Krooninen sairaus

tiivistelmä

Moottori proteiini kinesiiniin superperheen proteiineista (KIFS) ovat osallisina syövän etenemiseen. Ehtyminen yksi KIFS, KIF14, voi viivästyttää metafaasissa-to-anafaasia siirtyminen, mikä johtaa binucleated asema, joka parantaa kasvaimen etenemistä; kuitenkin, tarkka korrelaatio KIF14 ja syövän etenemistä on edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa käytetään Heterotsygotian menetys ja array vertaileva genominen hybridisaatio analyysejä, havaitsimme 30% menetys alueilla ympäröivä KIF14 kromosomissa 1q keuhkojen adenokarsinooman. Lisäksi, proteiinin ilmentymisen tasot KIF14 122 keuhkojen adenokarsinoomat osoittivat myös, että noin 30% adenokarsinoomat osoittivat KIF14 down-regulation verrattuna ekspression keuhkoputken epiteelisoluissa viereisen normaalin kanssa. Lisäksi, alennettu ilmentyminen KIF14 mRNA: n tai proteiinien korreloi huonon eloonjäämiseen (P = 0,0158 ja 0,0001, vastaavasti), ja proteiini tasot korreloi käänteisesti etäpesäkkeitä (P 0,0001). Yli-ilmentyminen KIF14 keuhkoissa adenokarsinoomasolua esti ankkurista riippumaton kasvu

in vitro

ja ksenograftin kasvaimen kasvua

in vivo

. Yli-ilmentyminen ja vaiennettu KIF14 esti myös tai tehostetun syöpäsolujen muuttoliike, invaasio ja tarttuvuus soluväliaineen proteiinien laminiinista ja kollageeni IV. Lisäksi olemme havainneet adheesiomolekyylien kadheriinin 11 (CDH11) ja melanooma adheesiomolekyyli (MCAM) kuin lasti KIF14. Yli-ilmentyminen ja vaiennettu KIF14 tehostettu tai vähentynyt rekrytointi CDH11 vuonna membraanijakeen, mikä viittaa siihen, että KIF14 saattaa toimia rekrytoimalla adheesiomolekyylien solukalvoon ja moduloiva soluadhesiivisen, muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia. Näin ollen, KIF14 voi estää kasvaimen kasvua ja syövän etäpesäkkeiden keuhkojen adenokarsinoomia.

Citation: Hung P-F, Hong T-M, Hsu Y-C, Chen H-Y, Chang Y-L, Wu C-T, et ai. (2013) Moottorin Protein KIF14 kasvaimen kasvu estyy ja syövän etäpesäkkeiden Lung Adenokarsinooma. PLoS ONE 8 (4): e61664. doi: 10,1371 /journal.pone.0061664

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 lokakuu 2012; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Hung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin avustusta National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-2321-B-002-071, ja NSC100-3112-B-006-005) ja National Taiwan University (NTU101R7601-2 ja NTU102R7601-2). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kinesiinin (KIF) superperheen koostuu moottorin proteiinien kuljetuksen organellit, proteiineja ja mRNA: adenosiini-5′-trifosfaatti (ATP) – ja mikrotubulusten riippuvaisella tavalla [1], [2]. On yli 45 jäsentä KIF superperheen, jotka on jaettu 13 alaperheeseen niiden suunnan, domain ja toiminta [3]. KIF14, jäsen kinesiinin-3 perheen, sisältää moottorin ja forkhead liittyvä verkkotunnus, ja tämä proteiini on tärkeä rooli sytokineesiin ja eriytymistä, congression ja kohdistus kromosomeja [4] – [6]. Ehtyminen KIF14 saattaa aiheuttaa aikaviiveen metafaasivaiheen-to-Anaphase siirtyminen, estävät sytokineesin ja tuottaa binucleated asema [7], [8]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että KIF14 voitaisiin edistää tehokasta sytokineesiin vuorovaikutusten kautta sitronikinaasigeenin (CIK) ja proteiini säädin sytokineesin 1 (PRC1) [7].

Cytokinesis on viimeinen vaihe solusyklin jossa kaksi tytärsoluksi täysin erillinen [9]. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että poikkeava sytokineesiin saattaa syntyä epävakaita tetraploidiset soluja, mikä johtaa aneuploidian, joka lopulta kehittyy syövän synnyn [9] – [11]. Monet komponentit, jotka säätelevät sytokineesiin on tunnistettu, ja jotkut molekyylit, mukaan lukien KIFS, on selvästi yhdistetty syöpään. Esimerkiksi, KIF2 ja KIF15 on tunnistettu kasvaimen antigeenejä rintasyövän [12], [13]; KIF13A yli-ilmentyy joissakin retinoblastoomassa [14]; KIF20A on säädellään ylöspäin haimasyövän [15]; KIF3 ja KIF4 on todettu kasvain suppresser geenien mahasyövässä [16], [17]; ja ilmaus KIF10 pienenee maksasolukarsinoomassa [18]. Lisäksi on raportoitu, että jotkut KIF perheenjäsenet, kuten KIF3, KIF4 ja KIF22, on ristiriitaisia ​​rooleja kasvainten synnyssä [16], [17], [19] – [23].

