Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aikaisemmin on raportoitu, että syövän estäjä proteiinia 2A (CIP2A-proteiinia) välittää apoptoottisen vaikutuksen Bortetsomibin maksasolukarsinoomassa (HCC). Täällä me raportoimme proteasomin riippumaton mekanismi, jolla bortetsomibi indusoi autophagy HCC. Tuloksemme osoittavat, että bortetsomibi aktivoitu autophagy annoksesta ja aikaa riippuvasti HCC solulinjojen Huh-7, SK-HEP1, ja Hep3B. Bortetsomibi vaimentua CIP2A-proteiinia, fosfo-Akt (P-Akt) ja fosfo-4EBP1 (P-4EBP1) annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla kaikilla testatuilla HCC-soluissa. Kohdunulkoinen ilmaus CIP2A-proteiinia poisti vaikutuksen Bortetsomibin on autophagy. Co-hoito Bortetsomibin ja kalykuliini A: PP2A estäjä, vähensi vaikutusta bortetsomibin P-Akt, P-4EBP1, ja autophagy. Lisääntynyt fosforylaatiota joko Akt tai 4EBP1 mukaan kohdunulkoisen yli-ilmentyminen suojattu soluja bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy. Lisäksi tutkimme vaikutus ΔBtz, Bortetsomibipitoisuuden johdannainen, joka muistuttaa läheisesti bortetsomibilla rakenteellisesti mutta ei proteasomiaktiivisuus, HCC. Mielenkiintoista on, ΔBtz osoitti samanlaisia ​​vaikutuksia bortetsomibille on autophagy, CIP2A-proteiinia, P-Akt: n ja P-4EBP1, mikä viittaa siihen, että vaikutus Bortetsomibin on autophagy on riippumaton proteasomin esto. Lisäksi meidän

in vivo

tiedot osoittivat, että bortetsomibin ja ΔBtz esti kasvaimen kasvua, vaimentua CIP2A-proteiinia, P-Akt ja aiheuttama autophagy in Huh-7 kasvaimia. Lopuksi bortetsomibi indusoi autophagy HCC kautta CIP2A-proteiinia-PP2A-Akt-4EBP1 reitin.

Citation: Yu H-C, Hou D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng A-L, et al. (2013) syöpä Inhibitor proteiinifosfataasi 2A välittää Bortetsomibi aiheutetun Autophagy maksasolukarsinoomassa Riippumaton Proteasome. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10,1371 /journal.pone.0055705

Editor: Peter Starkel, St. Luc University Hospital, Belgia

vastaanotettu: 25 lokakuu 2012; Hyväksytty: 28 joulukuu 2012; Julkaistu: 01 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuetaan apurahoja, NTUH 101P01 (KFC) National Taiwan University Hospital; NSC99-2314-B-002-017-My2 (KFC), ja NSC100-2325-B-002-036 (KFC) National Science Council, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin kiinteän kasvaimen maailmanlaajuisesti [1]. Advanced HCC on tunnusomaista usein resistenssin tavanomaisia ​​kemoterapia-aineiden ja säteilyn. On siis selvästi olemassa tarve kehittää uusia terapeuttisia kohteita ja strategioita HCC hoitoa. Äskettäin autophagy polku on tullut lupaava uusi tavoite syövän hoidossa. Autophagy tunnetaan homeostaattinen mekanismi säilyttää solujen eheyden ja on catabolic prosessi, johon hajoamista sytoplasman komponenttien kautta lysosomaalisen koneet [2]. Autophagy pelaa useita rooleja syövän: se voi edistää syöpäsolujen kuoleman tai eloon jäämisen riippuen monimutkaisesta vuorovaikutuksesta metabolisen stressin, reittejä apoptoosin ja autophagy [3], [4], [5]; ja häiriön autophagy voi myös edistää kasvaimien syntyyn [3], [6]. Parempi käsitys autophagy asetus voi helpottaa löytämään uusia potentiaalisia terapeuttisia kohteita HCC.

Bortetsomibi on ensimmäinen luokan dipeptidi boronate proteasomin estäjä erikseen nimetty kohdistaa 26S-proteasomin [7], [8]. Bortetsomibi on hyväksytty hoitoon useita myelooma ja vaipan solu non-Hodgkin-lymfooman (NHL) ja on kliinisessä tutkimuksessa käytettäväksi muissa syövissä [9], [10]. Sen lisäksi, että sen vaikutukset apoptoosin, solusyklin inhibitio (G2-M-vaiheen pysähtymisen) ja monia muita solun mekanismeja, jotka liittyvät proteasomin esto [10], [11], [12], bortetsomibilla on äskettäin osoitettu aiheuttavan autophagy vuonna hypoksinen HeLa kohdunkaulansyövän solut vasteena aktivoiduille Endoplasmakalvosto (ER) stressi [13], ihmisen eturauhasen syöpäsolujen kautta EIR-2α fosforylaatio [14] ja ihmisen pään ja kaulan okasolusyöpä soluja yhdessä proteasomin riippuva JNK aktivointi ja Bcl-2-fosforylaation [15]. Vaikka nämä tutkimukset yleisesti osoittavat bortetsomibihoitoon aiheuttama autophagy korreloi sen proteasomin esto [13], [14], [15], tarkka mekanismi bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy ei ole täysin ymmärretty.

