Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

molekyyli chaperone Hsp90 on lupaava uusi tavoite syövän hoidossa ja selektiiviset Hsp90 estäjiä parhaillaan kliinisissä tutkimuksissa. Aikaisemmin nämä estäjien on raportoitu aiheuttavan joko solusyklin pysähtymisen tai solukuolemaa syöpäsoluissa. Olipa solusyklin pysähtymiseen on palautuva tai palautumaton ei yleensä ole arvioitu. Tässä olemme tutkineet yksityiskohtaisesti solusyklin pysähtymiseen ja solukuolemaa vasteita ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat Hsp90 eston.

Menetelmät /Principal Havainnot

MTT määrityksissä, pienisoluinen keuhkosyöpä solut osoittivat kaksivaiheinen vastaus Hsp90 estäjien geldanamysiinistä ja radicicol, jossa pienet pitoisuudet aiheuttavat lisääntymistä pidätyksen ja suurina pitoisuuksina aiheuttaa solukuoleman. Arviointi Hsp90 solunsisäisen aktiivisuuden avulla menetys asiakkaan proteiinin ilmentymisen osoittivat, että geldanamysiinistä pitoisuudet, jotka estivät Hsp90 korreloi läheisesti ne aiheuttavat leviämisen pidätetty mutta ei solukuolemaan. Lisääntyminen pidätys aiheuttama pieninä pitoisuuksina geldanamysiinistä ei peruuteta ajaksi yli kolmekymmentä päivää lääkkeen poistamiseksi ja osoittivat piirteitä vanhenemista. Harvinaiset populaatiot variantin pienisoluisen keuhkosyövän soluja voitaisiin eristää, joka oli geneettisiä muutoksia ja enää tehtiin peruuttamaton leviämisen pidätys vastauksena Hsp90 estäjiä.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että: ( 1) Hsp90 eston ensisijaisesti aiheuttaa ennenaikaista vanhenemista, pikemminkin kuin solukuolema, on pienisoluinen keuhkosyöpä solut; (2) pienisoluinen keuhkosyöpä solut voivat ohittaa tämän vanhenemista kautta edelleen geneettisiä muutoksia; (3) Hsp90 estäjän aiheuttama solukuoleman pienisoluisen keuhkosyövän solujen johtuu eston kohteena muu kuin soluliman Hsp90. Nämä tulokset vaikuttavat sen suhteen, miten nämä inhibiittorit käyttäytyy kliinisissä tutkimuksissa ja suunnittelun tulevaisuuden estäjien tässä luokassa.

Citation: Restall IJ, Lorimer IAJ (2010) induktio Ennenaikainen Vanheneminen mukaan Hsp90 esto in pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10,1371 /journal.pone.0011076

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2009; Hyväksytty: 17 toukokuu 2010; Julkaistu: 11 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Restall et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahoja IL Kanadan Institutes of Health Research (avustus number62797) (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) ja Kanadan Cancer Society (lupanumeroon 020121) (http : //www.cancer.ca/canada-wide.aspx? sc_lang = fi). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hsp90 toimii kaperonina normaaleissa soluissa, edistää oikea laskostuminen sekä vasta syntetisoitujen proteiinien ja proteiineja, jotka on osittain denaturoitua johtuu stressistä [1]. Se näyttää olevan osallistuu pääasiassa loppuvaiheen taitto, luultavasti tunnustamalla alttiina hydrofobiset pinnat osittain taitettu proteiineihin. Perus mekanismi Hsp90 aiheuttaman proteiinilaskostumisen liittyy konformaation vaihtumisen avoimen ja suljetun konformaation, joka säätelee ATP hydrolyysi [2]. Valuuttojen Hsp90 ATP hydrolyysin ohjataan vuorotellen sen yhdessä eri cochaperones.

Vaikka määrä proteiinien tiedetään vaativan Hsp90 oikean taitto kasvaa edelleen, Hsp90 on selvästi selektiivinen osajoukon solun proteiinien. Näihin kuuluu useita proteiineja, joiden tiedetään olevan kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden, kuten Her2, Raf1 ja Cdk4 [3]. Joissakin tapauksissa Hsp90 näyttää etuoikeutettu yhdessä mutantti, onkogeenisiä muotoja proteiineista; tämä on osoitettu sekä Src ja EGF-reseptorin [4] – [6]. Hsp90 osoittaa myös lisääntynyt yhdessä cochaperones ja korkeammat ATPaasiaktiivisuuden syöpäsoluissa, sekä

in vitro

ja

in vivo

[7]. Näistä syistä on huomattavaa kiinnostusta Hsp90 tavoitteeksi syövän hoidossa.

