Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syövän kuoleman miehillä. Useita näyttöä siitä, että populaatio kasvaimeen käynnistäneen tai syövän kantasoluja (CSCS) on vastuussa syövän kehittymisen ja poikkeuksellinen lääkeresistenssin, mikä erittäin tärkeä terapeuttinen kohde. Tässä tutkimuksessa arvioitiin CSC-spesifisiä muutoksia aiheuttama uuden sukupolven taksoidikonju- SBT-1214 ja uusi polyenolic sinkkiä sitovan curcuminoid, CMC2.24, eturauhasen CSCS.

Keskeiset havainnot

CD133

korkea /CD44

korkea fenotyyppi eristettiin spontaanisti kuolemattomaksi potilaasta johdettujen PPT2 solujen ja erittäin metastaattinen PC3MM2 soluja. Viikoittainen käsittely NOD /SCID-hiirissä, jotka kantoivat PPT2- ja PC3MM3-aiheutettujen kasvaimien kanssa SBT-1214 johti dramaattiseen kasvaimen kasvun estoa. Neljä kuudesta PPT2 ja 3 6 PC3MM2 kasvaimia ovat osoittaneet Koska varteenotettavia solujen jäljellä kasvaimia.

vitro

, SBT-1214 (100 nmol-1 uM, 72 h) aiheuttama noin 60% solukuoleman CD133

korkea /CD44

+ /korkealla soluja viljelty kollageeni I kantasolujen väliaineessa (toisin samoja annoksia paklitakselin lisääntynyt näiden solujen). Sytotoksinen vaikutuksia korotettiin kun SBT-1214 yhdistettiin CMC2.24. Kantasolupankki PCR-array määritys paljasti, että tämä lääkeyhdistelmä välittämää massiivisen eston useita konstitutiivisesti sääteli kantasolu liittyviä geenejä, mukaan lukien keskeiset pluripotenttisuuden transkriptiotekijöitä. Tärkeää on, tämä lääkeyhdistelmä indusoima p21 ja p53, jotka puuttuivat CD133

korkea /CD44

korkea soluja. Elävät solut, jotka selvisivät tämä hoito eivät enää pysty aiheuttamaan toissijainen pallosia, osoittivat merkittävää epämuodostumien ja kuoli 2-5 arkipäivää.

Johtopäätökset

Me raportoimme tässä, että SBT-1214 yksin tai yhdistettynä CMC2.24, on merkittäviä aktiivisuus eturauhasen CD 133

korkea /CD44

+ /high kasvaimen aloittamista soluihin. Tämä lääke yhdistelmä estää tehokkaasti ilmentymisen useimmissa kantasolujen liittyvien geenien ja pluripotenttisuuden transkriptiotekijöiden. Lisäksi se aiheuttaa aiemmin poissa ilmaus p21 ja p53 ( ”geeni herätys”), joka voi mahdollisesti kääntää lääkeresistensseihin lisäämällä herkkyyttä syöpälääkkeitä.

Citation: Botchkina GI, Zuniga ES , Rowehl RH, Park R, Bhalla R, Bialkowska AB, et ai. (2013) Eturauhassyöpä Stem Cell-Kohdennettu tehokkuus New Generation taksoidikonju-, SBT-1214 ja Novel Polyenolic sinkkiä sitovan Curcuminoid, CMC2.24. PLoS ONE 8 (9): e69884. doi: 10,1371 /journal.pone.0069884

