milli-Q Biocel vedenpuhdistus järjestelmä (18,2 MQ), jossa on 0,22 um: n suodattimen. HPLC-analyysit suoritettiin käyttäen Agilent 1200 series väline. Koko ja zeta-potentiaali mittaukset suoritettiin Malvern Zetasizer Nanoseries väline. Geelipermeaatiokromatografia (GPC) kerättiin Shimadzu LC20-AD Prominence neste chromatographer. Kaikki NMR-spektrit rekisteröitiin Varian 400 MHz NMR: llä. TEM kuvat otettiin sijoitukset Tecnai 20 FEM mikroskoopilla. Ultraääntä suoritettiin Misonix S-4000 Ultraääni neste prosessori.

synteesi PLGA-

b

-PEG-OH

synteesi PLGA-PEG-

b

-OH suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32].

synteesi PLGA-

b

-PEG-TPP

synteesi PLGA-PEG-

b

-TPP suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32].

synteesi Gemsitabiini Encapsulated Nanohiukkasten (Gem-PLGA-

b

-PEG-OH-NP) b

Gemsitabiini (10 mg /ml Nanopure H

2O) emulgoitiin PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg CH

2CI

2) käyttäen sauvasonikointia yhdelle minuutti (amplitudi: 40% 600 W teho, Pulse: 1 sek päälle, 1 s pois). Ensisijainen Emulsio emulgoitiin uudelleen lisäämällä vesi-öljyssä-emulsio, 2 ml: aan Nanopure vettä, joka sisälsi 0,5% polyby 8 ml Nanopure vettä, joka sisälsi 0,05% PVA ja sonikoitiin käyttäen edellä mainitut edellytykset. Orgaaninen liuotin poistettiin pesemällä kolme kertaa käyttäen Amicon suodattamalla kalvolla, jonka 100 kDa: n cut-off. NPS suspendoitiin uudelleen Nanopure veteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan. Dynaaminen valonsironta (DLS) mittaukset suoritettiin määrittämään koko, polydispersiteetti-indeksi (PDI), ja zeta-potentiaali ja NP: itä. NP leimasi käyttäen TEM kiihtyvyydellä jännitteellä 200 kV. TEM-näytteet valmistettiin kerrostamalla 8 ui NP: itä (5 mg /ml) päälle 200-mesh hiilellä päällystetty kupari verkkoon. Näytteet blotattiin pois 15 minuutin kuluttua ja verkkoja värjättiin negatiivisesti steriiliä 2% (w /v) uranyyliasetaatilla vesiliuosta 15 minuutin ajan.

synteesi DZNep Encapsulated nanopartikkelit (DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-NP) b

DZNep (10 mg /ml Nanopure H

2O) emulgoitiin PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg CH

2CI

2) käyttäen sauvasonikointia yhden minuutin (amplitudi 40% 600 W teho, Pulse: 1 sek päälle, 1 s pois). Ensisijainen Emulsio emulgoitiin uudelleen lisäämällä edellä on muodostettu vesi-öljyssä-emulsio, 2 ml: aan Nanopure vettä, joka sisälsi 0,5% PVA: ta ja sonikoitiin käyttäen samanlaisia ​​olosuhteita. Lopuksi, tämä emulsio uudelleen emulgoitiin 8 ml Nanopure vettä, joka sisälsi 0,05% PVA alle sonication käyttäen samanlaisia ​​olosuhteita kuin ennen. Orgaaninen liuotin poistettiin pesemällä kolme kertaa käyttäen Amicon suodattamalla kalvolla, jonka 100 kDa: n cut-off. NPS suspendoitiin uudelleen Nanopure veteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan. DLS Mittaukset suoritettiin määrittämään koko, polydispersiteetti-indeksi (PDI), ja zeta-potentiaali ja NP: itä. NP luonnehdittiin käyttämällä TEM kuten edellä mainittiin.

synteesi Gemsitabiini ja DZNep Encapsulated NP (Gem-DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-NP) B

gemsitabiini ja DZNep co-kapseloitu PLGA-b-PEG-OH NP seurasivat tarkka edellä mainitun menettelyn paitsi ensimmäisessä vaiheessa, jossa DZNep (10 mg /ml Nanopure H

