Krooninen sairaus

tiivistelmä

Joillakin ruokatorven syöpä potilaat, sädehoitoa ei voi estää etäpesäkkeiden mikä johtaa huonoon säilymiseen . Taustalla mekanismi etäpesäkkeiden näillä potilailla ei ole vakiintunut. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ionisoiva säteily saattaa aiheuttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), johon liittyy lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen kautta downregulation fosfataasin ja tensin homologi (PTEN), ja aktivointi Akt /GSK-3β /Snail signalointi. Olemme kehittäneet säteilyresistenteille (RR) ruokatorven okasolusyöpä syöpäsolun linja, KYSE-150 /RR, jonka fraktioitu ionisoiva säteily (IR) käsittely, ja vahvisti sen radioresistance käyttäen klonogeeniset -eloonjäämiskoe. Huomasimme, että KYSE-150 /RR solulinjan näkyy tyypillisiä morfologisia ja molekyylitason ominaisuudet EMT. Verrattuna vanhempien soluihin, KYSE-150 /RR soluihin kasvoi jälkeisissä IR yhdyskunnan eloonjäämiseen, muuttoliike, ja invasiivisuus. Lisäksi lasku PTEN in KYSE-150 /RR soluja havaittiin. Olemme oletettu, että yli-ilmentyminen PTEN voivat aiheuttaa mesenkymaalisten-epiteelin siirtymisen KYSE-150 /RR-soluja ja palauttaa IR-indusoidun solumigraation. Mekanistisesti, fraktioitu IR inhiboi ilmentymistä PTEN, mikä johtaa aktivoitumiseen Akt /GSK-3β signalointia ja liittyy kohonneita Snail-proteiinin, transkriptiotekijä mukana EMT. Vastaavasti hoito LY294002, joka on fosfatidyyli-3-estäjät, mimicked PTEN yliekspressio vaikutus KYSE-150 /RR soluja, edelleen viittaa rooli Akt /GSK-3β /Snail signalointia vaikutukset välittyvät PTEN. Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että fraktioitu IR-välitteistä EMT KYSE-150 /RR-solujen kautta PTEN-riippuvaisten reittien, esiin suoraan proinvasive säteilyn vaikutusta hoidon kasvainsoluihin.

Citation: Hän E, Pan F, Li G, Li J (2015) Fraktioitu Ionisoiva säteily Edistää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon Human Ruokatorven Syöpäsolut kautta PTEN deficiency välittämän Akt aktivointi. PLoS ONE 10 (5): e0126149. doi: 10,1371 /journal.pone.0126149

vastaanotettu: 27 lokakuu 2014; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2015; Julkaistu: toukokuu 22, 2015

Copyright: © 2015 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tutkimus tukee General Financial Grant Kiinasta Postdoctoral Science Foundation (JL, Grant No. 2013M542451) (https://jj.chinapostdoctor.org.cn/V1/Program1/Info_Show.aspx?InfoID=270124f8-9c55-4916-ab8d-1ee53c952329). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on yksi vaikeimpia syövät hoitoon kahdeksannen korkein kuolleisuus keskuudessa kaikista syövistä maailmanlaajuisesti. [1] Se on neljänneksi yleisin diagnosoitu syöpä ja neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Kiinassa. [2] ruokatorven levyepiteelisyöpä (ESCC) on merkittävä histopatologinen alatyypin ruokatorven syöpään Kiinassa. Sädehoito on tärkeä osa hoidettaessa ESCC, mutta paikallinen vika on säilynyt merkittävä huolenaihe, jossa jatkuva tai uusiutuva sairaus on raportoitu noin 40-60%: lla potilaista. [3] osajoukko ruokatorven syöpä potilaat eivät vastaa sädehoidon takia sen syntyminen säteilyresistenteille (RR) syöpäsoluja. Taudinkulku näillä potilailla on ominaista usein pahenemisvaiheita ja etäinen metastaattinen vaurioita. Tutkiminen taustalla olevien mekanismien mukana kehittämässä RR kasvainsolujen on ensiarvoisen tärkeää tutkittaessa vaikutusta sädehoidon ESCC.

