Krooninen sairaus

tiivistelmä

RUNX3 (runt liittyvä transkriptiotekijä-3) on raportoitu tukahduttaa kasvaimen kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden eri ihmisen syövissä. Tässä tutkimuksessa käytimme kudos microarray (TMA) määrittää merkitystä RUNX3 eturauhassyövässä progession. Tulokset osoittavat ektooppinen ilmentyminen RUNX3 eturauhassyövässä kudoksissa verrattuna kasvaimen vieressä normaalissa eturauhasessa kudoksiin, ja vähentää RUNX3 värjäys korreloi merkitsevästi TNM-luokitus. Lisäksi olemme osoittaneet, että RUNX3 yliekspressio inhiboi eturauhassyövän Solujen migraation ja invaasion johtuvat koholla upregulation kudoksen estäjä matriisin metalloproteinaasi-2 (TIMP-2), joka tämän jälkeen inhiboi metalloproteinaasi-2: n (MMP-2) ilmentymisen ja in vitro. Knock alas RUNX3 ilmaisun hajosi tasapaino TIMP-2 /MMP-2, kun taas hiljaisuus TIMP-2 johti MMP-2: n ilmentymisen eturauhasen soluissa. Osoitimme myös, että palauttaminen RUNX3 vähentynyt verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) eritystä ja tukahdutti endoteelisolujen kasvua ja putken muodostumiseen. Silmiinpistävän, RUNX3 osoitettiin estävän tuumorimetastaasin ja angiogeneesiä in vivo. Kaikkiaan tuloksemme tukevat kasvain tukahduttava roolia RUNX3 ihmisen eturauhassyövän, ja antaa oivalluksia kehittämistä täsmähoitoihin tähän sairauteen.

Citation: Chen F, Wang M, Bai J, Liu Q, Xi Y Li W, et ai. (2014) Rooli RUNX3 tukahduttamaan Etäpesäke ja Angiogeneesi Ihmisen eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10,1371 /journal.pone.0086917

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 elokuu 2013; Hyväksytty: 16 joulukuu 2013; Julkaistu: 24 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukee avustusta National Natural Science Foundation of China (nro 81302207). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa [1]. Kirurginen toimenpide on edelleen tehokkain hoito ensisijainen eturauhassyövän, joskin noin 30% eturauhasen potilaista esiintyy sairauden uusiutumisen ja /tai metastaasien jälkeen alkuperäisen hoitoja, jolloin suhteellisen lyhyessä elinaikajakson (12-15 kuukausi) [2]. Etäpesäke on harvinaisen monimutkainen prosessi, mukaan lukien syöpäsolut siirtyvät pois primaarikasvainten ja tunkeutua viereisiin kudoksiin, intravasate vereen tai lymfakiertoa, hengissä verenkiertoon, ja kohdistaa tiettyihin elimiin aloittaa metastaattinen kasvain [3]. On tärkeää ymmärtää paremmin mekanistinen perusta tuumorimetastaasin tunnistamalla avainmolekyylejä mukana tässä prosessissa, joka antaa oivalluksia kehittämistä tehokkaampia keinoja estää syövän etenemiseen.

Runt domain perhe, joka koostuu RUNX1, RUNX2, ja RUNX3, ovat master sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen solujen lisääntymistä ja erilaistumista. RUNX proteiinit sisältävät hyvin konservoituneen verkkotunnusta 128 aminohappojen alue (Runt domain) ja muodostaa stabiilin kompleksin PEBP2b /CBFb käyttämään sen transaktivaatio kyky [4]. Kaikki kolme RUNX perheenjäsenten tärkeitä rooleja normaalissa kehitys- prosesseja ja tumotigenesis [5]. RUNX proteiinit säätelevät ilmentymistä solun geenien sitoutumalla-promoottorit tai tehostajat kohdegeenien liittyvät solun kohtalon päätöksiä, jotka tulevat häiriintynyt syöpäsoluissa [6].