On hyvin tunnettua, että nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on keskeinen säätelijä solujen kasvua ja autophagy [16]. Lisäksi aktivoitu mTOR kompleksi 1 (mTORC1), yksi kaksi suurta mTOR komponentit, aktivoi S6K ja fosforyloi 4EBP-1 (vapauttaen siten 4EBP-1 EIF4E) edistää mRNA: n translaation [17]. Lisäksi mTORC1 suoraan vuorovaikutuksessa ja estää ULK1 monimutkainen, olennainen osa autophagy aloittamista [18]. Sovittelu kasvutekijän signalointi mTOR on ensisijaisesti vasteena fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitillä [19]. Akt on keskeinen rooli syövän solujen eloonjäämistä ja apoptoosin sääntely, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että esto Akt edistää myös autophagy [20], [21], [22]. HCC, Akt-reitin on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktivoitua ja korreloi huonompi ennuste [23]. Aikaisemmat tutkimus osoitti myös, että downregulation p-Akt on suuri molekyyli tekijä bortetsomibihoidon aiheuttaman apoptoosin HCC-soluissa [24]. On huomionarvoista, että negatiivisen säätelyn Akt signalointi voidaan saavuttaa fosfataasien, kuten fosfataasi ja tensin homologi poistetaan kromosomissa kymmenen (PTEN) ja proteiini fosfataasi 2A (PP2A). PTEN on dual proteiini /rasva-fosfataasi, joka ehkäisee PI3K /Akt-signaloinnin defosforyloimaan fosfatidyyli-3,4,5-trisfosfaattia (PIP3) 3-asemassa [20]. Sen sijaan, PP2A on seriini /treoniini-proteiinifosfataasi, joka voi suoraan defosforyloida p-Akt ja p-ERK [25]. PP2A koostuu katalyyttisen C alayksikön (PP2Ac), rakennustelineet A-alayksikön (PR65) ja sääntelyyn B-alayksiköt [26]. PP2A on ehdotettu olevan tuumorisuppressori [27]. Esimerkiksi, lisääntynyt PP2A aktiivisuus voi indusoida apoptoosia inaktivoinnin Bcl-2 tai aktivoitumista Bad [28]. PP2A myös säätelee solusyklin, solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä joko suoraan tai epäsuorasti estämällä cdc2, MAPK ja Akt kinaasien [28]. Viimeaikaiset tiedot osoittivat myös, että bortetsomibi lisää PP2A toimintaa siten vähen- tämisessä p-Akt ja apoptoosin indusoimiseksi HCC-soluissa [29]. Lisäksi useat solun estäjät PP2A, kuten SET [30] ja CIP2A-proteiinia on tunnistettu [31]. CIP2A-proteiinia on tullut uutena onkoproteiinia ja yhä useammat raportit osoittavat, että se on yli-ilmennetään monissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien HCC [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A-proteiinia on osoitettu vakauttaa c-Myc-onkoproteiinin estämällä PP2A aktiivisuus c-Myc, mikä edistää ankkurista riippumaton solujen kasvua ja

in vivo

kasvaimen muodostumisen [31]. Viime aikoina olemme osoitti lisäksi, että CIP2A-proteiinia, estämällä PP2A-riippuvaisen p-Akt inaktivaation, välittää apoptoottisen vaikutuksen bortetsomibia HCC-soluissa [40].

Tässä tutkimuksessa me raportoimme proteasomin riippumaton mekanismi joka bortetsomibi indusoi autophagy HCC. Nykyinen työ viittaa siihen, että bortetsomibi indusoi autophagy HCC kautta CIP2A-proteiinia-PP2A-Akt-4EBP1 reitin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

Bortetsomibi (Velcade®) oli ystävällisesti Millennium Pharmaceuticals. Sillä

in vitro

tutkimuksissa, bortetsomibihoitoon eri pitoisuuksilla liuotettiin DMSO: hon ja lisättiin sitten soluihin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia (FBS). Lopullinen DMSO-pitoisuus oli 0,1%, kun lisäksi välineellä. Kalykuliini A ja 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​ostettiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Vasta-aineet immunoblottauksella, kuten anti-Akt1, ostettiin Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA). Muut vasta-aineet, kuten anti-LC3, -P-Akt (Ser473), -4EBP1, -P-4EBP1, -P-mTOR, -mTOR, -P-S6K, -S6K, anti-S6, -P-S6, – NF-KB, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7, ja -Beclin 1 olivat Cell Signaling (Danvers, MA).