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on prosessi, joka erottaa epiteelisolujen esiinny huomattavaa morfologisia muutoksia peräisin epiteelin mukulakivi fenotyyppi pitkänomainen fibroblastivasteeseen fenotyyppi [3], jolle on tunnusomaista vähentynyt ilmentyminen epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista ja N-kadheriinin. [4] tällä hetkellä, EMT on ollut sekaantunut kaksi tärkeimmistä prosesseista vastuussa syöpään liittyvää kuolleisuutta eli invaasio ja eteneminen kaukaisiin etäpesäkkeitä, ja hankinta terapeuttisia vastus. [5] Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että EMT on ratkaiseva merkitys syövän kehittymiseen radioresistance. Säteily välittämä EMT on laajasti tutkittu erilaisia ​​kasvaimia, sekä

in vitro

ja

in vivo

, kuten peräsuolen, kohdunkaulan, rinta- ja keuhkosyöpä. [6-10] Kuitenkin tarkka rooli EMT ja taustalla olevien mekanismien mukana kehittämisessä radioresistance ruokatorven syöpä on vielä selvittämättä.

fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) on tärkeä kasvainta estävä geeni, joka on negatiivinen säätelijä n fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) -Akt reitin siten osallistuvat säätelyyn solusyklin, jakautumista, apoptoosia soluadheesiota, ja EMT alkionkehityksen aikana ja syövän etenemiseen. [11, 12]. On raportoitu, että vähentynyt ilmentyminen PTEN, post-IR, indusoi radioresistance edistämällä solujen lisääntymisen ja esto solujen apoptoosin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja nenänielun syöpä. [13, 14] Suoraan palauttamaan PTEN toiminto on aiemmin raportoitu olevan arvokas lähestymistapa saavuttaa säteilylle herkäksi

in vitro

. [15] Se, onko PTEN osallistuu säteilyn laukaisema EMT ja kasvaimen etäpesäkkeiden ESCCs ei ole vielä selvä.

Siksi esillä olevassa tutkimuksessa olemme arveltu rooli PTEN kehittämisessä säteilyn aiheuttaman EMT ESCC. Tutkimme jos (i) säteilytys voi parantaa invasiivisuus on ESCCs indusoimalla EMT, (ii) PTEN puutos oli mukana säteilyn aiheuttamien EMT, ja (iii) säteilyn aiheuttamien EMT oli aktivoimalla Akt /GSK-3β /Snail signalointi .

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa saatiin Gibco (Life Technologies Corporation, IN), naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin HyClone (Thermo, MA). Vasta-aineet PTEN, E-kadheriinin, N-kadheriinin, Slug, Snail, vimentiinin, Akt, fosforyloidun Akt (p-Akt), GSK-3β, phosphorylatedGSK-3β (p-GSK-3β) ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugoitu sekundaarinen vasta-aine hankittiin CST (Cell Signaling Technology, MA). PI3K estäjä, LY294002, ostettiin Sigma (Sigma-Aldrich, MO). GoScript Reverse Transcription System ja GoTaq qPCR Master Mix Kit olivat Promega (Promega, WI).

Solun viiva ja soluviljelmissä

Ihmisen ESCC solulinjaa, KYSE-150 (JCRB1095, toimitti Dr. . Fangfang Bu) [16, 17], viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% FBS: ää ja 100 yksikköä penisilliiniä-streptomysiiniä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Ennen kulttuuri, KYSE-150-solulinja oli todennettu lyhyillä peräkkäisen toiston profilointi (Beijing Microread Gene Technology Co., Kiina).

Fraktioitu ionisoiva säteily (FIR) käsittely [18]

KYSE -150 soluja viljeltiin 25 cm

2 pulloihin. Saavuttamiseen noin 75% konfluenssiin, solut säteilytettiin 1 Gy röntgen huoneenlämmössä käyttäen Hitachi MBR-1520-R säteilyttäjällä (Hitachi Medical Corporation, Tokio, Japani) annoksena nopeudella 4.73Gy /min, ja solut palautettiin inkubaattoriin välittömästi säteilytyksen jälkeen. Soluja sub-viljeltiin uusiin pulloihin noin 90% konfluenssiin. Tämä prosessi toistettiin siten, että saavutetaan altistuminen säteilylle annoksella 1 Gy, 3 kertaa; 2 Gy, 3 kertaa; ja 4 Gy, 7 kertaa, ja jokainen altistus oli välein kolmen päivän ajan; jossa kokonaisannos on 37 Gy yli 2 kuukauden ajan. Useita klooneja eristettiin RR soluja ja yksilöllisesti viljeltiin. Emosoluilta käsiteltiin käyttämällä samaa menettelyä, paitsi että niitä ei ole säteilytetty. Klonogeeniset määrityksiä käytettiin määrittämään vastuksen taso ja RR klooni nimeltä KYSE-150 /RR valittiin meidän kokeessa.