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 24 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Zuniga et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH R21 CA150085, NYSTAR avustus 1.072.170, ja osittain Stony Brook University Institute of Chemical Biology Drug Discovery (ICB DD); Stony Brook University Cancer Center, NY; ChemMaster International, NY ja SBU VP tutkimuksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: rooli ChemMaster International, Inc., koska keksijä CMC2.24 oli syntetisoida ja tarjota, luontoisetuna materiaali nykyisessä tutkimuksessa. Tämä yritys on puoliksi akateeminen yksikkö (puheenjohtaja, Francis Johnson, FT, on professori Kemian ja laitos Farmakologiset Sciences at SBU), joka on erikoistunut monivaiheisessa synteesien akateemisen ja teollisuuden ryhmiä. Tämä yritys ei toimittanut tukea työllisyyttä, konsultointi, patentteja tai tuotteiden kehittämiseen tai markkinoille niitä. Kirjoittajat vahvistavat, että tarjoamalla nykyisille tutkimus CMC2.24 ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat eivät mahdolliset taloudelliset tai ei-taloudellisia, ammatillista tai henkilökohtaista kilpailevien etujen.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PRC) on toiseksi suurin syy syövän kuoleman miehillä Western yhteiskunta [1]. Se on alun perin herkkä androgeenideprivaatio terapian, mutta yli 70%: lla potilaista joutuu jälkikäsittely uusiutuminen ja siirtyminen taudin parantumaton tila [2]. Potilaille diagnosoitu androgeenista riippumaton PRC, mikrotubulusten stabilointiaineita kuten Paklitakseli (Ptx; Taxol) ovat ensilinjan hoitoon strategia, joka on alun perin tehokas. Kuitenkin lähestymistapoja hoitoon solunsalpaajaresistentti PRC ei nykyisin ole [3]. Alkuvaiheen jälkeen löydettiin syöpä kantasolujen, CSCS [4], kävi yhä selvemmäksi, että kasvaimia on järjestetty hierarkisesti, joka sisältää suhteellisen pieni (mutta vaihteleva) populaatio kasvaimeen aloittamisesta solut ja heterogeeninen suurin osa bulk kasvainsolujen eri vaiheissa kypsymistä. Tueksi CSC käsite syövän, tuore tutkimus osoitti, että ilmentyminen useiden yleisesti käytettyjen CSC markkereita eli CD44, CD166 ja ALDH-1, sekä solujen osuus, jotka ilmentävät näitä markkereita, lisääntyy ikääntymisen myötä [5] . On havaittu ilmiö, joka ikääntyminen korreloi jyrkkä kasvu ilmaantuvuuden eturauhas- ja monien muiden syöpien [1]. Kertyneen tiedon osoittaa selvästi, että CSCS ovat vastuussa kasvaimen kehittäminen, ylläpito ja kestävyys standardin hoitomuotojen. Näin ollen on osoitettu monia syöpätyyppejä, että kasvaimia solut, jotka ilmentävät yhteistä CSC markkereita, erityisesti CD133 ja CD44, ovat poikkeuksellisen kestäviä tavanomaisten syövän vastaisten lääkkeiden (kuten 5-FU, oksaliplatiini, irinotekaani, dosetakseli ja muut). Lisäksi määrä tällaisia ​​soluja voidaan merkittävästi lisätyistä terapian jälkeen [6-13], joka yleensä ilmentyy enemmän vastustuskykyisiä lääkkeille ja aggressiivisempia toistuva ja etäpesäkkeitä. Näin ollen, on mahdollista, että CSCS ovat tärkein tavoite on kehittää uuden sukupolven syöpälääkkeet.

prekliininen arviointi ehdokas syöpälääkkeiden perustuu perinteisesti käyttöön yksikerroksisiin kokonaismäärästä, valitsemattomat syöpäsoluja. Kuitenkin tässä in vitro -mallissa ohitetaan harvinainen vielä toiminnallisesti merkittävää, erittäin lääkeresistenttiä kasvaimen aloittamista soluihin, ja siten on alhainen merkitystä monimutkaisuus ja patofysiologia

in vivo

tuumorikudoksissa. Lisäksi on äskettäin osoitettu, että yleisimmin käytetty vahvistettu syöpäsolulinjoissa ole mitään korrelaatiota alkuperäisen kliinistä näytettä, joka voi johtaa kriittiseen misevaluation lääkkeen tehosta [14]. Tämä voi osittain selittää korkea poistuman ehdokas syöpälääkkeet. Niinpä vain 5% aineita, joilla on syövän vastaista aktiivisuutta prekliinisissä kehityksen lisensoitu [15]. Siksi tunnistaminen ja luonnehdinta potilaasta johdettujen CSCS, kehittäminen optimaalinen

