Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset todisteet yhdistää eturauhassyövän korkeat kolesteroliarvot, jossa kolesteroli on tärkeä raaka-aine solujen kasvun. Solussa, kolesterolin homeostaasin ylläpitää kaksi master transkriptiotekijät: steroli-sääntely elementti sitova proteiini 2 (SREBP-2) ja maksan X-reseptori (LXR). Olemme aiemmin osoittaneet, että androgeenireseptorin, merkittävä toimija eturauhassoluhomoge- fysiologia, vaihtaa nämä transkriptiotekijät edistää kolesterolin kertymistä. Koska eturauhassyövän hoito kohdistuu androgeenireseptorin, valikoimalla soluja, joilla on muuttunut androgeenireseptorin aktiivisuutta, miten tämä vaikuttaa SREBP-2 ja LXR toimintaa? Käyttämällä uutta eturauhassyövän etenemisen malli, selvitimme miten tämä ylikuulumisen androgeenireseptorin ja kolesterolin homeostaasiin muutosten aikana eturauhassyövän kehitykseen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Ensinnäkin tunnettu meidän etenemisen malli, johon osallistui 1) viljellään LNCaP fysiologisessa testosteronitasot tuottaa androgen sietävä LNCaP-305 soluja, ja 2) viljellään LNCaP-305 kanssa antiandrogeeninen Casodex tuottaa kastraatio kestävät LNCaP-364-soluissa. Tämä eteneminen liittyi ilmen- tymisen lisääntymisen androgeenireseptorin ilme, se todetaan yleensä kliinisesti, ja väheneminen androgeenireseptorin aktiivisuutta. Vaikka tämä vaikuttaa kuinka SREBP-2 ja LXR kohdegeenien vastasi androgen hoitoon, solu kolesterolia ja heidän muuttuvien steroli- asema oli samankaltainen kaikissa LNCaP alamomenteista.

Päätelmä /merkitys

Kaiken kolesteroli homeostaasiin ei vaikuta muuttamalla androgeenireseptorin aktiivisuutta eturauhassyövän soluissa. Tämä ei tee tyhjäksi suhdetta androgeenien ja kolesterolin homeostaasiin, vaan ehdottaa, että muut tekijät kompensoimaan muuttuneen androgeenireseptorin aktiivisuutta. Koska kolesteroli asetus säilyy aikana etenemistä, tämä tukee kasvavaa ajatusta, että kolesterolin aineenvaihduntaan on sopiva kohde eturauhassyöpään.

Citation: Krycer JR, Brown AJ (2013) Onko muuttaminen androgeenireseptorin Status aikana Eturauhassyöpä Development vaikutus kolesteroli Homeostasis? PLoS ONE 8 (1): e54007. doi: 10,1371 /journal.pone.0054007

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 17 syyskuu 2012; Hyväksytty: 05 joulukuu 2012; Julkaistu: 8. tammikuuta 2013

Copyright: © 2013 Krycer, Brown. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AJB tutkimus- tukee avustusta Eturauhassyöpä Foundation of Australia (PG2710, https://www.prostate.org.au). Jrk on vastaanottaja Petre Foundationin apurahan (https://www.petrefoundation.org.au). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska löytö androgeenien, nämä hormonit ovat tiiviisti eturauhasen. Normaalin eturauhasen solut ovat riippuvaisia ​​androgeenien lisääntymistä, erilaistumista, ja ylläpitää erittävien toimintoja. Tämä välittyy androgeenireseptorin (AR), transkriptiotekijä aktivoidaan näitä hormoneja.

Tämä käsite hormoni riippuvuus perustettiin nobelisti Charles Huggins [1], ja muodostaa biologiset perusteet androgeenipuutteen terapia (ADT), suuri nykyaikainen hoitostrategia metastaattisen eturauhassyövän (PCA). ADT kuuluu kemiallinen kastraatio alentaa veren androgen tasoilla (~ 10 nM testosteronia [2] – [3] optimaalisesti ~0.7 nM) [4]. Tämä on usein täydennetty käsittelemällä antiandrogeenit (esimerkiksi casodex /biculatimide), jotka kilpailevat jäljellä olevat androgeenien AR pyrkii näin estämään täydellisesti Jälleenkytkentätoiminto. Yhdessä Kaksiosaiselle hoitoa kutsutaan ”yhdistettynä androgeenien saarto” [5]. Vaikka 80-90% potilaista aluksi reagoi hyvin ADT, PCA lopulta sairauden pahenemisvaihetta mediaani 18 kuukauden ajan [6], etenee jotta ”kastraatio kestävä” tila, joka tekee ADT tehottomaksi.

