Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

fotodynaaminen hoito (PDT) käyttää yhdistelmää valolle huumeiden ja vaaraton kevyt aiheuttaa selektiivinen vahinkoa syöpäsoluihin. PDT on siis vaihtoehto polttovälin hoidon paikallisten sairauden tai muuten leikkaushoitoon kasvaimia. Lisäksi on yhä enemmän näyttöä siitä PDT voivat aiheuttaa systeemisiä anti-kasvain immuniteetin, joka tukee valvonnan kasvainsolujen, joita ei ole hylätty ensisijaisen hoitoa. Kuitenkin vaikutus ei-tappavien PDT käyttäytymiseen ja pahanlaatuinen potentiaalia syöpäsolujen elossa PDT ei molekyylirakennetta ei ole määritelty hyvin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä olemme arvioineet muutoksia transcriptome ihmisen glioblastooma (U87, U373) ja ihmisen (PC-3, DU145) ja hiiren syöpäsolujen (TRAMP-C1, TRAMP-C2) jälkeen ei-tappavia PDT

in vitro

ja

in vivo

käyttäen oligonukleotidia microarray-analyyseillä. Huomasimme, että kokonaisvaste oli samanlainen eri solulinjojen ja valoherkistimien molemmat

in vitro

ja

in vivo

. Kaikkein näkyvästi voimistunut geenit koodata proteiineja, jotka kuuluvat reitit aktivoidaan solustressiä tai osallistuvat solusyklin pysähtymiseen. Tämä vaste oli samanlainen kuin pelastuspalvelun kasvainsolujen seuraavan suuren annoksen PDT. Sitä vastoin tuumorisolut käsittelevät ei-tappavia PDT todettiin merkittävästi upregulaatioon useita immuunijärjestelmän geenit, johon sisältyi kemokiinin geenit

CXCL2

,

CXCL3

ja

IL8 /CXCL8

sekä geenit IL6 ja sen reseptorin IL6R, jotka voivat stimuloida proinflammatoristen reaktioita, kun taas IL6 ja IL6R voi myös parantaa kasvaimen kasvua.

päätelmät

tulokset osoittavat, että PDT voi tukea anti-kasvain immuunivasteita, ja on näin ollen, järkevä hoito vaikka kasvainsoluja ei voida kokonaan poistaa ensisijaisen fototoksinen pelkillä. Kuitenkin ei-tappavia PDT voi myös stimuloida kasvaimen kasvua edistävää autokriinisten silmukoita katsottuna vahvistava säätely IL6- ja sen reseptori. Täten tehoa PDT kasvainten voidaan parantaa ei-toivottujen ja mahdollisesti haitallisia kasvua stimuloiva reittejä.

Citation: Kammerer R, Buchner A, Palluch P, Pongratz T, Oboukhovskij K, Beyer W, et ai . (2011) immunologisen sovittelijoita Gliooma ja syöpäsolujen tappamista fotodynaaminen hoito. PLoS ONE 6 (6): e21834. doi: 10,1371 /journal.pone.0021834

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu 11 joulukuuta 2010 Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 30 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Kammerer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Deutsche Krebshilfe (107320; https://www.krebshilfe.de/deutsche-krebshilfe.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fotodynaaminen hoito (PDT) onkologian perustuu valikoivaan kertyminen valoherkistäjää (PS) syöpäsoluissa, jonka jälkeen sen aktivointi matalan energian kudokseen tunkeutuva valo. Vuonna hapen läsnäollessa, innoissaan PS tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), kuten singlettihappea, jotka ovat myrkyllisiä eläviä soluja [1].

Various PS olemassa, jotka kaikki on etunsa ja rajoituksensa. 5-amino-levuliinihappoa (5-ALA), on luonnollinen esiaste hemin nisäkässoluissa. Solut aineenvaihdunta 5-ALA: Hemi, tuottaa protoporfyriini IX (PpIX) välituotteena niiden mitokondrioita. Koska muuntaminen PpIX on hemin on nopeutta rajoittava vaihe, PpIX kertyy syöpäsolujen seurauksena Kertymistä ja säilyttäminen 5-ALA. PpIX paikantuu solunsisäisesti mitokondrioita ja sytoplasmaan [2]. Photofriniä®, toisaalta, on eksogeeninen valoherkistäjää, joka kertyy myös syöpäsoluja, mutta sijaitsee eri solukalvoissa [3]. Yleensä aktivointi PS, jotka kohdistuvat mitokondrioita johtaa syöpäsolun apoptoosin, kun taas PS jotka liittävät solukalvojen pääasiassa aiheuttaa solunekroosia [2].

Alunperin tavoite PDT onkologiaan oli kokonaan poistaa lokalisoitu kasvaimia . Kuitenkin kliininen käyttö PDT syövän hoidossa on nyt alkanut muuttua. Viime aikoina hoito-on sovellettu, joilla pyritään saamaan aikaan verisuonten kohdistamisen tai anti-kasvain immuuni vaikutuksia [4] – [7]. Tämä osoittaa, että PDT voisi myös olla järkevä hoito vaihtoehto kuin pinnallinen tuumorit, kuten eturauhassyövän ja glioblastooma.