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuolemaan, erityisesti Aasiassa, ja osuus 17% kaikista syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [24], [25]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat keskittyneet roolista kinesiiniin proteiineja, kuten KIF3, KIF5B ja KIF14, keuhkosyövän etenemisen; kuitenkin, yksityiskohtaiset mekanismit toimintoja näiden proteiinien edelleen epäselviä [16], [26] – [28]. Siksi tavoitteena oli tutkia roolia kinesiinin moottorin proteiinien keuhkoadenokarsinooma.

Tässä tutkimuksessa arvioimme mahdollista roolia KIF14 vuonna keuhkoadenokarsinooma käyttäen Heterotsygotian menetys (LOH) ja array vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) analyysit 138 keuhkojen adenokarsinooman kromosomissa 1Q, joka on missä KIF14 sijaitsee. Lisäksi tutkimme myös proteiinin ilmentymistä KIF14 sisään kudosnäytteiden 122 keuhkoadenokarsinooma käyttävillä potilailla immunohistokemiallista värjäystä. KIF14 mRNA ja proteiinin ilmentyminen oli korreloi eloonjäämisaste ja etäpesäkkeiden hinnat näillä potilailla. Olemme myös dissektoitujen molekyylimekanismi KIF14, joka välittää tukahduttaminen syöpäsoluinvaasiota, migraation ja adheesion. Nämä tulokset viittaavat siihen, että KIF14 voisi estää kasvaimen kasvua ja syövän etäpesäkkeiden keuhkojen adenokarsinooman.

Tulokset

KIF14 Expression keuhkosyöpäpotilaiden

arvioimiseksi mahdollista roolia kinesiini keuhkoissa adenokarsinooma, ensin tutkinut taajuus LOH kromosomien avulla mikrosatelliittimarkkerin, ja totesi, että LOH välillä ilmennyt markkereita D1S1660 (40,0% LOH ja 86,7% microsatellite epävakaus (MI)) ja D1S213 (31,6% LOH ja 60,5% MI), jotka ovat lähellä KIF14 kromosomissa 1q (kuvio 1A). Näiden tulosten vahvistamiseksi, teimme tiheitä array CGH riippumattomalla kohortin 138 keuhkojen adenokarsinooman [29]. Tulokset osoittivat, että lähes 25% (22,5% ja 26,8%) menetykseen kahden koettimen sisällä KIF14 lokalisointi ja 5% (2,9% ja 6,5%) vahvistus esiintyi potilailla (kuvio 1 B ja taulukko 1).

(A) Loss heterotsygoottisuuden (LOH) ja microsatellite epävakaus (MI) analysoi lähellä sijainti KIF14 perusterveydenhuollossa keuhkoadenokarsinooma. Kromosomi 1 ideogrammi esittäen mikrosatelliittimarkkerin kartoitetaan 1q sijainnin mukaan tietokantaan; potilaan numero ja prosenttiosuus on merkitty. (B) Copy-määrä muutos profiilit kromosomi 1. KIF14 sijainnin osoittaa sisällä kromosomi 1q32.1. (C) proteiini ekspressiokuvio KIF14 tutkittiin käyttäen immunohistokemia anti-KIF14 vasta normaaleissa keuhkoputken limakalvolla (vasen paneeli) ja primaarikasvaimen yksilöt (keskimmäinen ja oikea paneeli). Alkuperäinen suurennus 200 ×.

vieressä tarkasteltiin ilmentymisen KIF14 vuonna kudosnäytteiden ja viereisten normaaleissa kudoksissa 122 keuhkojen adenokarsinooman käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Spesifisyyden KIF14 vasta-aineen varmistettiin KIF14 antigeenin kilpailua käyttäen immunoblottaus ja immunohistokemia (kuvio S1), ja kliiniset ominaisuudet näiden potilaiden on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Nämä tulokset osoittivat, että KIF14 voimakkaasti ilmentyy normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa (kuvio 1C ). Tarkempi analyysi osoitti, että 30,3%: n adenokarsinoomien osoitti KIF14 alassäätöä kasvaimissa verrattuna keuhkoputken epiteelisolujen viereisissä normaali kollegansa ja 18,0%: n adenokarsinoomien osoitti suurempaa KIF14 ilmaus kuin normaalissa keuhkojen limakalvolla (taulukko 1). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että KIF14 saattaa olla suurempi tappio (-30%) kuin vahvistus (3-6%) keuhkojen adenokarsinooman.

