Krooninen sairaus

tiivistelmä

Meidän elin, solut altistuvat jatkuvasti fyysinen voimia, jotka voivat säädellä eri solun toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja kuolema . Tässä työssä käytimme kahta eri strategioita mekaanisesti stressiä syöpäsoluja. Syöpä ja terveen solun populaatiot hoidettiin joko mekaaninen rasitus toimittaman mikropumpun (valmistettu syvä röntgen- nanolithography) tai ultraääniaaltovastaanotin ärsykkeitä. Erityinen alas-säätely major histocompatibility complex (MHC) luokan I molekyylien ilmentymisen syövän solukalvon verrattuna erilaisia ​​terveiden solujen (fibroblastien, makrofagit, dendriittisolut ja lymfosyyttisoluissa) havaittiin, stimuloimalla soluja voimien välillä nano -newton, ja paineet välillä 1 ja 10 bar (1 bar = 100.000 Pascal), riippuen käytettyjen laitteiden. Lisäksi Ramanspektroskopia analyysi, kun mekaaninen käsittely, joka on välillä 700-1800 cm

-1, osoitti suhteellinen pitoisuus vaihtelua MHC-luokan I PCA-analyysi suoritettiin myös erottaa valvontaa ja korosti solujen eri solulinjoissa. Nämä mekaaniset aiheuttama fenotyyppiset muutokset lisäävät kasvaimen immunogeenisyyden, joka käy ilmi siihen liittyvä lisääntynyt alttius Natural Killer (NK) solujen sytotoksinen tunnustamista.

Citation: La Rocca R, Tallerico R, Talib Hassan A, Das G, Tadepally L, Matteucci M, et al. (2014) Mekaaninen rasitus Downregulates MHC-luokan I ilmentyminen Human Cancer Cell kalvo. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10,1371 /journal.pone.0111758

Editor: Laurent Kreplak, Dalhousien yliopisto, Kanada

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 30 syyskuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 La Rocca et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Ennio Carbone työ on tukenut UICC Kansainvälinen Cancer Technology Transfer Fellowship, myöntää AIRC-IG 10189, ja myöntää AIRC 15521. Rossana Tallerico on Post Doc myöntämän kolmivuotisen apurahoja ”Luciana Selce” FIRC. Giovanni CUDA on tukenut PON01_02834 Prometeo (opetus- ja tutkimus) ja PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (opetus- ja tutkimus). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Luonnossa solut jatkuvasti alttiina fysikaalisia, kemiallisia ja biologisia rasituksia. Aiemmin fyysiset muutokset tapahtuvat sairaan kudoksen otettiin huomioon, että lääkärit arvokkaina diagnostisia indikaattoreita. Fyysinen stressi on osallisena patofysiologiaan useissa ihmisen sairauksien, kuten tulehduksen ja syövän. Molemmissa olosuhteissa, muutos on kemiallis-fysikaaliset soluväliaineen (ECM) ympäristö liittyy patogeneesin näitä sairauksia. Lisäksi fyysisten voimien merkittävä rooli metastasointiin. Viime vuosina uusia työkaluja, kuten atomivoimamikroskooppi, on kehitetty analysoimaan muutoksia soluissa jousto liittyvät fyysisiä muutoksia solunulkoisessa matriisissa osasto [1]. Lisäksi määrittää, kuinka paljon solu voi muuttaa muotoaan, laitetta kutsutaan ”optista paarit” kehitettiin [2]. Toisin kuin muut työkalut, optinen paarit perustuu kaksinkertaisen-palkki optinen trap [3], [4], jossa kaksi vastustaja ja samanlaista lasersäteiden ansa solun keskellä. Tätä menetelmää voidaan käyttää mittaamaan elastinen ja supistuvien ominaisuuksia monissa soluissa, koska tiedetään, että solun kyky tehdä sopimuksia on erittäin tärkeä muuttoliike ja lisääntymistä [5]. Lisäksi joustavuus ja supistumiskyvyn eri kasvainsolujen saattaa muuttua taudin etenemiseen, ja lisääntynyt elastisuus syöpä verrattuna terveiden solujen [6]. Välinen suhde ECM jäykkyyden ja kasvaimen muutos on kuvattu [7]. On osoitettu, että ECM-välitteinen isometrinen voimat havaitaan integriinien, jotka säätelevät fosforylaatiota mekaanis-muuntimen kinaasien, kuten ERK ja Rho [8]. On myös osoitettu, että kasvu eksogeenisen voimien johtaa lisääntyneeseen soluproliferaatioon nopeudella ja aiheuttaa kasvaimen kaltaisia ​​fenotyyppisiä muutoksia. Lopuksi, tulehduksellinen rintasyöpä tiedetään kohdistamaan mekaaninen kuormitus, joka johtuu ECM muutoksiin, mikä saattaa johtaa suurempaan metastaattista potentiaalia [9].