Eturauhassyöpä on kolmas johtava syy syöpään liittyvien kuolemien Pohjois-Amerikan miesten [8]. Ensisijainen eturauhassyövän hoitoon kuuluu eturauhasen, androgeenipuutteen hoitoa, sädehoito ja transperineal brakyhoidoksi. Kaikki nämä hoidot on monia kielteisiä vaikutuksia, joilla on huomattava vaikutus potilaiden [9]. Johtuen dramaattisia parannuksia varhaisvaiheen eturauhassyöpä diagnoosin polttoväli hoitoja, kuten kylmähoito, korkean intensiteetin keskityttiin ultraääni ja PDT ovat nousemassa uusia hoitovaihtoehtoja [10], [11]. Varjopuolena polttoväli hoito on epävarmuus täydellisen kasvainsolun hävittämisen, varsinkin kun tiedetään vain vähän vastetta syöpäsolujen paeta polttovälin hoitoa. Ei-toivottu skenaario on, että nämä tuumorisolut pystyy kasvattamaan maligniteetti tai alkaa salainen tukevia tekijöitä lisääntymistä tai tunkeutumisen jäljellä syöpäsolujen paracrine tavalla.

glioblastoma multiforme (GBM) on yleisin ja aggressiivinen ensisijainen aivokasvaimia ihmisillä. Keskimääräinen elinaika GBM potilaista on 14,6 kuukautta [12]. Yksi tunnuspiirteistä glioblastomas on niiden diffuusi luonteesta [13]. Äskettäin havaittiin, että fluoresenssilla ohjatun resektion ja toistuvia PDT voi merkittävästi pidentää eloonjäämismediaani potilaalla on GBM [14], [15]. Lisäksi pitkän aikavälin selviytyminen GBM potilaiden jälkeen PpIX-pohjainen PDT oli raportoitu muissa kliinisissä tutkimuksissa [16], [17]. Huolimatta näistä lupaavia havaintoja eri asioita on käsiteltävä optimoida PDT terapeuttisena vaihtoehtona GBM. Esimerkiksi vastaus syöpäsolujen hengissä PDT johtuu niiden pitkälle tunkeutuminen aivojen normaalia kudosta ei ole määritelty hyvin, mutta se voi olla kohde adjuvanttihoitona.

Olemme aiemmin raportoitu, kuinka transcriptome ja eturauhassyövän solulinja PC-3 vastaa 5-ALA-pohjainen PDT [18]. Yllättäen PC-3-solujen voimistunut paitsi stressi ja DNA korjaavien geenien myös geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka osallistuvat immuunivasteiden säätelyyn lukien tietyt kemokiinit ja sytokiineja. Siksi halusimme tietää, onko tämä havainto pätee muihin PS, muihin eturauhassyövän solulinjoissa, kasvaimen solut toisen kudosalkuperän ja kasvainten

in vivo

. Tätä varten olemme verrattain analysoineet genominlaajuisia transkription muutosten jälkeen matalan tason, ei-tappavia PDT kahdessa ihmisen eturauhasen ja glioblastoomasolulinjoissa jokaisen, vertasi transcriptome ihmisen eturauhassyövän linja PC-3 jälkeen 5-Ala- ja fotofriini -pohjainen PDT ja analysoitiin transkription muutosten hiiren eturauhasen syöpäsolujen ihonalaisesti istutetaan albiino C57BL /6-hiiriin PDT. Havaitsimme, riippumaton kudoksen alkuperästä ja tyypistä herkistävä, merkitty transkription stimulointi koodaavien geenien proinflammatoristen sytokiinien, jotka stimuloivat ja houkutella pääasiassa myelooinen leukosyyttien ja, samaan aikaan, aktivointi geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka liittyvät solusyklin pysähtymiseen. Yhdessä väistämätön epätäydellinen tuhoutuminen kasvain kudoksen PDT kliinisessä asetukset saattavat jopa tukea anti-kasvain immuunivasteen.