Alhainen ilmentyminen KIF14 oli yhteydessä huonoon Overall Survival in keuhkojen adenokarsinooma potilaat

tutkimiseksi edelleen, onko ilmentymisen KIF14 in keuhkoadenokarsinooma korreloi kliinisten tulosten, mRNA tasot KIF14 kasvaimen yksilöitä 53 keuhkoadenokarsinooma potilaille määritettiin käyttämällä reaaliaikaisella kvantitatiivisella käänteistranskriptaasi-polymeraasia ketjureaktio. Kliiniset ominaisuudet näiden potilaiden on esitetty taulukossa S1. Potilaat, joilla on alhainen KIF14 ilme näytteillä huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on korkea KIF14 ilme (kuvio 2A, P = 0,0158). Coxin monimuuttuja suhteellinen vaara regressioanalyyseissä osoittivat, että KIF14 lauseke (riskisuhde [HR] = 0,341, 95% luottamusväli [CI] = 0,179-0,652; P = 0,0011) ja sairauden vaihe (HR = 1,962, 95% CI = 1,311-2,936 ; P = 0,0010) olivat riippumattomia liittyvät tekijät eloonjäämisaste keuhkoadenokarsinooma potilaista (taulukko S2).

(A) matala KIF14 mRNA ilmentyminen liittyi huono eloonjäämisaste potilaiden keuhkojen adenokarsinooma. KIF14 mRNA-tasot mitattiin käyttämällä reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR primaarikasvaimen yksilöitä. Mediaani arvoa käytettiin jakamaan potilaita alhainen (punainen viiva) ja korkea (sininen viiva) KIF14 lauseke ryhmät (log rank, P = 0,0158). (B) Low KIF14 -proteiiniekspressio liittyy huono eloonjäämiseen riippumattomalla kohortin keuhkoadenokarsinooma potilaista. Potilaat jaettiin kahteen ryhmään sen mukaan, immunoreaktiivisuus KIF14 vasta-aineita. Cut-off-arvo oli 70% tuumorisektioiden osoittaa immunoreaktiivisuutta vasta-aineisiin. Kaplan-Meier-analyysit käytetään arvioitaessa yleistä selviytymistä keuhkoadenokarsinooma potilaat mukaan KIF14 lauseke (log rank, P 0,0001). (C) Prosenttiosuus analyysi metastaattisen asema korkean ja matalan KIF14 ilme ryhmiä. Potilaat sekä korkean ja matalan KIF14 ilmaisun ryhmä jaettiin edelleen läsnäoloon perustuvaa etäpesäkkeiden; ja numerot kunkin alaryhmän esitetään prosenttiosuutena käyttämällä tilastollisen analyysin (chi-neliö testi, P 0,0001). (D) KIF14 ilmentyminen ihmisen keuhkojen adenokarsinooma ennusti esiintyminen etäpesäke. Etäpesäke vapaa eloonjäämiskäyristä 122 keuhkoadenokarsinooma potilaita ositettu alhainen (punainen viiva) ja korkea (sininen viiva) KIF14 proteiinin ilmentymisen (log rank, P 0,0001).

laajentaa analyysi proteiini ekspressiotasot, käytimme immunohistokemiassa ekspression tutkimiseksi KIF14 kasvaimen yksilöitä 122 keuhkoadenokarsinooma potilaista riippumaton kohortissa. Yhdenmukainen aiempien tulosten, potilaat, joilla on alhainen KIF14 ilmaisun oli huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin potilailla, joilla on korkea KIF14 ilmentymisen (P 0,0001; kuvio 2B). Monimuuttujakalibrointi Coxin suhteellinen vaara regressioanalyyseissä paljasti, että riippumattomat ennustetekijöiden KIF14 lauseke (HR = 0,37, 95% CI = 0,18-0,76; p = 0,0006) ja sairauden vaihe (HR = 5,38, 95% CI = 2,82-9,88; P 0,0001). Kaplan-Meier arvio etäpesäkkeiden vapaa-eloonjääminen osoitti myös, että potilailla, joilla on alhainen KIF14 ilme oli huomattavasti huonompi etäpesäke vapaa eloonjäämisaste kuin ne, joilla on korkea KIF14 ilme (kuvio 2D, P 0,0001). Nämä tulokset osoittavat, että KIF14 voisi olla kasvaimia ja metastaattisen vaimennin keuhkojen adenokarsinooman.

