PLoS ONE: In vivo lähi-infrapuna fluoresenssikuvantamisella Apoptoosin käyttäminen histoni H1-kohdistaminen Peptide Probe jälkeen Anti-Cancer sisplatiinihoidolle ja Setuksimabia Early päätös Kasvain Response
tiivistelmä
Early päätös kasvaimen vastetta anti-syövän hoitoon on edelleen tyydyttävää lääkehoitoa. Täällä, tutkimme
in vivo
kuvantamiseen apoptoosin käyttäen lineaarista ja syklisiä (Disulfidisitoutuneen) muoto ApoPep-1, peptidi, joka tunnistaa histoni H1 alttiina apoptoottisia soluja, alkuvaiheessa hoidon jälkeen voi ennustaa kasvaimen hoitovasteesi myöhemmin. Hoito vatsan kasvainsolujen cistplatin tai setuksimabin yksinään indusoiman apoptoosin, kun taas yhdistelmä sisplatiinin ja setuksimabin tehokkaammin indusoiman apoptoosin, kun havaitaan sitomalla lineaarinen ja syklinen muoto ApoPep-1. Kuitenkin erot yhden aineen ja yhdistelmä hoidon olivat merkittäviä, kuten havaitaan kanssa syklisessä muodossa verrattuna lineaariseen muotoon. Tuumoria kantavissa hiirissä, apoptoosin kuvantaminen tehtiin 1 viikko ja 2 viikkoa sen jälkeen, kun hoidon aloittamisesta, kun kasvainten tilavuudet ja painot mitattiin 3 viikkoa hoidon jälkeen.
In vivo
fluoresenssikuvantamisella signaalit saadaan ottoa ApoPep-1 kasvain oli merkittävin ryhmässä ruiskutetaan syklinen muoto ApoPep-1 1 viikon kuluttua yhdistelmähoito sisplatiinin plus setuksimabia. Korrelaatio analyysi paljasti, että kuvantamisen signaalit syklinen ApoPep-1 1 viikon kuluttua hoidon sisplatiinilla plus setuksimabin yhdistettynä olivat useimmissa liittyy läheisesti kasvaimen tilavuus muuttuu (r
2 = 0,934). Nämä tulokset osoittavat, että
in vivo
apoptoosin kuvantamisen avulla Apopep-1, erityisesti syklinen ApoPep-1, on herkkä ja ennakoiva väline pikainen päätös mahatuumori vastetta anti-syövän hoidossa.
Citation: Jung HK, Wang K, Jung MK, Kim IS, Lee BH (2014)
In vivo
infrapuna-fluoresenssi Imaging Apoptoosin käyttäminen histoni H1-kohdistaminen Peptide Probe jälkeen Anti-Cancer sisplatiinihoidolle ja Setuksimabia Early päätös tuumorivasteita. PLoS ONE 9 (6): e100341. doi: 10,1371 /journal.pone.0100341
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat
vastaanotettu: 02 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 23 toukokuu 2014; Julkaistu: 20 kesäkuu 2014
Copyright: © 2014 Jung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät käsikirjoituksen.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta kansallisten T Welfare, Korean tasavalta (0720550-2 kohteeseen Byung-Heon Lee) ja apurahan NRF-2012M2A2A7035589 (jotta Byung-Heon Lee) kautta National Research Foundation Korean. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1]. Single-agentti kemoterapiaa edennyt mahasyöpä sisältää kapesitabiinin tai 5-fluorourasiilin, kun taas yhdistelmähoito sisältää sisplatiinin plus 5-fluorourasiilin tai sisplatiinin plus kapesitabiini [2]. Valitettavasti mahasyöpä on osoittanut alhainen vastuuta kemoterapiaa. Vastausprosentti oli edennyt mahasyöpä vaihtelee 10-30% yhden-agentin hoito ja 30-60% yhdistettyjen kemoterapiaa [2]. Lisäksi molekyyli kohdennettuja lääkkeitä kuten setuksimabi (anti-epidermaalisen kasvutekijän reseptorin vasta-aine) ja trastutsumabilla (anti-HER2-reseptorin vasta-aine) on käytetty yhdessä kemoterapian, jolloin monipuolinen hoitovaste [3] – [5]. Kun otetaan huomioon näiden alhainen hoitovasteen seurannan ja varhaisen päätös mahatuumori vasteen hoidon jälkeen syöpälääkkeitä on siksi erittäin tärkeää hallinnassa syöpähoidon.