Tulokset

Altistuminen ja säteilytys edellytyksiä ei-tappavia

in vitro

PDT

voidakseen toistettavasti ladata kasvainsolujen valoherkistäjää määritimme kinetiikkaa ja 5-ALA pitoisuuden riippuvuus PpIX muodostumisen tuumorisolulinjoja käyttää. Valitsimme kaksi ihmisen eturauhasen (PC-3, DU145) ja kaksi glioblastoomasolulinjoissa (U87, U373) sekä hiiren eturauhasen syöpäsolulinjoissa TRAMP-C1 ja TRAMP-C2, jotka on johdettu kasvainten siirtogeenisen hiiren line ”siirtogeeninen malli eturauhasen syöpä ”(TRAMP) [19], [20]. Kertyminen photosensitizer kvantifioitiin virtaussytometrialla (kuvio 1 E). Totesimme suuri solulinja liittyviä eroja tasojen PpIX muodostumisen inkuboinnin jälkeen PpIX esiaste 5-ALA (Kuva 1A-C, E). Tämä voi johtua eroista ATP-sitova kasetti kuljettaja ABCG2 jonka tiedetään olevan vastuussa vienti PpIX soluista [21]. Itse asiassa läsnäolo ABCG2 mRNA eri solulinjoissa korreloivat alhainen PpIX inkuboinnin jälkeen 5-ALA kanssa mahdollisimman paljon ABCG2 mRNA on havaittu TRAMP-C1 ja TRAMP-C2-soluja, jotka osoittivat alhaisin PpIX ( Kuva S1, kuvio 1). Lisäksi, kertyminen PpIX väheni 2-3-kertaisesti, kun inkubointi 5-ALA suoritettiin seerumin läsnä ollessa median (kuvio 1 B, C). Tämä johtui luultavasti sitoutumisen PpIX seerumin albumiiniin kun kuljetetaan ulos solusta, mikä siirtää PpIX vakaan tilan tasot [22], [23]. Näiden tietojen perusteella, 16 h inkuboinnin aikana 50 ug /ml 5-ALA: n läsnä tai poissa ollessa 5% seerumia valittiin ihmisen eturauhasen (PC-3, DU145), ja ihmisen glioblastooma ja hiiren eturauhassyöpäsolulinjoissa (U87, U373, TRAMP-C1, TRAMP-C2), tässä järjestyksessä. Melko pieni, mutta tehokkaasti herkistävän fotofriini konsentraatio (5 ug /ml), valittiin, jotta vältetään mahdolliset sytotoksisuuden puuttuessa valo (kuvio 1 D).

Kasvaimen soluja inkuboitiin 50 ug /ml (A, E) tai ilmoitetut pitoisuudet 5-ALA (B, C) tai fotofriini (D) läsnä ollessa (PC-3, U373, A, D, E ja punainen linjat B, C) tai ilman 5% seerumia (TRAMP -C1, TRAMP-C2, A ja siniset linjat B, C). Ellei toisin ole osoitettu, PpIX sisältö solut kvantitoitiin sen jälkeen, kun 16 tuntia käyttäen virtaussytometriaa fluoresenssin kanavalla 3 (mediaaniarvot ± keskihajonta). Edustaja histogrammit 5-ALA-käsitellyn ihmisen kasvainsolulinjoja on esitetty E. Käsittelemättömät soluja käytettiin kontrollina; yksi edustaja kontrollinäyte ilman 5-ALA inkuboinnin näkyy (punainen täytetyn käyrä). Fotoherkistimiä osoitti saturoituvasta kerääntymistä riippuen inkubaatioajan ja keskittyminen. Seerumin kasvualustaan ​​voimakkaasti vähentänyt ALA-pohjainen PpIX muodostumista. Olosuhteet herkistävä lastaus käytetään transcriptome analyysit osoitettu pystysuorilla katkoviivoilla. AU, mielivaltaisia ​​yksiköitä.

Seuraavaksi valoannoksien säteilyttämiseksi herkistyneet solut määriteltiin joka mahdollistaisi solujen selviytymisen ajaksi 24 h 48 h, jonka aikana vaurioituneita soluja voisi aktivoida geenejä. Huomasimme, että PDT olosuhteet, jotka aiheuttivat vähennystä aktiivisuus solunelinkykyisyysmääritys 30% 24 h kuluttua PDT verrattuna ei-säteilytettyä soluviljelmässä pikemminkin johtivat kasvun pysähtymisen vähän tai ei lainkaan menetystä solujen kuluessa 48 tuntia (kuvio 2E). Määrittää valon annos indusoi 30%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden mittaamalla mitokondrioiden toimintaa, solut herkistettiin kuten edellä on kuvattu, ja säteilytettiin kasvavia annoksia laservaloa. Solun elinkyvyn menetykseen lisääntyi ajan säteilytyksen jälkeen ja valon annoksesta ja vaihteli solulinjoja. Esimerkiksi 4 kertaa suurempi valon annos tarvitaan aiheuttamaan 30%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden 24 h kuluttua PDT DU145-soluja verrattuna U373 tai TRAMP-C1-soluja (kuvio 2A-D; taulukko S1). Tämä ero herkkyys eri solulinjojen ei korreloi niiden kyky kerääntyä PpIX: n läsnä ollessa 5-ALA. Mielenkiintoista, valo annokset johtavat samaan 30% menetys solujen elinkelpoisuuden aiheuttama eri tasolla apoptoosin analysoituja ihmisen solulinjoissa mitattuna kaspaasi 3 ja kaspaasi 7. katsoo mitään tai marginaalinen apoptoosin havaittiin eturauhassyövän solulinjoissa DU145 ja PC-3, vastaavasti, maksimaalinen apoptoosi havaittiin glioblastoomasolulinjoissa samoissa olosuhteissa (kuvio 2F).