2O) ja Gemsitabiini (10 mg /ml Nanopure H

2O) emulgoitiin PLGA-PEG-OH (5 mg CH

2CI

2). Orgaaninen liuotin poistettiin pesemällä kolme kertaa käyttäen Amicon suodattamalla kalvolla, jonka 100 kDa: n cut-off. NPS suspendoitiin uudelleen Nanopure veteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan. DLS Mittaukset suoritettiin määrittämään koko, polydispersiteetti-indeksi (PDI), ja zeta-potentiaali ja NP: itä. NP luonnehdittiin käyttämällä TEM kuten edellä mainittiin.

synteesi Controlled Release Gem-DZNep-PLGA-

b

-PEG-TPP-NP

Gemsitabiini (10 mg /ml in Nanopure H

2O) emulgoitiin PLGA-

b

-PEG-TPP (5 mg CH

2CI

2) käyttäen sauvasonikointia yhden minuutin (amplitudi: 40% 600 W teho, Pulse: 1 sek päälle, 1 s pois). Ensisijainen Emulsio emulgoitiin uudelleen lisäämällä vesi-öljyssä-emulsio, 2 ml: aan Nanopure vettä, joka sisälsi 0,5% PVA: ta ja sonikoitiin käyttäen samanlaisia ​​olosuhteita. Lopuksi tämä emulsio emulgoitiin käyttäen 8 ml Nanopure vettä, joka sisälsi 0,05% PVA ja DZNep (10 mg /ml Nanopure H

2O) mukaisesti ultraäänikäsittelyllä käyttämällä olosuhteita, kuten edellä on mainittu. Orgaaninen liuotin poistettiin pesemällä kolme kertaa käyttäen Amicon suodattamalla kalvolla, jonka 100 kDa: n cut-off. NPS suspendoitiin uudelleen Nanopure veteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan. DLS Mittaukset suoritettiin määrittämään koko, polydispersiteetti-indeksi (PDI), ja zeta-potentiaali ja NP: itä. NP luonnehdittiin käyttämällä TEM kuten edellä mainittiin.

synteesi Controlled Release Gem-DZNep-DSPE-PEG-OH-NP

Gemsitabiini (10 mg /ml Nanopure H

2O) emulgoitiin PLGA-b-PEG-OH (5 mg CH

2CI

2) käyttäen sauvasonikointia yhden minuutin (amplitudi: 40% 600 W teho, Pulse: 1 sek päälle, 1 s pois) . Ensisijainen Emulsio emulgoitiin uudelleen lisäämällä vesi-öljyssä-emulsio, 2 ml: aan Nanopure vettä, joka sisälsi 0,5% PVA: ta ja sonikoitiin käyttäen edellä mainitut edellytykset. Tämä emulsio emulgoitiin edelleen käyttäen 8 ml Nanopure vettä, joka sisälsi 0,05% PVA, 0,1% DSPE-PEG-COOH, ja DZNep (10 mg /ml Nanopure H

2O) mukaisia ​​ultraäänikäsittelyllä käyttämällä samoja olosuhteita kuten edellä on mainittu. Orgaaninen liuotin poistettiin pesemällä kolme kertaa käyttäen Amicon suodattamalla kalvolla, jonka 100 kDa: n cut-off. NPS suspendoitiin uudelleen Nanopure veteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan. DLS Mittaukset suoritettiin määrittämään koko, polydispersiteetti-indeksi (PDI), ja zeta-potentiaali ja NP: itä. NP luonnehdittiin käyttämällä TEM kuten edellä mainittiin.

Kuormaus- ja kapselointi tehokkuus Gemsitabiini ja DZNep NPS

gemsitabiini ja DZNep lastaus ja kapselointi tehokkuuden (EE) määritettiin liuottamalla polymeerinen ydin 0.1 M NaOH ja määrällisesti määrä terapeuttista NPS käyttäen HPLC (Liikkuva faasi: asetonitriili 20% H

2O ja 0,1% trifluorietikkahappoa, käytetty aallonpituus: 270 nm.