Perinteisesti päätös tuumorivaste on suoritettu mittaamalla muutokset kasvaimen kokoa tietokonetomografia (CT). Tällainen kasvaimen koon perustuvaa päätöstä tuumorivaste kuitenkin yleensä mahdollista kahden kuukauden kuluttua hoidon aloittamisesta. Suuntaviivojen mukaisesti Response arviointiperusteet vuonna kiinteitä kasvaimia (RECIST), kun on vähintään 30% vähennys kasvaimen koon, hoidon pidetään osittaisen vasteen, kun taas silloin, kun on 20% tai suurempi tuumorin koon kasvuun, se on määritelty etenevä sairaus, [6]. Vähentää vievää aikaa ja kustannuksia varten kasvainhoitojen, se on velvollisuus tehdä go /no-go päätöstä hoidon nykyistä aiemmaksi perustuva menetelmä kasvaimen koon mittaus CT.
Measuring otto
18F-fluorideoksiglukoosi (
18F-FDG) kasvaimen positroniemissiotomografialla (PET) kuvantaminen on antanut meille mahdollisuuden tehdä aiemmin päätöksen kasvaimen vastetta kasvainhoitojen kuin kokoon perustuva CT kuvantaminen.
18F-FDG oton kasvainsolukon väheni väheneminen aineenvaihduntaa ja taakka syöpäsolujen kemoterapian jälkeen. On kuitenkin tunnettua, että otto
18F-FDG riippuu lähinnä histopatologinen tyyppisiä mahasyöpä. Esimerkiksi Signet-rengas cell carcinoma ja mucinous adenokarsinooma otto
18F-FDG matalalla tasolla johtuen alhainen GLUT-1 transporter [7], [8]. Nämä ominaisuudet tekevät päätöksen mahasyövän vastaus
18F-FDG oton rajoitettu. Lisäksi joidenkin kasvainten, kuten rintasyövän, osoittavat metabolista leimahtaa, nostamisesta väliaikaisesti
18F-FDG oton jälkeen kemoterapia, jota on vaikea sen erottamiseksi kasvaimen uusiutumisen [9].
kun kasvainsolut kemoterapiaa ja molekyylitason kohdennettuja lääkkeitä, ne yleensä kuolevat apoptoosin [10] – [12]. Apoptoottisen solukuoleman näyttää esiintyvän ennen anatomista muutosta tai kasvaimen koon pienentyminen [13], [14]. Tässä suhteessa, kuvantaminen apoptoosin antaisi meille mahdollisuuden päättää, kasvain reagoi hoitoon varhaisemmassa vaiheessa kuin tekee kuvantaminen pienentäminen. Lisäksi apoptoosin suoraan edustaa kasvainsolun kuoleman, kun taas
18F-FDG oton edustaa kasvaimen aineenvaihduntaa ja siten epäsuorasti edustaa kasvainsolun kuoleman. Apoptoottisia soluja laittaa allekirjoituksia tai biomarkkereita niiden pinnalla, kuten fosfatidyyliseriini ja histoni H1, jotka ovat vähän tai poissa pinnalla terveitä soluja [15] – [17]. Apoptosis kuvantamisen antureista kuten anneksiini V ja dipicoyl sinkki amidi, jotka sitoutuvat fosfatidyyliseriini on hyödynnetty seurantaan kasvainsolujen apoptoosin
in vivo
[15] – [17].
Olemme aiemmin tunnistettu ApoPep -1 että hyväksytyt apoptoottisten ja nekroottisten solujen sitoutumisen kautta histoni H1 pinnalla apoptoottisten solujen ja tumassa nekroottisia soluja, vastaavasti [18]. ApoPep-1: n on osoitettu olevan kertynyt kasvaimen jälkeen doksorubisiinin kanssa [18]. Lisäksi se on käytetty kuvantamiseen sydänlihaksen solukuolema varhaisessa vaiheessa sen jälkeen, kun sydäninfarktin arviointia varten pitkäaikaisen sydämen toimintaa [19]. Terapeuttisiin tarkoituksiin, ApoPep-1 on käytetty, koska kohdeosan parantaa lääkeaineen ja T-solun toimitus kasvaimen apoptoosin induktion jälkeen kemoterapian [20], [21]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko
in vivo
kuvantamisen signaaleja apoptoosin saatu oton lineaariset ja sykliset (Disulfidisitoutuneen) muoto ApoPep-1 varhaisessa vaiheessa käsittelyn jälkeen korreloivat muutosten kasvaimen tilavuuden myöhemmin ja pystyvät tekemään pikaisesti päätöksen tuumorivaste mahdollista.