in vivo

ja

in vitro

nonkliinisissä, ja CSC-kohdennettua analyysit lääkkeen aiheuttamista muutoksista ovat kriittisiä vaiheita arvioinnissa uusien syöpälääkkeiden. On kuitenkin tunnetusti vaikea määritellä ensisijaisen solulinjoja eturauhasen karsinoomat, ja tällä alalla on edelleen olla yksi kiistanalaisia ​​aiheita syöpätutkimuksessa [16]. Ensinnäkin, PRC on maligniteetti suurella solu- ja molekyylitason epäyhtenäisyys siis olemassa objektiivisia vaikeuksia eristämisestä puhdasta solupopulaatioiden eturauhaskudoksiin. Molekyylitasolla, ei tällä hetkellä ole lopullisia markkereita todistaa pahanlaatuinen tai ei-pahanlaatuisten luonteeltaan eturauhasen soluja ja erottaa normaalin ja syövän kantasoluja. Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että CSCS saattaa merkitä heterogeeninen alapopulaatio kasvaimeen aloittamista soluihin [17-23]. Kuitenkin yhdistelmä useita solunpintamarkkereiden alku- solulaji seurasi perusteellinen toiminnallinen luonnehdinta eristetyn solun fenotyypit voivat johtaa tunnistamiseen eniten toiminnallisesti merkitsevä (eli kasvain- ja metastaasin-aloite-, tai kaikkein lääkkeille vastustuskykyisten) solu populaatiot.

Aiemmissa tutkimuksissa on havaittu, että uuden sukupolven taksoidi, SBT-1214, indusoi tehokkaasti pitkän aikavälin tukahduttaminen koolontuumoriksenografteissa [24] ja dramaattisesti alas-säätelee ilmentymistä useita varren solu-asiaa geenien [25]. Etsiminen turvallinen aineita, jotka voivat mahdollisesti pienentää systeemistä myrkyllisyyttä ja parantaa edelleen CSC kohdistetun toimintaa SBT-1214, me motivoi lukuisat syöpälääkkeen piirteitä luonnollisen phytochemical curcumin (diferuloylmethane). Suuri joukko tutkimuksia, kurkumiinin on raportoitu monistamiseen sytotoksisia aiheuttamia vaikutuksia erilaisten kemoterapeuttisten lääkkeiden ja mikä tärkeintä, estää klonogeenisten kapasiteettia ja aiheuttaa pro-apoptoottinen vaikutus lääkeresistenttejä soluja, jotka ilmentävät kantasolujen merkkiaineita [26]. Erityisesti, kurkumiini merkittävästi vähentää proliferatiivisen potentiaalin ja lisää apoptoosia sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinjoissa [27,28]. Kuitenkin Kurkumiini on alhainen bioaktiivisuutta ja hyötyosuus, joka stimuloi meitä kehittämään noin 30 rakenteellisia analogeja curcumin (polyenolic Zink-sitovia aineita, PEZBINs), mukaan lukien nykyinen lyijyn yhdiste, CMC2.24, joka on korkeampi bioaktiivisuus, parempi liukoisuus ja mitään todisteita myrkyllisyyttä jopa suurina annoksina [29]. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata tehoa SBT-1214 ainoana lääkkeenä, ja sen yhdessä tämän uuden curcuminoid vastaan ​​primaarinen ja metastaattinen eturauhassyövän-aloittavat soluihin.

Tulokset

perustaminen ja luonnehdinta spontaanisti kuolemattomaksi ensisijainen eturauhassyöpäsolulinja, PPT2

Dissosioituneet solujen neulabiopsiat 22 resektoitiin eturauhasen karsinoomat eri histologisia laadut testattiin klonogeeniset ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

ja

in vitro

kuvatulla tavalla menetelmät jaksossa. Kaksikymmentä näytteet sisälsivät alapopulaatio nopeasti kiinnittyneitä soluja (FA) ja tyypin I kollageenin, joka aluksi lisääntyneet seerumivapaassa kantasolujen väliaineessa. Neljätoista 22 yksilöiden indusoidun kelluva monisoluisten aggregaatit, ja vain kolme näytteet kykenivät indusoimaan tiheä 3D sferoideja ominaisuus CSCS. Kuitenkin suurin osa ensisijainen solujen menettivät klonogeeniset ja palloja muodostavan kapasiteetin usean kohtia, mikä on linjassa useiden havaintojen ensisijainen eturauhasen syöpäsolujen on rajallinen elinikä (5-6 kohdat) [16]. Sitä vastoin tuumorisolut eristetään potilaasta vaiheen pT2c PNx pMX Kiinasta spontaanisti ikuistettu ja jatkoi pitkäaikaista