yli-ilmentyminen KIF14 Lung adenokarsinoomasolua estivät Anchorage riippumaton kasvu in vitro ja Vieraslajisiirteen kasvainten muodostumiselle

in vivo

havaintoja tukevat hypoteesia, että KIF14 toimii tuumorisuppressori keuhkoadenokarsinooma. Tarkastelemaan tätä hypoteesia edelleen, me ensin arvioinut endogeenisen KIF14 proteiinin ilmentymistä matalan invasiivisia CL1-0 ja korkea-invasiivisia CL1-5 keuhkoadenokarsinooma soluja (kuvio S2A). Havaitsimme, että KIF14 proteiinin CL1-0 soluissa oli korkeampi kuin CL1-5 soluissa. Tutkia muutoksia syövän etenemisen

in vitro

ja

in vivo

[30], loimme vakaa Flag-merkittyjen KIF14 ilmentäviä solulinjoja CL1-5 soluista ja KIF14-vaiennettu CL1- 0-solut, ja proteiinin ilmentyminen kuvio varmistettiin immunoblottauksella (kuvio 3A ja 3B). Havaitsemiseen soluproliferaation nopeus, emme havainneet merkittäviä eroja vain vektorin sisältävään valvontaa ja KIF14 yli-ilmentyvä solulinjoissa (kuvio 3C), mutta vähentää proliferaatiota havaittiin KIF14-vaimennettu soluja verrattuna shLacZ ohjaus (kuvio 3D, P 0,0001). Perustuen todisteita, jotka osoittavat, että ankkurointi riippumattoman solujen kasvun saattaa liittyä Tuumorigeenisuustutkimuksissa [31], [32], me tutki vielä kasvua vakaa solulinjojen pehmeässä agarissa. Tulokset osoittivat, että muodostuneiden pesäkkeiden määrästä väheni, kun KIF14 yliekspressoitiin CL1-5 soluissa (kuvio 3E), ja kasvaa, kun KIF14 on vaiennettu vuonna CL1-0 soluissa (kuvio 3F). Myöhemmin stabiileja solulinjoja ihonalaisesti SCID hiiriin tutkia vaikutusta KIF14 kasvaimen kasvuun

in vivo

. Yli-ilmentyminen KIF14 vähensi kasvaimen kasvua kontrolleihin verrattuna (kuvio 3G, oikea; P = 0,0021). Edustaja kuvat CL1-5 /vektori-ja KIF14 # 2-ympätty hiiriä kuvassa (kuva 3G, vasemmalla).

(A) Solulinjat ilmentävät konstitutiivisesti KIF14 perustettiin kautta transfektointi pCMV-7.1- 3-3 × Flag-KIF14 osaksi CL1-5 soluihin. Yksittäisiä pesäkkeitä valitaan käyttäen genetisiinin, ja KIF14 proteiinin ekspressio arvioitiin läpi immunoblottaus anti-Flag-vasta-aineita; aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Tähti ja nuolenkärki osoittavat epäspesifistä band ja Flag-KIF14, vastaavasti. (B) KIF14 ilmentyminen pudotettiin vuonna CL1-0 soluissa käyttäen shRNA lentivirus infektio. Kun valinta on puromysiinin kaksi viikkoa, KIF14 proteiinin ilmentymisen kuviot arvioitiin läpi immunoblottaus anti-KIF14 vasta-aineet; aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C ja D) vaikutukset KIF14 yli-ilmentymisen ja hiljentäminen viljellyillä kasvainsoluproliferaation. Solujen lukumäärä laskettiin osoitetussa aikoina istutuksen jälkeen. Virhepalkit edustavat keskihajonnan keskiarvon. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu proliferaatiota hinnat eri solulinjojen yksisuuntaisella ANOVA-analyysi (C). (E ja F) ankkurointi-riippumaton kasvu KIF14 yli-ilmentyvä ja -silencing solulinjoja arvioitiin pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa. Virhe palkit edustavat keskihajontojen kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. (G) KIF14 yliekspressio vähentää kasvaimen kasvua. Hiiriin injektoitiin subkutaanisesti kylkien kanssa CL1-5 /vektorin ja CL1-5 /KIF14 # 2 solut. Vasen paneeli: Final kasvain valokuvia 35 vuorokauden kuluttua ihon alle. Oikea paneeli: Keskimääräinen kasvaimen tilavuus 35 vuorokauden kuluttua ihonalaisen injektion laskettiin, ja eläimet myöhemmin uhrattu. Palkit edustavat keskiarvoja ± keskihajonnat kuusi hiirtä per ryhmä (yksisuuntainen ANOVA, P = 0,0021).