Materiaalit ja menetelmät
synteesi ja fluoresenssi merkintöjä peptidien
Linear (CQRPPR) tai syklinen (CQRPPRC, syklisointi kautta disulfidisidosten amino- ja karboksipäätteet) muodossa ApoPep-1 peptidit syntetisoitiin ja puhdistettiin käyttäen korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), jolloin 90%: n puhtaudella Peptron Inc. (Daejeon, Korea.). Peptidit leimattiin FPR675 lähi-infrapuna (NIR) fluoresenssiväriä (Bioacts Inc., Incheon, Korea.) B
In vitro peptidien sitoutumista apoptoottisten solujen
SNU16 ihmisen mahasyöpä solulinja oli ostettu KCLB (Seoul, Korea). Apoptoosin, soluja käsiteltiin sisplatiinin (300 ng /ml), setuksimabi (200 ug /ml), ja sisplatiini (300 ng /ml) plus setuksimabi (200 ug /ml) yhdessä 24 tuntia. Sisplatiinin ja setuksimabi valittiin mukaan edelliseen raportit [22], [23]. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin 10 uM fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu lineaarinen tai syklinen muoto ApoPep-1 lämpötilassa 4 ° C: ssa 1 h. Kontrollina, solut värjättiin Alexa488-konjugoidulla anneksiini V (Life Technologies, Carlsbad, CA) 15 minuutin ajan RT: ssä. Prosenttiosuudet fluoresoiva (peptidi-sitoutuneiden tai anneksiini V-sitoutunut) soluihin mitattiin virtaussytometrialla.
Anti-kasvain hiirten ja kasvaimen koko mittaus
Kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen hoitokäytännön ja mukaan eläimen protokollan hyväksymän suuntaviivat Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC) on Kyungpook National University (luvalla nro KNU 2012-15).
Kahdeksan viikkoa vanhoja naaraspuolisia kateenkorvattomissa (
nu /nu
) Balb /c-hiiriä ostettiin Orient laboratorioista (Seongnam, Korea) ja sijoitettiin häkkeihin erityisiä-patogeenivapaissa olosuhteissa laboratoriossa ruokaa ja vettä
halun
. Vatsa tuumoriksenografteja vahvistettiin ihonalaisesti ruiskuttamalla 1 x 10
7 SNU-16 solua 100 ul: ssa suolaliuosta oikeaan kylkeen. Kasvainten annettiin saavuttaa 50-60 mm
3 tilavuus ennen satunnaistamista ja hoidon aloittamista. Hoito kasvain hiirillä sisplatiinin ja setuksimabin suoritettiin mukaisesti aikaisemmin kuvatun protokollan [24]. Hiiret jaettiin neljään hoitoryhmään (
n
= 6 per ryhmä) ja käsiteltiin kahden viikon ajan: 1) suolaliuos valvonta; 2) sisplatiinia (5 mg /kg, intraperitoneaalinen (i.p.) injektiota, kerran viikossa yhteensä kaksi injektiota); 3) setuksimabi (1,5 mg /kg, i.p., kahdesti viikossa yhteensä neljä injektiota); 4) sisplatiinia (5 mg /kg, i.p., kerran viikossa yhteensä kaksi injektiota) plus setuksimabi (1,5 mg /kg, i.p., kahdesti viikossa yhteensä neljä injektiota). Yksi kierros hoito kuuluu injektion sisplatiinia päivänä 1 viikossa ja setuksimabi päivänä 1 ja päivänä 4 viikossa. Muutokset kasvaimen koon mitattiin yli kolme viikkoa. Halkaisijat kasvain mitattiin automaattisella paksuus. Kasvaintilavuudet laskettiin kaavalla: tilavuus = (pituus x leveys x korkeus) /2, jossa pituus, leveys ja korkeus tarkoittaa pisin mitta, lyhyempi ulottuvuus rinnakkain hiiren kehon, ja halkaisija kasvaimen kohtisuorassa pituus ja leveys vastaavasti. Kasvaimen painot mitattiin eristämisen jälkeen syöpäkasvaimen.