Geldanamysiini ja radicicol kaksi rakenteellisesti etuyhteydettömille luonnollisia tuotteita, jotka sitoutuvat ATP sitoutumiskohta Hsp90, estää konformationaalista pyöräily, joka on tarpeen sen kaperonitoiminta. Nämä yhdisteet osoittavat hyvää selektiivisyyttä Hsp90, vaikka ne sitoutuvat myös Hsp90 Endoplasmakalvosto paralogi Grp94 ja Hsp90 mitokondrioiden paralogi Trap1 korkeammilla pitoisuuksilla [8] – [10]. Vaikka nämä yhdisteet vahvistaa periaatteessa, että Hsp90 on ”druggable” target peräisin farmakologian näkökulmasta, huono liukoisuus ja epäspesifistä toksisuutta tekevät niistä sopimattomia käytettäväksi ihmisillä. Derivatisoitu versiot geldanamysiinistä on tuotettu jotka ovat parantuneet farmakologiset ominaisuudet, vaikka niillä on edelleen joitakin rajoituksia emoyhdisteen [11]. Tästä huolimatta on näyttöä joidenkin tutkimusten että Hsp90 esto on saavutettavissa, joka perustuu biomarkkereiden analyysiin potilaan lymfosyyteissä [12], [13] ja kasvaimen näytteitä [14]. On myös jonkin verran näyttöä syövän vastaista aktiivisuutta [15]. Äskettäin uusi Hsp90-inhibiittoreita on kehitetty, joilla ei ole rajoituksia edellisen yhdisteitä, ja ne ovat nyt siirtymässä kliinisissä tutkimuksissa [11]. Näiden kehitys farmakologian Hsp90 esto, kriittinen uusi alue tutkimuksessa on tunnistaa subsets syöpäpotilaiden, jotka todennäköisimmin hyötyvät Hsp90 esto.

Keuhkosyöpä on suurin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuinen. Noin 15% keuhkosyövässä ovat alatyypin tunnetaan pienisoluinen keuhkosyöpä. Tämä syöpä yleensä esittelee etäpesäkkeitä ja ei yleensä hoidettu leikkausta. Pienisoluinen keuhkosyöpä yleensä reagoi hyvin säteily- ja kemoterapian aluksi, mutta suurin osa potilaista relapsi vastustuskykyisiä tautia ja kuolevat kahden vuoden kuluessa [16]. Suurin osa pienten keuhkosyövät on neuroendokrii- ominaisuudet ja aktiivisesti erittävät polypeptidihormonien [17]. Nämä eritetyt hormonit aiheuttavat erilaisia ​​paraneoplastic oireyhtymiä, jotka ovat yhteisiä komplikaatioita pienisoluinen keuhkosyöpä.

Tässä olemme tutkineet vaste pienisoluisen keuhkosyövän soluja Hsp90 inhibition. Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että Hsp90-inhibiittorit indusoivat solukuoleman pienisoluisen keuhkosyövän soluja aktivoimalla sisäisen reaktiotien apoptoosin [18]. Meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​tämän, mutta havaitsimme, että solukuolema tapahtuu vain pitoisuuksina huomattavasti suuremmat kuin ne, joita vaaditaan eston sytosolin Hsp90. Huomaamme, että hoitoon pienisoluisen keuhkosyövän solujen Hsp90 estäjiä pitoisuuksina, jotka riittävät estämään sytosolin Hsp90 indusoi ennenaikaisen vanhenemisen sijaan solukuolemaa.

Tulokset

Response ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän solulinjojen Hsp90 inhibition

ihmisen pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja H69 oli kaksivaiheinen vaste hoitoon, joilla on erilaisia ​​geldanamysiini pitoisuudet (kuvio 1A). Vuonna MTT-määritystä, 48 h solujen altistaminen 0,1 uM geldanamysiini laski elinkykyisten solujen määrä noin 40%. Suurempaa geldanamysiinistä jopa 3 uM ei aiheuttanut edelleen vähentynyt elinkelpoisten solujen määrä. Jossa pitoisuudet geldanamysiinistä 4 uM, elinkykyisten H69 solujen laski olennaisesti nolla. Radicicol, toinen Hsp90 estäjä, joka on rakenteellisesti liity geldanamysiinistä, antoi myös kaksivaiheinen annos Vastekäyrän H69 soluja, vaikkakin vähemmän selvästi tasannevaiheen (kuvio 1 B). Kaksi muuta pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat (H187 ja H889), osoittavat myös kaksivaiheinen vaste geldanamysiini (kuvio 1C ja D); mutta U87MG glioblastoomasolulinjan osoitti vain ensimmäinen vaihe tämän vasteen (

eli

. vaihe nähdään pienillä geldanamysiinistä pitoisuuksina) (kuvio 1 E).