in vitro

ja

in vivo

kasvu (˃28 kohtia, tällä hetkellä). Jonka sarjanumero kierrosta siirroista ja johtamisella kantasolujen keskikokoinen, kolme erilaista solupopulaatioiden tuli selväksi: suuret populaatio pitkänomainen soluja, lukuisia pyöreä holoclones sisältävät pieniä soluja, ja harvinainen, hyvin suuri Monitumaisia ​​soluja (jota usein tarkkailla useita vakiintuneita ja ensisijainen eturauhas- ja paksusuolen syöpä solulinjoja). Alakloonaus nämä pienet soluja sisältävään holoclones johti dramaattiseen rikastumista solut, jotka ekspressoivat suuria määriä CD133, CD44, CD44v6, EpCAM, CD49f ja CD166 (kuvio 1A). Tämä solulinja (kutsutaan PPT2) sarjalaimennettiin lisättyjä NOD /SCID-hiiriin tuumoriksenografteja, kelluva 3D pallosia ja tyypin I kollageenin kiinnittynyt kulttuureissa. Mukaan ATCC raportin (ID numero 002872), The PPT2 solut ovat ainutlaatuisia ihmisen soluja ei pärjää tahansa profiili ATCC STR tietokantaa, mikä tarkoittaa, että ne eivät ole saastuneet mitään tunnettua vakiintuneet solulinjat. Vaikka fenotyyppiä CSC rikastetun kulttuureissa on dynaaminen johtuu kaksijakoinen luonne CSCS (eli kyky itse uudistaa ja tuottaa sitoutuneita esiasteita), The PPT2 solut säilyttävät suhteellisen vakaa fenotyyppejä jopa 8 viikkoa viimeisen MACS- CD133

+ solujen lajittelu ja viljelemällä tyypin I kollageenilla päällystetyille pinnoille seerumittomassa mesenkymaalisen kantasolun kasvua väliaineessa, MSCGM (Lonza, taulukko 1, kuvio 1). Niinpä lähes koko väestön PPT2 soluja oli erilaistumaton (vain 3-5% ilmaistuna markkeri erilaistuneita soluja, pan-keratiini), positiivinen EpCAM, CD49f, vakio isoformin CD44 (98-99%; klooni MEM-85; Invitrogen), ja jopa 72% nimenomaista varianttia isoformin, CD44v6 (klooni 2F10, R Sigma-Aldrich ). Kaksitoista-kuusitoista prosenttia PPT2 solut olivat positiivisia androgeenireseptorin (AR

+), ja 8-10% oli positiivisia CXCR4 (kuvio 1A). Toisin kuin alkuperäisen kasvainkudoksen, puhdistettu CD133

+ solut eivät ilmaista PSA, joka ilmestyi uudelleen NOD /SCID-hiirissä kasvaimia, elinsiirron jälkeen on CD133

+ -soluista (kuvio 1 B). Valtaosa on CD133

+ PPT2 solut ilmensivät runsaita sytoplasmista tasoja vimentiinista ja nestiinifenotyypin ominainen hermo ja alkion kantasolut. Ilmaisu Näiden kahden merkkiaineiden oli korkein jättiläismäinen monitumaisia ​​soluissa (MNCs; kuvio 1 C). Sekä ydin- ja sytoplasmista jakeet PPT2 solujen ilmaistaan ​​c-Myc, kun taas muut pluripotenttisuus markkereita (Oct-4 ja Sox-2) havaittiin vain tumafraktios- (kuvio 1 D). Tärkeää on, PPT2 solut olivat negatiivisia pro-apoptoottisten /tuumorisuppressorin proteiineja, p53 ja p21, ja erittäin kestävä standardin syöpälääkkeet. Vuoteen hetkellä noin 2,5 vuoden kunnossapidon, valtaosa on PPT2 solujen edelleen kehittymätön tilassa, edelleen ilmaista korkea suhde ja korkea yleisesti käytetty stemness ja pluripotenttisuus edellä mainittua merkkiainetta ja säilyttää erittäin korkea kasvaimeen aloittamista, klonogeeniset ja palloja muodostavan kapasiteetin aikana sarja transplantations suhteellisen alhainen solujen määrä. Kaikki edellä motivoitunut tiimimme testaamaan kaksi alkuperä- lääkkeistä, SBT-1214 ja CMC2.24 tätä erittäin lääkkeille vastustuskykyiset, CSC-rikastettu ensisijainen eturauhassyöpäsolulinja ja vertailun, vastaan ​​perustanut erittäin metastaattinen johdannainen PC-3 solulinja, PC3MM2 soluja, jotka oli tunnettu edellisessä tutkimuksessa [30].