Tämän perusteella olemme arveltu, että mekaaninen rasitus voi vaikuttaa joko ilmentymistä solun antigeenejä tai ilmentymisen indusoimiseksi stressi-indusoituvan molekyylit, kuten NKG2D reseptorin ligandeja [10] osaa prime sytotoksisen Efektorilymfosyytit solujen toimintaan.

viime vuosina löytämisen immunoreceptors tunnistamaan stressin indusoima proteiinit ovat laajentaneet tiedon siitä, miten immuunijärjestelmän pistosta [11], [12]. Nämä havainnot ovat edistäneet kiinnostusta ohjata stressiä toimitus laitteita, jotka voivat saada kasvain immunogeeninen fenotyyppi kykenee herättämään immuunivasteen, varsinkin kun kasvain on jo toimittanut sytotoksisten lymfosyyttien [13].

Natural Killer solut voimakas sytotoksinen lymfosyytit kykenevät tunnistamaan juuri irrotetut syöpäsoluja [14] – [16] ja spontaanisti hajottamaan tiettyjä kasvainkohteita [17] – [19]. Niitä säännellään herkkä tasapaino estävä reseptorien, tunnustaa itse MHC-luokan I molekyylien ja aktivoivat reseptorit stressi-indusoituvaa molekyylit [20]. NK-solut on kyky tunnistaa ja tappaa virally tartunnan ja pahanlaatuisten solujen säästäen normaalit solut. NK-solujen asetus huonosti kunnes 1980-luvun loppupuolella, kun ”puuttuva itse” hypoteesi ehdotettiin [21]. Tämän hypoteesin, alas-säätely MHC-luokan I molekyylien aikana virusinfektio tai pahanlaatuisiksi laukaisee NK aktivointia.

Pyydämme onko hoito NK resistenttien syöpäsolujen mekaaninen rasitus voi kallistaa tasapainoa estävä ja aktivoimalla kasvain ilmentävien molekyylejä hyväksi jälkimmäisen, mikä NK-solujen aktivoitumisen. Tässä työssä olemme käyttäneet kahta erilaista menettelyä mekaanisesti stressiä syövän ja normaalien solujen valvotuissa olosuhteissa. Vertasimme biologisten vaikutusten mekaanisten ärsykkeiden toimitetaan joko mikropumpun laitteen suunniteltu nimenomaan tätä tarkoitusta varten [22], jotta ne toimittamat sokkiaaltoja pulssi laitteita. Vaihtelu MHC-luokan I molekyylien ennen ja jälkeen mekaanista rasitusta seurattiin sekä avulla Raman-spektroskopia (yhdessä pääkomponenttianalyysi (PCA)) ja jonka avulla sytotoksisten mittauksia. Lopullisena tavoitteena Tutkimuksemme oli ymmärtää, jos käytetään mekaanisia voimia voisi saada ja /tai moduloivat tulevien biologisten solujen ominaisuuksia, kuten niiden immunogeenisyys. Lisäksi selvitimme mahdollisuus käyttää adoptiivisesti mekaanista manipulointia toswitch kasvain NK-solujen resistenttejä fenotyyppi tulee altis yhteen.

Materiaalit ja menetelmät

mikropumpun laite

toimittaa mekaanista rasitusta kasvaimen solupopulaatioiden, käytimme aiemmin kuvattua mikropumpun [22] (S1A kuvio.) valmistettu avulla ofdeep X-ray litografia (DXRL) tekniikka erityisesti hoitoon eukaryoottisoluissa tuhoamatta niitä. Kolme miljoonaa solua /ml rasitu 1 tunnin ajan 48 sykliä ja vahvuus suurin paine oli noin 10 baaria. Tämä arvioitiin mittaamalla pumpun esiintyvyys käyttäen vettä nesteenä. Jälkeenpäin solut kerättiin 15 ml: n putkille ja analysoitiin virtaussytometrialla ja mikro Ramanspektroskopia.