klonogeeniset -eloonjäämiskoe

Vanhempien ja RR solut maljattiin kuuden kennon levyt 500, 1000, 2000, 3000, 4000 solua per kuoppa. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin yksittäisen annoksen säteilyä (0, 2, 4, 6, tai 8Gy vastaavasti). Solut palautettiin inkubaattoriin välittömästi säteilytyksen jälkeen, jotta pesäkkeitä muodostaen. 14 päivän kuluttua pesäkkeet kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Sisältävät pesäkkeet 50 solut laskettiin mikroskoopin alla. Eloonjääntifraktio, (SF) laskettiin pesäkkeiden määrä /(kylvettyjen solujen x maljaustehokkuus). Elossaoloajan käyrä johdetaan GraphPad Prism 5.0. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

Plasmidi rakentaminen ja transfektio

Rekombinantti plasmidi pcDNA3.0-PTEN rakennettiin insertoimalla ihmisen PTEN cDNA pcDNA3.0-vektoriin (Invitrogen, CA ) alukkeilla seuraavasti: eteenpäin, 5 ’cggggtaccccggccaccATGACAGCCATCATCAAAGAGATC 3’ (alleviivattu Kpn1 + Kozak) ja reverse, 5 ’ccgctcgagcggTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC 3’ (alleviivattu Xho1). KYSE-150 /RR-solut transfektoitiin pcDNA3.0-PTEN tai pcDNA3.0 vektorisäätö. Kaikki transfektiot suoritettiin käyttäen ScreenFectA transfektioreagenssia (InCellA, Egggenstein-Leopoldshafen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektoidut solut analysoitiin Western blottauksella, tai kvantitatiivisia käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR).

RNA-interferenssi-määritys

KYSE-150-soluja, joita ei ollut säteilytetty, transfektoitiin 100 nmol sirna (siRNA) -PTEN tai nontargeting salattu-siRNA käyttäen ScreenFectA transfektioreagenssia kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. siRNA-PTEN syntetisoitiin käyttäen seuraava sekvenssi: 5′-GGGCCAGGTCATAAATAAT-3 ’; kun taas Salatut-siRNA-sekvenssi oli seuraava: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’.

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin natriumdodekyylisulfaattia (SDS) hajotuspuskuria, ja homogenoitiin proteiini uuttamalla. Yhtä suuret määrät proteiinia kustakin lysaatista erotettiin SDS-PAGE: lla (10% akryyliamidi) ja blotattiin PVDF-western blotting kalvoja (Millipore Corporation, MA). Tätä seurasi inkubointi primaarisessa vasta-PTEN, E-kadheriinin, N-kadheriinin, Slug, Snail, vimentiinin, Akt, p-Akt ja glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH, kuten kuormituksen valvonta), ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen . Blot signaalit visualisoitiin sitten tehostetun kemiluminesenssin (Thermo, MA).

RNA ja RT-qPCR

kokonais-RNA viljellyistä soluista, erilaisten käsittelyjen jälkeen, uutettiin TRIZOL-reagenssilla ( Life Technologies Corporation, IN) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon. Yksi mikrolitra koko käänteiskopioinnin Tuote on lisätty reaaliajassa-qPCR seosta (20 ui), joka sisälsi 10 ui 2 × GoTaq qPCR Master Mix ja alukkeita (sense ja anti-sense, 1 ui) määrittää mRNA ilmentyminen ihmisen PTEN, E -cadherin, N-kadheriinin, Snail, Slug, vimentiinistä ja β-aktiini. Geenin mRNA: n kustakin näytteessä laskettiin normalisoimalla kanssa β-aktiini. Kaikki alukkeet suunniteltiin käyttäen IDT PrimerQuest Input ohjelmisto (taulukko 1). Näytteet monistettiin precycling pitää 95 ° C: ssa 30 s, 40 sykliä hehkutus ja pidennys 60 ° C: ssa 34 s. Kukin mittaus suoritettiin kolmena rinnakkaisena ApplidBiosystems 7500 StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc., CA) ja analysoitiin käyttäen Applied Biosystem 7500 ohjelmisto v2.0.1.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Siirtyminen määritykset suoritettiin 24-kuoppaisella siirtokuoppaan sisältävän kammion polykarbonaattisuodattimille 8 um huokosia (Corning, Acton, MA). Yhteensä 500 ui alustaa, joka sisälsi 20% FBS: ää, kun kemotaktinen tekijä, lisättiin alempaan osastoon ja sitten 1 x 10