Soluviljely ja western blot analyysi

Sk-HEP1 ja Hep3B solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Huh-7 HCC-solulinja saatiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani; JCRB0403). Soluja pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml, penisilliini G, 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia, ja 25 ug /ml amfoterisiini B: tä 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, ja atmosfäärissä, 5% CO

2. ilmassa. Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu.

Autophagy analyysi

Drug-induced autophagy arvioitiin useita määrityksiä, mukaan lukien: (1) Western blot -analyysi mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 ( LC3-II), kuten on kuvattu aiemmin; (2) Immunofluoresenssi ja LC3-II. Lyhyesti, Huh7-solut ympättiin 6 cm: n maljaa. Pesun jälkeen PBS: llä, solut käsiteltiin 800 nM bortetsomibihoitoon 16 tuntia, ja kiinnitettiin jääkylmällä 4% paraformaldehydillä. Kiinnitetyt solut jälkeen sitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanin anti-LC3II (1:200, # 3868, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), estoliuoksessa (1% naudan seerumin albumiinia TBST: ssä) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja värjättiin sitten anti-kani-IgG (H + L), F (ab ’) 2-fragmentti (Alexa Fluor® 488 Konjugaatti, # 4412, Cell Signaling) ja DAPI. Soluja tutkitaan LEICA DM2500 fluoresenssimikroskooppiin; (3) Virtaussytometria-analyysi LC3-II. Lyhyesti, Huh7 ja Hep3B ympättiin 6 cm: n maljaa. Pesun jälkeen PBS: llä, solut käsiteltiin 800 nM bortetsomibihoitoon 16 ja 24 tunnin ajan, kiinnitettiin jääkylmällä 4% paraformaldehydiä, ja käsiteltiin sitten jääkylmää 100% metanolia. Kiinnitetyt solut jälkeen sitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanin anti-LC3II (1:100, # 3868, Cell Signaling) estoliuoksessa (1% naudan seerumin albumiinia TBST: ssä) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten värjättiin anti- kani-IgG (H + L), F (ab ’) 2-fragmentti (Alexa Fluor® 488 Konjugaatti, # 4412).

immunof- ja LC3-GFP: n ja akridiinioranssi

Huh7-soluja, kasvatettu coverslip, transfektoitiin EGFP-LC3 plasmidi, jota seurasi 400 nM bortetsomibihoidon 24 tuntia. Sitten solut pestiin nopeasti PBS: llä ja kiinnitettiin huoneen lämpötilassa 15 minuuttia 4% paraformaldehydillä. Sen jälkeen, kun pestiin kahdesti PBS: llä, solut estettiin 1% naudan seerumin albumiinia TTBS: llä ja sitten asennetaan. Solunsisäisen jakautumisen EGFP-LC3 havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Leica DM2500). Sillä akridiinioranssivärjäyksellä, SK HEP1 soluja siirrostettiin 6 cm: n maljaa. Pesun jälkeen PBS: llä, solut käsiteltiin 800 nM bortetsomibihoitoon 16 tuntia, kiinteä jääkylmällä 4% paraformaldehydillä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten värjättiin akridiinioranssilla (5 ug /ml) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut tutkitaan LEICA DM2500 fluoresenssimikroskoopilla.

HCC-solujen konstitutiivisesti aktiivisen CIP2A-proteiinia

CIP2A-proteiinia cDNA (KIAA1524) hankittiin Origene (RC219918, Rockville, MD). Lyhyesti, transfektion jälkeen soluja inkuboitiin, kun läsnä oli G418: aa (0,78 mg /ml). Sen jälkeen kun 8 viikkoa valinta, elossa pesäkkeitä, eli ne, jotka johtuvat stabiilisti transfektoiduista soluista, valittiin ja erikseen monistettiin. HCC solujen vakaa ilmentyminen CIP2A-proteiinia-myc käsiteltiin sitten huumeita, korjattu, ja käsiteltiin Western blot analyysiä.

Vieraslajisiirteen kasvaimen kasvua

Male NCR atyymisissä karvattomia hiiriä (5-7 viikkoa ikä) saatiin National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Hiiret majoitettiin ryhmissä ja ylläpidetään vakio laboratorio-olosuhteissa on 12 tunnin valo-pimeä sykli. He saivat käyttöönsä steriloitu ruoka ja vesi

halun

. Kaikki kokeellisia menetelmiä, joissa nämä hiiret tehtiin protokollien mukaisesti hyväksymien Institutional Laboratory Animal Care ja käyttö komitea National Taiwan University (Luvan numero: 20080205). Kukin hiiri s.c. selkäpuoli kylkeen 1 x 10

6 Huh-7-solut suspendoitiin 0,1 ml: aan seerumitonta elatusainetta, joka sisälsi 50% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 200-300 mm

3 hiiret saivat intraperitoneaalisesti bortetsomibi (1 mg /kg) tai ΔBtz (1 mg /kg) kahdesti viikossa hoidon kestosta. Kontrollit saivat ajoneuvo.