Kolmesta RUNX perheenjäsenten, RUNX3 oli alun perin kloonattiin AML2 ja on kromosomissa 1p36.1. RUNX3 raportoitiin ensimmäisen korreloivan genesis ja etenemisessä ihmisen mahasyövän tuumorisuppressorina [7]. Sen lisäksi, mahasyöpä, on raportoitu, että ektooppinen ekspressio RUNX3 havaittiin erilaisten syöpien, mukaan lukien rintasyövän, gliooman [8], [9]. Analysointi kliinisistä kudosnäytteitä vatsakalvon etäpesäkkeitä johtuvat mahasyövistä antaa näyttöä, että RUNX3 ilmaisu väheni merkittävästi metastaattisen kudoksessa verrattuna normaaliin mahan limakalvoa tai ensisijainen tärkein kasvaimia. ([10]) Mikä tärkeintä, lasku RUNX3 proteiinin ilmentyminen liittyy merkittävästi huono selviytyminen mahasyövän ja melanooma potilaiden [11], [12]. Edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että RUNX3 voi toimia tuumorisuppressorina säätelemällä solumigraation, invaasion ja angiogeneesin munuaissolukarsinoomassa [13]. Nämä tutkimukset viittaavat keskeinen rooli RUNX3 että kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Kuitenkin toiminta RUNX3 eturauhassyövässä ei ole vielä tutkittu paljon.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmentymistä RUNX3 suhteessa viittaavia tekijöitä käyttäen eturauhassyöpää kudosta mikrosirun. Huomasimme, että menetys RUNX3 ilmaisun suoraan korreloi eturauhassyövän TNM vaiheessa. Lisäksi palauttaminen RUNX3 ilmaisun johti tukahduttaminen MMP-2 ja induktio TIMP-2, jotka muodostavat ainakin osittain tukahduttaminen tumopr etenemisen ja etäpesäkkeiden. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​roolia RUNX3 säätelyssä TIMP-2 /MMP-2 normaalissa eturauhasessa soluissa. Lisäksi osoitimme, että lasku VEGF erityksen aiheuttamien RUNX3 uudelleen esti eturauhassyöpää angiogeneesiä. Kliinisen ja mekanistisen tulokset osoittivat, että RUNX3 voi olla tuumorisuppressori mukana etenemisen eturauhasen syöpä ja kohdentamiseen RUNX3 reitin muodostaa potentiaalisen hoitomuotoa ihmisen eturauhasen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus kudosta microarray suoritettiin alla protokolla hyväksymä Institutional Review Boards of Affiliated sairaala Xuzhou Medical College ja kaikki tutkimukset tehtiin saatuaan kirjallisen tietoon perustuva suostumus.

kaikki eläin kokeet suoritettiin käyttäen urospuolisten nude-hiirten (6-7 viikkoa vanhoja). Hiiret ostettiin SLAC Laboratory Animal Ltd, Co (Shanghai, Kiina) ja hoidetaan mukaisesti National Institutes of Health Guide for Care ja koe-eläinten käytön. Kaikki eläin tutkimussuunnitelma hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean Xuzhou Medical College (IACUC nro 1201).

Potilaat ja näytteet

eturauhassyövän TMA ostettiin Shanghai Xinchao Biotechnology ( Shanghai, Kiina). Kasvaimet lavastettu mukaan vuoden 2013 tarkistettu TNM järjestelmä seuraavasti [14]: 139 tapausta, joissa vaiheissa I-II ja 79 tapauksissa vaiheiden III-IV. Lisäksi se sisältää 52 tapauksissa kasvaimen viereisen normaalin eturauhasen kudosta. Array piste halkaisija oli 1,5 mm, ja jokainen piste edustaa kudosta paikan yksilöstä näytteestä, joka oli valittuna ja patologisesti vahvistettu.

immunohistokemia

Immunohistokemia värjäys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Ensisijainen kanin anti-RUNX3 vasta-ainetta (1:200) (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japani), anti-VIII (1:100), anti-PAP (1:100) (Santa Cruz, CA, USA) ja biotinyloitu anti-hiiri-IgG (1:200) (Boster Biotech, Wuhan, Kiina) käytettiin. Sillä TMA värjäyksen arviointia, immunoreaktiivisuus arvioitiin sokkona kaksi riippumatonta tarkkailijaa valomikroskoopilla (Olympus BX-51 valomikroskoopilla), ja kuva kerättiin Camedia Master C-3040 digitaalikamera. Ilmentyminen RUNX3 luokiteltiin positiivisiksi, kun 10% syöpäsolujen osoitti immunopositivity. Koepaloja 10% kasvainsoluja osoittaa immuunivärjäysmenetelmällä katsottiin negatiivinen [15].