Shock Waves laite

Shock aallot sovelletaan ortopediassa ja ovat pääosin akustisia aaltoja mekaanisella vaikutus. Kun paineaallot kulkevat neste, luo paine-erot vastuussa muodostumista kaasukuplia (kavitaatio), jotka vaikuttavat myöhemmin paineaallot ja muuttavat muotoaan, kunnes luhistumisen. Epäsymmetrinen romahtaminen kupla aiheuttaa muodostumista vesisuihkun ”jet stream”. Tämä ilmiö parantaa edelleen mekaanista vaikutusta paineaallon aiheuttaa mikro-vaurioita, joiden koko on funktio pulssien lukumäärä ja vuon energiaa. Hoitoon kasvainsolulinjojen käytettiin

Sveitsin Dolorclast laite

(Electro Medical System-EMS, Italia) käsi-osainen runsaasti energiaa (S1B Fig.).

Syöpäsolut kasvatettiin petrimaljoille ja käsiteltiin paineaallot (500 laukausta) soveltamalla vuon energian 1 bar. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin, ja saadut tiedot verrattiin vastaaviin kontrolleihin.

Solut eristämistä ja viljelyä

mekaanista rasitusta kokeissa käytettiin erilaisia ​​solulinjoja. Ensiöparit Mel 59c, Mel 42a, Mel 42b, Mel 66b, Mel 137a ja Mel 103b saatiin tuoreeltaan irrotetut melanoomaihosyöpien metastaattinen solujen muutaman in vitro kohtia, vastaavasti potilailta 59, 42, 66, 137 ja 103. Kaikki potilaat antoivat kirjallinen suostumus mukaan Helsingin julistuksen ja eettisen toimikunnan II Heidelbergin yliopisto (0198,3 /2002). Terveiden luovuttajien PBL ja niihin liittyvien puhdistettu NK-solujen kertyi vastaavasti, eettisen komitean University Magna Graecia Catanzaron (49/2003). Tutkimuksen hyväksyi UMG eettisen komitean (49/2003). Ihmisen munuaisen karsinooma solulinja (293T), ihmisen B-lymfoblastoidisolulinjassa (IM9), ja fibroblasti- solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Perifeerisen veren lymfosyytit (PBL: t) saatiin terveiltä luovuttajilta Ficoll-Paque (Biochrom AG, Berliini, Saksa) tiheysgradienttisentrifugointi ihmisen kerättiin vastaavasti, eettisen komitean University Magna Graecia Catanzaron (49/2003). Soluja kasvatettiin RPMI 1640 väliaineessa ja Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma Aldrich, St. Louis) ja penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml ) (Sigma Aldrich, St. Louis) ja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Makrofagien ja dendriittisolujen (DC) saatiin veren mononukleaarisia soluja. Makrofagit muodostettiin monosyyteistä tarttuu lautasella. Dendriittisolut (DC) perustettiin monosyyteistä täydennettiin 7 päivää 50 ng /ml granulosyytti /makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) ja 1000 U /ml IL-4 [23] .

Natural Killer solujen puhdistus

NK-solut saatiin, kuten on kuvattu [24]. Lyhyesti, ihmisen NK-lymfosyytit puhdistettiin perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC), joka on saatu terveiltä luovuttajilta Ficoll-Paque tiheysgradienttisentrifugoinnilla käyttämällä NK Cell Isolation kit ja Vario MACS varten ehtyminen NK-solujen (Miltenyi Biotec). Solut suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 3% ihmisen seerumia, penisilliiniä (100 IU /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml) ja käytettiin sytotoksisuusmäärityksessä. NK-solujen puhtaus oli vähintään 95%.

ramanspektroskopia

Microprobe Raman spektrit innoissaan lähellä IR laserin 830 nm laser viiva huoneenlämpötilassa (RT) in backscattering geometrian kautta 100X tavoite (

NA

= 0,95) Leica mikroskooppi (Model – DMLM). Kaikki tiedot kerättiin laserilla teho 70-130 mW. Laser teho oli aina valittu siten vältetään vahingot solun. Tämä laser teho ei odoteta aiheuttavan merkittävää lisäämistä näytteen lämpötila johtuen erittäin alhainen absorptiokerroin solujen 830 nm. Lisäksi, solun olosuhteissa tarkastettiin optisella kuva ennen ja jälkeen mittausten. Useat solut kustakin solulinjasta seulottiin välillä 700-1800 cm