Castration- resistenttejä PCa (CR-PCA) on erittäin aggressiivinen, liittyvä kuolleisuus oli korkein PCA. Näin ollen on olemassa tarve ymmärtää paremmin fenotyyppisiä muutoksia, jotka tapahtuvat aikana etenemisen CR-PCa. Yksi tällainen ominaisuus hiljattain saamassa kiinnostus on kolesterolin aineenvaihduntaan (esim [7]). Korkea kolesterolipitoisuus on yhdistetty PCA riski epidemiologisissa tutkimuksissa [8] – [9], kun taas laboratorion tutkimuksissa on todettu, että solunsisäiset kolesteroliarvot nousevat, kun eturauhasen solut ovat syöpä [10]. Tällaiset kolesterolin kertyminen voisi edistää PCa kehitystä esiasteena syntetisoimiseksi kalvoja, androgeenien ja muiden toimijoiden signaalinvälitysreittien [7], [11]. Siten kolesterolia alentavat lääkkeet on otettu huomioon PCa hoitoon [7] – [9], [12]. Näitä toimia voitaisiin lisätä tutkimalla syitä kolesterolin kertymistä PCA.

Solun sisällä, kolesteroliarvot ovat pitkälti säätelee kaksi master transkriptiotekijät: steroli sääntely elementti sitova proteiini-isoformin 2 (SREBP-2) ja maksan X-reseptori (LXR). SREBP-2 ylössäätelee geenien kolesterolin synteesiä (esim

HMGCR

) ja oton (esim LDL- reseptorin,

LDLR

). Tämä lisää kolesterolia, mikä vähentää SREBP-2 aktiivisuutta palautetta asetuksella. Sen sijaan, hapetettuja kolesteroli johdannaiset (oksisterolit) aktivoivat LXR, joka alentaa solun kolesterolitasoja säätelemällä geenien mukana kolesterolin ulosvirtausta, kuten ATP-sitova kasetti kuljettaja isoformeja A1 (

ABCA1

) ja G1 (

ABCG1

).

Nämä kaksi transkriptiotekijöitä vaikuttavat androgeenit: AR aktivoi SREBP-2 säätelemällä sen säädin, SCAP [13] – [14], ja estää LXR mukaan koaktivaattorikompleksien kilpailu [14]. Näin AR säätää kolesterolin homeostaasiin yhdenmukaisella tavalla, säätämättä miten androgeenit edistävät kolesterolin kertymistä eturauhasen soluissa (esim. [15]). Koska CR-PCa syntyy muuttaa androgeenireseptorin (ja AR) asema, tässä tutkimme, miten kolesterolin homeostaasin muuttuu aikana eteneminen CR-PCa. Tämän saavuttamiseksi, käytämme uusi CR-PCa etenemisen malli.

tutkimiseksi CR-PCa

in vitro

, eteneminen malleja (esim [16] – [17]) ovat yleisesti syntyy androgeenien-riistää LNCaP solu-linjan, joka on androgeeniriippuvainen, AR-positiivisten PCa solulinjassa [18]. Nämä mallit ovat enemmän informatiivinen kuin androgen riippumaton solulinjojen, kuten PC-3, joka ei ilmennä AR [19], koska ne mahdollistavat suoran vertailun vanhempien ja androgeenista riippumaton soluja.

Vaikka edellinen LNCaP-etenemisen mallit ovat tuottaneet runsaasti tietoa androgeenista riippumaton (PCA tarkistetaan [20]), on ollut kaksi suurta varovaisuudella. Ensimmäinen, LNCaP-soluja viljellään rutiininomaisesti alusta täydennettynä naudan sikiön seerumia (FBS), joka sisältää androgeenitason vastaa kuohittua ihmisen uros [2]. Myöhemmin LNCaP solu-line on valittu kasvamaan androgeeni-niukasti ympäristössä, toisin kuin kliininen ”hormoni-naiivi” (pre-ADT) PCa. Itse asiassa, fysiologisen, kuohitsemattomat testosteronitasot (~ 10 nM [2] – [3]) inhiboivat LNCaP-solujen kasvua (esim, [21]), koska AR toimii ”lisenssi tekijä”, joka estää solusyklin etenemisen [ ,,,0],22] – [23]. Toiseksi, LNCaP-solut ovat tyypillisesti androgen-riistää pitkäaikaisin kulttuuri alusta täydennettynä hiilellä erotettua FBS. Charcoal-strippaus poistaa paitsi androgeenien päässä FBS, mutta muut hormonit ja kasvutekijät, ja näin ollen voi edusta riittävästi kliinistä ADT. Olemme tuottaneet etenemisen malli, joka voittaa nämä varoitukset [12].

Täällä me kuvaamaan tätä mallia käyttäen sitä testaamaan hypoteesia, että muutokset AR signalointi ja kolesterolin homeostaasin CR-PCa solut liittyvät. Koska AR vaikuttaa kolesterolitasoa, selvittää, onko tämä vuorovaikutus muuttuu aikana eteneminen CR-PCa auttaisi määrittämään mahdollisia kolesterolimetabolian tavoitteeksi CR-PCa.