Tilastollinen

Kasvaimen kasvu datapisteitä raportoidaan keskiarvona kasvaimen tilavuus ± SE. Vertailut keskiarvojen tehtiin käyttämällä riippumattomien näytteiden

t

testin SPSS for Windows 11.5 ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Tulokset

Bortetsomibi indusoi autophagy HCC

vaikutuksen tutkimiseksi bortetsomibin on autophagy HCC, ensin tarkasteltiin ilmentymistä mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3-II), joka on LC3-fosfatidyyli-etanoliamiini konjugaatti, joka on tuntomerkki autophagy. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, bortetsomibi aiheuttama autophagy pitoisuudesta riippuvaisella tavalla aloittaen pitoisuudella 200 nM Huh-7, SK-HEP1 ja Hep3B soluja, minkä osoittaa lisääntyminen LC3-II. Lisäksi, teimme ajasta riippuva analyysi bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy. Meidän tiedot osoittavat, että bortetsomibi voimistunut ilmentyminen LC3-II ajasta riippuvalla tavalla (Kuva. 1 B). Seuraavaksi havaitaan ilmentymistä LC3-II virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 1C

jäljellä

bortetsomibi nostivat LC3-II merkitsevästi jälkeen bortetsomibihoidon 24 tuntia. Lisäksi bortetsomibi aiheuttama autophagy vahvisti myös LC3-II immunof- värjäytymistä (Fig. 1 C

oikea

). Stimuloivan vaikutuksen Bortetsomibin on autophagy vahvistettiin lisääntyminen GFP-LC3 pisteitä soluissa käsitelty huumeiden, kuten tutkittiin GFP-LC3 määritystä (Fig. 1 D

Top), ja myös toimesta kasvaa akridiinioranssivärjäyksellä happamat vesicular organelles (Fig. 1 D

alhaalla

). Nämä tiedot osoittavat, että bortetsomibi merkittävästi aktivoi autophagy HCC.

, annoksesta riippuvaa vaikutusta bortetsomibin aiheuttaman autophagy. HCC solut käsiteltiin bortetsomibilla ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solulysaatit valmistettiin immunoblottauksen mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3). B, ajasta riippuva vaikutukset bortetsomibihoidon aiheuttaman autophagy. Solut altistettiin bortetsomibille ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tai 48 tuntia. C, vaikutukset Bortetsomibin on LC3-II.

Vasen,

analyysi LC3-II värjäys virtaussytometrialla. Soluja käsiteltiin bortetsomibilla 800 nM 16 tai 24 tuntia.

Oikea,

analyysi LC3-II immunofluoresenssimenetelmällä. Hep3B solut käsiteltiin bortetsomibilla 800 nM 24 tuntia. D,

top,

LC3-GFP värjäystä.

Ala,

akridiinioranssin tahra.

esto CIP2A-proteiinia-Akt-4EBP1 signalointireitistä liittyy bortetsomibilla aiheuttama autophagy HCC

aikaisemman työn havaittiin, että esto CIP2A-proteiinia on määräävä tekijä bortetsomibihoidon indusoiman apoptoosin HCC-soluissa. Tutkimaan edelleen mekanismi, jonka bortetsomibi aiheuttama autophagy HCC, me seuraavaksi tutkittava, onko CIP2A-proteiinia on rooli bortetsomibin aiheuttaman autophagy HCC. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja B, bortetsomibi vaimentua proteiinin tasot CIP2A-proteiinia, P-Akt, P-4EBP1 ja aiheuttama autophagy kaikissa HCC solulinjoissa, mukaan lukien Huh-7, SK-HEP1 ja Hep3B, joka pitoisuus- ja aikaa riippuvasti. Lisäksi bortetsomibi ei merkittävästi muuttanut ekspressiotasot muiden autophagy liittyviä proteiineja, mukaan lukien ATG7, ATG5, Beclin 1, ATG3, P-S6K, ja S6K (Fig. 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio CIP2A-proteiinia-Akt-4EBP1 liittyy bortetsomibilla aiheuttama autophagy HCC-soluissa.

A, annoksesta riippuva analyysi CIP2A-proteiinia, Akt ja 4EBP1 HCC-soluissa. Solut altistettiin bortetsomibille ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. B, aikariippuvainen analyysi CIP2A-proteiinia, Akt ja 4EBP1 HCC-soluissa. Solut altistettiin bortetsomibille ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tai 48 tuntia. C, annoksesta riippuvainen analyysi autophagy liittyviä proteiineja. Solut altistettiin bortetsomibi ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia.