5-solut kunkin ryhmän seerumivapaassa DMEM lisättiin ylempään osastoon kammion ja inkuboitiin 24 h. Yläpinta kammio raaputetaan sitten poistamaan ei-muuttavien soluissa. Siirtyneet solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja valokuvattiin valomikroskoopin alla (x 100). Kammiot pestiin 100 ul: lla 10% etikkahappoa ja OD värjättyjen solujen eluentti mitattiin 560 nm: ssä. Jokainen ryhmä valmistettiin kolmessa rinnakkaiskoekuopissa. Sillä invaasiomääritys, joka on transwell järjestelmä on päällystetty 2 mg /ml tyvikalvon, Matrigel, (Corning, Acton, MA) käytettiin. Loput menettelystä oli samanlainen migraatiokokeessa kuten edellä on kuvattu.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin, kunnes 40% konfluenssiin; Konfluenttien yksisolukerros oli naarmuuntunut kanssa 20 ul pipetin kärjen tuottaa pystysuoran viivan poikki keskellä kuoppiin. Leviäminen haavan jälkeen havaittiin 0 ja 24 tunnin välein ja valokuvattiin valomikroskoopilla.

Tilastollinen

erot arvioitiin Studentin t-testiä verrataan kahta ryhmää. Data ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD).

P

arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

säteilyn vaikutusta solujen morfologiaan ja EMT markkereita

Kahden kuukauden kuluttua FIR yhteensä annoksella 37 Gy, subkloonia eristettiin ja nimettiin KYSE-150 /RR-soluja, ja niiden RR luonteen osoitettiin klonogeenisten solujen eloonjääminen määrityksessä. Kuvio 1A osoittaa, että KYSE-150 /RR solut elivät pitempään verrattuna vanhempien soluihin.

(A) Säteily solujen selviytymisen käyrät ja klonogeeniset luvut ohjaus KYSE-150-soluilla ilman säteilytystä ja radioresistance subklooni KYSE-150 /RR-soluja. (B) morfologia KYSE-150 ja KYSE-150 /RR solut tutkittiin faasikontrastimikroskopiaan. (C) Expression of EMT markkereita (E-kadheriinin ja vimentiinin) ja transkription repressoreja E-kadheriinin (Snail ja Slug) havaittiin qRT-PCR: llä, data on esitetty keskiarvona ± SD, *

P

0,05. Data edustaa keinoin keskihajonta kolmen erillisen kokeen. (D) edustaja western blotit E-kadheriinin, vimentiinistä, etana ja Slug olivat osoitti.

RR solut osoittivat morfologisia muutoksia. Ohjaus- KYSE-150-solut (KYSE-150 Ctrl) oli epiteelin kaltainen morfologia, tiukoilla solu-solu yhdessä ja mukulakivikadut näköisiä (kuvio 1 B vasemmalla). KYSE-150 /RR-solujen kehitetty karamaisen morfologia, jossa lisääntyneen muodostumisen valejalka ja menetys solu-solu kosketukseen, mikä on ominaista mesenkymaalisten fenotyypin (kuvio 1B oikealla). Vahvistuksen Näiden morfologisten ominaisuuksien RR alilinjat ehkä aavistuksen kohti muuttaneet ominaisuudet, kuten muuttoliike ja invaasiota. [19]

Vahvista, onko tämä fenotyyppi muutos johtui EMT, mRNA ja proteiini ilmentymistä EMT- liittyvien geenien havaittiin qRT-PCR ja Western blotit. KYSE-150 /RR-solut osoittivat downregulation epiteelin marker E-kadheriinin ja säätelyä mesenkymaalisten marker vimentiinin, verrattuna KYSE-150 Ctrl-soluissa (kuvio 1 C ja 1 D). Etana ja Slug, alipaineensäätöventtiileillä E-kadheriinin, olivat kriittisiä EMT. [19] In KYSE-150 /RR soluja, sekä etana ja Slug lisääntyivät merkitsevästi proteiinin taso (kuvio 1 D), mutta ei muutettu mRNA tasolla (kuvio 1 C). Nämä tulokset osoittavat, että säteilytys on riittävä indusoimaan EMT in ESCC solulinjassa.