manipulointi KIF14 eksressoitumistasojen Altered Migration, Invasion ja adheesio Lung Adenokarsinooma Cell Lines

Koska ilmentymistä KIF14 oli negatiivinen korrelaatio etäpesäkkeitä potilailla, tutkimme seuraavaksi KIF14 vaikuttaa syöpäsolumetastaasi. Haava-paranemista määritystä käytettiin havaitsemaan siirtymä kyvyt KIF14-ilmentävien solujen. KIF14 ilmaisu vähensi migraation CL1-5 soluja, kun taas knockdovvn KIF14 proteiinin ilmentymisen CL1-0 soluissa lisäsi solujen vaeltamiseen (kaikki P 0,05, kuvio 4A ja 4B, vasemmalla). Vahvista saatujen tulosten CL soluista, selvitimme KIF14 ekspressiotasot muissa keuhkon adenokarsinooma solulinjoissa (kuvio S2B) ja yli-ilmentyy KIF14 A549-solujen alhaisen endogeenisen KIF14 proteiinia ja vaiennettu KIF14 in H1299 solujen suhteellisen korkean KIF14 proteiinipitoisuuden. KIF14 proteiinin ilmentymisen ja lisääntymisen hinnat näiden solujen on esitetty kuviossa S3. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä muita solulinjoja verrattuna CL-solut (kaikki P 0,05, kuvio 4A ja 4B, oikealla).

(A) CL1-5 solujen pysyvä KIF14 yli-ilmentymisen ja A549-soluihin väliaikaisesti infektoitu lentiviruksen koodaus ei-merkittyä täyspitkän KIF14 analysoitiin solun vaeltavien kyky haavan paranemista määrityksessä. Tiedot osoittavat määrän vaeltavien solujen, ja P-arvot laskettiin suhteessa vektori vain ohjauksista Opiskelijan

t

-testi. (B) haavan paranemista määritys CL1-0 ja H1299 solujen KIF14 hiljentämiseen. Lukumäärä vaeltavia solujen laskettiin myös. (C ja D) KIF14 yliekspressio pienentää soluinvaasiota. Hyökkäys kyky vakaana tai ohimenevästi tartunnan KIF14 ja KIF14-vaiennettu solulinjoissa mitattiin käyttämällä modifioitua Boyden kammioita määritystä. Hyökkääviä Solut merkitty propidiumjodidivärjäys ja määrällisesti (n = 3). (E) KIF14 yliekspressio parantaa soluadheesiota. 96-kuoppainen levy päällystettiin laminiinin ja kollageenin IV. Yhteensä 3 x 10

4-soluja maljattiin 96-kuoppaiselle levylle, inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja liiman aktiivisuus laskettiin käyttäen crystal riko värjäystä. Korkea absorbanssi 540 nm osoitti parannetun soluadheesiota.

vieressä arvioinut invasiivisia ominaisuuksia näistä solulinjoista käyttämällä muunnettua Boyden kammion määrityksiä. KIF14 yliekspressio CL1-5 ja A549-solut pienentää solun invasiivisuus 11,6-64,9% verrattuna vektorin vain valvonta (P 0,05; kuvio 4C). Käänteisesti knockdown endogeenisen KIF14 ilmaisun CL1-0 ja H1299 solujen lisääntynyt solujen invasiivisuus 1,4- 2,3-kertaisesti (P ​​ 0,05; kuvio 4D).

Yleensä soluadheesiota on monimutkainen mekanismi, joka osallistuu erilaisia ​​prosesseja, kuten solun muuttoliike ja invaasiota [33]. Koska nämä tiedot osoittivat, että ilmentyminen KIF14 voivat vaikuttaa muuttavien ja invasiivisia kyvyt keuhkoadenokarsinooma solulinjojen, me tutki tarkemmin sitä soluadheesiota vaikuttivat jälkeen moduloiva KIF14. Yhdenmukainen hypoteesia, tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen KIF14 lisääntynyt tarttuvuus soluväliaineen proteiinit, laminiini ja IV-kollageeniin, sekä CL1-5 ja A549-soluja; Lisäksi hiljentäminen KIF14 alentunut pito sekä CL1-0 ja H1299 soluja (kuvio 4E).