, MTT-määritystä H69-solujen käsiteltyjen jossa geldanamysiinistä 48 tuntia; B, MTT-määritystä H69 soluista käsitelty radicicol 48 tuntia; C, MTT-määritystä H187 pienisoluisen keuhkosyövän solut geldanamysiini 12, 36 ja 60 h; D, MTT-määritystä H889 käsiteltyjen solujen geldanamysiinistä 48 tuntia; E, MTT-määritystä U87MG glioblastoomasolua käsitelty geldanamysiinistä 48 tuntia; F, H69 solut käsiteltiin geldanamysiinistä 48 tuntia ja määritettiin elinkykyiset (○) ja yhteensä (•) solumäärät käyttäen Vi-solu XR solujen elinkykyä analysaattorin. Virhepalkit esittävät keskiarvoa ± SE kolme toistoa.

Koska ensimmäinen vaihe voisi mahdollisesti johtua joko soluproliferaation inhibointi tai valikoiva tappaminen osajoukko SCLC-solujen lisäksi määritykset suoritettiin erottaa näiden mahdollisuuksia. Vaste H69 solujen käsittely eri geldanamysiinistä pitoisuudet määritettiin solumäärien käyttäen trypaanisinieksluusiolla erottaa elävät solut kuolleista soluista (kuvio 1 F). Elävien solujen määrä oli myös kaksivaiheinen vaste, kun määritettiin tällä menetelmällä. Yhteensä solumäärät olivat samanlaisia ​​elää solumäärää ensimmäisessä vaiheessa kaksivaiheisesti vastekäyrän mutta poikkesivat toisessa vaiheessa. Nämä tiedot osoittavat, että geldanamysiinistä ensisijaisesti indusoi pidätys H69 soluissa pieninä pitoisuuksina, mutta indusoi solukuolemaa korkeat pitoisuudet. Tiedot kuviossa 1C, jotka osoittavat MTT määrityksiä H187 soluja käsitellään eri aikoja (12, 36 ja 60 h) geldanamysiinistä, ovat yhdenmukaisia ​​tämän päätelmän, sillä ensimmäinen vaihe on vain ilmeinen enää hoitoja, joissa on aika merkittäviä solujen lisääntymisen tapahtuvan valvonnan. Tämä osoittaa myös, että solukuolema suurilla geldanamysiinistä pitoisuuksilla tapahtuu suhteellisen nopeasti (

eli

alle 12 h).

reaktio H69-solujen poistamisen jälkeen Hsp90 eston

Leviämisen pidätys lääkkeellisesti voi olla palautuva tai palautumaton (

eli

vanhenemista-like). Erottamaan näitä mahdollisuuksia, H69-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla geldanamysiini kaksi päivää. Drug poistettiin sitten ja elinkykyisten solujen määrää seurattiin. Soluproliferaatiota talteen käsittelemällä geldanamysiini pitoisuus on 50 nM tai vähemmän. Kuitenkin käsittelyn jälkeen 100 nM geldanamysiini, populaation elävien solujen jäi, että ei lisätä ajanjakson ajan, joka on suurempi yli kolmekymmentä päivää sen jälkeen, lääkkeen (kuvio 2A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kanssa H187 ja H889 pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjoissa (kuvio 2B ja kuvio S1A) ja H69: lla käsiteltyjen solujen kliinisesti merkityksellisiä Hsp90: n estäjä 17-AAG (kuvio 2C). H69 solut vaaditaan vähintään 24 tunnin altistumisen geldanamysiinistä aiheuttaa peruuttamattomia leviämisen pidätys (kuvio 2D) ja induktion peruuttamaton leviämisen pidätys oli vaikuttanut kaspaasi esto (kuvio 2E). Vertailun vuoksi sama koe suoritettiin U87MG ihmisen glioblastoomasolulinjan (kuvio 2F). Nämä solut takaisin kasvu-hoidon jälkeen 100 nM geldanamysiinistä ja myös toipua hoidon kymmenkertaista suurempaa geldanamysiinistä. Jatkuva lisäänty- misen pysähtymisen aiheuttamaa geldanamysiini ei siis ole universaali vaste syöpäsoluja, vaan on syöpä solu- tyypistä.

Soluja käsiteltiin 48 h ilmoitetun pitoisuuden inhibiittorin, joka sitten poistetaan. Elävien solujen laskenta määritettiin sitten ilmoitettuina aikoina jälkeen estäjä poiston. A H69 solut käsiteltiin geldanamysiinistä; B, H187-solut käsiteltiin geldanamysiinistä; C, H69 soluja käsiteltiin 17-AAG. D, H69-soluja käsiteltiin 100 nM geldanamysiini 4, 12 tai 24 h. E, H69-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 100 nM geldanamysiini puuttuessa tai läsnä oli 100 uM Z-VAD-FMK, yleisen kaspaasi-inhibiittori. Z-VAD-FMK käsittely aloitettiin 1 tunti ennen kuin lisättiin geldanamysiini. F, U87MG solut käsiteltiin geldanamysiinistä.