Tulokset

ominaispiirteiden kastraation kestävä PCa etenemisen malli

LNCaP-soluja viljeltiin aluksi FBS täydennettynä fysiologinen testosteronin pitoisuus, joka tuottaa 305 solulinja (kuvio 1A). Nämä solut ovat androgeeniriippuvaisissa PCa soluja, jotka voivat kasvaa seerumin-androgeenitason, sietää korkeampia androgeenikonsentraatiot kuin vanhempien LNCaP (kuvio 1 C). Tämä lähestymistapa kehittää androgeenin sietävien solujen samalla suoritettiin aikaisemmin [17], paitsi me korvataan synteettisellä AR-agonisti R1881 testosteroni. On todennäköistä, että vaikutus testosteronin johtuu suoraan aktivoinnin AR tai muuntaminen voimakas androgeeni, dihydrotestosteroni, eikä aromatisation estrogeenit, koska testosteronin ja dihydrotestosteronin on samankaltaisia ​​vaikutuksia solujen elinkelpoisuuden (kuvio S1A).

(A) Kaavamainen hahmotellaan kehitystä näiden LNCaP sub-linjat, joissa pitkäaikainen viljely, kun läsnä on joko testosteronin (T) tai Casodex (CDX). Tiedot tekstissä. (B-D) Soluja käsiteltiin 10% (v /v), seerumit ja lääkkeiden pitoisuudet ilmoitettu. (B), tähän sisältyy FBS (LNCaP) tai FBS täydennettynä 10 nM T (305) tai 10 uM CDX (364). In (C) ja (D), tähän sisältyy FBS: n tai CS-FBS, jossa T ja CDX pitoisuuksina ilmoitettu. Solujen proliferaatio määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B-D) Data esitetään keskiarvona + keskivirhe, kolmesta erillisestä kokeesta solua kohti line, jokainen suoritetaan neljänä kaivoihin kohti kunnossa. In (D), virhepylväät ovat sisällä symbolit.

simuloida ADT (erityisesti yhdistettynä androgeenien saarto), 305-soluja viljeltiin FBS (sisälsi kastraatiotason androgeenien), johon anti- -androgen Casodex (kuvio 1A). Tämä tuotti androgeenisäädellyn riippumaton 364 solulinjassa, jossa on vain vähän proliferatiivinen vaste joko androgeenien (kuvio 1 C) tai antiandrogeenit (kuvio 1 D). Tämä fenotyyppi oli stabiili ainakin 10 kohtia (kuvio S1B). Lisäksi positiivisena kontrollina, PC-3-solut olivat yhtä vastetta media-androgeenireseptorin tila (kuvio S1C).

Verrattuna 305 ja vanhempien LNCaP, 364 solut kasvoivat hitaammin (kuviot 1 B, S1D) ja riippumatta media-androgeenien tila (kuviot 1C, D). Tämä eroaa muista tutkimuksista (taulukko 1), mikä johtuu todennäköisesti viljelemällä FBS sijaan CS-FBS, millä varmistetaan, että vain AR-aktiivisuutta kohdistettu pitkän aikavälin valinta 364 solua. Lisäksi riippumattomuus 364 soluja median androgeenihoito asemaa, jos pieni etu CS-FBS (kuvio 1 B), mikä tarkoittaa, että hiili-strippaus paitsi poistaa androgeenien, mutta muita kasvua edistäviä tekijöitä. Tämän vuoksi on perusteltua lähestymistapamme generoimaan kastraatio kestävä solujen rivi casodex käsittely FBS (kuvio 1A).

Seuraavaksi tunnettu AR asema näiden solulinjojen kautta AR proteiinin ilmentymisen ja AR aktiviteetti, jälkimmäinen arvioidaan mRNA ilmaus kanonisen AR-kohdegeenin,

PSA

(prostataspesifisen antigeenin). Autoregulaatioon AR tasojen (esim. [24]) voidaan havaita testosteronin ja casodex hoitoa LNCaP (kuvio 2A,

kaistat

1-3). Verrattuna näiden vanhempien solut, 305-solut oli korkeammat AR-proteiinin tasoja niiden ruselatusainetta (kuvio 2A,

kaista

5 vs 1), mutta samanlaisia ​​AR aktiivisuus (kuvio 2B). Samoin alle androgeenin puutteesta olosuhteissa (CS-FBS), 305-solut oli pienentynyt seerumin vaste dihydrotestosteroniksi (kuvio 2C), on esitetty sekä

PSA

mRNA tasolla (

yläpaneeli

) ja

PSA

promoottorin aktiivisuutta (

alapaneelin

). Yhdessä tämä heijastaa niiden mukauttaminen korkeampia seerumin-androgeenitason väheneminen AR aktiivisuutta.