Vaikutukset Säteilytyksen solumigraation ja invaasiota

tuumorisoluja, jotka käyvät läpi EMT ovat lisääntyneet solumigraatioon ja invaasion kyky. Sen tutkimiseksi, KYSE-150 /RR solujen näyttää tällaisia ​​ominaisuuksia, arvioimme muuttoliike ja hyökkäys kyky KYSE-150 Ctrl ja KYSE-150 /RR solujen

in vitro

. Haavan paranemista määritys osoitti, että KYSE-150 /RR soluilla oli huomattavasti nopeampi sulkeminen haavan alue verrattuna KYSE-150 Ctrl-soluissa (kuvio 2A). Solujen migraation ja invaasion KYSE-150 /RR soluja havaittiin korotetaan 50% ja 33% vastaavasti, verrattuna KYSE-150 Ctrl-soluissa (kuvio 2C). Kuvat ovat siirtymiselle ja invaasion kyky kustakin solulinjasta on esitetty kuvassa 2B.

(A) KYSE-150-solut altistettiin arpeutumisprosessit määrityksessä tai ilman säteilyä 100 x suurennus. Kuvat ovat valokuvattiin oikeassa ja 24 tunnin kuluttua alusta. (B) edustavat kuvat migraatiokokeessa ja invaasiomääritys of KYSE-150-solujen kanssa tai ilman säteilyä kuvattiin 24 h kristalliviolettivärillä. (C) Yhteenveto kuvaajat muuttoliikettä ja invaasiota (data näytetään keskimääräisenä ± SD, *

P

0,05).

PTEN puute tarvitaan säteilytys aiheuttama EMT

on todettu, että ilmaus PTEN on vähentynyt RR kasvainsoluissa. [13, 14] Tutkimme mRNA ja proteiini ilmentymistä PTEN in KYSE-150 Ctrl ja KYSE-150 /RR soluja. Tuloksemme osoittivat, että säteily merkittävästi vähentynyt ilmentyminen PTEN sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoja (kuvio 3A). Voit selvittää vaikutukset PTEN vajauksen solujen vaeltamiseen ja EMT, siRNA kohdistaminen PTENin käytettiin (kuvio 3B vasemmalla). Muuttoliike ja invaasiomääritys osoittivat, että knockdovvn PTEN johti selvästi muuttavien fenotyypin KYSE-150 soluja verrattuna ajoneuvon transfektoiduissa soluissa (kuvio 3D). Western blotit osoittivat, että KYSE-150-siPTEN solut osoittivat menetys soluadheesion merkki E-kadheriinin ja korkeus mesenkymaalisten differentiaatiomarkkeri vimentiinista (kuvio 3C vasemmalla).

(A) Säteily merkittävästi vähentää ilmentymistä PTEN vuonna KESE-150 /RR soluja ei väliä mRNA tasolla (tiedot esitetään keskiarvona ± SD, **

P

0,01) ja proteiini taso (edustaja western blotit). (B) Transfektoidut tehokkuus siPTEN in KYSE-150 (vasemmalla) ja pcDNA-PTEN in KYSE-150 /RR soluja (oikealla) (tiedot esitetään keskiarvona ± SD, **

P

0,01) . (C) tyypillisen western blot-analyysi osoitti ilmentymistä PTEN, E-kadheriinin ja vimentiinista in KYSE-150-solut transfektoitu siPTEN tai ajoneuvoa tai KYSE-150 /RR transfektoitujen solujen pcDNA-PTEN tai pcDNA3.0. Esitetyt tulokset edustavat kolmea eri kokeessa. (D) Kuvat ovat maahanmuutto- ja invaasiomääritys of KYSE-150-solut transfektoitu siPTEN tai ajoneuvon kuluttua 48 h (vasemmalla); Yhteenveto kaaviot on muuttoliikettä ja invaasiota (oikealla, data näytetään keskimääräisenä ± SD, *

P

0,05). (E) edustaja kuvia migraatiokokeessa ja invaasiomääritys of KYSE-150 /RR transfektoitujen solujen pcDNA-PTEN tai pcDNA3.0 kuvattiin 24 h kristalliviolettivärillä (vasemmalla); Yhteenveto kuvaajat muuttoliikettä ja invaasiota (oikealla, data näytetään keskimääräisenä ± SD, *

P

0,05). siPTEN on lyhenne siRNA-PTEN.