Vahvista kestävää kasvua pidätti Toisessa menetelmässä sisällyttäminen BrdU osaksi H69-soluja, jotka oli altistettu 100 nM geldanamysiinistä arvioitiin myös. Yhdenmukainen elinkykyisten solujen määrää tämä testi osoitti, että H69 solut eivät takaisin niiden proliferatiivista kapasiteettia jälkeen geldanamysiinistä poisto (kuvio 3A).

. H69-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 100 nM geldanamysiinistä. Geldanamysiini poistettiin sitten. Kuusi tai kahdeksan päivän kuluttua lääkkeen poistamiseksi, 25000 käsitellyt solut (GA) per kuoppa maljattiin yhdeksänkymmentäkuusi kuoppaisille levyille yhdessä saman määrän käsittelemättömien H69-solujen vertailua varten (ei GA). Solujen annettiin ottoa BrdU: ssa 16 tuntia ja BrdU-inkorporaatio määritettiin sitten, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset normalisoitiin arvot käsittelemättömissä soluissa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SD kuusi replikaattia. B. Soluja käsiteltiin 48 h geldanamysiinistä. Kokosoluliuotteista sitten kerättiin ja analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita ilmoitettu proteiineja. Alapaneelissa näkyy blot värjättiin yhteensä proteiinia amidomusta- ennen vasta-inkubointia. Yhtä suuret määrät DMSO: ta lisättiin solujen kutakin käsittelyä, lukuun ottamatta äärimmäisenä vasemmalla kaistalla, jossa DMSO jätettiin pois.

Muutokset Hsp90 asiakkaan proteiinien ja lämpösokkiproteiinit vastauksena Hsp90 inhibition

vaikutukset eri pitoisuuksia geldanamysiinistä tunnetuista Hsp90 asiakkaiden arvioitiin myös H69-soluissa (kuvio 3B, oikealla neljä kaistaa blot). Huomattavia ehtyminen Hsp90 asiakkaan proteiinit Cdk4 ja Raf1 nähtiin geldanamysiinistä pitoisuuksina niinkin alhainen kuin 50 nM. Toinen hyvin kuvattu vaste solujen Hsp90 inhibitio on induktio muiden lämpösokkiproteiinien että tapahtuu aktivoimalla Hsf1 [19]. Kuten asiakkaan proteiini vastausten geldanamysiinistä alhaisina pitoisuuksina kuin 50 nM aiheuttama nousu Hsp70, Hsp27 ja Hsp90α /β. Nämä geldanamysiinistä pitoisuudet samansuuntaiset jotka aiheuttavat leviämisen pidätys, mutta ovat noin 100 kertaa pienempi kuin pitoisuudet, jotka aiheuttavat merkittäviä solukuoleman.

U87MG ja H69 soluista osoitti hyvin samanlaisia ​​herkkyyksiä geldanamysiiniin suhteen asiakkaan proteiinia pienenee ja lämmön sokki proteiini lisääntyy (kuvio 3B). Tämä osoittaa, että ero toiminnallisuudessa H69 ja U87MG solujen poistamisen jälkeen geldanamysiinistä ei ole seurausta eroista lääkeainemetaboliaa (

esim

monilääke kuljettajan toimintaa tai diaforaasilla aktiivisuutta, jotka molemmat vaikuttavat geldanamysiinistä toimintaa [20], [21]). Pikemminkin vaikuttaa siltä, ​​että eri vasteet näiden solujen poistamisen jälkeen geldanamysiini johtuvat erot, jotka ovat alavirtaan Hsp90-inhibition. Western blot-analyysi vahvisti, että H69 soluista puuttui havaittavissa p53 (kuvio 3B), kanssa Smith

et al

., Jotka osoittivat, että on pysäkki mutaatio

P53

eksonin 5 tässä solussa line [22]. p16Ink4a oli läsnä H69 soluissa ja sen tasot pysyivät muuttumattomina käsittelemällä geldanamysiinistä 48 tuntia (kuvio 3B).

Vanheneminen merkkiaineiden kasvua pidätettiin pienisoluisen keuhkosyövän solujen