KIF14 Voisi Säädellä työhönoton Adheesiomolekyylien CDH11 solukalvoon in Lung Adenokarsinooma Solulinjat

Koska KIF14 esti solujen vaeltamiseen, invaasiota ja tarttuvuus

in vitro

ja syövän etäpesäkkeiden

in vivo

halusimme selvittää muutosten motoriikka soluissa voi johtaa fysiologisiin muutoksiin. Siksi tutkimme mahdollisesti tukiorganisaatioiden KIF14 käyttämällä String 9.0 proteiinin vuorovaikutuksen tietokantaan (https://string.embl.de/) ja tunnistettiin kaksi tunnettua liittyvien proteiinien, PRC1 ja CIK [7], ja kaksi proteiineja, kadheriinin 11 (CDH11) ja melanooma soluadheesiomolekyyli (MCAM), jotka mahdollisesti liittyvät KIF14 (kuva S4). Koska CDH11 ja MCAM ovat tärkeitä adheesiomolekyylien liittyy kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden [34], [35], me arveltu, että KIF14 saattavat vaikuttaa soluadheesiota ja maahanmuuton nämä lastimolekyylejä. Vahvista Tämän hypoteesin ensin tutki KIF14 voisi yhdistää CDH11 ja MCAM käyttäen samanaikainen immunosaostus. Tulokset osoittivat, että HA-merkitty CDH11 ja MCAM liittyy Flag-merkittyjen KIF14 proteiineja (kuvio 5A). Endogeeninen immunosaostus vahvisti myös assosiaatiot KIF14 ja CDH11

in vivo

(kuvio 5B). Jakaumia KIF14 ja CDH11 tai MCAM proteiinit tutkittiin H1299-soluissa käyttäen immunofluoresenssivärjäyksen. Tulokset osoittivat, että CDH11 ja MCAM proteiinit saattavat kolokalisoituvat yhteiseen osastoon kanssa KIF14 proteiinia, ja ilmaus CDH11 ja MCAM oli ensisijaisesti havaittu solun reuna kun KIF14 yliekspressoitui (kuvio 5C). Koska KIF14 on moottori proteiini, joka osallistuu kuljetukseen molekyylien, me tutkia tarkemmin, onko ilmaus KIF14 voisi säädellä lokalisoinnin CDH11. Me eristetty membraanifraktio proteiineja ja analysoitiin ilmentyminen CDH11 peräisin KIF14-yliekspressoivassa ja KIF14-vaiennetaan solulinjoissa. Määrät HA-CDH11 kalvon osa kvantifioitiin läpi normalisoinnin määrä kokosoluliuotteissa, ja tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen KIF14 lisääntynyt ilmentyminen CDH11 kalvon osa kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 5B, vasen ). Sen sijaan ehtyminen KIF14 pienentää CDH11 ilmentymisen solun pinnalla verrattuna ei-vaiennettu ohjaimet (kuvio 5B, oikealla). Tutkimme myös jakelua endogeenisen CDH11 in CL1-5 /vektori, CL1-5 /KIF14 # 2, CL1-0 /shLacZ ja CL1-0 /shKIF14 soluja, ja tulokset olivat samankaltaisia ​​kuin aiemmat tiedot (kuva S5).

(A) KIF14 liittyvä CDH11 ja MCAM. Lysaatin HEK293T-solujen, jotka on transfektoitu osoitettujen plasmidien käytettiin eksogeenistä immunosaostusmäärityksissä. Immunoblottaus suoritettiin mainituilla vasta-aineilla. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) lysaatti H460-soluja käytettiin endogeenisen immunosaostusmäärityksissä. Immunoblottaus suoritettiin mainituilla vasta-aineilla. (C) jakautuminen CDH11 ja MCAM muuttui yli-ilmentyminen KIF14. H1299-solut kotransfektoitiin HA-CDH11 tai HA-MCAM ja GFP-KIF14, kiinteät ja hybridisoitiin käyttäen anti-HA-vasta-aineita. Signaali oli kaapattu käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (alkuperäinen suurennos, 1000 x). (D) HEK293T-solut kotransfektoitiin HA-CDH11 ja Flag-KIF14 tai siKIF14 ja sen jälkeen, membraanifraktio eristettiin. Proteiinin membraanifraktio ja kokosolulysaattia analysoitiin läpi immunoblottauksella. Määrät HA-CDH11 in membraanijakeen kvantifioitiin läpi normalisoinnin kanssa summa kokosoluliuotteista. Hsp90 käytettiin sytosoliin merkki.