(A-B) Soluja kasvatettiin Medium A 10 nM testosteronia (T) tai 10pM Casodex (CDX). (A) proteiini kerättiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottauksella vastaan ​​androgeenireseptorin (AR) ja α-tubuliinin. (B) RNA kerättiin ja

PSA

mRNA-tasot määritettiin qRT-PCR: llä, normalisoitu LNCaP-soluja. (C)

Ylälevy

: Solut nälässä vuonna Medium B 24 tuntia, ennen kuin hoito 1 nM dihydrotestosteronin (DHT) ja /tai 10 uM CDX vuonna Medium B vielä 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen RNA kerättiin ja

PSA

mRNA-tasot määritettiin qRT-PCR: llä, normalisoitu apuaineella hoidettuun LNCaP-soluissa.

Pohjalevy

: Transfektion jälkeen solut ympättiin Medium B. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin 1 nM DHT ja /tai 10 uM CDX alustassa B, vielä 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus, tehty suhteessa ajoneuvon kunnon kussakin solulinjassa. (D) yhteenveto saatujen tulosten (A-C). (A) Täplät ovat edustavia neljä erillistä koetta. (B-C) Data esitetään keskiarvona + SE, kolmesta erillisestä kokeesta solua kohti line, jokainen suoritetaan kolmen kuopan kohti kunnossa.

Lisäksi 364-solut ovat vielä korkeampi AR tasoja (kuvio 2A ), jota on havaittu muissa

in vitro

tutkimuksissa (taulukko 1) ja monissa kliinisissä CR-PCa näytteitä (esim -30% kliinisistä CR-PCa näytteet on AR geenimonistuman joka on osoitettu lisäävän AR ilme [25] – [27]). Vaikka pohjapinta AR aktiivisuus oli pienempi (kuvio 2B), casodex toiminut agonistisesti (kuvio 2C) katsottuna muissa tutkimuksissa (taulukko 1). Yhdessä meidän malli kuvastaa huomattavan osajoukko CR-PCa ja näyttää muutoksen AR toiminnan aikana etenemisen kastraation-vastus (kuva 2D).

Onko kolesterolin homeostaasin muutos tässä mallissa?

Koska AR edistää SREBP-2 aktivointi ja estää LXR [13] – [14] (kuvio 3A), niin miten näitä vuorovaikutuksia vaikuttavat kastraatio-vastus? Tutustua, tutkimme vaste SREBP-2 ja LXR kohdegeenien (kuvio 3A) ja androgen manipulointia.

(A) Kaavamainen hahmotellaan vaikutukset androgeenireseptorin (AR) keskeisiin transkriptiotekijöitä kolesteroli homeostaasiin. Tiedot tekstissä. (B-C) Soluja nälkiinnytettiin Medium B 24 tuntia, ennen käsittelyä 1 nM dihydrotestosteronin (DHT) ja /tai 10 uM CDX alustassa B, vielä 24 tuntia. Hoidon, RNA korjattu ja (B)

LDLR

ja

HMGCR

, ja (C)

ABCG1

ja

ABCA1

, mRNA-tasot määritettiin by qRT-PCR, normalisoitu ajoneuvon kunnon kussakin solulinjassa. (B-C) Data esitetään keskiarvona ± SE, kolmesta erillisestä kokeesta solua kohti line, jokainen suoritetaan kolmen kuopan kohti kunnossa.

Kuten olemme osoittaneet aiemmin [14], dihydrotestosteroni hoito lisäsi SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä (kuvio 3B) ja vähensi LXR kohdegeenin ilmentymistä (kuvio 3C) LNCaP-solut, ja nämä vaikutukset palautettiin casodex. 305-solut osoittivat samanlaista mutta pyöristettyjä kehitys (kuviot 3B, C), vastaamaan vähentynyttä AR aktiivisuus verrattuna LNCaP (kuva 2). Samoin 364-soluissa, SREBP-2 ja LXR aktiivisuus oli vastannut dihydrotestosteroni hoitoon ja Casodex toimineet agonistisesti vähentää LXR kohdegeenin ilmentyminen (kuviot 3B, C). Siten koko etenemisen malli, androgeenireseptorin tila on vaihteleva vaikutus SREBP-2 ja LXR.

Näin ollen näiden kahden suuren kolesterolia sääntelyviranomaisten olisi vaikuttaa muuttamalla AR toiminnan aikana etenemisen. Todellakin, löydämme samanlaista jakaumaa

PSA

ilme. Ensinnäkin oli pieni ero kohdegeenin ilmentymisen välillä LNCaP ja 305-solut (kuviot 4). Toiseksi, kuten

PSA

, SREBP-2 kohdegeenin ilmentyminen on vähennetty 364-soluissa (kuvio 4A). Kun otetaan huomioon, AR antagonistinen LXR (kuvio 3C),

ABCG1

ilmentyminen on suurempi 364-soluissa, kuten odotettiin, mutta

ABCA1

ilmentyminen vähenee (kuvio 4B).