peruuttamaton leviämisen pidätys aiheuttama Hsp90 inhibition pienisoluisen keuhkosyövän soluja viittasi siihen, että nämä solut oli tullut senescent. Tämän arvioimiseksi edelleen ylimääräisiä markkereita vanhenemisen arvioitiin. Kuvio 4A esittää morfologiaa suspension viljelmät käsittelemättömien H69-solujen kahdeksan päivän kuluttua geldanamysiinistä poisto. Käsitellyt solut näkyä laajentumisen ja lisääntynyt soluliman rakeisuus, ominaispiirteet senescent soluja. Toinen yleinen piirre senescent solujen läsnäolo vanhenemista liittyvän heterochromatin pesäkkeitä (SAHF) [23]. Yhdenmukainen senesenssiin induktion inhibitio Hsp90 kanssa geldanamysiini johti muodostumista SAHF on H69-soluissa osoittaa DAPI-värjäyksellä (kuvio 4B). SAHF säilyivät poistamisen jälkeen geldanamysiinistä odotetusti varten vanhenemista merkki ja rikastuneet histoni H3 trimetyloidaan lysiinijäännöksissä 9, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten (kuvio S1B) [24]. Aktivointi DNA-vaurion vaste on tärkeä sekä replikatiivista ja ennenaikaista vanhenemista, joka edistää kasvun pysähtymisen fenotyypin senescent soluihin [25]. Keskeinen piirre DNA-vaurioita vastaus on tuottaa fosforyloidun histoni H2AX (γH2AX) paikoissa viereen DNA-vaurioita. Sekä geldanamysiinistä ja radicicol hoitoja kohonneeseen γH2AX in H69-soluissa (kuvio S1C). γH2AX pysyivät koholla jopa kuuden päivän kuluttua geldanamysiinistä poiston, pisimpään piste arvioidaan (kuvio 4C). Tämä on sopusoinnussa raportit että senescent solut että aktivoitu DNA-vaurioita vastaus pitkään induktion jälkeen Vanheneminen [25], [26].

. H69-soluja käsiteltiin pelkästään DMSO: lla tai 100 nM geldanamysiini 48 tuntia. Geldanamysiini poistettiin sitten. Kahdeksan päivää myöhemmin solujen annettiin laskeutua päälle poly-L-lysiinillä päällystettyihin peitinlaseilla, kiinnitettiin paraformaldehydillä ja valokuvattiin faasikontrastimikroskopialla käyttämällä 63x objektiivilinssin. B. SAHF muodostuminen hoidon jälkeen solujen Hsp90-inhibiittorit. H69-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 100 nM geldanamysiini 48 tuntia. Solut kiinnitettiin sitten, värjättiin DAPI ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. C. H69-soluja käsiteltiin DMSO (kontrolli) tai 100 nM geldanamysiini. DMSO ja geldnamycin poistettiin sitten päivänä 0. kokosoluliuotteista kerättiin ilmoitettuun päivän kuluttua geldanamysiinistä poiston ja analysoitiin γH2AX ja H2AX tasot Western-blottauksella. Kaaviosta densitometrian Western blot analyysit kolmen biologisen rinnakkaista. Data normalisoitiin ajoneuvon käsiteltyjen kontrollisolujen ja esitetään keskiarvona ± SE.

eristäminen variantin H69-solujen, jotka ohittavat geldanamysiini aiheuttama vanhenemista

Vaikka H69-soluja ylläpidetään leviämisen-pidätetty tilassa yli kolmekymmentä päivää sen jälkeen, geldanamysiinistä jälkeen noin neljäkymmentä päivää solupopulaatio teki alkavat lisääntyä yhdessä kokeessa. Olemme nimenneet tämän väestön H69 /41d soluja. H69 /41d soluilla on erilliset morfologia: kun H69-solut ovat ei-adherentteja soluja, jotka muodostavat repaleinen aggregaatteja, variantti-solut, mutta myös ei-kiinnittynyt, muodostaa tiukka aloilla mieleen, joita nähdään kantasolujen populaatioiden (kuvio 5A). Kun uusi koe, nämä solut edelleen tehtiin lisääntymistä pidätys vastauksena 100 nM geldanamysiinistä, mutta pystyivät toipua proliferatiivista kapasiteettia poistettaessa huumeiden, samanlainen kuin mitä me havaittu glioblastoomasoluissa (kuvio 5B). H69 /41d solut pystyivät myös toipua proliferatiivista kapasiteettia käsittelyn jälkeen Hsp90 estäjän radicicol (kuvio 5C). Verrattuna vanhemman H69 solulinja, H69 /41 d-solut osoittivat samanlaisia ​​vasteita Hsp90 eston suhteen leviämisen esto läsnäollessa lääkkeen, vaikka solukuolema oli taipumus esiintyä hieman pienempinä pitoisuuksina kuin nähdään H69-solujen (kuvio 5D). Hajoaminen asiakkaan proteiinien ja induktio muiden lämpösokkiproteiinien oli myös samanlainen kahdessa solulinjassa (kuvio 6A). Kuten edellä, tämä sulkee pois eroja lääkealan jalostus kahden solupopulaatioiden, ja osoittaa, että erot johtuvat tapahtumista myötävirtaan Hsp90-esto, joka kohdistuu nimenomaan onko solut käyvät läpi palautuva tai palautumaton leviämisen pidätyksen. SAHF muodostuminen oli myös heikentynyt H69 /41 d-solut (kuvio 6B). Vuonna H69-soluja, SAHF havaittiin maksimaalisesti noin 35% soluista (kuvio 6C). Sen sijaan geldanamysiinistä hoitoon vain aiheutti lievän nousun SAHF in H69 /41 d-solut ja SAHF havaittiin 4,5% soluista maksimaalisesti (kuvio 6C).