Release kineettiset tutkimukset DZNep /gemsitabiini NP

NP pantiin Slide-A-Lyzer® MINI dialyysihoitoyksiköt kanssa MW cutoff 10000 g /mol. Näytteet dialysoitiin 1 x PBS: ää (6,0 L) vakiolämpötilassa ravistelijassa 37 ° C ja 35 rpm. eri ennalta määrätyn ajan pistettä, näytteet poistettiin, ja gemsitabiinin /DZNep pitoisuus määritettiin liuottamalla polymeerinen ydin 0,1 mmol NaOH: lla ja määrällisesti HPLC-analyysillä (liikkuva faasi: asetonitriili 20% H

2O ja 0,1% trifluorietikkahappoa, käytetty aallonpituus: 270 nm).

TILASTOANALYYSI

tapauksissa, joissa vain kaksi edellytystä verrattiin, opiskelijan t testiä käytettiin tunnistamaan merkittäviä eroja. Niissä tapauksissa, joissa on kolme tai useampia olosuhteissa verrattiin, yksisuuntainen ANOVA suoritettiin seurasi Tukeyn monivertailutestillä. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Ellei toisin mainita,

p

0,05 ja

p

0,01 verrattuna valvontaolosuhteet edustaa yhdellä ja kahdella tähdellä, vastaavasti.

Tulokset

DZNep valikoivasti täydentää Gemsitabiini sytotoksisuus in syöpä, mutta ei normaali haimasoluissa

Aloitimme tutkimalla sytotoksisuutta DZNep normaaleilla ja syöpä haiman solulinjoissa. Hoidon kasvavia pitoisuuksia DZNep (0,1 nM-100 uM) osoittivat merkittävää vähenemistä solun elinkelpoisuuden kaikki kuusi haimasyövän testatuissa solulinjoissa (eli BxPC-3, Capan-1, L3.6pl, AsPC-1, MIA PaCa- 2, PANC-1) (Fig. 1A). Sytotoksisuus havaittiin alkaen noin 0,5-1 uM DZNep riippuen solulinjasta, ja vähitellen lisätä suurempia pitoisuuksia jälkeen. Sytotoksisuus alkoi vasta ~48 h hoidon (tuloksia ei esitetty). Maksimaalinen pieneneminen solujen elinkelpoisuuden (-50% vähennys 10pM DZNep 72 tuntia) havaittiin huonosti erilaistunut MIA PaCa-2, joka on vain marginaalisesti gemsitabiini-herkän (Fig. 1A). Vuonna subkonfluenteista soluja, vaikutus DZNep on MIA PaCa-2 oli melkein samanlainen kuin gemsitabiinin (Fig. 1 C). DZNep osoitti paljon alhaisempi sytotoksisuus hyvin erilaistunut, gemsitabiini-herkkä haimasyövän solulinjoissa (so BxPC-3, Capan-1, L3.6pl) verrattuna gemsitabiinia (Fig. 1 C). Huomattavaa on, että mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu lisääntymistä ja solujen elinkelpoisuus normaalin ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) soluja (jopa 10 uM DZNep 72 h), jotka ovat erittäin gemsitabiini-herkkä, sekä kaksi muuta normaalista solulinjat ( 293T (ihmisen alkion munuainen) ja MCF-10A (ihmisen rinta- epiteelin)) (kuviot. 1A-B, S1). Nämä tulokset osoittavat, että DZNep valikoivasti luojana sytotoksisia vaikutuksia (huonosti eriytetty) haimasyöpäsoluissa ilman merkittävää heikentymistä leviämisen normaaleissa haiman epiteelisolujen.

. Kaikki syöpä- solulinjat lukuun normaalin HDPE ovat DZNep reagoivia ja vähensi solujen elinkelpoisuuden. B. DZNep ja gemsitabiinin näkyvät antagonistisia vaikutuksia in HDPE. C. DZNep ja gemsitabiinin näytetään lisäaineen tai synergistisiä vaikutuksia monissa syöpä haiman solulinjat. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun 3 x 10

3 solua /kuoppa siirrostettiin 96-kuoppalevylle, soluja käsiteltiin joko DZNep, gemsitabiini, tai molempien yhdistelmä on ekvimolaarinen suhteessa 72 tuntia. Cellular elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Sytotoksiset IC