Human (A, B, DF) tai hiiren tuumorisolujen ( C) herkistettiin inkuboimalla 50 ug /ml 5-ALA (DU145: 100 ug /ml) kanssa tai konsentraatiot fotofriini 16 h: n läsnä (A, D, E, F, PC-3, DU145 ) tai puuttuminen 5% seerumia (B, C, F, U87, U373). Solut säteilytetty laservalolla (635 nm) toimittamalla osoitti valoannoksien. Sen jälkeen kun ilmoitettu ajat, solujen elinkelpoisuus ja caspase3 /7 aktivaatio määritettiin ja esitetään joko% valvonnan kunakin ajankohtana (A-D, F) tai suhteellinen fluoresenssi (RFU, E, F). Huomaa eri taipumuksesta eturauhasen ja glioomasoluihin kärsivän apoptoosin pienen annoksen PDT.

transkriptiota osajoukko kemokiinin ja sytokiinien geenit on erittäin yliaktiivista kasvainsolujen jälkeen ei-tappavia

in vitro

PDT

Voit selvittää geenien joilla sääntely on purettu 4 h ja 24 h kuluttua ei-tappavia PDT suoritimme transcriptome analyysi säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen ihmisen ja hiiren kasvainsoluihin herkistetty inkuboimalla 5 Ala (olosuhteet on esitetty taulukossa S1). Suuri osa koetinsarjojen /geenien voimistunut PDT: n jälkeen on jaettu solulinjoja jopa eri solulinjoissa, jotka ovat peräisin kasvainten eri kudosten alkuperää (esim ~30-60% 24 h kuluttua PDT; Taulukko S2, Taulukko S3). Pathway analyyseistä Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ohjelma paljasti, että 24 tuntia säteilytyksen jälkeen, pois yhteensä 3479 geenin sarjaa, 208 geenin sarjaa merkittävästi yläreguloituja glioblastoomasoluissa, 156 geenin sarjaa eturauhassyövässä, ja 508 geeniä setit yhdistetyt näytteet (p 0,01) (taulukko S4). Sarjaa geenit näkyvimmin yläreguloituja kaikissa solulinjoissa kuuluvat reitit aktivoituvat solustressiä myös prosessien käynnistänyt vahinkoja läpi ultraviolettivaloa, hypoksia ja ionisoivaa säteilyä sekä geenin sarjaa, koodatut proteiinit, jotka haittaavat lisääntymistä ( ”negatiivinen säätely solujen sykli ”,” solusyklin pysähtymiseen ”ja” apoptoosi ”, taulukko 1). Merkittävintä on, useita immuunijärjestelmän reitit ovat transkriptionaalisesti aktivoida ei-tappavia PDT, kuten reitit ovat ”proinflammatoristen geenien”, ”interferoni-β-reitin” ja ”neutrofiilien aktivaation haavan paranemista” (taulukko 1, kuvio 3). Gene ontologia geeni sets merkittävimmin vaimentua kaikissa analysoitiin solulinjoissa havaittiin liittyvän mitokondrioiden väyliä (3 out of 5), joka on sopusoinnussa mitokondrioissa ollessa paikalla PpIX tuotannon ja ensisijainen vahinkoja ROS (taulukko S4) .

Gene asettaa rikastus analyysi (GSEA) paljasti aktivointi joukko geenejä 24 tunnin kuluttua ei-tappavia PDT kaikista 4 eturauhasen ja glioblastoomasolulinjoissa (tiedot esitetään PC-3), joka on myös todettu oltava ominaista neutrofiiliaktivaatiota haavan paranemisen aikana [55]. Ylössäätely havainnollistetaan pitoisuus pystysuoran mustia viivoja (jotka edustavat geeniperimä jäsen tehtävissä sijoittui geenissä luettelo) vasemmalla puolella geenin listan ( ”nolla cross”, katso ”vesiputous juoni” alareunassa kaavion) . Tämä jakelu johtaa korkeaan ja merkittävä rikastus pisteet (maksimi poikkeama vihreän linjan nollasta; P 0,001 ja väärien löytö määrä (FDR) 0,001).