In vivo
NIR fluoresenssin kuvantamiseen kasvaimen apoptoosin
In vivo
NIR fluoresenssikuvantamiseen tehtiin sen jälkeen, kun ensimmäisen ja toisen kierroksen hoitoon. Jokainen hoitoryhmä (
n
= 6) jaettiin kahteen alaryhmään (
n
= 3) kuvantaminen lineaarinen ja syklinen muoto ApoPep-1, tässä järjestyksessä. Lineaariset ja sykliset muodossa FPR675-leimatun ApoPep-1 (1,45 mg /kg ja 1,54 mg /kg, vastaavasti, mikä vastaa 800 nmol /kg kutakin peptidiä) injektoitiin häntälaskimon kautta hiiriin. 90 minuutin kuluttua annon jälkeen hiiret nukutettiin ja niille suoritettiin kuvantaminen. NIR fluoresenssi (tyypillisesti välillä 650 ja 1100 nm) on suosinut
in vivo
optisen kuvantamisen sen alhaisen kudosten imeytyminen ja syvälle kudokseen tunkeutuminen ominaisuuksia [25]. Viritys- /emission aallonpituudella FPR675 väriainetta käytetään tässä tutkimuksessa oli 675/698 nm. Kuvat otettiin käyttäen tutkia Optix optinen kuvantamisjärjestelmä (ART Inc., Montreal, Kanada). Tämä aika-alueen tomografia järjestelmä on osoitettu olevan herkempiä korkeammat havaitsemista syvyys ja spatiaalinen resoluutio kuin jatkuvan aallon tasokuvantamismenetelmiä järjestelmä [26]. Hankinta aika koko kehon skannaus oli 15 minuuttia per hiiri. Fluoresenssin intensiteetti kohdealueen (ROI) mitattiin käyttämällä analyysin ohjelmisto, jonka valmistaja (ART Inc.).
histologisen analyysin apoptoosin
Kun
in vivo
kuvantaminen, hiiret lopetettiin ja kasvaimet poistettiin ja jäädytettiin nopeasti OCT upotusaineeseen (Sakura Finetechnical, Tokio, Japani). Kudokset leikattiin 6 um: n leikkeiksi ja värjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) varten ydin counterstaining. Terminal deoksi-nucleotidyl välittämällä dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) värjäys suoritettiin käyttäen Apoptag Red In situ Apoptosis Detection Kit ohjeiden mukaisesti valmistajan toimittamien (Millipore, Billerica, MA). Kudosleikkeet havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa).
Korrelaatioanalyysiä välillä fluoresenssi-intensiteetin ja kasvaimen tilavuuden
3 viikon kuluttua hoidon (päätepiste kokeiden), kasvainten mitattiin ja kasvaimet eristettiin painon mittaukseen. Korrelaatio NIR fluoresenssi-intensiteetin ja kasvaimen tilavuus arvioitiin lineaarisen regressioanalyysin avulla Graphpad ohjelmistoa.
peptidien säilyvyys seerumissa
Peptidi vakautta seerumissa tutkittiin kuten on aikaisemmin kuvattu [ ,,,0],27]. Verta hiiristä otettiin talteen ja sen annettiin hyytyä, ja sitten seerumi saatiin sentrifugoimalla 4 ° C kaksi kertaa, jota seurasi suodatus (0,22 um huokoskoko). Peptidi (100 ug 50 ul: ssa PBS: ää), inkuboitiin 50 ul: suodatettiin seerumia 37 ° C: ssa osoitettu aika. Inkuboidut näytteet laimennettiin 100-kertaisesti ja fraktioitiin C18-käänteisfaasi-FPLC-lineaarisella asetonitriilin gradientilla (Vydac-proteiinin ja peptidi C18, 0,1% trifluoriasetaatti vedessä tasapainotukseen, ja 0,1% trifluoriasetaatti asetonitriilissä eluointiin). Identiteetin varmistamiseksi, että huippu profiilit C18-käänteisfaasi FPLC, jokainen piikki kerättiin, kuivattiin tyhjössä ja analysoitiin massaspektrometrialla (MS) käyttäen MALDI-TOF-massaspektrometriin (Life Technologies, Carlsbad, CA).
tilastollinen
tilastollista merkitystä eroja koe- ja kontrolliryhmissä analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).
tulokset
In vitro
havaitseminen apoptoosin mahalaukun kasvainsoluista ApoPep-1-hoidon jälkeen sisplatiinin ja setuksimabin
tutkimiseksi havaitseminen apoptoosin ApoPep-1, vatsan kasvainsoluja käsiteltiin sisplatiinin, setuksimabi, ja sisplatiinilla plus setuksimabi ja inkuboitiin sitten lineaarinen ja syklinen muoto ApoPep-1. Syklinen muoto ApoPep-1 (CQRPPRC) valmistettiin lisäämällä kysteiinitähde karboksipään lineaarisen muodon ApoPep-1 (CQRPPR) ja syklisointi disulfidisidostumisen kautta. Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen havaitaan lineaarinen muoto ApoPep-1 oli noin 28%, 25%, ja 34%, kun sisplatiinin, setuksimabi, ja sisplatiinin ja setuksimabi, vastaavasti (kuvio 1A). Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen tunnistama syklinen muoto ApoPep-1 oli noin 56%, 49%, ja 78% hoidon jälkeen sisplatiinilla, setuksimabi, ja sisplatiini plus setuksimabi, vastaavasti (kuvio 1 B). Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen havaitaan anneksiini V oli noin 43%, 40%, ja 45%, kun sisplatiinin, setuksimabi, ja sisplatiinin ja setuksimabi, vastaavasti (kuvio 1C). Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmähoito sisplatiinin ja setuksimabi indusoi apoptoosia vatsaan kasvainsolujen korkeammilla tasoilla kuin hoidossa sisplatiinia tai setuksimabin yksinään tekee. Lisäksi, nämä tulokset viittaavat siihen, että syklinen muoto ApoPep-1 herkemmin havaitsee apoptoosin mahan kasvainsolujen kuin lineaarinen muoto ApoPep-1 tai anneksiini V: ei.