. Valokuvia H69 ja H69 /41d soluja vaiheessa mikroskopian, pienillä (ylälevyissä) ja korkea (alapaneeli) suurennus; B. H69 ja H69 /41d solut käsiteltiin 100 nM geldanamysiinistä 48 tuntia. Geldanamysiini poistettiin sitten ja elinkykyisten solujen arvioitiin ilmoitettuina aikoina sen jälkeen, kun lääkkeen poistamiseksi. C. H69 ja H69 /41 d-soluja käsiteltiin 5 uM radicicol 48 tuntia. Radicicol poistettiin sitten ja elinkykyisten solujen arvioitiin ilmoitettuina aikoina sen jälkeen, kun lääkkeen poistamiseksi. D. MTT-määritystä H69 /41d soluja käsiteltiin 48 h geldanamysiinistä.

H69 ja H69 /41 d-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan geldanamysiinistä tai DMSO vehikkelikontrollina. A. Total solulysaatit kerättiin 48 tunnin kuluttua käsittelystä ja analysoitiin Western blottauksella, kuten kuviossa 3. B. DMSO-käsiteltyjä soluja värjättiin SAHF 2 päivää sen jälkeen, poistamalla DMSO. Geldanamysiini-käsitellyt solut värjättiin SAHF 2, 4 ja 6 päivää sen jälkeen, kun lääkkeen poistamiseksi. Edustavia fluoresenssimikroskopiaan kuvia H69 ja H69 /41 d solutumissa, kuusi päivää sen jälkeen, geldanamysiinistä, näkyvät. C. SAHF in H69 (vaaleanharmaa) ja H69 /41 d-solut (tummanharmaa) laskettiin ilmoitettuina aikoina jälkeen lääkkeen poistamiseksi. Data on ilmaistu prosenttia ytimet, jotka ovat SAHF positiivisia. Bars osoittavat keskimääräinen prosenttiosuus ± SE. D. yhteensä solu-uutteita käsittelemättömän H69 ja H69 /41 d-solut analysoitiin ilmentymistä p21-proteiinin Western-blottauksella.

suoraan arvioida geneettinen suhde H69 solujen H69 /41 d-solut, DNA eristetty sekä solulinjoista ja analysoitiin Affymetrix genominlaajuisten Human SNP Array 6.0 siruja, jotka sisältävät koettimia 900,000 yhden emäksen monimuotoisuus ja saman verran antureista arvioida kopioluvun vaihtelua. Kuvio S2 esittää karyotyyppejä kahden solulinjojen uudelleen tämän datan (kukin on verrattuna Affymetrix viite karyotyyppi). H69 soluilla laaja kromosomimuutokset odotetusti syöpäsoluja. Nämä tappiot, voitot ja alueiden vahvistus /kopioluvun vaihtelu ovat hyvin samankaltaisia ​​H69 ja H69 /41 d-solut, jotka osoittavat yksiselitteisesti, että ne polveutuvat samasta kloonista. Jotkut erot olivat ilmeisiä kahden solulinjojen. Näitä ovat 4,8 Mbp poistamisesta sillä yksi kopio kromosomi 2, joka sisältää noin yhdeksäntoista geenejä ja 9,6 Mbp poisto yhdellä kopio kromosomi 11, joka sisältää noin 83 geenejä. Myös voitto pitkän varren kromosomin 3 ja menetyksen osittaisen pitkän varren kromosomin 15. Kuitenkin SNP /kopiomäärä analyysi ei osoita yhden määrätyn geneettisen lokukseen, joka voisi selittää, miksi H69 /41d solut voisivat välttyä Hsp90 estäjän aiheuttama vanhenemista. Koska toinen lähestymistapa määrittää mekanismia, jolla nämä solut kiertävät Hsp90-estäjän aiheuttama vanhenemista, solut seulottiin useita proteiineja, jotka on aiemmin osoitettu olevan tärkeä rooli vanhenemista. p21 (CDKN1A, p21Waf1 /CIP1) on yksi tällainen proteiini, joka on erityisen kiinnostava, koska se on osoitettu aiheuttavan vanhenemista syövän soluja, joista puuttuu p53 [27]. p21 ilmaistaan ​​H69-soluissa, mutta on huomaamaton H69 /41 d-solut (kuvio 6D). Koska sen tiedossa rooli induktioon ja ylläpitoon vanhenemisen [26], menetys p21 ilmaisun tarjoaa uskottava selitys epäonnistumiselle H69 /41 d-solut tehdään vanhenemista vastauksena Hsp90 estäjiä.