50-arvot osoitetaan. Merkitykset välillä gemsitabiini ja DZNep sekä DZNep + gemsitabiini ja DZNep tunnistettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukeyn post-hoc-testi. Yhdistelmä-indeksi (CI) tontit (sisäkkeet) osoittavat vuorovaikutuksesta kahden lääkkeen. CI 1, antagonismin; CI = 1, additiivisuus; CI 1, synergiaa. Pylväsdiagrammit oikealle osoittaa suhteellista kaspaasi-3: n aktiivisuuden (RCA) kunkin hoidon mitattuna fluoresenssin intensiteettiä. Arvot olivat tausta vähennetty ja esitetään kertamuutosta ohjauspaneelista. Merkitys joko yksittäinen lääke vs. lääkeyhdistelmän tunnistettiin kautta yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukeyn post-hoc-analyysissä. Soluja käsiteltiin 1 uM DZNep, 100 nM gemsitabiini, tai molemmat.

Bars

, SD.

n

= 3. *

p

0,05, **

p

0,01.

rohkaisemana mahdollinen kyky DZNep kompensoimiseksi nukleosidianalogia vastareaktioita haimasyövän, me yhteistyössä käsiteltyjen solujen DZNep ja gemsitabiinin on ekvimolaarisista ja verrattiin solujen elinkykyisyyksiä, jotka on saatu, kun soluja käsiteltiin joko DZNep tai gemsitabiinin yksin. Mielenkiintoista on, että co-käsittely osoitti merkittävästi korkeampi ryhmässä solujen elinkykyä useimmat gemsitabiinin-herkkä ja -insensitive syöpäsoluja kuin, kun yhdisteitä käytettiin stand-alone aineet (Fig. 1 C). Kääntäen, co-hoito vähensi sytotoksisuus ( 2-kertainen 100 nM konsentraatio) in HDPE (Fig. 1 B), mikä viittaa cytoprotective roolin DZNep vain normaaleihin soluihin.

Arvioimme yhdistelmän indeksi ( CI) tontteja [26] määrittämään tapahtuvaa vuorovaikutusta DZNep ja gemsitabiinia. Nämä arviot tunnistanut synergistisiä tai additiivisia vuorovaikutusta DZNep ja gemsitabiinia (100 nM-10pM) kaikissa haimasyövän solulinjoissa ainoana poikkeuksena AsPC-1, samoin kuin karu antagonistista vuorovaikutusta normaaleissa HDPE (Fig. 1 C). Co-hoito DZNep (1 nM-10pM), joilla on erilaiset gemsitabiinin pitoisuudet (1-100 nM) osoittivat, että DZNep voimistaa sytotoksisuus on gemsitabiinin annoksesta riippuvalla tavalla in marginaalisesti gemsitabiinin herkkien MIA PaCa-2, kun taas tällainen voimistumisen tapahtui pitkälti gemsitabiinin annoksesta riippumaton muodin erittäin gemsitabiinin herkkien Capan-1-solut (Fig. S2). HDPE pysyi sytotoksinen gemsitabiinin, vahvistaa antagonismi kahden yhdisteiden (Fig. S2). Edelleen vuorovaikutus analyysi eri suhteissa gemsitabiinin: DZNep (01:01, 01:04, 04:01, 01:10, 10:01) tunnistettiin maksimaalisen synergistisen ja sytotoksisen vasteen MIA PaCa-2 käyttäen 1:10 ( kuva S3). Lopuksi, jotta ymmärtää mekanismia väheneminen solujen elinkelpoisuuden, teimme kaspaasi-3 pohjainen apoptoosin määrityksiä. Nämä tulokset (Fig. 1 C) tunnistettiin huomattava apoptoosin induktio kuin vähentämään merkittävästi mekanismi DZNep aiheuttama kasvu gemsitabiinin sytotoksisuus (Fig. 1 C).