Soluja inkuboitiin sisplatiinin kanssa (300 ng /ml ), setuksimabi (200 ug /ml), ja sisplatiini (300 ng /ml) plus setuksimabi (200 ug /ml) yhdessä 24 tuntia. Solut kerättiin ja niitä inkuboitiin FITC-leimatun ApoPep-1 lämpötilassa 4 ° C: ssa 1 h tai anneksiini V huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Tulokset edustavat prosenttiosuudet apoptoottisten solujen mitattuna virtaussytometrialla. (A-C) Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen havaitaan lineaarinen muoto ApoPep-1, syklinen muoto ApoPep-1, ja anneksiini V, vastaavasti. PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos; CPT, sisplatiini; CET, setuksimabi; CPT + CET, sisplatiini ja setuksimabi.
In vivo
kuvantamiseen apoptoosin mahatuumori käyttäen ApoPep-1 vastauksena sisplatiinin ja setuksimabi
tarkastella
in vivo
havaitseminen ja kuvantaminen apoptoosin mahatuumori käyttäen ApoPep-1, mittasimme fluoresenssin intensiteetti on kasvain, jonka kertyminen NIR fluoresenssiväri leimatun ApoPep-1 kasvainkudoksen jälkeen ensimmäisen ja toisen kierroksen hoidon (yhtä kuin yksi viikko ja kahden viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, vastaavasti). Kvantifiointi fluoresenssin intensiteetin tuumoripaikkaan joko lineaarinen tai syklinen muoto ApoPep-1showed että intensiteetit olivat huomattavasti korkeampia ryhmissä sisplatiinia, setuksimabi, ja sisplatiini plus setuksimabi, verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään, kun ensimmäinen tai toinen kierros hoidon (kuvio 2A, 2B). Fluoresenssivoimakkuudet lineaarisesti ApoPep-1 olivat korkeampia ryhmässä sisplatiinia plus setuksimabin verrattuna ryhmään sisplatiinia yksinään (
p
0,05 ja
p
0,05, kun ensimmäinen ja toinen kierros hoidon vastaavasti kuva 2A) ja setuksimabin yksinään (
p
0,01 eikä merkittäviä jälkeen, kun ensimmäinen ja toinen kierros hoito, vastaavasti, kuvio 2A). Erityisesti fluoresenssivoimakkuudet kasvain sivuston syklinen ApoPep-1 olivat huomattavan korkeampi ryhmässä sisplatiinia plus setuksimabin verrattuna ryhmään sisplatiinia yksinään (
p
0,01 ja
p
0,01, kun ensimmäinen ja toinen kierros hoito, vastaavasti, kuvio 2B) ja setuksimabin yksinään (
p
0,001 ja
p
0,01, kun ensimmäinen ja toinen kierros hoidon vastaavasti kuvio 2B). Edustavia koko kehon fluoresenssikuvia lineaariset ja sykliset muoto ApoPep-1 näytettiin (kuvio 2C, 2D, vastaavasti). Vähän tausta fluoresenssisignaalit havaittiin muissa elimissä, kuten maksassa ja keuhkoissa (kuvio 2C, 2D).
SNU-16 vatsaan tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin sisplatiinin, setuksimabi, ja sisplatiinin ja setuksimabi. Sen jälkeen, kun ensimmäisen ja toisen kierroksen hoidon, lineaariset tai sykliset muodossa FPR675 NIR fluoresenssiväri-leimatun ApoPep-1 injektoitiin suonensisäisesti hiiriin.