(A) edustaja FACS-analyysit eri solunpintamarkkereiden ilmentymistä lajittelemattomina PPT2 soluja kasvatettiin 4 viikkoa tyypin I kollageenin in MSGB välineellä. Jokainen pisteviiva neliö edustaa populaatio ilmentävien solujen kohtalainen /korkea tietyn merkki konjugoitu eri fluoresoivia tageja. Huomaa pitkäaikainen säilyttäminen CD133-APC, vakio (CD44-PE) ja variantti (CD44v6-FITC) CD44 ja CD49f-APC. Sitä vastoin, vain pieni murto-osia PPT2 solujen ilmaisivat tyvisolujen merkkiaine, p63, merkkiaine erilaistuneita soluja, pan-keratiini, CK18, AR ja CXCR4. (B) immunohistokemiallinen analyysi osoittaa, että toisin kuin vanhempien kasvainkudoksen, puhdistettu CD133

+ PPT2 solut eivät ilmennä PSA

vitro

; kuitenkin, PPT2 aiheuttama NOD /SCID tuumoriksenografteja ovat heikosti PSA-positiivisia. (C) immunosytokemi- analyysi osoittaa yhtenäinen ilmaus vimentiinista ja nestiinifenotyypin, joissa erityisen paljon näistä merkeistä hermoston kantasolujen suurten ylikansallisten yhtiöiden. (D) Western blot analyysi osoittaa ilmentymisen pluripotenttisuuden merkkiaineiden ydin- ja sytoplasman jakeet CD133

+ PPT2 soluja. Sekä ydin- ja sytoplasman jakeet ilmaistaan ​​c-Myc ja olivat negatiivisia p53 ja p21; vain tumafraktios- ilmaistu Oct-4 ja Sox-2.

PPT2 solujen **

PC3MM2 solut ***

Marker

Source

Expr. taso

% soluista

Expr. taso

% soluista

CD133Miltenyi Bio. +++ 75 ± 15 ++ /+++ 3 ± 1CD44Invitrogen MEM-85 +++ 99,5 ± 0,5 ++ /+++ 7,5 ± 2.5CD44v6R Taxol) lisäsi suhde solujen korkein ilmentymä CD133 pitoisuutena riippuvaisella tavalla (välillä 10 nM 10 uM, 24 tuntia) sekä PPT2 ja PC3MM2 solulinjoissa (edustaja FACS näkyy kuviossa 2A, B) . Nämä tiedot viittaavat siihen, että molemmat lääkkeet ensisijaisesti vaikuttaa solujen alhainen CD133 ilme, ja aluksi ei vaikuttanut tai jopa stimuloida leviämisen CD133

korkea soluja. Kuitenkin pidempi hoidon (48-72 tuntia) paljasti syvällinen ero sytotoksisia vaikutuksia SBT-1214 ja Ptx: kun Ptx käsiteltyjä soluja säilytetään elinkelpoisuutta ja elinkykyisten solujen lukumäärä oli edelleen kasvanut, jopa 60%: n SBT-1214-käsitelty CD133