Keskustelu

Aiemmissa tutkimuksissa yleisimmin kuvattuja reaktio syöpäsolujen Hsp90 esto on solusyklin pysähtymiseen. Tämä solusyklin pysähtymiseen on yleisesti oletettu olevan palautuvia luonteeltaan, vaikka useimmat tutkimukset eivät käsitellä tätä suoraan. Kasvu pidätys voi tapahtua joko G1 /S tai G2 /M siirtyminen [28], [29] ja on todennäköisesti seurausta Hsp90 riippuvuus proteiinien kuten CDK4, cdc2 ja polo kaltainen kinaasi [30] – [ ,,,0],32]. Alaryhmässä syöpäsolutyyppien, Hsp90 estäjien on osoitettu indusoivan apoptoosia. Näihin kuuluvat pienisoluinen keuhkosyöpä solut ja useita myeloomasoluja [18], [33].

lisäksi ohimenevä solusyklin pysähtymiseen ja solukuolema, kolmas solu kohtalo syöpäsoluja on vanhenemista. Syöpäsoluja, tämä on joskus kutsutaan ”ennenaikainen” tai ”nopeutettu” solujen vanhenemista sen erottamiseksi replikoituvan Vanheneminen että normaalit solut käyvät läpi päästyään heidän hayflickin raja [34], [35]. Vanheneminen syövässä on tutkittu kahdessa yhteyksissä: ensimmäinen näistä on Vanheneminen nähdään vastauksena onkogeeni aktivointi, jossa se voi olla tärkeä rooli suojella organismien sairastua syöpään; toinen näistä on vastauksena syöpähoitojen [36]. Solunsalpaajiin jotka vahingoittavat DNA näyttävät johtavan vanhenemista paljon suuremmassa määrin kuin aineita, jotka kohdistuvat mikrotubuleiksi [37]. Tämä on todennäköisempää altistuminen pienemmillä annoksilla huumeiden, suuremmilla annoksilla aiheuttaa apoptoosin. Kemoterapian aiheuttama vanhenemista on havaittu sekä soluviljelmässä ja eläinmalleissa [38].

Avain, piirteistä senescent solut ovat, että ne pysyvät metabolisesti aktiivisia, mutta läpikäyvät jatkuvia vetäytymistä solusyklin joka on ei kumota standardin mitogeenisesta ärsykkeitä. Sen jälkeen ohimenevä altistuminen pieniä pitoisuuksia geldanamysiinistä, pienisoluisen keuhkosyövän soluista pysyi elossa ja metabolisesti aktiivisia (kuten trypaanisinieksluusiolla ja MTT määritykset). Kuitenkin nämä solut tehtiin leviämisen pidätys, joka pysyisi yli kolmenkymmenen päivän huolimatta säännöllisen lisättiin uutta väliainetta, joka sisälsi vasikan sikiön seerumia, rikas lähde mitogeenien. Lisääntyminen pidätys oli ilmeinen sekä Live solumäärät ja BrdU määrityksissä.

Lisäksi pysyviä leviämisen pidätys, lisämerkkiaineille vanhenemisen on kehitetty, mutta mikään näistä on nykyisin nähdään lopullinen merkkiaine senescent valtio [39]. Luonteenomaista sarja morfologisia muutoksia on kuvattu senescent soluja, jotka sisältävät solun laajentuminen ja lisääntynyt rakeisuuden solulimassa [40]. Nämä ominaisuudet näkyivät H69 pienisoluisen keuhkosyövän soluja, joissa jatkuva leviämisen pidätys oli indusoitu Hsp90 estäjiä. (Ne eivät näytä litistyminen kuvattu tarttuvien solujen, kuten pienisoluinen keuhkosyöpä solut Tässä tutkimuksessa käytetty kasvaa suspensiossa.) SAHF ovat toinen merkki, joka on yleisesti havaittu senescent soluissa ja joiden ajatellaan olevan rooli ylläpitämisessä senescent fenotyyppi. SAHF oli läsnä pienisoluisen keuhkosyövän soluista, joissa jatkuvan leviämisen pidätys oli indusoitu Hsp90-inhibiittorit. Expression of SAHF säilyi jopa kuusi päivää sen jälkeen, Hsp90 estäjän (pisimpään piste tutkitaan) ja niiden ajallinen niiden ulkonäkö oli edellisiin tutkimuksiin induktion ennenaikaista vanhenemista eri tekijöiden [41], [42] . Aktivointi DNA-vaurioita vastaus on myös yleisesti havaittu Vanheneminen, missä sillä on rooli sekä aloittamisen ja ylläpidon senescent fenotyypin [25], [26]. Hsp90 estäjät (sekä geldanamysiinistä ja radicicol) aktivoitua DNA vaurioita vasteen, joka säilyi jälkeen estäjä poiston. Tämä havainto on myös sopusoinnussa vanhenemista fenotyyppi ja tarjoaa mekanismin, jolla nämä inhibiittorit aktivoivat vanhenemisen merkkejä.