Soluja kasvatettiin heidän -peruselatusaineessa: Alusta A (LNCaP), johon oli lisätty 10 nM testosteronia (305) tai 10pM Casodex (364). RNA kerättiin ja (A)

LDLR

ja

HMGCR

, ja (B)

ABCG1

ja

ABCA1

, mRNA-tasot määritettiin qRT- PCR, normalisoitu LNCaP. (A-B) Tiedot esitetään keskiarvona + SE, kolmesta erillisestä kokeesta per solu-line, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto.

Näistä muutoksista huolimatta vakaan tilan kolesteroliarvot olivat samanlaisia ​​välillä LNCaP, 305, ja 364-solut (kuvio 5A). Tämän ~95% oli vapaa kolesteroli (kuten todettu aiemmin LNCaP-soluissa [14]) kaikissa solulinjoissa (tuloksia ei ole esitetty). Erityisesti kun otetaan huomioon, että on olemassa kaksi-kertainen kolesterolitasoa, kun eturauhasen epiteelisolujen kehittyä PCa [10], tämä viittaa siihen, että pohjapinta kolesteroli homeostaasin säilytetään huolimatta muuttunut AR tila aikana eteneminen kastraatio-vastus.

( A) Soluja kasvatettiin perusinsuliininsa media: Alusta A (LNCaP), johon oli lisätty 10 nM testosteronia (305) tai 10pM Casodex (364). Kolesterolin tasot määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) Soluja käsiteltiin niiden ruselatusainetta, minkä jälkeen LDL sisäänotto määritettiin. (C) Solut maljattiin perusinsuliininsa median, sitten nälässä yön Medium C. Muutaman päivän, soluja käsiteltiin 6 h tai ilman 10 uM 25-hydroksikolesteroli- (25-HC) in Medium C, minkä jälkeen LDL otto oli määritetään. (A-C) Data esitetään keskiarvona + SE, kolmesta erillisestä kokeesta solua kohti line, jokainen suoritetaan kolmen kuopan kohti kunnossa.

Tämä snapshot ei valaista siitä castration- resistentit solut reagoivat eri tavalla muuttuviin sterolin asemaan. Esimerkiksi kun löytää pohjapinta LDL otto oli samankaltainen solulinjojen (kuvio 5B), selvitimme vastaus oksisteroleja, 25-hydroxcholesterol, joka vähentää SREBP-2 aktiivisuus ja siten LDLR toimintaa [28]. Kaikki solulinjat reagoivat samalla 25-hydroksikolesteroli- käsittely (kuvio 5C). Tutkia niiden sterolien vaste edelleen, palasimme transkription säätelyyn, käyttäen 25-hydroksikolesteroli- samanaikaisesti estää SREBP-2 ja aktivoi LXR. Vaikka käytimme Lusiferaasimäärityksiä aikaisemmin tähän tarkoitukseen [12], analysoimme kohdegeenin ilmentymisen tänne, jotta voimme: 1) tutkia LXR ja SREBP-2 aktiivisuutta samanaikaisesti samalla solupopulaatioiden, ja 2) ovat lyhyemmät hoitoajat (mRNA tasoilla tyypillisesti reagoida nopeammin kuin promoottori perustuva lusiferaasi tasoa), jotta voimme tutkia akuutti vaste steroleja. Osoituksena Periaatteessa tämä määritys vahvisti, että PC-3-solut ovat korkeammat SREBP-2 aktiivisuus kuin LNCaP-soluja (kuvio S2A), kuten on esitetty aiemmin [28]. Sen sijaan, SREBP-2 reagoivat samalla 25-hydroksikolesteroli- LNCaP, 305, ja 364-solut (kuvio 6,

yläpaneelien

).

Solut maljattiin niiden ruselatusainetta: Alusta A (LNCaP), johon oli lisätty 10 nM testosteronia (305) tai 10pM Casodex (364). Solut nälässä yön yli Medium C, ja sitten sitä käsiteltiin 6 h 25-hydroksikolesteroli- (25-HC) in Medium C, annettuina pitoisuuksina. Käsittelyn jälkeen RNA kerättiin ja

LDLR

,

HMGCR

, ja

ABCG1

tasot määritettiin qRT-PCR: llä, normalisoitu ajoneuvon kunnon kussakin solulinjassa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE, kolmesta erillisestä kokeesta per solu-line, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto.