neljä tuntia sen jälkeen ei-tappavat PDT, selostukset ”varhaisen reagoinnin geenit” olivat voimakkaimmin aiheuttama ja korkeimmin ilmaistu geenien sekä ihmisen ja hiiren kasvainsoluja (kuvio 4, taulukko S2, taulukko S3, kuva S2A-C). Tämä ryhmä geenejä koodaa transkriptiotekijöitä kuten FBJ hiiren osteosarcoma viruksen onkogeenin homologi (FOS), kesäkuu, aktivoiva transkriptiotekijä 3 (ATF3), varhainen kasvu vaste 1 (EGR1) ja DNA-vaurioita-indusoituva transkriptio 3 (DDIT3). Säätelyä näiden geenien puolestaan ​​johtaa transkriptio tyypillisiä stressin geenien kuten lämpösokkiproteiini (HSP) geenien ja voi aloittaa G1 pysähtymiseen ja apoptoosiin (DDIT3) [24], [25]. Todellakin, indusoituvia jäsenet HSP geeniperheen, nimittäin lämmön shock 70 kDa proteiinin 6 (

HSPA6

) seurasi sijoitusta

HSPA1A

ja

HSPA1B

olivat vallitsevasti aiheuttamaa geenit 4 h kuluttua PDT ihmisen tuumorisolulinjoja (kuvio 4A-D). Vuonna hiiren TRAMP-C1 ja TRAMP-C2-solujen selostukset ortologeihin kahden viimeksi mainitun jäseninä vallalla 4 h kuluttua PDT (kuvio S2B, C). Ylivoima selostukset varhaisen reagoinnin transkriptiotekijän ja HSP geenien katosi 24 tuntia PDT: n jälkeen, joka oli mukana lisääntynyt aktiivisuus kaksi suurta ryhmää liittyvien geenien vastakkaisen solun prosesseissa. Yksi voimakkaasti stimuloi ja korkean tason ilmaistuna ryhmä geenejä koodaa proteiineja, joilla on antiproliferatiivisia, proapoptoottisten ja anti-invasiivisen toiminnot indusoitavissa genotoksisten stressitekijöitä, kuten ROS (kasvua pidätys ja DNA-vaurioita-indusoituva beeta (GADD45B), dual-specific fosfataasi 1 (DUSP1), ADAM metallopeptidaasi kanssa trombospondii- tyypin 1 motiivi 1 (ADAMTS1), homokysteiinin indusoitavissa, Endoplasmakalvosto stressi-indusoituva ubikitiinistä kaltainen toimialuetta 1 (HERPUD1) [26], sinkkisormipolypeptidiin proteiini 36 (ZFP36); kasvu erilaistumista tekijä 15 /NSAI-aktivoitu geeni 1 (GDF15 /NAG-1 [27], spermidiinin /spermiini N1-asetyylitransferaasia 1 (SAT-1) [28]). toinen ryhmä geenejä koodaa proteiineja, joiden tiedetään tai oletetaan parantamiseksi solujen selviytymistä jälkeen solustressiä estämällä apoptoosin ja solukierron pysähtymisen (

aivoista X-linked 2

(

BEX2

) [25]) tai tukemalla vieroitus haitallisten yhdisteiden tuottamat ROS (

aldo-keto-reduktaasin 1C1 Twitter /

1C2

(

AKR1C1 Twitter /

AKR1C2

)) (kuva 4A-D).

Kasvain solut altistettiin ei-tappavia PDT jälkeen herkistymistä 5-ALA (A, C-F) tai fotofriini (B). Kokonais-RNA eristettiin 4 ja 24 tuntia PDT: n jälkeen, ja ne analysoitiin hybridisoimalla oligonukleotidi mikrosiruja. Normalisoinnin jälkeen, kertamuutos geeni-ilmentymisen välillä vastaa säteilytettyjen ja ei-irridiated näytteet laskettiin ja piirrettiin ekspressiotaso PDT: n jälkeen. Vain geenit ( ”koetin sarjat”) esitetään, jotka olivat ylös- ja alas-säädellä ≥3-kertaiseksi ja joille ”läsnä puhelu” on rekisteröity kaikille säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen näytteiden vastaavasti. Voimakkaimmin ajan tai alas -regulated ja eniten ilmaistuna geenejä näytteet tunnistetaan geenin symbolia. useita kuvaus geenin symbolien johtuvat läsnä useita koetinsarjojen yksittäisten geenien. koodaavat geenit immuunijärjestelmän modulatorisen proteiineja on lisäksi merkitty pienillä ympyröillä. Huomaa, että jälkimmäinen geenit ovat kaikkein voimakkaasti säädelty geenejä. värikoodin käytettiin erottamaan ryhmien geenejä, jotka koodaavat toiminnallisesti liittyviä proteiineja (katso boxed kuva legenda). kaikkiin tarkoitetaan näytteitä ilmentymisen arvojen kaksoiskappaleet käytettiin. FU, fluoresenssiyksiköinä.