Solulinjat ja transfektio

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3, DU145 ja eturauhassoluhomoge- RWPE-1 ostettiin Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). HUVEC saatiin Nanjing Kaiji Biotech. DU145-soluja viljeltiin F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS). RWPE-1-soluja ylläpidettiin K-SFM mediun 10% FCS. PC3-soluja, ja HUVEC-viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% FCS: ää. Solut olivat 37 ° C kostutetussa inkubaattorissa 95% ilmaa, 5% CO

2. PFLAG-ohjaus ja pFlag-RUNX3 ilmentymisplasmideja saatu tri Pei-Jung Lu (National Cheng-Kung yliopisto, Tainan, Taiwan).

lyhytaikaista transfektiota, transfektio pFlag-ohjaus ja pFlag-RUNX3 plasmidit PC3 ja DU145 soluja suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Shanghai, Kiina) seuraten valmistajan protokollaa. Transfektion si-RUNX3, si-TIMP-2 ja valvoa siRNA osaksi RWPE-1-soluja suoritettiin käyttäen siLentFect Lipid reagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Tä stabiilia transfektiota varten, lentiviruksen ilmentämisvektorit Lv5-RUNX3 ja Lv5-Control saatiin Shanghai Gene Pharma Company (Kiina). Lentivirukset sekoitettiin polybreenin (5 ug /ml) ja lisätään DU145-solujen infektio. Positiiviset kloonit valittiin puromysiiniä (5 ug /ml). Vakaa RUNX3 transfektantit eristettiin 2 viikon aikana valinta.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Solun maahanmuutto- ja invaasiomääritys määritettiin käyttäen modifioitua kahden kammion migraatiokokeessa jonka huokoskoko 8 pm . Sillä migraatiokokeessa, 1 x 10

6 PC3 ja DU145 solut ympättiin seerumittomassa väliaineessa ylemmässä kammiossa. 12 h inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, solut ylemmässä kammiossa poistettiin varovasti pumpulipuikolla ja soluja, jotka oli kulkenut kalvon kiinnitettiin metanolissa, värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin. Sillä invaasiomääritys, solut ympättiin seerumittomassa elatusaineessa ylemmässä kammiossa. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, noinvasive solut poistettiin varovasti yläosasta matrigeelin kanssa pumpulipuikolla moppi. Invasiivinen solut alareunassa Matrigel kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin leucocrystal violetti. Kvantifioinnin solut laskettiin mikroskoopilla viidellä (ylös, alas, mediaani, vasen, oikea. × 200).

HUVEC kasvu- ja Putken muodostumisen määritys

Transfektoidut PC3 ja DU145 solujen viljeltiin 6-kuoppaisella levyllä tuoretta täydellistä elatusainetta 24 tunnin ajan, väliaine kerättiin ja sentrifugoitiin kaiken solujäännöksen poistamiseksi ennen sen käyttöä väliaine. Solujen kasvun määrityksessä, 2 x 10

4 HUVEC suspendoitiin 100 ui: aan elatusainetta ja ympättiin tiheydellä 2 x 10

4 96-kuoppaiselle viljelylevylle ja inkuboitiin 24 tuntia. Sitten, soluproliferaatiota havaittiin käyttäen Cell laskenta kit-8 (CCK-8) hankittiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Shanghai, Kiina). Putkien muodostuminen määrityksessä, 48-kuoppainen levy päällystettiin Matrigelillä (BD Biosciences, NJ, USA) ja pidettiin 37 ° C: ssa 0,5 tuntia. Sitten, 2 x 10

4 HUVEC suspendoitiin 100 ui väliainetta ja lisättiin ennalta päällystetty 48-kuoppaiselle levylle. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa vielä 24 h, määrä kapillaarimaisen putket kolmesta satunnaisesti valitusta kenttää laskettiin ja valokuvattiin Nikon käännettyä mikroskooppia (Nikon, Japani).