Lisäksi tämä oksisteroleja oli sama vaikutus LXR-kohdegeenin (

ABCG1

) ilmentymistä sekä LNCaP ja 364-solut (kuva 6,

alapaneelin

). Tämä vaste oli heikompi 305-soluissa, mutta talteen kun solut ympättiin FBS ilman testosteronia lisäravinteen (kuvio S2B). Tangentiaalisesti, löysimme samanlainen vaikutus LNCaP-soluissa (tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että nämä solut voivat kerääntyä androgeenien hoitoa edeltävänä vuonna mättömällä media; Tämä jäljellä androgeeni voisi puolestaan ​​stimuloida AR ja estävät LXR-odotuksiin

ABCG1

ilmaisu (kuvio 3C). Kuitenkin tämä malli viittaa siihen, että pyöristetty AR toimintaa kastraatio-resistenttien solujen ei vaikuta niiden kykyyn reagoida solun sterolien tila.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme luonnehtia

in vitro

PCa malli, joka koostuu kolmesta osasta (kuvio 1): (1) LNCaP-soluja, jotka on sovitettu alhaisen seerumin-androgeenitason, (2) 305-soluissa, joka on sovitettu korkea seerumin-androgeenitason, ja (3 ) 364 solua, joka on sovitettu kasvu riippumatonta seerumin androgeenihoito tila. Nämä muutokset olivat mukana muutokset AR aktiivisuuden (kuvio 2). Vaikka cross-talk välillä AR ja kolesterolin sääntely vähenee suunnassa LNCaP ja 305-364 soluihin (kuvio 3), huomasimme, että yleinen kolesteroli homeostaasin säilyy muuttumattomana (kuviot 4,5,6).

Meidän PCa malli androgeeni sietävä 305-solut olivat vähentyneet AR vastata verrattuna LNCaP-soluja (kuvio 2), mutta olivat yhtä herkkiä androgeenipuutteen (kuvio 1). Niinpä simuloitu yhteenlaskettu androgeenien saarto jonka casodex hoito androgeeni-köyhien FBS. Tuloksena 364 solut ovat korkeammat AR lauseke, joka on yhdenmukainen muutoksen eteneminen CR-PCa

in vivo

[29] ja kliinisissä näytteissä [25], [30]. Lisääntynyt AR ilme voi aiheuttaa antiandrogeenit toimimaan agonistit (esimerkiksi [16], [29], [31]), kuten havaittiin here (kuva 2) – tämä tukeutuu AF-1 domain AR, mikä viittaa muuttunut stoikiometria kanssa transkription jaksoihin [31]. Lisääntynyt AR ilmaisun ja Casodex agonism on yhteinen teema jaettu aiemmin tutkimuksissa (taulukko 1) – mielenkiintoisesti, CS-FBS käytettiin näissä tutkimuksissa (taulukko 1, kuva 2), kun taas tämä casodex agonism hävisi FBS (tuloksia ei ole esitetty) , mikä viittaa seerumin tausta voi vaikuttaa säätelijäproteiinien stoikiometria. Kuitenkin, hyödyntämällä alhainen androgen sisältöön FBS ja välttää pitkän aikavälin kulttuuri in CS-FBS, olemme saaneet kolme LNCaP alamomenteista että vaihtelevat niiden AR toimintaa.

Koska välinen ylikuuluminen AR, SREBP- 2 ja LXR (kuva 3), nämä solut tarjoavat mahdollisuuden tutkia vaikutusta erilaisten AR valtioiden PCA kolesterolin homeostaasin (kuviot 4-5). Vuodesta LXR akseli, havaitsimme poikkeava vaste välillä LXR geenikohteet: pienemmällä AR aktiivisuutta 364 soluissa (kuvio 2), pohjapinta

ABCG1

ilmaisun odotetusti nousi, kun taas

ABCA1

ilme oli vähennetään (kuvio 4). Tämä havaittiin aiemmin kastraatio-resistenttien solujen valittu pitkäaikainen viljely CS-FBS [32], mikä viittaa siihen, että AR voi myös vaikuttaa ABCA1 välittävän joka vastustaa LXR. Tämä sama väli voi vaikuttaa myös SR-BI, toinen LXR kohdegeenin (esim [33]), joka välittää HDL otto ja ulosvirtaus [34], koska

SR-BI

mRNA ilmaisun vähensi myös vuonna 364-soluissa ( Kuvio S3). Lisäksi alustavat kokeet osoittivat mitään eroja seerumin riippuvaisten kolesterolin ulosvirtauksen välillä LNCaP sub-linjat (tuloksia ei ole esitetty), mutta tulevissa tutkimuksissa tulisi harkita erityisiä kolesteroli harjoittajat leikellä vaihtoa kolesterolin kanssa solun ulkopuolelle, jotta voidaan määrittää seuraukset tämän erilaisen sääntelyn välillä SR-BI, ABCA1, ja ABCG1.