Mielenkiintoista, joukossa geenit erittäin voimistuvan kasvainsolut PDT: n jälkeen oli useita immuunivasteen geenien, erityisesti kemokiinin ja sytokiinien geenit sekä kemokiini- ja sytokiinireseptorin geenien (kuvio 4, kuvio 5). Expression Huomattava osa näistä geeneistä oli merkittävästi voimistunut 24 h kuluttua PDT usein sekä eturauhasen ja glioblastoomasolulinjoissa (P 0,05, kaksisuuntainen-ANOVA-testi). Kaikkein johdonmukaisesti voimistunut geenit olivat kemokiinin geenit

CXCL2

,

CXCL3

ja

interleukiini-8

(

IL8

) /

CXCL8

sekä sytokiinigeenin

IL6

(kuvio 5A-C, H). Ylössäätely

CXCL2

,

CXCL3

geenien havaittiin jo 4 tunnin kuluttua PDT useimmissa solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Expression analyysi verkon geenituotteiden kanssa vuorovaikutuksessa IL6 paljasti mahdollista autostimulatoristen silmukan PC-3-solut, joissa IL6: n ja sen reseptorin alayksiköiden IL6R /IL6RA ja IL6ST /IL6RB (kuvio 6). Huomattavaa on, että ilmaus

CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin β

(

CEBPB: lle

), joka koodaa transkriptiotekijä tiedetään osallistuvan säätelyyn ilmentymisen

IL6

oli 3 kertainen ja 4,2-kertainen indusoiman 4 h ja 24 h kuluttua PDT, vastaavasti (ei esitetty). Lisäksi geenit koodaavat sekä negatiivisia että positiivisia sääntelyviranomaisten IL6 signaloinnin eli vaimennin sytokiinien signalointia 3 (SOCS3) ja Janus-kinaasi 1 (JAK1) /JAK2, vastaavasti, upregulated. Sillä

IL6

geenin olemme aiemmin osoittaneet, että transkription säätelyä näkyy myös kohonnut eritys koodatun proteiinin PC-3-soluja sen jälkeen, kun 5-ALA-pohjainen PDT [18]. Ei tilastollisesti merkittävää aktivoitumista havaittiin joitakin kemokiinin ja sytokiinien geenit (esim

CXCL1

(P = 0,25),

CCL26

(P = 0,24; tuloksia ei ole esitetty);

IL18

, kuva 5J);

CXCL14

havaittiin merkittävästi vaimentua (kuvio 5E). Validoida ekspressiotietojen saatu microarray oligonukleotidi kokeissa olemme analysoineet mRNA-tasoja valitun joukon geenejä (IL6, CXCL8 ja CXCL14) yhteensä RNA: PDT-käsiteltyjen ja kontrolli-soluissa 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. Olemme löytäneet hyvän välisen kahden ilmaisun arvoista määritetään kahdella eri määritysrajan menetelmistä (kuva S3, kuvio 5). Tätä kuvastaa kertoimia määrityksen R

2 lähellä 1,0 (0,947 ± 0,072) ja samanlainen tilastollisesti merkitsevä ylä- (IL6, CXCL8) ja alassäätöä (CXCL14) kuten todettu käyttäen oligonukleotidia microarray keräämiseen.

Kasvaimen solut altistettiin ei-tappavia PDT jälkeen herkistymistä 5-ALA tai fotofriini ja RNA analysoitiin 24 tunnin jälkeen toipuminen PDT hybridisaatiolla oligonukleotidigeenisirumenetelmää kuvatulla Legend kuvioon 4. Keskimääräiset ilmaisun arvojen suhteellinen fluoresenssi (RFU) ja niiden poikkeamat ilmaistaan ​​interleukiini ja kemokiinin ja interleukiini ja kemokiinireseptorin geenit näkyvät. Sillä

CXCL8

ja

CXCL14

geenien 202859_x_at ja 222484_s_at koetinsarjojen käytettiin vastaavasti. PC-3 ja U87 tarkoitetaan näytteitä ilmentymisen arvot kaksoiskappaleita varten DU145 ja U373 näytteitä yhden mittauksia käytettiin. Merkitys tasoa (P) laskettiin Kaksisuuntainen ANOVA.

Muutokset geenien ilmentymisen 4 h ja 24 h kuluttua PDT mitataan oligonukleotidin mikrosirujen analyysit kuvataan kertainen muutos (fluoresenssi säteilytettyjen /non -irradiated näyte). Suuruus kertainen muutos näkyy eri värejä ( 1,2-kertainen, valkoinen; ≥1.2-kertainen, 2-kertainen, oranssi, ≥2-kertainen, punainen). Vahvin voimistumista ilmaisun havaittiin

IL6

geeni (12,3-kertainen), jotka voisivat osa autostimulatoristen silmukan kanssa myös voimistunut IL6 reseptorialayksiköitä (IL6R ja IL6ST). Koko ovals ilmaisee absoluuttisen ekspressiotason jälkeen PDT ( 100 FU, pieni symboli, ≥100, 1000, keskipitkän symboli; ≥1000, suuri symboli). Linjojen soikio symboloivat eri vuorovaikutusta proteiinien tai geenejä.