ELISA VEGF

PC3 ja DU145-solut maljattiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille tiheydellä 1 x 10

6 solua kuoppaa kohti. Sitten solut transfektoitiin pFlag-ohjaus ja pFlag-RUNX3 kanssa seerumistarvaatio. Supernatantit kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. VEGF-konsentraatio määritettiin käyttäen Quantikine ELISA-kittejä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (R käänteinen GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3; TIMP2 eteenpäin, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG; CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG ja GAPDH eteenpäin, TgAA GGTCGGAGTCAACGGATT; kääntää, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT.

Western blot -analyysi

Solun tai kudoksen uutteita erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Proteiinit siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: hiiren anti-RUNX3, kanin anti-MMP-9, MMP-2, TIMP-1 ja TIMP-2 (Cell Signaling Technology, MA, USA) ja hiiren anti-β-aktiini (Santa Cruz, CA, USA). Sitten membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-kani ja vuohen anti-hiiri-IgG) 2 h, värjättiin värjäytyminen nestettä, joka sisältää 10 ml alkalista fosfataasi-puskuria, ja kehitettiin käyttäen NBT /BCIP värisubstraattia (Promega, Madison, USA ).

in vivo Kokeellinen metastaasin mallit

Kaksi ryhmää 8 nude hiiriä pidettiin SPF este tilat alle 12 tunnin valo /pimeä sykli. Hiiret injektoitiin häntälaskimoon RUNX3 stabiilisti transfektoitujen DU145-soluja (1 x 10

6 solua per kylki) 100 ul: ssa PBS: ää. Insuliini neulaa käytettiin häntälaskimoon injektion. Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla ja vain yhden solun suspensiot 95% elinkelpoisia käytettiin. Hiiret lopetettiin 8 viikon kuluttua implantaatiosta, keuhkot fiksoitiin 10% virallisen telmillä, ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjättiin etäpesäkenystyröiden.

ihonalainen in vivo kokeet

arvioimiseksi putkeen muodostumista, kaksi ryhmää 8 nude-hiiriin injektoitiin RUNX3 stabiilisti transfektoitujen DU145-soluja (1 x 10

6 solua per kylki) 100 ul: ssa PBS: ää /Matrigel (50:50) ihon alle. Eläimiä seurattiin päivittäin. Kehon paino kunkin hiiren kirjattiin ja kasvaimen tilavuus määritettiin Vernier paksuus päivittäin, seuraavan kaavan mukaisesti A x B

2 x 0,52, jossa A on pisin halkaisija kasvaimen ja B on lyhin halkaisija. Hiiret lopetettiin 8 viikon kuluttua implantaatiosta, ja kasvaimet poistettiin kirurgisesti ja kiinnitettiin 10%: muodollinen telmillä histologiaa varten. Kaikki koe-eläin menettelyt suoritettiin noudattaen institutionaalisten eettisten vaatimusten ja hyväksytty komitean Xuzhou Medical College varten käytön ja hoidon Animals.

Tilastollinen analyysi

Numeeriset tulokset ilmaistaan ​​keinoin ± SD Tilastollisia eroja välineet eri ryhmien arvioitiin Instat 5,0 (GraphPad-ohjelmisto, San Diego, CA) käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). TMA, tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 11.5 ohjelmistolla (SPSS). Yhdistyksen välillä RUNX3 värjäystä ja ennusteeseen viittaavia parametreja eturauhassyöpäpotilaalla, kuten ikä, kasvaimen koko, kasvaimen ja TNM-luokitus, arvioitiin χ

2 testiä. Merkitystä in vivo data määritettiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​Mann-Whitneyn U-testi. Erot katsottiin tilastollisesti erilainen

P

0,05.

Tulokset

RUNX3 Expression on Alennettu Human Eturauhassyöpä

Ensimmäinen määritettävä, RUNX3 ilme muutetaan ihmisen eturauhassyöpää. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin TMA dia sisältävä kasvain viereisten normaalissa eturauhasessa kudoksiin ja eturauhasen syöpä kudoksiin. Presentative kuvat on esitetty kuvassa. 1A. Tuloksemme osoittivat, että oli merkitsevästi alhaisempi RUNX3 ilmaisun kasvaimia kuin kasvaimen viereiseen normaaliin eturauhaskudoksiin (

P

0,01, Fig. 1 B). Nämä ehdotti, että RUNX3 oli yleisesti ilmaistu normaalissa ihmisen eturauhasen kudosta mutta vähentynyt tai puuttuu eturauhassyöpäkudoksen.