Target validointi CIP2A-proteiinia-PP2A-Akt-4EBP1

validoimiseksi roolin CIP2A-proteiinia välittämisessä vaikutusta bortetsomibin on autophagy HCC, olemme yli-ilmentynyt CIP2A-proteiinia in HCC. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen CIP2A-proteiinia suojattujen solujen bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy in Huh-7 ja Hep3B soluja, mikä osoittaa, että CIP2A-proteiinia on avainasemassa välittämisessä autophagic vaikutus bortetsomibia HCC-soluissa (kuvio. 3A). Lisäksi lisäämällä kalykuliini A: PP2A estäjä, vähensi vaikutusta bortetsomibin on CIP2A-proteiinia, P-Akt, P-4EBP1 ja autophagy in Huh-7 (Fig. 3B

jäljellä

). yliekspressio Akt1 lakkautetaan bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy merkittävästi (Fig. 3B

keskellä

). Kohdunulkoinen ilmaus 4EBP1 vähensi myös vaikutusta bortetsomibin on autophagy in Huh-7. Nämä tulokset osoittavat, että CIP2A-proteiinia-PP2A-Akt-4EBP1 signalointireitistä avainasemassa välittämisessä bortetsomibin vaikutuksesta autophagy HCC. Lisäksi tutkimme vaikutus yhdistelmän bortetsomibin ja rapamysiinin, mTOR-estäjä, on autophagy. Tuloksemme osoittivat yhtäaikainen käsittely rapamysiinin ja bortetsomibilla kasvoi autophagy merkittävästi (Fig. 3C

jäljellä

). Lisäksi 3-MA, joka on autophagy estäjä, käänteinen autophagic vaikutus bortetsomibia Huh-7-soluissa (kuvio. 3C

oikea

). Erityisesti olemme suorittaneet kaikki kokeet edellä (kuva 3) kussakin HCC solulinjoissa ja huomannut, että ei ollut merkitsevää eroa näiden solulinjojen suhteen vaikutusta bortetsomibin on validoitu tavoitteista. Vain joitakin edustavia tietoja on esitetty tässä.

, ektooppinen ilmentyminen CIP2A-proteiinia-myc kumoaa vaikutuksia Bortetsomibin on autophagy in Huh-7 ja Hep3B soluja. Solut transfektoitiin CIP2A-proteiinia-myc ja valittiin 8 viikkoa G-418. Analyysi autophagy suoritettiin Western blot (WB) sen jälkeen, kun soluja altistuu peräkkäin DMSO: ssa tai bortetsomibilla (200 nM tai 400 nM tai 800 nM) 24 tuntia. B,

jäljellä,

yhtäaikainen käsittely kalykuliini A: PP2A estäjä, kääntää vaikutusta bortetsomibin on CIP2A-proteiinia, P-Akt, P-4EBP1 ja autophagy. Soluja käsiteltiin kalykuliini A (1 mM) tai bortetsomibilla (800 nM) 24 tuntia.

Middle,

ektooppinen ilmentyminen Akt1 vähentää vaikutuksia Bortetsomibin on autophagy in Huh-7-soluissa.

Oikea

ektooppinen ilmentyminen 4EBP1 vähentää vaikutuksia Bortetsomibin on autophagy in Huh-7-soluissa. C,

jäljellä,

yhtäaikainen käsittely rapamysiinin, mTOR-estäjä, parannettu bortetsomibilla aiheuttama autophagy in Huh-7-soluissa. Soluja käsiteltiin rapamysiiniä (100 nM) ja /tai bortetsomibilla (400 nM) 24 tuntia.

Oikea,

Samanaikainen käyttö autophagy estäjä 3-metyyliadeniinin (3-MA) ​​vähensi bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy. Huh7-soluja käsiteltiin bortetsomibilla (800 nM) ja /tai 3-MA (1 mM) 16 tunnin ajan.

vaikutus Bortetsomibin on autophagy ja CIP2A-proteiinia on riippumaton proteasomin

jotta voidaan tutkia, onko vaikutus bortetsomibin on autophagy ja CIP2A-proteiinia, jotka liittyvät sen proteasomin estovaikutuksen, syntetisoimme Bortetsomibipitoisuuden johdannainen (ΔBtz), joka on samanlainen bortetsomibille rakenteellisesti paitsi että siitä puuttuu boronihappo funktionaalinen ryhmä, joka on kriittinen tekijä proteasomiaktiivisuus (Fig. 4A

jäljellä

). Verrattuna bortetsomibin, ΔBtz oli vähän vaikutusta proteasomin esto (Fig. 4A

keski

) tai NF-KB-esto (Fig. 4A

oikea

). NF-KB on tunnettu proteasomin inhibiittoria tavoite. Mielenkiintoista, ΔBtz osoitti merkittäviä vaikutuksia CIP2A-proteiinia, P-Akt, ja P-4EBP1 on pitoisuudesta ja ajasta riippuva tavalla HCC samanlainen bortetsomibiin (Fig. 4B