+ solut tapettiin samoina pitoisuuksina lääkeaineen (MTT-määritystä tiedot on esitetty kuviossa 2C, D, kuvio 3A). Yllättäen pienempiä pitoisuuksia SBT-1214 (100 nmol-1 uM) alulle korkeammat sytotoksisuuden PPT2 soluissa verrattuna 10 uM lääkepitoisuus. Paklitakseli 10gM oli sytotoksinen ja indusoi noin 40% solukuolema (kuvio 2C, D). Tänä ajankohtana, lisääntynyt suhde erittäin suuri MNC (usein ≥200 um) oli ilmeinen sekä PPT2 ja PC3MM2 soluissa (kuvio 3A, B). Sen testaamiseksi, onko hoito SBT-1214 vaikuttaa klonogeeniset potentiaali CD133

+ soluja, PPT2 ja PC3MM2 kelluva pallosia käsiteltiin 1 uM lääkkeen 24 tuntia, jotta saadaan aikaan muutoksia, mutta välttää syvällinen solukuolemaa. Olemme havainneet, että toisin hallita käsittelemättömän sferoideja, SBT-1214 käsitellyt solut menettivät kyvyn aiheuttaa sekä toissijaisen 3D pallosia (kuvio 3C) tai kollageenin kiinnittynyt pesäkkeet (ei esitetty). Sekä PPT2 ja PC3MM2 solujen hoitoa-eloonjääneiden kohdistama syvällinen solukuolemaa 2-5 päivän kuluttua hoidon SBT-1214 (kuvio 3D).

edustaja FACS-analyysi osoittaa annoksesta riippuva nousu suhteet CD133

korkea PPT2 (A) ja PC3MM2 (B) soluista 24 tunnin kuluttua hoidon SBT-1214 ja Ptx. Pidempi käsittely (72 tuntia) ja SBT-1214 (10 nM-10pM) indusoi jopa 65% solukuoleman PPT2 soluissa (C) ja jopa 60% vuonna PC3MM2 soluissa (D; alempi viiva). Sitä vastoin hoito saman annoksen Ptx ei tukahduttaa leviämisen kasvaimia eturauhassyövän soluissa (C, D, ylempi viiva). Soluja inkuboitiin osoitetun lääkeainepitoisuudet ja tiedot saatiin vakio MMT määritys perustuu kolmen erillisen kokeen neljä toistoa kummassakin hoitoryhmässä. Arvot ovat keskiarvoja ± SD.

(A, B) Faasikontrasti- mikrovalokuvia osoittavat, että yksi hoito 1 uM SBT-1214 48 tuntia aiheuttama kuolema PPT2 ja PC3MM2 solujen rikastuminen suuri monitumaisia ​​soluja (nuolet). (C) jälkikäsittely menetys palloja muodostavan kapasiteetin perhe-solujen verrattuna käsittelemättömiin niistä. Arvot ovat keskiarvoja ± SD perustuva 3 riippumatonta toistoa. (D) perusteellinen kuolema käsiteltyjen PPT2 ja PC3MM2 solujen aikana seuraavien päivien aikana viljelmässä.

In vivo

tehoa SBT-1214 vastaan ​​eturauhasen tuumoriksenografteja aiheuttama CD133

+ solupopulaatioiden

jälkeen transplantaation CD133

+ PPT2 ja PC3MM2 soluja, NOD /SCID-hiiriin jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään kunkin solun tyyppi: yksi, kuten käsittelemätön kontrolli (n = 4), toinen ryhmä SBT-1214-hoidon 40, 40, 40 mg /kg kerran viikossa annosteltuna (n = 4), ja kolmas ryhmä, joiden käsittely 40, 20, 20, 20 mg /kg kerran viikossa annosteltuna (n = 6). Hoito aloitettiin 2-3 viikkoa transplantaation jälkeen tuumorisolujen, kun tuumoriksenografteja saavuttanut ˃100 mm

3; kasvaimen kehitystä seurattiin viikoittain. Vaikka kaikki neljä kasvaimia käsiteltiin 40, 40, 40 mg /kg kerran viikossa hoito oli dramaattisesti vähentynyt kolmas käsittely, kaikki hiiret ilmaistuna yhteisiä merkkejä systeemisestä toksisuudesta ja tapettiin (tietoja ei ole esitetty). Hoidon 40, 20, 20, 20 mg /kg kerran viikossa hoito indusoi suurempia kasvaimen regressio (kuvio 4A-D), jossa on paljon pienempi systeeminen toksisuus. Viikko viimeisen käsittelyn jälkeen, kaikki jäljellä kasvaimet kerättiin ja analysoitiin histopatologisesti ja

ex vivo

klonogeeniset kapasiteettia. Hoitamaton kontrolli kasvaimet poistettiin saavuttaessaan ~ 2 cm halkaisijaltaan suurin mukaisesti IRB vaatimuksia.