on kuitenkin vain murto-osa geenien (-25%), joka oli ensisijaisesti säädelty (≥4-kertaisesti) PC-3 tai U87 solujen ja siten saattaa ilmetä kudoksen alkuperämaan-erityisiä stimulaatio. Eniten eri tavalla kannustanut geenit ovat joko jo verrattain voimakkaasti ilmaistu penseä solulinjassa (esim

EGR1

,

IL11

,

AKR1C1-3

vuonna U87; CD55 PC -3) tai todennäköisesti eivät kuulu ohjelmistoon ilmaistavissa geenien vastaavissa solulinjassa (

tumareseptorin subfamily 4 ryhmän jäsen 1

(

NR4A1

),

tuumorinekroositekijä -α aiheuttama proteiinin 6

(

TNFAIP6

),

dehydrogenaasin /reduktaasin (SDR perhe) jäsen 9

(

DHRS9

),

sykliiniriippuvainen estäjä 1A

(

Kip2

) in U87) (taulukko S5).

vertailun vain harvat geenit /koetin sarjat olivat vaimentua 3-kertaiseksi jälkeen PDT (kuvio 4E , F ja tietoja ei ole esitetty). Voimakkaimmin ilmaisivat geenejä, jotka vaimentua usein koodattu solujen kasvua ja selviytymistä edistävät proteiinit.

ROS indusoitavissa geenit tehokkaammin voimistuvan 5-ALA-pohjainen PDT kuin fotofriini välittämä PDT

Mielenkiintoista, vaikka endogeenisesti tuotetun PpIX ja synteettiset oligomeerisen porfyriinin fotofriini arvellaan toimivan eri solun osiin [3], on vastaava joukon geenejä oli voimistunut sekä 4 tunnin ja 24 tunnin kuluttua ei-tappavia PDT in PC-3-solut (kuvio 4A, B). Vaikka samantasoista eston solujen elinkelpoisuuden 4 h kuluttua ei-tappavia PDT (5-ALA 15 ± 3%; fotofriini 17,5 ± 0,5%; taulukko 1) 14% (28/204) geenien /anturi asetetaan, jotka olivat yli 3-kertaiseksi voimistunut jälkeen 5-ALA-pohjainen PDT, osoitti ≥4 kertaa suurempi transkription aktivaation verrattuna annoksen jälkeen fotofriini välittämää PDT (taulukko S6). Ensisijaisesti voimistunut geenit, joita esitettiin korkealla tasolla kuuluivat muun geenejä, varhainen muuniresponssigeeneinä (

FOS

), HSP geenit (

HSPD1, HSPA6

), solujen selviytymisen geenejä (histoni cluster 1-geenien), sekä immuunivasteen geenit (

IL1A

,

CCL26

). Sen sijaan ei geeni ilmentyy voimakkaasti jälkeen PDT ( 1000 RFU) selektiivisesti stimuloi fotofriini-pohjainen PDT (taulukko S6).

transkription säätelyä proinflammatoristen geenien TRAMP-C2 kasvaimia jälkeen ei-tappavia PDT

Koska ilmaus kemokiini ja sytokiinien geenit johdonmukaisesti yläreguloituja solulinjoissa jälkeen 5-ALA-pohjainen PDT

in vitro

, tutkimme, onko 5-ALA-pohjainen PDT voi myös indusoida proinflammatoristen geenien kasvaimia, jotka voivat tukea anti-kasvain immuunireaktioita. Käytimme kasvain malli hiiren TRAMP-C2-eturauhassyövän soluissa, joita kasvatettiin subkutaanisesti albiino C57BL /6-hiiret, jotka sallitaan transdermaalinen säteilytys kasvaimen näkyvää valoa. Ensin optimoitu herkistymistä olosuhteissa mittaamalla kertyminen PpIX ihon yli kasvaimen jälkeen i.p. injektio 5-ALA arviona varten PpIX muodostumista kasvainkudoksessa. Useimmissa hiirissä, maksimaalinen PpIX tasot ihon saavutettiin 2-3 h (kuvio 7A). Samanlainen kineettinen on PpIX kertymistä havaittiin määritettiin spektrofotometrisesti PpIX in kasvainuutteiden (kuvio 7B).

kinetiikka PpIX kertymistä hiirikudoksissa i.p. injektio 5-ALA määritettiin joko mittaamalla suoraan PpIX fluoresenssin ihossa kattaa kasvain (A) tai fluoresenssi spektroskooppiset määritys PpIX kasvaimen otteita yhdellä hiiren kukin joka uhrattiin ilmoitettuina ajankohtina (B). PpIX kertyminen eri kudoksissa suhteessa TRAMP-C2 kasvaimen 3,5 h kuluttua 5-ALA injektio on esitetty (C). (A), joka on tyypillinen kineettinen on PpIX kertymistä iholla on esitetty. Maksimaalinen kertyminen PpIX ihon ja kasvainkudoksessa havaittiin ~180 min kuluttua 5-ALA injektio. Kasvaimet alistettiin PDT (75 J /cm