jäljellä

keski

). Co-hoidon autophagy estäjä 3-MA vähensi autophagic vaikutusta ΔBtz (Fig. 4B

oikea

). ΔBtz lisääntynyt ekspressio LC3-II (Fig. 4C

vasemmalle

), ja myös lisääntynyt akridiinioranssivärjäyksellä happamat vesicular organelles (Fig. 4C

keskellä

). Käyttämällä elektronimikroskoopilla tekniikka, numerot autophagic vacuoles osoitettiin olevan merkittävästi lisääntynyt Sk-HEP1 soluja käsiteltiin 800 nM bortetsomibiin tai ΔBtz, mutta ei kontrolli (Fig. 4C

oikea

). Lisäksi tutkimme vaikutuksia muiden proteasomiestäjät MG132 ja laktakystiiniä puolesta autophagy ja CIP2A-proteiinia. Tuloksemme osoittivat, että kumpikaan MG132 eikä laktakystiiniä ollut merkittäviä vaikutuksia autophagy tai CIP2A-proteiinia (Fig. 4D

jäljellä

). Kuitenkin odotetusti, nämä kaksi proteasomiestäjät osoittivat merkittävää proteasomin esto aktiivisuutta (Fig. 4D

oikea

). Nämä tulokset osoittavat, että vaikutus Bortetsomibin on autophagy on riippumaton proteasomin.

,

jäljellä,

kemiallisia rakenteita Bortetsomibin ja ΔBtz.

Middle,

vaikutukset Bortetsomibin ja ΔBtz on proteasomin esto.

Oikea,

vaikutukset Bortetsomibin ja ΔBtz NF-KB. B,

jäljellä,

annosriippuvaista vaikutusta ΔBtz on CIP2A-proteiinia, Akt ja LC-3.

Middle,

ajasta riippuva vaikutus ΔBtz on CIP2A-proteiinia, Akt ja LC-3.

Oikea,

Samanaikainen käyttö autophagy estäjä 3-MA vähensi ΔBtz aiheuttamaa autophagy. C,

jäljellä

, vaikutukset ΔBtz on LC3-II immunof-.

Lähi

, vaikutukset ΔBtz on akridiinioranssivärjäyksellä.

Oikea,

Sk-HEP1 soluja käsiteltiin bortetsomibilla (800 nM) tai ΔBtz (800 nM) tai ajoneuvo otettiin talteen, kiinteät ja upotettu kannustaa hartsia. Seitsemänkymmentä nanometrin ohuita leikkeitä leikattiin ja tutkittiin 120 Kv kanssa JEM-1400 lähetyksen elektronimikroskoopilla. Nuolet osoittavat autophagic vacuoles. D, Muut proteasomiestäjät ei aiheuttanut autophagy HCC.

Vasen

, vaikutukset MG-132 ja laktakystiiniä päälle CIP2A-proteiinia ja LC-3.

Oikea

, vaikutukset bortetsomibin, MG-132 ja laktakystiiniä on proteasomin esto.

Effect Bortetsomibin ja ΔBtz on HCC ksenograftin kasvaimen

Vahvista onko vaikutus bortetsomibin on autophagy on mahdollisesti merkitystä kliinistä merkitystä, arvioimme

in vivo

vaikutusta bortetsomibin on HCC ksenograftikasvaimissa. Kasvain hiiriä käsiteltiin vehikkelillä tai bortetsomibiin tai ΔBtz. Molemmat lääkkeet injektoitiin intraperitoneaalisesti 1,0 mg /kg kahdesti viikossa 2 viikkoa. Kaikki eläimet sietivät hoitoja hyvin ilman havaittavia merkkejä myrkyllisyydestä ja oli vakaa painon koko tutkimuksen ajan. Ei brutto patologista poikkeavuuksia havaitaan ruumiinavauksessa. Tuloksemme osoittivat, että bortetsomibi ja ΔBtz osoittivat samankaltaisia ​​vaikutuksia Huh-7 kasvaimen kasvua. Koko kasvaimen väheni merkittävästi kahden viikon kuluttua hoidon jälkeen. Korreloivan biologisen vasteen kanssa toimintamekanismi tunnistettu

in vitro

, vaikutus Bortetsomibin on autophagy HCC kasvainten tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 5B ja 5C, hoito ΔBtz vähensi proteiinin tasot CIP2A-proteiinia ja P-Akt ja merkittävästi aiheuttama LC3 in Huh-7-solujen samanlainen bortetsomibiin. Nämä tiedot osoittavat, että ΔBtz ollut merkittäviä antituumorivaikutuksia

in vivo

ja mikä tärkeintä, viittaavat siihen, että bortetsomibi indusoi autophagy HCC kautta proteasomin-riippumaton mekanismi.