Edustaja immunohistokemiallista otettiin valokuvia eri suurennoksilla kasvaimen viereiseen normaalissa eturauhasessa ja eturauhassyöpäkudoksille (Ylälevy × 100, pohjapaneeli × 400). B Verrattuna että kasvaimen viereiseen normaalin eturauhasen kudosta, yleinen ekspressiotaso RUNX3 eturauhasen syöpä kudoksiin oli merkitsevästi pienempi (

P

0,01, χ

2 -testi). C Laskua RUNX3 ilmentyminen korreloi TNM (

P

0,01, χ

2 testi, jossa verrataan I-II vs. III-IV).

Menetys RUNX3 Expression in eturauhassyöpä liittyy kasvaimen vaiheesta

kaikissa 218 eturauhassyöpäpotilaille, suhde RUNX3 ilmaisun ja patologisen ja kliinisen piirteet on esitetty taulukossa 1. keskimääräinen (SD) ikä potilailla oli 58,7 vuotta ( mediaani 66,5 vuotta valikoima, 37-87 vuotta). Koska TNM vaihe on tärkeä prognostinen markkeri potilaille, joilla on eturauhasen syöpä, me havainnut RUNX3 ilmentymistä 139 varhaisen vaiheen (I-II) sekä 79 myöhäisvaiheen (III-IV) luokkiin eturauhassyöpäkudoksille. Löysimme RUNX3 värjäytyminen laski rajusti vuonna loppuvaiheissa verrattuna alkuvaiheen I-II (

P

0,01, Fig. 1 C). Emme kuitenkaan ole löytänyt merkittävä korrelaatio RUNX3 ilmaisun muiden ennusteeseen viittaavia muuttujia, kuten ikä, kasvaimen kokoa ja laatu.

Palauttaminen RUNX3 Expression Inhibioitu syöpäsolujen Muuttoliike ja Invasion in vitro

Koska RUNX3 ilmentyminen liittyy TNM eturauhasen syöpä, RUNX3 voi olla tärkeitä rooleja yhdessä tai useammassa vaiheessa eturauhassyövän etäpesäkkeiden. Ensin tutkia vaikutusta RUNX3 uudelleen eturauhasen syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. Me transfektoitiin lyhytaikaisesti PC3 ja DU145 solujen pFlag-ohjaus ja pFlag-RUNX3 plasmideja. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, proteiini yliekspressoituvat merkittävästi syöpäsoluja (Fig. 2A ja B). Transfektoidut solut altistettiin solujen migraatiomääritys ja invaasiomääritys. Solussa migraatiokokeessa, huomasimme, että RUNX3 palauttaminen PC3 ja DU145 solujen vähentynyt kyky kulkeutua Boyden kammion 55% ja 63%, tässä järjestyksessä (Kuva. 2C ja D) (

P

0,05) . Solussa invaasiomääritys, RUNX3 transfektoidut solut osoittivat merkitsevästi pienempi invasiivisia teho kuin kontrolli, jossa invasiivista solujen 57% ja 82% vuonna PC3 ja DU145 soluja, tässä järjestyksessä (Kuva. 2E ja F) (

P

0,05, ANOVA).

invasiivinen kyky syöpäsoluja voidaan säätää MMP. Tutkia mahdollista roolia MMP: iden RUNX3 inhiboivan vaikutuksen soluinvaasiota teimme gelatiinitsymografialla mitata MMP-2 ja MMP-9 toimintaa. MMP-2-entsyymin aktiivisuus tukahdutettiin jälkeen pakko ilmentymistä RUNX3 PC3 ja DU145 soluja (Fig. 3A). Western blot käytettiin tutkimaan TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja eturauhassyöpäsoluissa. Tulokset osoittavat, että MMP-2-proteiinin taso johtuu lisääntyneen ekspression TIMP-2, kun RUNX3 yliekspressio sekä solulinjoissa (Fig. 3B). Jotta edelleen vahvistaa asemaa RUNX3 säätelyssä TIMP-2 /MMP-2, normaalissa eturauhasessa cell RWPE-1 käytettiin tutkimuksessamme ja meidän tiedot osoittivat, että kaataa of RUNX3 ilmaisun hajosi tasapaino TIMP-2 /MMP -2 (Fig. 3C), kun taas hiljaisuus TIMP-2 johti inhibitio MMP-2: n mRNA ja proteiinin ilmentyminen eturauhasessa solussa (Fig. 3d ja E). Nämä tulokset osoittivat, että RUNX3 oli mukana säätelyssä TIMP-2 /MMP-2.