NOD /SCID hiiriin ektooppisesti istutettiin 3000 CD133

+ PPT2 ja PC3MM2 soluja kyljissä. Kolme viikkoa injektion jälkeen, hiiriä käsiteltiin viikoittain i.v. injektiot SBT-1214 (x4: 40, 20, 20, 20 mg /kg). Tämä hoitomuoto indusoi dramaattinen väheneminen kasvaimen koon suurin osa PPT2- ja PC3MM2-aiheutettujen kasvaimien (A-D). Edustavia tapauksia näkyvät B ja D Arvot ovat keskiarvoja ± SD;

p

≤0.0009 varten PPT2-tuumoreita (SBT-käsiteltyjen versus käsittelemättömien kontrollien; n = 6), ja

p

≤0.0018 varten PC3MM2-tuumoreita (n = 6). Histopatologisia analyysi jäljellä kasvaimia osoitti, että läsnä elävien solujen ja kertymistä suuria monitumaisia ​​soluja 2 6 PPT2 kasvaimia ja 3 6 PC3MM2 kasvaimia (edustaja H musta pilkullinen alue), mutta johti merkittävä muutos koko solun väestön kohti eriyttäminen (C; alue punaisella tähdellä) ja jonkin verran lisääntynyt solujen korkein ilmentymä pan-keratiini (C; punainen pilkullinen alue). Nämä tiedot osoittavat, että pitoisuudet ovat pieniä CMC2.24 lisätä proliferaation ei-varsi progenitorien sijaan CSCS. Tärkeää on, että yhdistelmä 30 gM CMC2.24 (joka ei ole myrkyllinen edes paljon suurempia annoksia [29]) ja pieninä pitoisuuksina SBT-1214 tai Ptx (10 nM-1 uM) aiheutti syvällisempi kuoleman CD133

+ soluja kuin kutakin yhdistettä ainoana lääkkeenä (kuvio 5D, E). Sen jälkeen kun väliaikainen jälkikäsittely kertyminen suurten monitumaisten solujen, ne menettivät kyvyn indusoida kelluvan 3D sferoideina ja tehtiin perusteellinen solukuolemaa samalla tavalla kuin SBT-1214-käsitellyissä soluissa esitetään kuviossa 3.

(A, B ) CMC2.24 monoterapiana aiheuttama kaksivaiheiseen vaikutuksia eturauhassyövän soluproliferaatioon: pienempiä pitoisuuksia se edistää leviämisen, kun taas suuremmat ne olivat sytotoksisia. (C) Toisin kuin SBT-1214, hoito CMC2.24 ei aiheuttanut kasvua suhteessa CD133

+ soluja (mustat pisteviiva alueet), mutta samoin SBT-1214, kasvoi ekspressio differentiaatiomarkkeri pannulla -keratin (punainen pisteviiva alueet) ja siirtynyt koko solupopulaation kohti erilaistumista (alueet tähdillä). Yhdistelmä kahden aineen indusoi suurempia solukuoleman CD133

+ PPT2 (D) ja PC3MM2 (E) soluja verrattuna kutakin yhdistettä yksittäisenä aineena. Tiedot saatiin standardin MMT määrityksessä (A, B, D, E). Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta 4 toistojen kunkin lääkkeen pitoisuus.