, kasvain kasvukäyrät Huh -7. Points, keskiarvo (n = 6); baareja, SE. *

P

0,05; **

P

0,01. B, western blot-analyysi CIP2A-proteiinia, P-Akt, Akt1 ja LC-3 Huh-7 kasvaimia. C, immunoblot skannattiin jonka UVP BioSpectrum AC kuvaa järjestelmän ja kvantitatiivisesti käyttäen VisionWork LS ohjelmiston suhteen määrittämiseksi tason CIP2A-proteiinia aktiiniin.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD (n = 3, *

P

0,05). D, yhteenveto tila toimien Bortetsomibin.

Keskustelu

Tämä tutkimus paljastaa uuden mekanismin, jolla bortetsomibi indusoi autophagy HCC-soluissa (eli CIP2A-proteiinia-PP2A-Akt -4EBP1 polku), ja lisää ymmärrystä onkogeenisten proteiinien, kuten Ras, Akt ja ERK jotka säätelevät autophagy [6], [41]. Mielenkiintoista, käyttämällä yhdistettä ΔBtz joka muistuttaa läheisesti bortetsomibihoitoon kemialliselta rakenteeltaan, mutta siitä puuttuu merkittäviä proteasomin estävä kyky, osoitimme, että tämä CIP2A-proteiinia riippuva sääntely Bortetsomibin aiheuttama autophagy ei välttämättä riipu proteasomin esto. Bortetsomibi oletetaan estävän proteasomin 20S ydinhiukkasen muodostamalla stabiilin tetraedrisen boronihapon välituotteen N-terminaalisen treoniinin tähde aktiivisen β-alayksikön 20S ydinhiukkasen [7]. Perustuen tärkeydestä boronihapon funktionaalisen ryhmän saarto proteasomin, me korvataan bortetsomibilla kanssa ΔBtz joka eroaa bortetsomibiin sen boronaattiryhmällä (kuvio 4A). ΔBtz todellakin osoitti hieman proteasomin esto, mutta kuitenkin esiin CIP2A-proteiinia riippuvainen autophagy samalla tavalla bortetsomibiin (kuvio 4). Tämä proteasomin riippumaton CIP2A-proteiinia esto ja autophagy välittämää bortetsomibin tukee lisäksi havainto, että muut proteasomiestäjät (MG132 ja laktakystiiniä), ei merkittävästi vaikuttanut autophagy ja CIP2A-proteiinia (kuvio. 4D

jäljellä

) huolimatta osoittaa merkittävää proteasomin estovaikutuksen (Fig. 4D

oikea

). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että vaikutus Bortetsomibin on autophagy voi olla riippumaton proteasomin esto. Huomattavaa on, että vaste kunkin solulinjan induktion LC3-I /LC3II bortetsomibilla oli erilainen (Fig. 1A) ja ei ollut identtinen mukaan muutokset CIP2A-proteiinia ja P-Akt (Fig. 2A). Yksi mahdollinen selitys on, että nämä erot voivat liittyä selvä geneettinen tausta välillä solulinjoja. Kuitenkin on edelleen mahdollista, että uudet tavoitteet tai väyliä (muu kuin CIP2A-proteiinia /Akt-reitti) saattaa myös olla rooli välittämisessä vaikutusta bortetsomibin on autophagy.

proteasomin ja autophagy-lysosomin reittejä pidetään kaksi pääreittiä eukaryoottisen solunsisäisen proteiinin purkupallon niiden yhteyttä ja vuorovaikutusta ovat olleet viime aikoina kiinnostavia aiheita [42], [43], [44]. Katsotaan, että näiden kahden solun hajoamisen järjestelmät on toiminnallisesti kytketty ja tukahduttaminen proteasomireitillä koulutusjakson aktivoi autophagy kautta aiheuttamaa ER stressin [43], [45]. Tässä yhteydessä aktivointi autophagy toimintoja kompensoimaan heikentynyt hajoamista ubikitinoituja proteiinin indusoima proteasomin inhibiittorit ja lievittää ER stressiä [14], [45]. Näin ollen, autophagy voi suojata soluja myrkyllisyyttä proteasomiestäjät. Toisaalta, esto autophagy voi vaarantaa hajoamista Ubikitiini-proteasomireitillä substraatteja [46]. Näyttö on osoittanut, että yhdistelmä autophagy estäjien ja proteasomiestäjät edistää solukuolemaa kautta sekä apoptoosin ja kuolion [14]. Meidän HCC malli, olemme osoittaneet, että bortetsomibilla indusoi autophagy läpi proteasomin-riippumaton mekanismi. Aiemmin vahvisti, että bortetsomibi voi aiheuttaa apoptoosin kautta CIP2A-proteiinia-PP2A-p-Akt mekanismi, joka on myös erottaa proteasomin esto bortetsomibilla [40]. Olemme osoittaneet, että bortetsomibi aiheuttama autophagy HCC solulinjoissa (so Sk-HEP1, Hep3B ja Huh-7), jotka ovat myös herkkiä bortetsomibin indusoiman apoptoosin. Käyttämällä HCC malli on selvää, että estämällä CIP2A-proteiinia bortetsomibihoidon saa aikaan sekä apoptoosin ja autophagy, jotka molemmat ovat riippumattomia proteasomin esto. Lisäksi näyttö että CIP2A-proteiinia on merkittävä rooli välittämisessä bortetsomibin aiheuttaman apoptoosin ja autophagy HCC-soluissa viittaa siihen, että CIP2A-proteiinia, voi olla mahdollinen uusi lääke tavoite HCC ja että yhdisteet /lääkkeet, jotka toimivat CIP2A-proteiinia inhibiittorit saattavat olla terapeuttista potentiaalia HCC. Olipa nykyisin tunnetut autophagy inhibiittorit kuten bafilomysiini A1, 3-MA tai chloraquine voi synergoida nämä CIP2A-proteiinia estäviä aineita tappaa syöpäsoluja optio tulevissa tutkimuksissa.