2) sen jälkeen herkistymistä 5-ALA 180 minuutin aikana. Huomaa, että 5-ALA välittämä PDT jälkeen maksimaalinen herkistyminen oli vain vähäinen (D) tai ohimenevä estävä vaikutus kasvaimen kasvuun (E), vaikka kahtena hakemuksen yksi viikko. Sillä transcriptome analyysi, herkistyneet kasvaimet yhdestä hiiren kukin käsiteltiin tai ei laservalolla (635 nm; 75 J /cm

2), leikataan 4, 14 tai 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. RNA eristettiin ja analysoitiin hybridisoimalla oligonukleotidi mikrosiruja. Normalisoinnin jälkeen, kertainen muutos geenien ilmentymisen välillä säteilytettyjen ja ei-irridiated näytteet laskettiin ja piirrettiin ekspressiotason PDT: n jälkeen (F). Vain geenit ( ”koetin sarjat”) esitetään, jotka voimistunut ≥3-kertaiseksi ja joille ”läsnä puhelu” on rekisteröity säteilytettyä näytettä. Voimakkaimmin voimistunut ja korkeimmin ilmaistuna geenejä näytteissä tunnistetaan geeni symboleja. Moniosainen esitys geenin symbolien johtuvat läsnä useita koetinsarjojen yksittäisten geenien. Geenit koodaavat immuuni modulatorisen proteiineja lisäksi merkitty pienillä piireissä. AFU; mielivaltainen fluoresenssi yksiköitä; n, määrä hiirien testattu.

Verrattuna TRAMP-C2 kasvaimia, suhteelliset korkeat PpIX löydettiin otteita maksan, rakkularauhanen ja ihon (kuvio 7C). Tämä saattaa johtua siitä, että voimakkaan ilmentymisen PpIX effluksitransportteri geeni

Abcg2

C2 kasvaimia ja C2 kasvaimen solulinja (kuvio S1) ja voisi selittää annosta rajoittava sivuvaikutukset hiirillä jälkeen PDT. Näin ollen, kun otetaan annokset, joita voitaisiin johtaa tehottomaan valvontaan kasvaimen kasvua (kuvio 7D, E). Transcriptome analyyseistä RNA eristettiin säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen koko kasvaimen 14 h ja 24 h kuluttua PDT paljasti, että osa korkeasti transkriptionaalisesti aktivoida geenien jälkeen ei-tappavia PDT koostuu pääasiassa geenejä, jotka koodaavat proinflammatoristen tekijöiden (Kuva 7F; Kuva S2). Kuten havaitaan PDT-hoitoa saaneilla tuumorisolulinjoja,

Cxcl2

,

Cxcl3

ja

IL6

olivat voimakkaimmin voimistunut geenit, vaikka emme voi sulkea pois, että nämä sytokiinit ilmaistiin stroomasolut kasvaimen mikroympäristössä tai kasvaimeen liittyvän immuunijärjestelmän soluihin. Mielenkiintoista,

Sprr2h

(

pieni proliinipitoinen proteiini 2

) geenin tiedetään säätelevän IL6 /STST3 signalointi [29] on toiseksi voimakkaimmin aiheuttama geeni 14 h kuluttua PDT (kuva 7F). Neljä h kuluttua PDT,

Hsp1a

ja

Hsp1b

kuului ryhmään voimakkaimmin aktivoituu ja korkeimmin ilmaisivat geeneistä (kuvio 7F).

Keskustelu

Various syitä, miksi ei-tappavien PDT käytetään usein tahattomasti kasvainsoluihin

in vivo

. Yksi näistä syistä on se, että solujen kasvaimen ovat usein heterogeenisiä ja voivat erota niiden kyky kerääntyä PS sekä niiden alttius oksidatiivista stressiä. Itse asiassa havaitsimme silmiinpistävää vaihtelevuus PpIX kertymistä eri tuumorisolulinjoja käyttää. Tämä ei rajoitu kasvainsoluihin

in vitro

, mutta havaittiin myös kasvainsolujen

in vivo

[30], [31]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme geenejä, jotka yläreguloituja syöpäsoluissa, kun ei-tappavia PDT

in vitro

ja verrattiin niitä geenejä, jotka vaikuttivat kasvainkudosten sisällä

in vivo

. Tärkeää on, olemme huomanneet, että syöpäsoluja riippumaton niiden kudoksen alkuperästä (eturauhas- ja aivot) itse säädellä lisäävästi immuuni liittyviä geenejä vastauksena PDT-indusoidun solujen stressiä. Tämä osoittaa, että oksidatiivinen stressi indusoi samanlaisia ​​vasteita eri solutyypeissä, joiden kaikkien tavoitteena on rajoittaa herkkyyttä solujen ROS, korjata aiheutettu solun viat ja koordinoida immuunivasteiden tarkoitus tyhjentää peruuttamattomasti vahingoittuneen kudoksen organismista.