Sen sijaan toinen ryhmä viljelty LNCaP ksenografteina kastroitu hiirillä, havainto, että

ABCA1

ja

SR-BI

ekspressio lisääntyi kastraation vastustuskykyisten kasvainten [35], mutta

ABCG1

ilmaisua ei tutkittu. Käyttämällä tätä samaa mallia,

SREBP-2

mRNA ja aktivoitu SREBP-2-proteiini olivat korkeammat seuraavat eteneminen CR-PCa [36], sekä lisääntynyt kolesterolin synteesiä [35]. Tämä korreloi mentymisprofiili tutkimukset potilailla, löytää lisääntynyt ilmentyminen SREBP-2 [37] ja sterolin biosynteettinen [38] geenejä. Toisessa tutkimuksessa havaittiin vähentynyttä ilmentymistä [39], mukaisesti lasku SREBP-2 kohdegeenien havaittu täällä 364-soluissa, mikä puolestaan ​​korreloi vähentynyt AR aktiivisuutta. Näistä muutoksista huolimatta vakaan tilan kolesteroliarvot olivat samankaltaisia ​​androgeeniriippuvaisissa PCa ja CR-PCa soluja, sekä tässä tutkimuksessa (kuvio 5A) ja

in vivo

ksenograftimallia [35]. Parhaan tietomme mukaan ei ole tietoa kolesterolia CR-PCa etäpesäkkeitä.

Nämä havainnot eivät selitä dynaamista luonnetta kolesterolin homeostaasin. Siten tutkimme vaikutus AR tilan reagointikykyä solujen muuttuviin sterolia tila – sikäli kuin tiedämme, tämä on ensimmäinen tutkimus vertailla tällaisia ​​kolesterolin homeostaasin emo ja kastraatio kestävä LNCaP. Vaikka SREBP-2 on yleensä palaute-säädellään steroleja, viittaavat siihen, että CR-PCa solut ovat steroli-vastustuskykyisiä, joka perustuu korkeampia kypsä SREBP-2

in vivo

[36] ja korkeamman SREBP-2 aktiivisuutta AR -negatiivinen PC-3-solujen verrattuna LNCaP ([28], kuva S2A). Olemme kuitenkin havainneet, että SREBP-2 ja LXR LNCaP, 305, ja 364-solut reagoivat samalla tavoin sterolit (kuvio 6), joilla on samanlaiset tulokset toiminnallisella tasolla LDL oton (kuva 5). Koska huolellinen, tämä etenemistä malli liittyy pitkäaikainen kulttuuri, joka voi tuottaa muutoksia kuin AR tila. Siten voidaan väittää, että nämä havainnot voitaisiin tukea suoremmin geenimanipulaatiot (esim AR yli-ilmentyminen ja knockdown), mutta yhä AR ilmaisua ei välttämättä paranna AR aktiivisuutta (kuten näkyy 364-soluissa), lyhytaikaisissa transfektioissa vaikuttaisi elinkelpoisuuden (samoin manipuloimalla AR aktiivisuus kuvassa 1), ja vakaa transfektiot aiheuttaisi pitkäaikaista kulttuurista ja näin kokevat samat varovaisuudella.

kuitenkin, havainnot tässä tarkoita, että on olemassa korvaavia mekanismeja torjumaan muutoksia kolesteroli homeostaasin [ ,,,0],40], menettämisen vuoksi perustason AR toimintaa. Esimerkiksi androgeeniablaatio liittyy nousu aktiivisen Akt [41], signalointikaavio kinaasi jotka olemme löytäneet parantaa SREBP-2 aktivointi [42]. Lisäksi vaikka nykyinen

in vitro

tutkimus mahdollistaa pelkistettyä lähestymistapaa ja käsittelyt kuten muuttamalla solujen sterolien tila, se ei selitä muutoksiin

in vivo

. Esimerkiksi eturauhasen kudos on yleensä hypoksinen, ja tämä on parannettu androgeeniablaatio [43] – koska suhde steroli- homeostaasiin ja happipitoisuus [44], tulevaisuuden kokeita tulisi tutustua PCA.

Kaiken meidän työ ei tee tyhjäksi suhdetta androgeenien ja kolesterolin homeostaasiin PCA soluissa (kuva 3), mutta viittaa siihen, että muut tekijät voivat kompensoida muutosten pohjapinta AR aktiivisuuden eri PCa soluja. Nämä on selvitetty tulevaisuuden kokeita. Jos kolesteroli sääntely on muuttumaton aikana etenemistä CR-PCa, tämä on kaksi vaikutuksia: ensin, että solut tarvitsevat ylläpitämään riittävää kolesterolin pitoisuus kasvun ylläpitämiseksi (sääntelyviranomaisten välittävät tätä vielä löydettävä), ja toiseksi, että CR-kumppanuus- olla yhtä alttiita kuin naiivi PCa lääkkeille, jotka manipuloida kolesterolin aineenvaihduntaan. Olemme aikaisemmin havainneet, että LNCaP ja 364 solut ovat molemmat herkkiä estävien lääkkeiden SREBP-2 aktiivisuus [12], joka tukee kasvava ajatus, että kolesterolin aineenvaihduntaan on sopiva kohde CR-PCa [7].