Sitten käytimme koodaava vektori PTEN (kuvio 3B oikealla), vahvistaa roolia PTEN säteilyn aiheuttama EMT ja kasvainmetastaasit. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen PTEN aiheutti KYSE-150 /RR-solujen palauttamiseksi ilmentymisen E-kadheriinin ja vähentää ilmentymistä vimentiinista (kuvio 3C oikealla). Lisäksi lisääntynyt liikkuvuus ja hyökkäys kyvyt KYSE-150 /RR solut merkittävästi inhiboi yliekspressio PTEN (kuvio 3E). Tulokset osoittavat, että PTEN puute on tarpeen säteilyn aiheuttamaa EMT ja muuttavien /invasiivisen fenotyypin.

PTEN laski Snail ilmentymisen aktivoitumisen kautta PI3K /Akt /GSK-3β signalointi

Snail ja Slug ovat transkriptiorepresso- jotka tärkeä rooli tuumorimetastaasissa by vähen- tämisessä E-kadheriinin. [19] Kuten edellä mainittiin, etana ja Slug ilmentyivät KYSE-150 /RR solut proteiinin tasolla, mutta ei mRNA tasolla. Sen määrittämiseksi, onko kohonnut ilmentyminen Snail ja Slug johtuivat PTEN puute säteilytettäessä, muutimme PTEN ilmaisun transfektoimalla siRNA vastaan ​​PTEN tai PTEN ekspressiovektorin, ja sitten Western blotit suoritettiin ekspression määrittämiseksi Snail ja Slug. Kuten on esitetty kuviossa 4A, Snail ilmentyminen kasvoi merkittävästi KYSE-150 Ctrl-siPTEN soluja verrattuna KYSE-150 Ctrl-siCtrl solun, kun taas se aleni KYSE-150 /RR-pcDNA-PTEN soluja verrattuna KYSE-150 /RR-pcDNA soluissa. Sitä vastoin ilmaus Slug ei merkittävästi muuttunut, kun PTEN ilme. Lisäksi qRT-PCR ei ollut merkittävää muutosta Snail mRNA (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että säätelyä Snail säteilyttämällä johtuu lasku PTEN tasoilla.

(A) ilmentyminen Etana ja Slug havaitaan western blot analyysi KYSE-150-solut transfektoitu siPTEN tai ajoneuvoa tai KYSE-150 /RR transfektoitujen solujen pcDNA-PTEN tai pcDNA3.0. (B) Expression of Snail havaittiin qRT-PCR, data näytetään keskimääräisenä ± SD. (C) tyypillisen western blot-analyysi osoitti ilmentymistä Akt, p-Akt, GSK-3β ja p-GSK-3β. Esitetyt tulokset edustavat kolmea eri kokeessa. siPTEN on lyhenne siRNA-PTEN. (D) tyypillisen western blot-analyysi osoitti ilmentymisen Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3β, Snail ja E-kadheriinin in KYSE-150 /RR-solujen kanssa tai ilman fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) estäjä, LY294002 (40 uM).

aktivoituminen PI3K /Akt /GSK-3β -systeemi nousemassa keskeinen piirre EMT, joissa GSK-3β säätelemällä Snail ilmaisun posttranslational muutos. [20, 21] Hypoteesimme onko PTEN säätelee Snail ilmaisun PI3K /Akt /GSK-3β väylän ESCC soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 4C, fosforylaatio Akt ja GSK-3β on yliaktiivista KYSE-150 /RR-soluissa, mutta ei KYSE-150 Ctrl-soluja. Ja tyrmäys PTENin todellakin helpotti fosforylaatiota Akt in KYSE-150 Ctrl soluissa, liittyy kasvu fosforylaatio GSK-3β (kuvio 4C, keskellä). Sen sijaan yli-ilmentyminen PTEN esti Akt ja GSK-3β fosforylaatiota KYSE-150 /RR-soluissa (kuvio 4C, oikealla). Edelleen todistaa PTEN-riippuvaisen eston PI3K /Akt /GSK-3β signalointi, PI3K-estäjä, LY294002, käytettiin jäljittelemään vaikutuksen PTEN yli-ilmentymisen KYSE-150 /RR soluja. LY294002 (40 uM) esti Akt ja GSK-3β fosforylaatiota KYSE-150 /RR-solut, ja ilmentyminen Snailin vaimentua ja E-kadheriinin proteiinin ilmentyminen lisääntyy (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PTEN puute aktivoi Akt /GSK-3β /Snail reitin säteilytettäessä.