-1 pisteeltä kartoitus mittauksia, jotka keräävät eri aallonpituuksilla eri sijainti kattaa koko solun pinnalla. Kutakin solulinjaa 5 solua sattumanvaraisesti valittu pisteen kartoitus. Raman-spektrit eri solujen kunkin solulinjoja sitten talteen ja niitä käytettiin tilastolliseen analyysiin (Spectra eivät osoita merkittävää eroa keskenään [25], [26]). Tilastollinen analyysi (sekä keskihajonta virhe) suoritettiin 10 Raman kunkin solulinjan. On huomionarvoista kohta se, että mittaukset valvontaa ja korosti soluja kustakin solulinjasta tehtiin samana päivänä välttämiseksi vaihtelu instrumentaalinen vastausta. Spectral tasoitus tehtiin kaikille yksittäisille Raman käyttäen WiRE 2.0 PS9 laitteen mukana tuleva Renishaw ramanspektrometriä. Käyrä kiinnitys spektrit suoritettiin käyttäen yhdistetyn Gaussin ja Lorentzin toiminto.

pääkomponenttianalyysiin

Viime vuosikymmenen monimuuttuja tekniikoita on laajalti käytetty analyysi suurten Raman aineistojen [27] , [28]. Näistä tekniikoista, pääkomponenttianalyysi (PCA) on osoittautunut yhdeksi ja luotettavin menetelmät [29], [30]. Kun PCA levitetään Raman, kukin Raman taajuus pidetään muuttuja, jonka arvo muuttuu koko tallennetun spektri, niin että koko aineisto muodostaa

N

ulotteinen tila, jossa

N

on määrä mitataan taajuuksilla (

N

on tyypillisesti hyvin suuri). Päätavoitteena PCA on dimensionality vähentämisen kärsimättä tietoa. Tämä saavutetaan kautta diagonalisointi kovarianssimatriisin spektrien: ominaisvektorit määrittävät yksiulotteinen (1 D) akselit

N

-space ja vastaavat ominaisarvoja määrän ilmaisemiseksi koko varianssi selittää kunkin ominaisvektori. Ominaisvektorit ovat ns pääkomponentit (PC: t), kun taas ominaisarvot on nimetty rikospaikkasormenjäljille. Ensimmäinen pääkomponentti on 1D akseli, jota pitkin suurin määrä varianssi otetaan huomioon (eli akselin suurin piilevä arvo); toinen pääasiallinen komponentti on akseli (kohtisuorassa ensimmäiseen), jonka osuus on suurin jäljellä varianssi (ts akselin kanssa toiseksi suurin piilevä), ja niin edelleen seuraavista komponenteista. Tällä tavoin riippumatta siitä

N

-variables aineisto olemme lyhentää muutamaan-muuttujia aineisto, menettämättä merkittävää osaa tiedon. PCA-analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmiston kehittänyt P. Candeloro et al. [31].

immunofluoresenssimäärityksellä

Jokaisen toimenpiteen jälkeen, solut kerättiin putkiin ja inkuboitiin ihmisen seerumin kanssa 15 minuutin ajan RT: ssä. Sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä 1X ja sen jälkeen inkuboitiin 30 minuutin ajan pimeässä 4 ° C: ssa, seuraavat mAb: t: W6 /32 (anti-MHC-luokan I, IgG2a, BioLegend, San Diego, CA); klooni BAM 195 (anti-MICA, IgG1) ja mAb 6D4 (anti-MICA /B, IgG1), oli ystävällisesti Veronika Groh (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA); M295 (anti-ULBP1, IgG1), M310 (anti-ULBP2, IgG1), M550 (anti-ULBP3, IgG3) ja M478 (anti-ULBP4 lgG1) oli ystävällisesti lahjakas D. Cosman, (Amgen Inc. Seattle, WA ); mAb L95 (anti-PVR, IgG1) ja mAb L14 (anti-Nectin-2, IgG2a) toimitti ystävällisesti A. Moretta (Genovan yliopisto, Genovan, Italia). Pesun jälkeen kahdesti, solut värjättiin toisen mAb: iden FITC vuohen anti-hiiri-IgG (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Sitten solut pestiin jälleen kahdesti ja analysoitiin FACSCalibur virtaussytometrialla (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). Solunsisäiseen värjäystä solut kiinnitettiin Cytofix ja läpäiseviksi mukaan Cytoperm (BD Biosciences). Solut värjättiin erityisen mAb: t ja sen jälkeen FITC: hen konjugoidun anti-hiiri-IgG-vasta-aineita (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) ja analysoitiin. Tulokset analysoitiin käyttäen Cell Quest (BD Biosciences) tai FlowJo ohjelmistoversion 9.3.1.