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

FBS saatiin Bovogen (Vic, AU) ja penisilliiniä /streptomysiiniä Life Technologiesin (Vic, AU). Kaikki muut alustan komponentit saatiin Sigma-Aldrich (NSW, AU). Kuten aiemmin on kuvattu, FBS tehtiin hormonin puutosta tuottamalla hiilellä erotettua FBS: ää (CS-FBS) [14], tai kolesteroli-puutteellinen tuottamalla lipoproteiiniin puutteellinen FBS (FBLPDS) [28]. Dil-leimattua LDL (Dil-LDL) valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [28]. Casodex (bikalutamidi), Hoechst-33258, kompaktiini (mevastatiini), mevalonaatin, ja 25-hydroksikolesteroli- saatiin Sigma-Aldrich. Testosteroni ja dihydrotestosteroni olivat lahjoja tohtori David Handelsman (ANZAC Research Institute, NSW, AU).

Soluviljely

PCA solulinjojen, LNCaP [18] ja PC-3 [19] olivat lahja tri Pamela Russell (Australian Eturauhassyöpä tutkimuskeskuksen, Qld, AU), ja pidettiin Alusta A (RPMI 1640, johon oli lisätty 10% (v /v) FBS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä). Sukupolven LNCaP-305 ( ’305) ja LNCaP-364 (’ 364) solujen kuvattu aiemmin [12]. Numerot ”305” ja ”364” osoittaa kokeen indeksinumero. 305 ja 364 soluja ylläpidettiin ja istutettiin niiden valinta media, joka Alusta A täydennettynä 10 nM testosteronia tai 10pM Casodex vastaavasti. Ennen solujen, levyt ja astiat käsiteltiin polyetyleeni-imiini (Sigma-Aldrich) parantaa soluadheesiota, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kuten määritelty kokeissa, PCa soluja käsiteltiin Medium B (RPMI: ssä 1640-, johon on lisätty 10% (v /v) CS-FBS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), poistaa vaikutuksen eksogeenisen androgeenien. Vaihtoehtoisesti, solut käsiteltiin Medium C (RPMI, täydennetty 10% (v /v) FBLPDS, 5 uM kompaktiini, 50 uM mevalonaatin, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), alentaa solun kolesterolin tilan myöhempää sterolin hoito [12].

Hoechst määritys soluproliferaation

soluja ympättiin ja käsiteltiin kuten solujen elinkelpoisuuden määritykset on kuvattu aiemmin meidän ryhmämme [12] – lyhyesti, solut ympättiin 10000 solua kuoppa 96-kuoppalevyille fenolipunattomassa RPMI, jota oli täydennetty 0,1% (v /v) naudan seerumialbumiinia. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin lisäämällä yhtä suuri tilavuus fenoli-punaista-RPMI, joka sisälsi seerumia ja huumeiden kuhunkin kuoppaan, saavuttaa lopulliset pitoisuudet on määritelty kuvioissa. Hoidon, WST-1 määritys vältettiin täällä, koska olemme huomanneet, että korkeampia androgeenikonsentraatiot stimuloi WST-1 vähentäminen vähentää samalla solujen elinkelpoisuuden (kuvio SA), mikä erottamalla oletettu korrelaatio aineenvaihdunnan aktiivisuuden ja elinkelpoisuutta WST-1 määrityksessä. Siten solujen kasvu sen sijaan kvantitoitiin käyttäen Hoechst tahra määritys [45], muutamin muutoksin: Media imettiin ja levyä jäädytettiin -80 ° C: ssa. Levyjä sulatettiin nopeasti huoneen lämpötilassa ja 100 ui vettä kuoppaa kohti ennen jäädytystä uudelleen -80 ° C: ssa. Levyt sulatettiin, minkä jälkeen lisättiin 100 ui Hoechst-33258 liuosta, joka sisälsi 10 ug /ml Hoechst-33258 TNE-puskuriin (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 2 M NaCl, 1 mM EDTA). Fluoresenssi mitattiin

F

Ex = 360 nm ja

F

Em = 440 nm, käyttäen Fluostar Galaxy fluorometrissä (BMG Labtech, Vic, AU).

Western blotting

hoidon jälkeen, solun analysoitiin Western blottauksella, kuten on kuvattu aiemmin [14] – lyhyesti, solut lyysattiin käyttämällä SDS: ää ((1% [w /v] SDS, 10 mM