A MMP-2 ja MMP-9 arvioitiin gelatiinitsymografialla. B Western blot-analyysi suhteellisen proteiinin MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 ja β-aktiini in RUNX3 uudelleen ilmentymisen ja kontrolliryhmässä sekä PC3 ja DU145 solulinjat. C Western pyyhi proteiinia MMP-2, TIMP-2 ja β-aktiini in RUNX3 viipalointi ja kontrolliryhmän RWPE-1-solulinjassa. D Western blot-analyysi MMP-2 ja β-aktiini ilmaisun jälkeen kaataa TIMP-2. E Reaaliaikainen PCR MMP-2: n mRNA ilmaisun jälkeen kaataa TIMP-2. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. *

P

0,05.

Palauttaminen RUNX3 Expression Alennettu Angiogeneesi in vitro

edelleen vaikutuksen määrittämiseksi palautettu RUNX3 ilmentymisen angiogeenisten potentiaalia ihmisen eturauhasen syöpäsolut, angiogeeninen potentiaaleja supernatantista PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin pFlag-ohjaus- tai pFlag-RUNX3 määritettiin endoteelisolujen proliferaation määritys ja putken muodostumisen määritys. Vuonna solulisäkasvumääritykselle, olemme huomanneet, että saadun sopeutetun elatusaineen PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin pFlag-RUNX3 inhiboi endoteelisolujen proliferaatiota verrattiin kontrolli-soluissa (kuvio. 4A ja B). Putken muodostumisen määritys, aste putken muodostumiseen arvioitiin prosentteina solun pinta-ala verrattuna kokonaispinta-ala. Kuten kuviossa 4C ja D, keskimäärin täydellisen putkimaisia ​​rakenteita muodostuu HUVEC pieneni merkitsevästi kunnostetussa alustassa alkaen RUNX3 yli-ilmentävät PC3 ja DU145 soluja verrattuna vektorin valvontaa (

P

0,05).

A ja B CCK-8-solujen lisääntymisen määritys suoritettiin havaitsemiseksi HUVEC leviämisen. C ja D edustaja kuvat on otettu in situ putken muodostumiseen supernatanttiin PC3 ja DU145 solut transdusoitiin pFlag-ohjaus ja pFlag-RUNX3. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. E ELISA eritystä VEGF PC3 ja DU145 solut transdusoitiin pFlag-ohjaus ja pFlag-RUNX3. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. *

P

0,05.

VEGF on tärkeä mitogeeni ja eloonjäämistekijänä endoteelisolujen. Vastauksena angiogeeninen stimulaatio, endoteelisolujen käynnistää aktiivisen proliferatiivinen tila. Arvioida mekanismi RUNX3 säätelevä angiogeneesin, ELISA suoritettiin havaitsemiseksi VEGF erittyy ilmastoitu viljelyalustaan ​​eturauhasen syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, vähennetään merkittävästi VEGF erityksen havaittiin kunnostetussa alustassa välillä PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen pFlag-RUNX3 verrattuna säätökennoja (

P

0,05).