Sytotoksisuusmääritvs

sytotoksisuusmäärityksissä kasvaimen tai terveitä soluja tavoite ja NK lymfosyytit vaikuttajasoluina soluja käytettiin. Sen jälkeen, kun mekaaninen rasitus hoidon kohdesolut inkuboitiin fluoresoivien CFDA (karboksifluoreseiini diasetaatti, Life Technologies, NY, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, sitten pestiin kahdesti ja inkuboitiin NK-solujen kolmen tunnin ajan inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Yksityiskohdat protokollan kuvattiin alkaen McGinnes et al [32]. Virtaussytometri käytettiin määrittää ne.

Real Time

Solun kokonais-RNA: t neljästä eri melanooma alkusolut ja kaksi terveitä soluja eristettiin käyttäen Trizol (Life Technologies).

Lyhyesti, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen Superscript III Reverse Transcript Kit (Life Technologies) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti; cDNA: t monistettiin käyttäen iTaq Universal SYBER Green Supermix (BioRad, Segrate (MI), Italia), kun läsnä on spesifisiä alukkeita, kuten on kuvattu aiemmin [33]. Seuraavia alukkeita käytettiin: MHC-I- FW, 5’CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3; MHC-I- RV, 5’CAGAGATGGAGACACCTCAGC -3 ’. Ilmentyminen housekeeping-geenin glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin normalisoimaan näytteitä, ja suhteellinen määrän HLA luokka I suoritettiin soveltamalla 2

-ΔΔCt menetelmä [34]. Seuraavia alukkeita käytettiin: GAPDH-FW, 5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ’, GAPDH-RV 5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3’.

Western-blottaus

erityksen MHC-luokan I molekyylien osaksi elatusaine vahvistettiin Western blot -analyysillä. Western blotting, soluja viljeltiin 100 cm: n maljoihin pestiin 0,1 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4) (Life Technologies), ja sen jälkeen 2 ml: lla seerumitonta RPMI lisättiin. Stressin jälkeen hoidon, väliaine kerättiin. Solut keskipitkän proteiinien pitoisuudesta kutakin korosti näytteen mitattiin kolmena kappaleena käyttäen väriaine-sitovan proteiinin (Bio-Rad), jossa ihmisen seerumialbumiinia (Life Technologies) kuten standardikäyrä.

Kunkin kokeellisen pisteen, 50 ug solun -Kulttuuri väliaineen proteiinit siirrettiin steriileihin putkiin, jotka sisältävät kylmällä asetonilla (20%, paino /tilavuus) ja saostetaan 30 minuuttia jäillä ja sen jälkeen sentrifugoimalla 15000 rpm: llä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa.

supernatantti dekantoitiin ja pelletti pestiin jäähdytetyllä asetonilla ja poistamalla sen jälkeen kaikki asetonia. Pelletti jälkeen liuotetaan LB [31,25 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 1,25% SDS: ää, 6,25% glyserolia, 0,06% bromifenolisinistä, ja 5% h-merkaptoetanolia], SDS-PAGE ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille.

sen jälkeen, kun esto seoksen [5% (w /v) maito PBS: ssä (pH 7,4) ja 0,05% Tween 20], membraania inkuboitiin 1:100 laimennus hiiren anti -HLA-vasta-ainetta, klooni W6 /32 (BioLegend,). Signaali detektoitiin anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:5000; Santa Cruz Biotechnology). Kalvo kehitettiin parannettu kemiluminesenssi-Western blot detektioreagensseja mukaan valmistajan ohjeiden (Santa Cruz Biotechnology).

kalvoa inkuboitiin Ponceau S punainen Värjäysliuos (Sigma-Aldrich) yhdenmukaisen geelilatauspuskuria. Sisäinen kontrolli ei käytetty, koska se on käytännössä mahdotonta löytää ”housekeeping” proteiinin seerumittomassa väliaineessa soluja, jotka voidaan käyttää jatkuvasti viitataan. Ponceau S voidaan käyttää edullisesti yli aktiini havaitsemiseen laatua tai yhtä lastaus valvonta Western blottauksella; Lisäksi sillä on lisäetu, eli että se ei perustu yhden proteiinin normalisoinnin tai latauskontrollina. Tämä kiertää sitä mahdollisuutta, että ”housekeeping” proteiineja käytetään tähän tarkoitukseen voi todellakin vaihdella joissakin olosuhteissa tai että ne tyydyttyneitä tasoilla lastaus tarpeen havaitseminen alhaisen ilmentymisen tuotteita tai että ne eivät ole havaittavissa kuin esimerkissä [35 ].