In vivo
NIR fluoresenssi kuvat otettiin 90 minuutin kuluttua annon jälkeen. (A) (B) kvantifiointi NIR fluoresenssisignaalin intensiteettiä kiinnostuksen kohteena olevan alueen (ROI) ryhmissä injektoitu lineaariset ja sykliset ApoPep-1. Pylväät edustavat signaalin intensiteetti ROI saatiin kolmesta yksittäisistä hiiristä (keskiarvo ± S.D.). Tähdellä edustavat tilastollista merkittävyyttä verrattuna PBS. Tähtinä sulut edustavat merkitystä ero ryhmien välillä. *
p
0,05, **
p
0,01 ja ***
p
0,001 yksisuuntaisella ANOVA (
n
= 3 per ryhmä). (C) (D) edustaja NIR fluoresenssi kuvien oton lineaariset ja sykliset ApoPep-1 kasvaimen näytettiin. Mittaviivat edustavat normalisoitu fluoresenssin voimakkuus. Ympyrät edustavat ROI.
mittaus kasvainten ja painot jälkeen kasvainten vastaisen hoidon sisplatiinilla ja setuksimabin
tutkimiseksi anti-kasvaimen kasvua vaikutusta sisplatiinin tai setuksimabin yksinään ja yhdistelmänä , kasvain tilavuudet ja painot käsittelyn jälkeen mitattiin. Sisplatiinihoidolle, setuksimabi, ja sisplatiini sekä setuksimabi vähensi kasvainten tilavuudet, käsittelemättömään verrattuna, lineaarisen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,05,
p
0,05, ja
p
0,001, vastaavasti, kuvio 3 A) ja syklisen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,05,
p
0,01 ja
p
0,001, vastaavasti, kuvio 3B). Yhdistetty hoito sisplatiinin ja setuksimabi tehokkaammin vähensi kasvainten tilavuudet verrattuna sisplatiinihoidolle tai setuksimabin yksinään, lineaarisen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,05 ja
p
0,05 vastaavasti, kuvio 3 A) ja syklinen ApoPep-1-ryhmän (
p
0,01 ja
p
0,01, vastaavasti, kuvio 3B).
SNU-16 vatsaan tuumoreita kantavaa hiirtä, jotka analysoitiin kuvantamisen jälkeen signaalit ensimmäisen ja toisen kierroksen hoidon pidettiin varten tuumorin koon mittaus. (A) (B) mittaus kasvaimen volyymit 3 viikkoa käsittelyn jälkeen. (C) (D) mittaaminen painot eristetty kasvain massa 3 viikon hoidon jälkeen.
* p
0,05, **
p
0,01 ja ***
p
0,001 yksisuuntaisella ANOVA. Nuolet edustavat ajankohtina hoidon. Tähdellä edustavat tilastollista merkittävyyttä verrattuna PBS. Tähtinä sulut edustavat merkitystä ero ryhmien välillä. (E) TUNEL värjäys tuumorikudoksissa. Green, apoptoottiset solut; Sininen, ydin. PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos; CPT, sisplatiini; CET, setuksimabi; CPT + CET, sisplatiini plus setuksimabi. Mittaviivat edustaa 50 um.
Samankaltaisia rakenteessa muutoksia kasvaimen painot hoidon jälkeen sisplatiinilla, setuksimabi, ja sisplatiinin sekä setuksimabia käsittelemättömään verrattuna havaittiin lineaarinen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,01,
p
0,01 ja
p
0,001, vastaavasti, kuvio 3C) ja syklinen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,01,
p
0,01 ja
p
0,001, vastaavasti, kuvio 3D). Sisplatiinihoidolle plus setuksimabin tehokkaammin vähensi kasvainten painot verrattuna sisplatiinihoidolle tai setuksimabin yksinään, lineaarisen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,05 ja
p
0,05, vastaavasti, kuvio 3C) ja syklinen ApoPep-1 ryhmässä (
p
0,01 ja
p
0,01, vastaavasti, kuvio 3D). Tasot väheneminen kasvainten ja painot käsittelyn jälkeen ryhmien välillä injektoitiin lineaariset ja sykliset muoto ApoPep-1 olivat samanlaisia, ja ei ollut eroja kasvainten näiden kahden ryhmän aikaan kuvantamisen. Korkeammalla apoptoosia käsittelyn jälkeen sisplatiinin ja setuksimabin yhdistelmän, verrattuna sisplatiinin tai setuksimabi yksin osoitettiin edelleen TUNEL värjäys kasvainkudoksessa (kuvio 3E).