Keskustelu

Nämä tulokset osoittivat, että moottori proteiini KIF14 toimii kasvain ja etäpesäke vaimennin keuhkojen adenokarsinooma. Havaitsimme enemmän tappiota kuin voittoa lähellä KIF14 kromosomissa 1q32 (kuvio 1) ja havaittiin, että potilaat, joilla on alhainen KIF14 ilme näytteillä huonompi yleistä ja etäpesäkkeiden elinaika verrattuna potilaisiin jotka ilmentävät korkeita KIF14 (kuva 2). Yli-ilmentyminen KIF14 keuhkojen syöpäsoluja estivät merkittävästi ankkurista riippumaton kasvu

in vitro

ja ksenografti kasvainten muodostumiseen

in vivo

(kuva 3). Lisäksi ilmentymisen moduloimiseksi KIF14 inhiboi solujen vaeltaminen, invaasio ja adheesion kautta liittämällä ja lisäämällä kalvon ilmentymisen lastiproteiinissa, CDH11 (kuvio 4 ja 5). Siksi KIF14 voisi olla potentiaalinen kohde keuhkoadenokarsinooma hoitoon.

kromosomi mis-erottelu johtaa poikkeavaan sytokineesi ja aneuploidia-. Tämä ilmiö estetään normaaleissa soluissa kautta solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin; kuitenkin, kasvainsolut osoittavat yhä hinnat Aneuploidian, jotka saattavat olla yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen [36] – [41]. KIF14 toimintoja kromosomi eriytymistä ja sytokineesi, ja sen ehtyminen saattaa johtaa kaksiytiminen tai usean ydinvoiman asema [4], [5], [7], [8]. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että aneuploidian kehittyy karsinogeneesin [9] – [11], [42]. Tässä tutkimuksessa, yliekspressio tai hiljentämisen KIF14 soluissa vähentää tai lisätä, vastaavasti, ankkurista riippumaton kasvu

in vitro

, ja KIF14 yliekspressio vähentää kasvaimen kasvu

in vivo

(kuvio 3). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemman tutkimuksen, jossa vaiennettu ilmentymistä KIF14 haiman syöpäsoluissa lisännyt kiinnittymisestä riippumaton eloonjääminen [43]. Lisäksi KIF14, monet muut sytokineesin säätölaitteet on myös raportoitu kasvainten synnyssä, mukaan lukien KIF1A, KIF1B, KIF3, KIF4, KIF10, Von Hippel-Lindaun oireyhtymä proteiini (pVHL) ja BRCA2 [16] – [18], [44] – [47]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että KIF14 puute voitaisiin edistää aneuploidian, jolloin kasvaimen muodostumisen, ja että KIF14 saattaa toimia tuumorisuppressori keuhkosyöpä.

Syöpä eteneminen on monimutkainen prosessi, jossa solujen kasvua, tyvikalvon hajoaminen, solujen vaeltamiseen, invaasio, tarttuvuus, ja etäpesäkkeiden [48], [49]. Saadut tulokset tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että KIF14 ollut mukana vain kasvainten synnyssä, vaan osallistui myös soluadheesion muuttoliike ja invaasiota (kuva 3 ja 4). Immunokemian osoitti, että ekspressiotasot KIF14 oli negatiivinen korrelaatio syövän etäpesäkkeitä potilailla (kuvio 2C ja 2D). CL solulinjojen KIF14 proteiinin tasot olivat käänteisesti yhteydessä solujen invasiivinen kyvyt (kuvio S2A). Nämä havainnot olivat samanlaisia ​​kuin aikaisemman raportin, jossa KIF14 ilmentyminen korreloi negatiivisesti matrigeelin ja hermo hyökkäyksen haimasyövän [43]. Siksi KIF14 saattaa toimia metastasoitunut vaimennin keuhkojen adenokarsinooman.

On huomattava, että tulokset

in vitro

määrityksissä olivat hieman ristiriitainen. Tiedot saatu toteamme, että KIF14 hiljentäminen vähentää solujen lisääntymistä (kuvio 3), mahdollisesti heijastaa M vaiheessa viivästyksiä ja sytokineesiin epäonnistumisia. Kuitenkin KIF14 yliekspressio ei merkittävästi vaikuttanut solujen lisääntymistä kontrolliin verrattuna. Olemme edelleen tutki jakautumista KIF14 ja ilmiöitä solujen kussakin vaiheessa, ja tulokset osoittivat, että mitään erityistä vikaa ei esiintynyt kanssa KIF14 yliekspressio (julkaisematon data). Siten hiljentäminen tai yli-ilmentyminen KIF14 vähennetään tai ei vaikuttanut soluproliferaatiota vaan lisätä tai vähentää pesäkkeiden muodostumisen; tällaiset vaikutukset pidetään solun muuttamassa kykyjä. Yli-ilmentyminen KIF14 (KIF14 # 2) in CL1-5 soluissa voimakkaasti vähentänyt pesäkkeiden muodostumista, solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen, ja lievä ilmaus KIF14 (KIF14 # 1) lievästi alennettu pesäkkeiden muodostumista ja voimakkaasti alentunut solujen vaeltaminen ja invaasiota (kuva 3 ja 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, KIF14 proteiini vaikuttaa solujen transformaatio ja invaasio eriasteisesti. Ehdotamme, että lievä kasvu KIF14 proteiinin ilmentymisen CL1-5 /KIF14 # 1 vakaa solujen edistää myös dramaattisia migraatiota estämällä liikenteen useiden tärkeiden Lastiproteiinimalleja mukana solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Vaikka KIF14 on tärkeä moottori proteiini, joka osallistuu sytokineesiin vuorovaikutusten kautta PRC1 ja sitronikinaasigeenin, rooli KIF14 muissa toiminnoissa on edelleen epäselvä [7]. Saadut tulokset tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että KIF14 voisi säätelevät solujen migraation ja adheesion kautta yhdistysten kanssa CDH11 ja MCAM; tämä lisäys kalvon lokalisoinnin CDH11 keuhkojen adenokarsinooma solulinjoissa on uusi löytää osalta toiminnan KIF14 (kuvio 5). Nämä tulokset ovat samanlaisia ​​kuin raportin, jossa KIF13 osallistuneet mannoosi-6-fosfaatti-reseptorin kuljetuksen sytosolista solukalvon [50]. Nämä tiedot osoittavat, että KIFS voi säädellä eri solutoimintojen muuttamalla lokalisoinnin eri lastin proteiineja.

Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että KIF14 toimii tuumorisuppressorina ja etäpesäkkeiden estäjä keuhkojen adenokarsinooma. Rooli KIF14 syövän etenemisen on keskusteltu viime vuosina. Corson et ai., Kim et ai. ja Wang et ai. osoittivat, että KIF14 ilmentyy voimakkaasti retinoblastooma, rintasyövän, munasarjasyövän, maksasyövän, gliooman ja jotkut keuhkojen kasvaimet [28], [51] – [55]. Käyttämällä CGH array analyysit, Corson ym. havaittiin 20% voitto keuhko- ja keuhkoputki kasvainten laajalla alueella kromosomi 1q31-1q32 [51]; kuitenkin, tässä tutkimuksessa, teimme CGH array analysoi ja havaittiin 25% (22,5% ja 26,8%) menetykseen kahden koettimen sisällä KIF14 lokalisointi ja 5% (2,9% ja 6,5%) voitto keuhkojen adenokarsinooman. Tutustua ristiriita, tutkimme myös mRNA ilmaus KIF14 tutkimuksessamme kohortin käyttäen alukkeita ja koetinta Corson ym.: N tutkimukset. Samanlaisia ​​tuloksia esitetään kuviossa 1, potilaalla on matala KIF14 ilme näytteillä huonompi kokonaiselinaika verrattuna potilaisiin, joilla on korkea KIF14 ilme. Corson et ai. Myös vaiennetaan KIF14 käyttämällä siRNA keuhkojen kasvainsolulinjoissa ja osoitti, että KIF14 hiljentäminen alentunut solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumisen [28]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vaiennetaan ilmaus KIF14 kautta lentiviruksen toimituksen shKIF14 ja saatu samanlaisia ​​tuloksia lisääntymisen, mutta päinvastaisiin tuloksiin suhteen pesäkkeiden muodostumista. Mielenkiintoista on, jää epäselväksi, miksi eri tuloksia saatiin samasta geenistä; kuitenkin on olemassa useita mahdollisia selityksiä näitä ilmiöitä. 1. Ero KIF14 proteiinia tagit: Theriault et al. hyödynnetään C-terminaali EGFP- ja Myc-merkittyjä KIF14 in leviämisen ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset, ja EGFP-tagged KIF14 näytteillä mietojen vaikutuksia kuin Myc-merkityn KIF14 [54]. Siksi me syntyy ei-merkittyä villityypin KIF14 rakentaa ja tutki vaikutukset solujen invasiivisuus; tulokset olivat samanlaisia ​​kuin Flag-merkityn KIF14 (kuvio 4C). Olemme myös luotu C-terminaalista Flag-merkittyjen KIF14 tutkia solujen vaeltamiseen, ja tiedot olivat samanlaisia ​​kuin saatiin N-pään Flag-merkityn ja ei-merkittyjä KIF14 (data ei näytä). 2. Etniset erot: tuoreessa tutkimuksessa selkeästi osoitti, että esiintyminen, syy, geenimutaatio tila, selviytyminen, ennuste, ja keuhkosyövän hoitoon olivat erilaisia ​​Aasiassa ja Yhdysvalloissa [56]. 3. Yksi geeni tai yhden proteiinin voisi olla kaksi tai useampia rooleja fysiologisesta. Esimerkiksi transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-beeta) toimii joko kasvaimeen vaimennin tai kasvain-promoottori eri olosuhteissa aikana syövän etenemisen [57], [58], ja signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3) on