ATM /ATR signalointiryöpyn analyysi

Etoposidi (Sigma, St. Louis, MO, USA) liuotettiin DMSO: hon ja lisättiin lopullinen pitoisuus 5 uM 1 tunnin ajan. Kokosolulysaateille valmistettiin tuoreeltaan talteen soluista käyttämällä lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 400 mM NaCl), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittori-seosta (Calbiochem, Merck Darmstadt , Saksa), 0,5 mM PMSF ja 2 mM natriumortovanadaattia. Lysaatit inkuboitiin jäillä 15 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 13000 rpm: ssä 10 min. Proteiinikonsentraatio supernatanteista määritettiin Biorad määrityksellä (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Sillä immunobloteilla, näytteet ladattiin Laemmli-puskuriin 6% tai 10% Tris-glysiini-SDS /PAGE-geeleillä, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja hybridisoitiin sopivia vasta-aineita on 1:1000 laimennus. Blotit kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Saksa). Vasta-aineet: hiiren anti-phosphoAtm (Ser 1981) kanin anti-phosphoChk1 (Ser 345), kanin anti-phosphoChk2 (Thr 387), kanin anti-fosfo-JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, New York, NY, USA), kanin -p53 ja hiiren anti-MCM7 (Santa Cruz).

tilastollinen

Kaikki tulokset raportoidaan keskiarvona ± SEM. Merkitsevyystaso määritettiin Mann – Whitneyn testi. Arvo * p≤0.05, ** p≤0,001 ja **** p≤0,0001 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tiedot ilmaistiin kertainen muutos suhteessa kontrolliin, asetetaan 1.

Tulokset

Ymmärtääksemme mahdollisia vaikutuksia mekaanista rasitusta solun immunogeenisyyden, syöpä ja terveitä soluja rasitu kanssa mikropumpun laite ja paineaallot.

aiheuttamien muutosten mikropumpun toimitettuna stressiä analysoitiin Raman. Raman mittaukset tehtiin vastaavat solut (Mel 59c, Mel 42a, Mel 103a ja 293 T-solulinja) PBS liuoksessa spektrin välillä 700-1800 cm

-1. Raman kanssa keskihajonta virhepalkin valvonnalle (jännityksetön) solut ja rasitu solut PBS puskuriliuoksessa on esitetty kuvassa. 1. Raman-spektrit nämä solut ovat samanlaisia ​​ominaista Raman-spektrit useimpien elävien solujen. Kaikki spektrit osoittavat eri piikit noin 780, 850, 1003, 1125, 1445, ja 1660 cm

-1. Tyypillisiä bändejä näiden spektrien (Fig. 1) ovat mukana nukleotidi- konformaation (600-800 cm

-1), molekyylirunkona geometria ja fosfaatti liittyvien värähtelyjen (800-1200 cm

-1), nukleotidit ( 1200-1600 cm

-1), ja CC ja CH

x tilat johtuen proteiinien ja lipidien [36]. Amidi värähtelyt, kuten amidi I-band (johtuen C = O-venytys, 1650-1700 cm

-1) ja amidi III bändi (johtuen CN venyttely, ja NH taivutus, noin 1250 cm

– 1) in proteiinit ovat helposti erotettavissa [37]. Amidin I bändejä on välillä 1650-1700 cm

-1 antavat myös erittäin tärkeää tietoa vahvistuksen tilasta sekundaarisen rakenteen (α-helix, β-levyt ja satunnaisen kela rakenne) proteiineja. Eri aminohapot voidaan tunnistaa nimenomaan noin 1003, 1011 ja 1032 cm

-1 Raman spektrit [37].

Raman valvontaa ja korosti syöpäsolulinjoissa (Mel 59c (A), Mel 42 (B), Mel 103b (C) ja 293T (D)), jossa keskihajonta virhepalkin. Spektrit tehtiin ennen ja jälkeen mekaanista rasitusta kanssa mikropumpun.

vaihtelu suhteellinen pitoisuus proteiinin eri soluissa laskettiin käyttäen käyränsovituksella näiden kahden alueen proteiiniryhmänä noin 1440 ja 1650 cm

-1. Kuva. Kuvio 2 esittää, eri solutyyppejä, vaihtelu suhteellinen intensiteetti solukalvon proteiini /rasva-(1440 cm

-1) ja α-heliksin (1650 cm

-1) kaistalla ennen ja jälkeen soveltamisen mekaanisen rasituksen . Selkeä lasku proteiinin määrän ja sen α-helix sekundaarinen rakenne havaittiin upon mekaanista rasitusta solujen käsittelyä.