korrelaatio fluoresenssin intensiteetin ja kasvaimen tilavuuden
tutki korrelaatio fluoresenssin voimakkuus
in vivo
kuvantamiseen apoptoosin jälkeen ensimmäisen ja toisen kierroksen hoitoa (yhtä kuin yksi viikko ja kahden viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, vastaavasti) ja kasvaimen tilavuus myöhemmin (3 viikon kuluttua hoidon aloittamisesta). Fluoresenssivoimakkuuksien otettuja kuvia syklinen ApoPep-1 ensimmäisen kierroksen jälkeen hoidon otettiin korreloi käänteisesti kasvainten kanssa vahvin sopimuksen (korrelaatiokerroin r
2 = 0,934, kuvio 4C), verrattuna ottanut syklinen ApoPep- 1 toisen kierroksen jälkeen hoidon (r
2 = 0,705, kuvio 4D) sekä lineaarisesti ApoPep-1, kun ensimmäinen (r
2 = 0,631, kuvio 4A) ja toisen kierroksen hoidon (r
2 = 0,402, kuvio 4B).
Data edustaa korrelaatiota NIR fluoresenssivoimakkuudet saadaan kuviossa 2A ja 2B, ja kasvainten saatu kuviossa 3A ja 3B. (A) (B) välinen korrelaatio fluoresenssin intensiteettien lineaarisesti ApoPep-1 sen jälkeen, kun ensimmäisen ja toisen kierroksen hoidon ja kasvaimen tilavuutta. (C) (D) välinen korrelaatio fluoresenssivoimakkuudet saadaan syklinen ApoPep-1, kun ensimmäisen ja toisen kierroksen hoidon ja kasvainten.
vakaus lineaarisen ja syklisen ApoPep-1 seerumissa
tutki korkeampi kuvantamisen signaalien syklinen ApoPep-1 verrattuna lineaarisen ApoPep-1 johtui ero seerumin vakauden peptidejä. Inkuboinnin jälkeen lineaarinen ja syklinen muoto ApoPep-1 hiiren seerumin jopa 24 h, määrä peptidin jäljellä seerumissa analysoitiin. Peptidi huippu oli erotettavissa epäspesifisestä huiput seerumia ja määrä lineaarinen ja syklinen muoto peptidin jäljellä seerumissa, laskettuna piikin pinta-ala, ei ole muuttunut merkittävästi 24 h (kuvio 5A ja 5B, vastaavasti). MS-analyysi kunkin peptidin piikin vahvisti identiteetin lineaarinen (kuvio 5C) ja sykliset (kuvio 5D) muodossa ApoPep-1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä lineaariset ja sykliset muodot ApoPep-1 ovat stabiileja seerumissa jopa 24 h eroa vakaus inkuboinnin ajan.
Lineaarinen ja sykliset ApoPep-1-peptidejä inkuboitiin hiiren seerumia, 37 ° C: ssa osoitetun ajanjaksoja. (A) (B) lineaarinen ja syklinen muoto ApoPpep-1 näytteet ja hiiren seerumia fraktioitiin C18-käänteisfaasi-FPLC. Y-akseli edustaa absorbanssiyksikköä 215 nm: ssä. Kukin peptidi huippu merkitty nuolella ja erotettavissa seerumista huippuja. (C) (D) MS spektri lineaarisen ja syklisen peptidin huippu kerättiin 24 h FPLC murto ja synteettiset lineaariset ja sykliset ApoPep-1.
Keskustelu
Tässä osoitti
in vivo
kuvantamiseen apoptoosin oton ApoPep-1 kasvain varhaisemmassa vaiheessa (yksi viikko hoidon jälkeen) voisi ennustaa mahassa tuumorivaste ja edelleen alentamiseen kasvaimen tilavuuden myöhemmin (kolme viikkoa käsittelyn jälkeen). Lisäksi, syklinen muoto ApoPep-1: n osoitti suurempia
in vitro
sitoutumisen apoptoottisia soluja ja
in vivo
kuvantamisen signaalit ja merkittävä ero sisplatiinia tai setuksimabi yksin ja sisplatiinin ja setuksimabi yhdistelmänä kuin lineaarinen muoto ApoPep-1 teki (herkempi tunnistus). Intensiteetit kuvantamisen signaaleja ottanut syklinen ApoPep-1 ensimmäisen kierroksen jälkeen hoidon osoitti lähempänä korrelaatio muutosten kasvaimen tilavuuden kuin teki ne lineaarisesti ApoPep-1 (tarkempi tunnistus). Nämä tulokset osoittavat, että kuvantamisen apoptoosin käyttäen syklistä ApoPep-1 voisi olla hyödyllinen väline aiemman päätöksen mahan kasvaimen vastetta anti-syövän hoidossa kuin tällä hetkellä saatavilla työkalu perustuu kasvaimen koon mittaus CT.