DNA-vaurioita, joko telomeerisesti tai ei-telomeerisiä, on laajimmin tunnettu indusoija vanhenemista. Samoin kuin on merkkiaine vanhenemista, aktivointi DNA-vaurioita vastaus Hsp90-inhibiittorit myös tarjoaa mekanismin, jonka avulla ne indusoivat vanhenemista on pienisoluinen keuhkosyöpä soluja. Aiemmat tutkimukset ovat myös viitanneet yhdyssiteenä Hsp90 ja DNA-vaurioita: sekä telomerase ja Fanconin anemia DNA-vaurioita vastereitissä ovat riippuvaisia ​​Hsp90 niiden toimintaa [43], [44].

Vanheneminen liittyvä β- galaktosidaasi (SAβgal) on myös laajalti käytetty vanhenemista merkki [35]. SAβgal aktiivisuus havaitaan seurauksena laajentamisen lysosomaalisen osaston senescent soluissa, mutta ei tarvita vanhenemista induktioon tai ylläpitoon [45]. Pienisoluinen keuhkosyöpä solut käsiteltiin Hsp90-inhibiittorit eivät olleet positiivisia SAβgal. Adriamysiini myös ei aiheuttanut SAβgal on pienisoluinen keuhkosyöpä solut, kun niitä käytetään pitoisuuksina, jotka indusoitiin tämän markkerin muissa syöpäsolutyyppien. Tämä viittaa siihen, että SAβgal voi olla käyttökelpoinen markkeri vanhenemisen on pienisoluinen keuhkosyöpä. Mahdollinen selitys on, että nämä solut ovat niukat sytoplasmaan ja ovat erikoistuneet erityssoluista, jotka voivat olla suhteellisen pieni lysosomaalisen osaston.

Yhteenvetona todettakoon, että edellä tiedot osoittavat, että Hsp90-inhibiittorit indusoivat jatkuvaa lisääntymistä pidätys, jonka ominaisuuksia sopusoinnussa ennenaikainen vanhenemista. Tämä ennenaikainen vanhenemista esiintyi pitoisuuksilla geldanamysiinistä joka korreloi läheisesti pitoisuuksien tarvitaan aiheuttamaan hajoamisen vakiintunut Hsp90 client proteiineja ja indusoida muiden lämpösokkiproteiinien (yleisesti käytetty markkerina Hsp90 esto). Ennenaikainen vanhenemista indusoitui myös 17-AAG (tanespimycin, 17-allyyliamino-17-demetoksigeldanamysiiniä), joka on geldanamysiinistä johdannainen, joka on testattu kliinisissä kokeissa [46]. 17-AAG aiheuttama vanhenemista pitoisuutena, joka on samanlainen kuin pitoisuudet saavutettiin plasmassa hoidetuista potilaista suurimmalla siedetyllä annoksella tätä yhdistettä [12], mikä viittaa siihen, että tämä vastaus on kliinisesti merkittävä. Vanheneminen induktion Hsp90-estäjien ei vaadi p53 tai Rb, koska molemmat tuumorisuppressoreilla tiedetään mutatoituja H69 solulinjassa käytettiin tässä tutkimuksessa.

Joissakin kokeissa solujen populaatiot ei alkavat kasvaa sen jälkeen, kun pitkän aikavälin kulttuuri senescent H69 soluista. Yksi näistä solupopulaatioiden, nimetty H69 /41 d, luonnehdittiin yksityiskohtaisesti. SNP ja kopioluvun analyysi näistä soluista osoittaa, että vaikka ne ovat selvästi peräisin H69 soluista niillä on selkeitä geneettisiä muutoksia. Nämä solut osoittavat samanlaisia ​​vastauksia Hsp90 esto kuin vanhemman H69 solujen suhteen leviämisen esto läsnäollessa huumeiden ja solukuoleman induktioon suurilla geldanamysiinistä pitoisuuksina. Kuitenkin he läpikäyvät reversiibelin sijaan peruuttamatonta leviämisen pidätys vastauksena Hsp90 esto. H69 /41d solut osoittavat myös identtinen vastauksia emosolulinjan suhteen hajoamiseen Hsp90 asiakkaan proteiinien ja induktio muiden lämpösokkiproteiinien. Siten tämä muoto ”Resistance” hsp90 esto on selvästi erottuu kuvattu aiemmissa tutkimuksissa, joissa vastus oli muutosten vuoksi lääkkeitä metaboloivia entsyymejä ja näkyi vaatimus suurempia annoksia nähdä soluvaikutuksensa [47]. Eristäminen näistä soluista osoittaa, että periaatteessa pienisoluinen keuhkosyöpä solut ylimääräisiä geneettisiin muutoksiin voidaan välttää Hsp90 aiheuttamaa ennenaikaista vanhenemista. p21 (CDKN1A) on aiemmin osoitettu olevan tärkeä säätelijä Vanheneminen, ominaisuus, joka näyttää olevan riippumaton sen inhiboiva vaikutus sykliiniriippuvaisten kinaasien [48]. p21 säätelee sekä p53 ja p53-riippumattomien mekanismien ja voi aiheuttaa sensescence soluissa, joilta puuttuu p53 (kuten on asianlaita H69-solut) [27].