Keskustelu

Sädehoito on tehokas hoito ruokatorven syöpä edes edennyt pitkälle. Kuitenkin uusiutuminen ja etäpesäkkeiden takia kehittämiseen radioresistance keskuudessa kasvainsolujen edelleen suuri haaste. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RR fenotyyppi korreloi useat tekijät, mukaan lukien muutokset solusyklin tarkastuspisteitä, hidasti, ja laski apoptoosin. [22, 23] epiteeliä mesenkymaalitransitioon arvellaan myös säänneltävä altistumista säteilylle. Kertyneet todisteet osoittavat, että ionisoiva säteily on yksi indusoijia EMT, joka on osoitettu esiintyä aloitettaessa etäpesäke, joka johtaa syövän etenemisen, ja liittyy resistenssin kehittyminen sädehoidon suun, rinta- ja keuhkosyöpää . [6, 7, 24]

tutkimiseksi kliinisessä radioresistance, hoito FIR on käytetty

in vitro

määrittää molekyylitason mekanismit radioresistance. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet KYSE-150 /RR-soluja, jotka ovat peräisin klooneista, jotka olivat selvinneet jälkeen FIR hoidon, [18], joka sopivasti jäljittelee sädehoidon vastus ESCC. KYSE-150 solu on laajasti käytetty ruokatorven syöpä solulinja tutkimiseen säteilyn vastarinnan ruokatorven syöpä. [18, 25-27] KYSE-150-solulinja on kehittänyt Dr. Yutaka Shimada vuonna 1991 huonosti eriytetty ESCC resekoitu ylemmästä ruokatorvi on 49-vuotiaan japanilaisen nainen saa sädehoitoa. [16] Näin ollen tämä solulinja voidaan helposti muuntunut RR solulinjaan. Olemme havainneet, että fenotyypin KYSE-150 /RR-solut kytketään epiteelin morfologian on mesenkymaaliset morfologia säteilytyksen jälkeen. Samalla teimme maahanmuutto ja invaasiomääritys ja totesi, että maahanmuutto ja hyökkäys kyky KYSE-150 /RR soluissa lisääntyi verrattuna vanhempien soluja, mikä viittaa siihen, että EMT on mukana kehittämisessä radioresistance ja etäpesäkkeiden ESCC.

Olennaisena vaiheena EMT on downregulation E-kadheriinin. E-kadheriinin säätelee joko transkriptiotekijät, kuten Snail liittyvät sinkkisormen transkriptiorepresso- (Snail ja Slug), SIP-1 /ZEB-2 ja perus helix-loop-helix transkriptiotekijä, Twist, tai ubiquitylation aiheuttama endosytoosin. Tutkimuksessamme löysimme FIR lisääntynyt ilmentyminen sekä Snail ja Slug on proteiini tasolla eikä muuta niiden mRNA ilmaisun. Kohdunulkoinen yliekspressio Snail johtaa myös hankintaan lisääntyneen resistenssin apoptoosin ja syövän kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia erilaisissa epiteelisoluissa. [28] aktivointi Snail ja Slug voi olla yksi mekanismeja kehittämiseen radioresistance vuonna ESCC sädehoidon jälkeen .

aktivointi proteiinikinaasi B (Akt) koulutusjakson on keskeisessä asemassa kolmen suuren radioresistance mekanismeja, jotka ovat luontaisia ​​radioresistance; kasvainta solujen lisääntymistä ja hypoksiaa. PTEN, estäjänä Akt, raportoidaan yhdistää radioherkkyyttä. On raportoitu, että ilmaisu PTENin vähennettiin RR soluissa mahalaukun [15] ja nenänielun [14] syöpä puolestaan ​​toiset löytää PTEN olevan olennainen vaimennus hyökkäyksen ja EMT. [11, 29] Löysimme ilmaus PTEN on vaimentua jälkeen FIR, ja yli-ilmentyminen PTEN palautti fenotyyppi KYSE /150 /RR soluja mesenkymaalisten morfologia epiteelin morfologia, johon liittyy vähentynyt muuttoliikkeen ja invaasio.