Normalized alueen bändi keskitetty noin 1440 (ylhäällä) ja 1670 cm

-1 (alhaalla) varten kaikki solulinjat, jotka osoittavat vaihtelua proteiinipitoisuus ja suhteellinen α-heliksin sisältöä solun pinnalla.

hyvin selkeä kuva voidaan paljasti vaihtelusta sekundaarirakenteen jälkeen työllistää mekaanista rasitusta. Se osoittaa vähentäminen α-heliksin sekundaarinen rakenne amidi-I-nauha kaikkien solujen mekaanista rasitusta. Tämä suuntaus ei ole selvästi havaittu Mel 42a soluja, jotka spektri on hyvin meluisa (Fig. 1 B). Lisäksi syvä analyysi, se on havaittu, että Mel 59c ja 293 T-solut käyttäytyvät samalla tavalla. Kaikki tutkitut solulinjat osoittavat vähenevät sekundaarinen rakenne mekaanista rasitusta. Sammutusta ja α-heliksin rakennetta ja lisälaite fluoresenssi tausta sekä voidaan selvästi havaita. Nämä muutokset Raman spektrit ovat yhdenmukaisia ​​meidän aiemmin raportoitu havaintoja MHC-luokan I havaitsemista Ramanspektroskopia [38].

Lisäksi Principal Component Analysis (PCA) suoritetaan erottelemaan korosti kontrolloida solujen kunkin solulinjat. PCA, tilastollinen analyysi, vähentää dimensionaalisuus moniulotteisen tietokokonaisuus pitäen ominainen kaikille spektrien [31]. Pienentynyt ulottuvuus olevia jokainen spektri kuvataan rajoitettu määrä muuttujia, kutsutaan pääkomponentit (PC). Nämä tietokoneet sisältävät suurimman osan spektrin tiedot. Kuva. 3 edustaa PCA-analyysi (PC1 vs. PC2, PC2 vs. PC3 ja PC1 vs. PC3) kaikkien solulinjojen välillä 700-1800 cm

-1. Täytetty lohkot ovat säätökennoja taas tyhjät lohkot liittyvät korostaa soluihin. Stressi solut voivat olla hyvin erottaa ohjaus soluista ja kauemmaksi joka solulinjoja löytyy ryhmitelty selkeästi kuviossa. Nämä tulokset paljastavat mielenkiintoinen ja tärkeä tapa erottaa soluja ja myös jos solut on levoton ulkoisesti.

PCA analyysi ohjaus ja stressiä solujen eri solulinjojen; Mel 42a, Mel 59c, Mel 103b ja 293T. a) PC1 vs. PC2, b) PC2 vs. PC3 ja c) PC1 vs. PC3.

Voit varmistaa mekaanista rasitusta indusoi alas-säätely MHC-luokan I soluihin pintaan , teimme immunofenotyypin määritys kaikille eri solutyyppejä.

jälkeen 1 bar teho hoito, jonka mikropumpun ja paineaallot, selkeä väheneminen MHC-luokan I-tasot kasvainsoluihin kalvon havaittiin (Fig. 4A), kun taas mitään muutoksia ei havaittu, kun terveitä soluja, fibroblasti, makrofagien, dendritic ja lymfosyytit soluja, kuormitetaan (Fig. 4B). Tilastolliset analyysit tehtiin tuumorisoluissa (melanooman ja IM9 solulinjat, kuva 4C) ja terveiden solujen (fibroblastien, makrofagien, dendriittisolujen ja lymfosyyttien solujen, kuva 4D).

Paneeli A esittää lasku MHC luokan I molekyylit ilme syöpäsoluihin (5 melanooman ja yksi lymfoblastisolulinjoissa) jälkeen mekaanista rasitusta hoidon avulla mikropumpun (yläosa) ja paineaallot (alaosa) verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Paneeli B raportoi vaikutus mekaanista rasitusta joidenkin terveiden solujen (fibroblastit ja makrofagit), MHC-luokan I kahden mainituissa hoidoissa. Tähän liittyvä isotooppinen ohjaus rahalaitos antoi saman limittymissignaali kaikille käytetyt solulinjat, siksi jätetty pois. Paneeli C esittää tilastolliset arvot kertainen pieneneminen MHC-I suoritetaan melanoomasolujen (n = 4 erillisessä kokeessa, jossa mikropumpun ja n = 4 erillisessä kokeessa, jossa paineaallot; p 0,05) ja IM9 soluja (n = 10 erillisessä kokeessa, jossa paineaallot; p 0,0001). Kannen väheneminen MHC-I oli peräisin mediaani fluoresenssin intensiteetti (MFI) MHC-I-molekyylien ennen ja jälkeen hoidon Melanooma ja IM9 solulinjat. Paneeli D näyttää tilastolliset arvot on saatu eri kokeessa (n = 3) kullekin terveitä soluja. Fibroblastien ja PBL: t painotettava mikropumpun samalla, makrofagit ja dendriittisolut käsiteltiin sokkiaaltoja. Arvo ilmoitetaan paneeli D ei ole tilastollisesti merkitsevä.