Palauttaminen RUNX3 Expression INHIBITED etäpesäke vivo

Koska RUNX3 ilmaisu vähentynyt kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota in vitro, häntälaskimon metastaattinen määritystä käytettiin analysoimaan in vivo vaikutuksia RUNX3 ilmaisua metastaattisen tehoon DU145 soluja. Verrattuna ohjata infektoiduissa soluissa tyhjä virusvektoria, HE-värjäys osoitti, että häntälaskimoinjektio solujen pysyvästi infektoitu Lv5-RUNX3 kateenkorvattomiin nude-hiiriin johti huomattavasti vähemmän määrän kyhmyjä keuhkoissa (Fig. 5A ja B). Edelleen vahvistaa tätä etäpesäkkeiden, suoritimme immunohistokemiaan havaita kriittinen eturauhassyövän merkkiaineisiin. Prostataspesifisen antigeenin (PSA) ja eturauhasen hapan fosfataasi (PAP) pidetään kriittinen markkereita eturauhassyövän diagnoosia [16]. Kuitenkin, PSA ei ole ilmaistu DU145 soluissa [17]. Siten käytimme PAP tutkimuksessamme selvittää lähde kasvain solmujen keuhkoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, PAP positiivinen keuhkokudoksessa osoitti, että kaukainen etäpesäke eläinmallissa päässä DU145 soluista, jotka ruiskutetaan hännän aluksesta. Nämä tulokset osoittivat merkittäviä estäviä vaikutuksia RUNX3 keuhkoihin etäpesäkkeitä eturauhasen syöpäsoluja.

Hiiret injektoitiin injektoitiin häntälaskimon kautta, jossa DU145-solut, jotka on transfektoitu mainituilla ilmentämis- plasmideja. Ryhmät sisälsivät 8 hiirtä. Kahdeksan viikkoa myöhemmin hiiret lopetettiin ja keuhkojen etäpesäkkeiden DU145-solujen mitattiin makroskooppisia jälkeen ruumiinavaus. Histologinen analyysi etäpesäkeleesioita kylkeen nude-hiirten kantoi HE värjäys. B kvantifiointi kyhmyjä keuhkoissa kanssa muuttunut RUNX3 tasoilla. Lukumäärät kyhmyt arvioitiin sokkona 5 random kenttää per implanttia 200 suurennoksilla. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. *

P

0,05. C edustaja immunohistokemiallinen valokuvia PAP ilmaisun keuhkokudoksessa (suurennoksia, × 200 ja x 400). * Tuumorikudos.

Palauttaminen RUNX3 Expression Tukahdetut tuumorigeneesiä in vivo

vaikutuksen tutkimiseksi RUNX3 hoidon kasvaimen kasvua in vivo, perustimme ihonalainen kasvain nude-hiirissä. Kuva. 6A osoitti RUNX3 proteiini oli yli-ilmentynyt jälkeen pysyvästi tartunnan Lv5-RUNX3. Hiirissä vakaasti tartunnan Lv5-RUNX3 oli aiheutunut merkittävää kasvua pidätys kontrolleihin verrattuna (

P

0,05). Edustava valokuva, joka esittää kasvaimen kasvun ohjaus ja RUNX3 ilmaisi hiiriä (Kuva. 6B).

Nude-hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti DU145 soluihin stabiilisti ilmentävät Lv5-RUNX3 tai Lv5-ohjaus. Western blot käytettiin tutkimaan RUNX3 proteiinin taso. B kasvaimia seurattiin kahdeksan viikkoa. Tuumorin halkaisija mitattiin paksuus joka viikko, ja tuumorin tilavuus laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti A x B

2 x 0,52, jossa A on pisin halkaisija kasvaimen ja B on lyhin halkaisija. Tuumorin tilavuus oli merkittävästi suurempi 8viikko hiirillä, joille annettiin ohjaus lentivirukset verrattuna annetaan RUNX3 lentivirukset (*

P

0,05). C Edustavia hiirillä kasvaimia hoidettiin ohjaus verrattuna ryhmä RUNX3 ryhmään. D ekspressiotasot RUNX3 ja VIII analysoitiin kasvainkudoksissa immuunihistokemiallisesti edustavat kuvat osoittivat (suurennoksia, × 400). E kvantifiointi pienten suonten muodostumisen kasvaimissa muuttuneisiin RUNX3 tasoilla. MVD arvioitiin kautta aluksen laskentaa. Lukumäärät värjättyä mikroverisuonten arvioitiin sokkona 5 random kenttää per implanttia 200 x suurennoksilla. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kontrolleista (

P

0,05).

tutkia kasvaimen kasvun estoa liittyy vaikutus pistetään RUNX3 stabiilisti transfektoitujen solujen kasvaimet leikeltiin tutkia RUNX3 ilmentymistä immunohistokemiallisella analyysillä. Kuten on esitetty kuvion. 6C RUNX3 proteiini overexpressesed in RUNX3-injektoitu ksenografti verrattuna alhainen RUNX3 ilmentymistä kontrolliryhmässä. Nämä tulokset edelleen vahvistaa merkittävä vaikutus RUNX3 tukahduttaminen eturauhassyövän kasvua.