tutkimiseksi edelleen roolin PTEN säteilyn laukaisema EMT, Akt /GSK-3β /Snail-reitin tutkittiin, joka on aiemmin liitetty kehittämiseen säteilyn aiheuttama keuhkosyöpä. [10, 30] Oletimme rooli PTEN, joka johtaa lisääntyneeseen E -cadherin ilmaisun kautta Akt /GSK-3β /Snail-reitin. Aktiivinen GSK-3β voi fosforyloida Snail helpottaa sen hajoamista, [20, 21], päinvastoin inaktivoitumisen GSK-3β, voi vakauttaa Snail. [30] Meidän tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen PTEN voi vaimentaa säteilyn indusoima Snail kautta defosforyloimalla Akt in KYSE-150 /RR soluja, mikä nopeutti downregulation p-GSK-3β ja edistänyt Snail hajoamista. Etana, yhtenä transkription repressors E-kadheriinin, kun saaminen vaimentua aiheutti säätelyä E-kadheriinin ilmentymisen. Tarkempia todistetaan osallistumista PI3K /Akt /GSK-3β signaloinnin PTEN riippuvaisella tavalla, PI3K-estäjä, LY294002, käytettiin jäljittelemään vaikutuksen PTEN yli-ilmentymisen KYSE-150 /RR soluja. LY294002 esti Akt ja GSK-3β fosforylaatiota KYSE-150 /RR soluja, ja ilmaisu Snailin vaimentua ja E-kadheriinin proteiini säädelty. Pidetään yhdessä, tiedot viittaavat siihen, että downregulation PTENin liittyy inaktivaatio GSK-3β, ja PTEN-riippuvaisten PI3K /Akt /GSK-3β signalointi on välttämätön upregulate Snail säteilyn aiheuttama EMT kehittyä ESCCs.

vimentiinista, tärkeä solun tukirangan osa mesenkyymisolujen, käytetään usein markkerina EMT aikana metastasointiin. On raportoitu, että tukos PI3K /Akt signalointi heikennettyä vimentiinista ilmaisun suun masoluja. [31] Tutkimuksessamme vimentiinistä oli säädellään ylöspäin KYSE-150 /RR-soluissa (kuvio 1 D) ja yliekspressio PTEN inaktivoituja PI3K /Akt signalointi johtaa downregulation vimentiinista ilmentymisen näissä soluissa (kuvio 1 C). Tämä viittaa siihen, että PTEN puute tarvitaan säteilyn aiheuttama EMT. On huomionarvoista, että Slug, toinen E-kadheriinin transkriptio repressori, on säädellään ylöspäin säteilyä (kuvio 1 D); kuitenkin, Slug tasoja ei havaittu vaikuttavan PTEN ilmaisu (kuvio 4A). Tämä havainto osoittaa, että säteilyn aiheuttama EMT on monimutkainen prosessi ja muut reitit voivat myös olla mukana.

Tutkimuksemme on selvitetty yksityiskohtia EMT väylän säteily laukaisi ESCC (kuvio 5). Tutkimuksessa korostetaan PTEN mahdollisena terapeuttisena kohteena. Vaimennussäätely PTEN ja säätelyä PI3K reitin laukaisi säteily herättää kaskadeista johtaa EMT. Kaikki nämä vaikutukset myötävaikuttavat tuumorimetastaasin ja uusiutumisen jälkeen sädehoitoa. Siksi ehdotamme, että PTEN puute jälkeen sädehoitoa ruokatorven syöpä on tärkeä rooli kehitettäessä RR kasvainmetastaasin. Niinpä yli-ilmentyminen PTEN voi osoittautua hyödylliseksi strategia estää syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden jotka voivat kehittyä jälkeen sädehoidon vuonna ESCC.

PTEN toimii ylävirtaan säätelijänä PI3K /Akt /GSK-3β signalointi verkko herättää cascades EMT. Slug säätelee E-kadheriinin ilmentymisen PTEN riippumattomasti.