Lisäksi havainto, että onkogeeniset CIP2A-proteiinia välittää bortetsomibin aiheuttama autophagy, tässä tutkimuksessa tunnistettiin p-4EBP-1 osallistujaksi bortetsomibin aiheuttama autophagy myötävirtaan p-Akt. Rooli p-4EBP1 validoitiin ektooppinen ilmentyminen 4EBP1, mikä johti kasvuun p-4EBP1, ja sen jälkeen vähentää vaikutusta bortetsomibin on autophagy (kuvio 3B). 4EBP-1 tunnetaan alavirtavaikuttajainhibiittorit PI3K /Akt /mTOR signalointi että ei-fosforyloitua muotoa sitoutuu tiukasti EIF4E ja estää keskeinen vaihe translaation aloituksen [47], [48]. EIF4E on avaintekijä cap-riippuvaisten translaation aloituksen (mukaan lukien useita tärkeitä onkoproteiineja kuten c-Myc, sykliini D1, hypoksia-indusoituva tekijä 1, ja Mcl-1), joka ohjaa kasvaimen solujen kasvua ja selviytymistä. Tuloksemme viittaavat siihen, että bortetsomibi vaimentua CIP2A-proteiinia-PP2A-p-Akt liittyvä p-4EBP1. On mahdollista, että downregulation p-4EBP1 tukahdutetaan EIF4E riippuvaisen translaation mikä edistää bortetsomibihoidon aiheuttama autophagy. Tätä olettamusta tukee tuore tutkimus osoittaa, että suppressio 4EBP1 ilmaisun johti uudelleen herkistymistä MYC-ilmentävien syöpäsolujen rapamysiiniin aiheuttamaa autophagy [49]. Itse asiassa olemme myös huomannut, että bortetsomibi tukahdutti myös ilmentymisen 4EBP-1 Sk-HEP1, ja Hep3B-solut (kuvio 2A), mikä saattaa myös edistää bortetsomibille aiheuttama autophagy. Vaihtoehtoisesti PP2A voi suoraan defosforyloivat EIF4E ja edistää bortetsomibille aiheuttamaa autophagy [50]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla p-4EBP1 osallistuu autophagy aktivoinnin HCC on vielä selvittämättä, ja lisätutkimukset ovat tarpeen. Vaikka nykyinen tulosten yksityiskohtainen mekanismi, jolla bortetsomibilla estää CIP2A-proteiinia on tuntematon ja edelleen Mekaaniset tutkimukset ovat tarpeen. Mahdollisia mekanismeja, joiden kautta bortetsomibi voivat vaikuttaa transkriptioon CIP2A-proteiinia sisältävät suoran tai välillisen promoottori sääntelyä CIP2A-proteiinia mRNA, epigeneettiset sääntelyn

CIP2A-proteiinia

geenin DNA: n metylaatio tai mikro-RNA koneita tai vaikuttavat muut vielä tuntemattomia molekyylejä jotka voivat säädellä CIP2A-proteiinia ilme.

Yhteenvetona bortetsomibi indusoi autophagy HCC soluihin uudenlainen proteasomin riippumaton mekanismi: CIP2A-proteiinia riippuva p-4EBP-1 downregulation. Tässä tutkimuksessa määritetään uuden onkoproteiinia CIP2A-proteiinia merkittävänä välittäjänä HCC solujen bortetsomibille aiheuttama autophagy ja ehdottaa, että CIP2A-proteiinia, voi olla mahdollinen uusi lääke tavoite HCC. Lisäksi löytö yhdisteiden /huumeiden toimii CIP2A-proteiinia inhibiittorit saattavat olla terapeuttista potentiaalia HCC terapiassa.