SBT-1214-indusoidut muutokset on stemness liittyvien geeniekspressioprofiili

esitämme Aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen genomin laajuinen ja reitti-spesifinen geeni-ilmentymisen profilointi, olemme havainneet, että kasvaimia solupopulaatiot eristettiin vakiintuneiden eturauhas- ja paksusuolen syöpä solulinjat ilmensivät voimistunut tasoja anti-apoptoottiset geenit, ABC kuljettajat ja suurin osa varren cell liittyviä geenejä [25,30,31]. Meidän proteomiikka Tutkimus toteutettiin yhteistyössä Harvard Proteomiikka Resource on CSC-rikastettu versus eriytetty PC3MM2 solut paljasti 198 ilmentyvät eri proteiineja ulos 600 analysoi niitä (julkaisematon data). Joukossa oli monia proteiineja, jotka liittyvät kantasolujen toiminto, solun liikkuvuus, invaasio, metastaasin ja heikkoon ennusteeseen, mukaan lukien vimentiinin, nestiinin, S100, lämpösokkiproteiinit HS90A ja HS90B, moesiini, galektiini ja monet muut. Esitetään mahdolliset lääkkeen aiheuttama muutokset stemness geeniekspression, analysoimme CD133

+ PPT2 solut ennen ja jälkeen hoidon SBT-1214 /CMC 2.24 yhdistelmä. Käyttämällä PCR array määritystä (PAHS 501; SA

biotieteiden

) kanssa suodatus kriteerit 1.5- tai greater- kertainen muutos ilmaisun, olemme havainneet, että noin 50% analysoitiin 84 kantasolun liittyvien transkriptiotekijöiden ( TF: t) on yläreguloituja CD133

+ versus eriytetty pRC soluja (kuva 6A). Joukossa oli CDX2, DLX2, DNMT3B, EGR, FOXP3, GLI2, HOX perhe TF: iä, IRX4, kesäkuu, KLF2, NFATC1, NR2F2, PCNA, PITX3, POU4F1, SIX2, Sox2, SOX9, TERT- WT1 ja muut. Yhden hoidon SB-1214 (1 uM) ja CMC2.24 (10 uM) 24 tunnin ajan indusoi merkittäviä säätely alaspäin näiden yliekspressoitujen geeneistä (kuvio 6B). Western blot-analyysi osoitti, että SBT-1214 ja CMC2.24 yksittäisinä aineina aiheuttama kohtalainen säätely alaspäin c-Myc ja Sox2 ydin- otteita molempien CD133

+ ja bulk PPT2 soluja, kun taas yhdistetty lääkkeen annon johti lähes täysin estäminen niiden ilmaisun (kuvio 6C). Tärkeää on, ydin- jakeet kaksi CD133

+ ja bulk PPT2 solut eivät ilmaista kaksi tuumorisuppressoreilla /sääntelyviranomaisten apoptoosin, p53 ja p21 (kuvio 7A), joka osittain selittää niiden äärimmäisen resistenssin syöpälääkkeet. Sekä SBT-1214 ja CMC2.24, ja etenkin niiden yhdistelmä indusoi ilmentymistä p21 ja p53. Tällaiset ”geeni herätys” indusoi esikäsittely lääkeyhdistelmän (SB-1214, 1 uM ja CMC2.24, 10 uM) 24 tunnin ajan kasvanut dramaattisesti edelleen herkkyyden nämä erittäin lääkeaineen-resistenttien solujen toiseen hoitoon, mikä johtaa käytännöllisesti katsoen täydellisen kuolema CSC-rikastettu soluissa (kuvio 7B, C).

(A) Multiple kantasolu-asiaan transkriptiotekijät ovat ajan säännelty CD133 + solupopulaation verrattuna niiden eriytetty kollegansa. (B) Down-sääntely sääteli transkriptiotekijöiden hoidon jälkeen 1 uM SBT-1214 ja 10 uM CMC2.24 24 tuntia (PCR array määritys, SABiosciences; PAHS 501). Western blot analyysi vahvisti merkittävästi alas-säätely keskeisten pluripotenttisuus transkriptiotekijöiden, c-Myc ja Sox-2 CD133

+ soluja (C). Histon H1 käytettiin latauskontrollina.

(A) Aiemmin poissa pro-apoptoottiset /tuumorisuppressorin proteiineja, p21 ja p53 indusoitiin yhden käsittelemällä SBT-1214 /CMC2.24 yhdistelmä 24 hr molemmissa CD133

+ ja bulk PPT2 soluja. Tällaiset ”geeni herätys” johti huomattavaan kasvuun herkkyyden CD133

+ solujen tämän lääkkeen yhdistelmä (B, C). Esikäsittely [SBT-1214 (1 uM) + CMC2.24 (10gM)];