Apoptosis kuvantamisen antureista, jotka tunnistavat erilaisia biomarkkereita on merkitty erilaisia kuvantamisen osien ja hyödynnetään seurannassa kasvaimen vastetta anti-syövän hoitoon. Esimerkiksi fluoresenssiväriä-leimattu anneksiini V sai osaksi paksusuolen kasvainta kantavien hiirten viikon kuluttua Setuksimabihoitoa ja osoitti piikin kertymiseen 24 tunnin kuluttua laskimoon, joka liittyi vähennystä kasvutekijän ottoa ja kaspaasi -3 [28].
3H-leimattua butyyli-2-metyyli-malonihappo, joka sitoutuu anionista fosfolipidiä annettiin osaksi paksusuolen kasvainta kantavissa hiirissä 24 tunnin kemoterapian jälkeen ja sen kertynyt kasvaimen 2 tuntia injektion jälkeen, joka oli mukana laskua kasvain painot [29]. Fluoresenssiväri-leimattua kaspaasi toimintaan perustuva peptidi koetin annettiin hiiriin, joissa paksusuolen kasvainta 12 h kuluttua hoidon Apomab apoptoosin indusoimiseksi, joka puolestaan osoitti fluoresenssisignaalien 50 min injektion jälkeen [30].
124I-leimattua fosfatidyyliseriinin vasta-aine injektoidaan hiiriin, joissa eturauhassyövän 24 h käsittelyn jälkeen kemoterapian tai sädehoidon, jossa kuvat on otettu 48 tuntia sen jälkeen vasta-aineen injektion ja kohonneen otto vasta-aineen kasvaimen ja käänteinen korrelaatio vasta-aineen ottoa ja muutos kasvaimen tilavuuden (r
2 = 0,85) [13]. Verrattuna edelliseen raporttien tulokset viittaavat siihen, että ApoPep-1 on lupaava koetin kannalta nopea kertymävakio (2 h) ja lähellä korrelaatio kasvaimen tilavuuden muutos (r
2 = 0,934).
syklinen muodossa peptidi on yleensä stabiilimpi hajoamista vastaan proteaasilla ja valikoivia kohde sitova kuin lineaarisessa muodossa [31]. Syklinen muoto RGD-peptidin, esimerkiksi, osoittaa parannetun stabiiliuden pH: n muutoksia [32]. Kliiniset tutkimukset mahdollisena angiogeneesinestäjän käyvät läpi syklisten muodossa RGD-peptidin [31]. Joissakin tapauksissa kuitenkin, lineaarinen muodossa peptidi osoitti parempaa sitova aktiivisuus ja kuvantamisen signaalit [31]. Tässä tutkimuksessa vertasimme lineaariset ja sykliset muoto ApoPep-1 mitkä muodossa näkyy paremmin aktiivisuutta havaitsemisessa apoptoosin. Huomasimme, että syklinen muoto ApoPep-1 oli herkempi sitomisessa ja havaitsemaan apoptoottisten solujen kuin sen lineaarisen muodon. Miksi syklinen muoto ApoPep-1 näyttää paremmin
in vitro
sitova ja
in vivo
tunnistus toimintaa apoptoottisia soluja? Tutkimme vakautta peptidien seerumissa. Aikaisemmin on kuvattu, että ApoPep-1 oli stabiili jopa 2 tuntia seerumissa [33]. Tässä tutkimuksessa, jatkoimme inkuboinnin ajan, ja havaittiin, että sekä lineaariset ja sykliset muoto ApoPep-1 olivat stabiileja, kun läsnä on seerumia, kunnes 24 h. Tämä viittaa siihen, että ero seerumin vakautta ei edistä tehostettua kohdistaminen aktiivisuutta syklisen muodon ApoPep-1 yli lineaarinen muoto ApoPep-1. Vaihtoehtoinen selitys voi olla se, että muodostuu kotetussa rakenteen disulfidisidosten voi johtaa edullisempia sitoutumisen apoptoottisten solujen syklisellä ApoPep-1 nähden lineaarisessa muodossa.
Lisäksi fluoresenssivärejä, ApoPep-1 voi merkittävä radioisotooppien, kuten
123I,
18F, ja
68Ga, kemiallisen linkkereitä ja käyttää koettimena yksifotoniemissioto- (SPECT) tai PET kuvantamisen. Koska tulevasta suunnasta, PET kuvantaminen apoptoosin avulla
18F-leimattua lineaarinen tai syklinen ApoPep-1 jää tutkittava seurantaa kasvaimen vasteen. ApoPep-1-kuvantaminen apoptoosin olisivat käyttökelpoisia huomioon hoitostrategioiden klinikoilla ja edistää uusien anti-syöpähoitojen.