Palauttaminen RUNX3 Expression Alennettu Angiogeneesi in vivo

Koska RUNX3 ei vaikuttanut kasvainsolujen proliferaatiota in vitro, on todennäköistä, että RUNX3 tukahdutti tuumorigeneesiä in vivo estämällä VEGF endoteelisolujen (angiogeneesi). Meillä on siis vaikutus testattiin RUNX3 angiogeneesiin. DU145 solut ilmentävät stabiilisti RUNX3 tai kontrollivektoreihin sekoitettiin Matrigel ja ruiskutetaan molempiin kylkiin nude-hiirissä. Hiiret lopetettiin 56 päivää istutuksen jälkeen. Määrä VIII-positiivisia mikrosuonten oli paljon pienempi osioita vierassiirrännäisiä RUNX3 ilmentävien DU145-solut (Fig. 6C ja D), mikä osoittaa, että RUNX3 heikennetty eturauhassyövän solu-angiogeneesin. Tulokset viittasivat siihen, että muutettu kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden mukaan palauttaa RUNX3 ilmentyminen korreloi muuttunut angiogeneesiä.

Keskustelu

rooli RUNX3 kasvainten synnyssä on tutkittu laajasti viime vuosina. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että RUNX3 ilmentyminen väheni lukuisia erityyppisiä ihmisen syöpien, kuten rintasyövän, peräsuolen syöpä, munuaissolukarsinooma, melanooma [8], [11], [13], [18]. On ollut näyttöä siitä, että RUNX3 metylaatio oli erityisen usein eri ikäluokat prostatasyövistä mutta ei normaalissa eturauhasessa limakalvon [19], [20]. Nämä havainnot viittaavat siihen merkittävä rooli RUNX3 ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä. Kuitenkin toiminta RUNX3 eturauhassyövässä ei ole tutkittu. Paremmin ymmärtämään tarkkaa roolia RUNX3 eturauhassyövän kehitykseen, käytimme TMA teknologia, in vitro solujen malliin ja in vivo eläinmallissa tutkia roolia RUNX3 eturauhassyövässä. Meidän kliiniset tulokset osoittivat, että RUNX3 hävisi eturauhassyövän ja korreloi TNM vaiheessa. Meidän in vitro tutkimukset osoittivat, että RUNX3 eturauhassyöpäsoluissa vähentää solujen vaeltaminen, invaasio ja angiogeneesi kykyjä, mikä oli yhdenmukainen toiminta RUNX3 in vivo.

Kirurginen resektio on suosituimpia strategia hoidon ensisijainen eturauhassyöpä [2]. Kuitenkin potilailla, joilla on kehittynyt sairauksia, kirurgisen intervention näyttää vähemmän benifits [21]. Näin ollen, on tärkeää ennustaa uusiutumisen riskiä minimoida haitalliset vaikutukset ja maksimoimaan terapeuttinen vaikutus eturauhassyövän hoitoon. Kuitenkin on käytettävissä ennustavat tekijät eturauhassyövän, tärkeintä on International Union syöpää vastaan ​​TNM määritetty syvyys hyökkäyksen, osallistuminen imusolmukkeiden ja läsnäolo etäpesäkkeiden [14]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että RUNX3 ekspressio hävisi eturauhassyöpäkudoksen. Lisäksi RUNX3 proteiinin väheni merkittävästi myöhäisessä vaiheessa (Fig. 1). Meidän kliinistä näyttöä selkeästi tukenut ajatusta, että muuttunut ilmentyminen RUNX3 edistää eturauhassyövän kehitykseen ja etäpesäke. On raportoitu, että alentunut ilmentyminen RUNX3 on usein aiheuttanut CpG-saarekkeen hypermetylaation [19]. Lisäksi pistemutaatioita RUNX3 havaittiin mahalaukun ja virtsarakon syöpien [22], [23].