Toinen immunogeenisten molekyylien analysoidaan, kuten MICA, MICB, ULBPs, PVR ja Nectin-2, eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia välillä ohjaus ja korosti solujen joissa paineaallot (S2 Kuva.). Ymmärtää vaikutus laski MHC-luokan I ilmentymisen rasitu kasvainsolujen immunogeenisyyden, toiminnalliset analyysit tehtiin käyttämällä molempia laitteita, mikropumpun ja paineaallot. Tässä NK solut alttius rasitu kasvainkohdesoluja verrattiin niiden jännittämättömässä valvonnan klassinen sytotoksisuusmäärityksiä. Selkeä ja toistettavissa kasvu NK herkkyyden havaittiin jälkeen mekaanista rasitusta hoidon. Välillä lisäämällä NK lyysin prosenttiosuus kasvainsolujen oli välillä 30-70% (Fig. 5A-E), kun taas terveet solut, ts fibroblasti (Fig. 5F), ei vastannut mekaanista rasitusta hoitoon. Tulokset osoittavat, että mekaanista rasitusta parantaa NK tunnustusta kasvain tilastollista merkittävyyttä (Kuva. 5G-H), mutta ei terveitä soluja. Mekaanista rasitusta kytkee kasvaimen fenotyypin olemasta NK resistenttejä NK alttiita. Tämä muutos NK herkkyys korreloi kasvainspesifin MHC-luokan I menetys. MHC-luokan I molekyylit ovat tehokkain estävä ligandien NK-reseptoreihin. MHC-luokan I alassäätöä tuumorisoluihin laukaisevat NK vasteen vastaavasti kanssa ”Missing itse hypoteesi” [21]. Tiedot tässä kerätyt osoittavat, että irtoaminen MHC-I tapahtuu sen jälkeen mekaaninen rasitus kasvain solun pinnalla, tämä ei päde terveitä soluja. Meidän havainto osoittaa immunologisesti asiaan vaikutusta mekaanista rasitusta kasvain alttius sytotoksisten hyökkäys.

NK-solu tunnistaa eri tuumorisolun tavoitteet eri E /T (efektori /kohde) suhde: 59c, 42a, 66b ( melanoomasolulinjojen), 293T (munuainen karsinooma) ja IM9 (lymphoblastoidcell riviä) ennen (harmaa) ja jälkeen (musta) mekaanista rasitusta. Mel 42a, Mel 66b, fibroblastit solut (paneelit B, E, ja F) hoidettiin mikropumpun, Mel 59c, IM9, 293 T-soluja (paneelit A, C ja D) korosti kanssa seismisiä aaltoja. Kuten terveitä kohdesoluja, tässä tapauksessa fibroblasteissa esitetään. Edustavia kokeita raportoidaan kullekin solutyypin. Paneelit G ja H osoittavat, tilastojen johdettu kolmesta eri funktionaalisia määrityksiä käyttäen NK lymfosyytit efektoreina solut (E) ja IM9 ja Melanoomasolut kohteina (T). IM9 kohdesoluja käsiteltiin seismisiä aaltoja (paneeli G: n = 3, p = 0,0325), kun taas melanooma kohdesoluja painotettava mikropumpun (paneeli H, n = 3, p = 0,0186). E /T-suhde 12/1, p 0,05.

lisääntynyt solujen sytotoksisuus havaittiin klassisen NK sytotoksisuusmäärityksissä ei johtunut passiivisella kohde solukuolema aiheuttama mekaaninen rasitus hoitoja, vaan pikemminkin aktiivista NK solut cytolitic ohjelma on osoituksena vähentäminen mekaanisen rasituksen kohdesolujen tappaminen jälkeen NK solun aktivoimiseksi reseptorien salpauksen.

Seuraavaksi tutkimme mekanismi, jolla mekaanista rasitusta, indusoi joko mikropumpun että paineaallot, voi johtaa MHC-luokan I alas sääntelyä.

Kuva.