Nukleosidiset Kuljettimet helpottaminen Cellular Entry DZNep

Koska DZNep on hydrofiilinen nukleosidianalogi, jossa log P -1,38 [5], me arveltu, että sen tuloa soluihin riippuu ilmaisun nukleosidin kuljettajat, ja siksi riittämätön harjoittaja ilmaisun rajoittaisivat sen solujen toimintaa. Tämän testaamiseksi suoritimme kilpailukykyinen määritys arvioimalla estämisen taso solu kuljetukseen nukleosidien kanssa DZNep. Valitsimme PANC-1 ja MIA PaCa-2 solulinjojen näihin tutkimuksiin, koska ne on raportoitu ilmaista useita nukleosidi- kuljettajat [33]. Liikenne analyysi havaitsi merkitsevän eston

3H-adenosiini ja

3H-guanosiini (puriinit) kuljetus, mutta ei

3H-tymidiini (pyrimidiinin) (Fig. 2A). Gemsitabiini liikenteen molemmissa solutyypeissä inhiboitui vain suurempina pitoisuuksina (200 uM) (Fig. 2A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että DZNep solujen virta on helpottaa puriini, mutta ei pyrimidiini, nukleosidi kuljettajat.

. DZNep vaikeutti oton radioleimattujen puriininukleosideihin in PANC-1 ja MIA PaCa-2. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun 5 x 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin 24-kuoppalevylle, solujen annettiin ottoa ilmoitettu radioleimatun nukleosidi läsnä ollessa DZNep tai sen vastaavan leimaamattoman nukleosidi. B. esto adenosiini liikenteen

Xenopus

varhaismunasolujen kanssa DZNep. C. Farmakologiset esto hENT1 ja ylimääräisen uridiinia vähensi sytotoksisuutta DZNep in MIA PaCa-2. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun 3 x 10

3 solua /kuoppa siirrostettiin 96-kuoppalevylle, soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla DZNep läsnä ollessa DMSO: ta (kontrolli), 10 uM NBMPR tai 200 uM uridiinia. Cellular elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT-määritystä. IC

50-arvot osoitetaan. Merkittävät erot kontrolli- ja kunkin hoidon määritettiin käyttäen Studentin t-testiä.

Bars

, SD.

n

= 3. *

p

0,05, **

p

0,01.

edelleen karakterisoimiseksi identiteettiä puriininukleosidi kuljettajat välittävä DZNep tulva, tutkimme kyky DZNep estää

3H-adenosiini liikenteen

Xenopus

varhaismunasolujen ilmentävät yksittäiset kuljettajat. Merkittävä estyminen hENT1- ja hCNT3 välittämä

3H-adenosiini liikenteen havaittiin, että huomattava eston hCNT2 välittämän

3H-adenosiini liikenteen havaittiin vasta korkeammalla (200 uM) pitoisuus (Fig. 2B ). Ei merkittävä väheneminen adenosiini liikenteen DZNep havaittiin hENT2 ilmentävien varhaismunasolujen.

Seuraavaksi tutkimaan vaikutuksia hENT1 ja hCNT3 on DZNep sytotoksisuus haiman syöpäsoluissa, tutkimme leviämisen MIA PaCa- 2, kun läsnä on farmakologinen estäjä hENT1 (10 nM NBMPR) tai ylimäärä uridiinin (200 uM), joka inhiboi kompetitiivisesti kaikki ents ja CNT. Tuloksemme osoittavat, että molemmat edellytykset voivat merkittävästi vähentää DZNep sytotoksisuutta MIA PaCa-2, arvioituna nousu sytotoksisen IC

50 arvioita (2-8-kertainen) (Fig. 2C).

Asyyli Johdannaisten of DZNep täydentää herkistyminen haimasolujen gemsitabiiniannokseen

Koska DZNep ainakin osittain hyödyntää kuljettajat kohdistamaan parhaalla mahdollisella tavalla, on todennäköistä, että kuljettaja-puutosta potilaat voivat reagoida huonosti DZNep. Voit kiertää tämän ongelman, me tuotetaan polaarinen asyylijohdokset DZNep (Fig. 3A) käyttäen synteettistä kuvattua menettelyä

Materiaalit ja menetelmät

. Me substituoidut DZNep N

6-NH

2 ryhmä asyyli sivuketjuja lähettämään kahta lipofiilisiä aihiolääkkeitä (Aihiolääke 1: C

20H

29ClN

4O

4 Aihiolääke 2 : C

18H

24N

4O

4). Syntetisoidun aihiolääkkeet arvioitiin niiden antiproliferatiivinen toiminta, sekä yksin ja yhdessä gemsitabiinin, normaalissa (HDPE), gemsitabiini-herkän (Capan-1), ja gemsitabiinia kestävä (MIA PaCa-2) solulinja.