Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maksa etäpesäke on suurin syy kuolla peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin mekanismit tässä prosessissa ovat suurelta osin tuntemattomia. Osteopontiinin (OPN) on erittyvä fosforyloitu glykoproteiini, joka on osallisena kasvaimen muuttoliikettä ja etäpesäke. Rooli OPN syövässä on tällä hetkellä epäselvä. Tässä tutkimuksessa, OPN mRNA tutkittiin kudoksissa CRC, vieressä normaali limakalvo, ja maksan etäpesäkeleesioita käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysillä. Proteiini ilmaus OPN ja sen reseptorit (integriini av ja CD44 v6) havaittiin käyttämällä immunohistokemiallista (

IHC

) menetelmällä. Rooli OPN maksassa etäpesäkkeitä tutkittiin perustettiin paksusuolensyöpä Colo-205 ja SW-480 solulinjat transfektoidaan sense- tai antisense-OPN eukaryoottiekspressio- plasmideja virtaussytometrillä ja soluadheesioanalyysin. Florescence uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP) käytettiin tutkimaan aukko toiminnallisia solujen välisen viestinnän (GJIC) joukossa OPN-transfektoiduissa soluissa. Todettiin, että OPN oli hyvin ilmaistu metastaattinen maksan vauriot CRC verrattuna ensisijaisen CRC kudokseen ja vieressä normaali limakalvo. Ilmaisu on OPN mRNA kasvainkudoksissa merkittävästi liittyvät CRC vaiheisiin. OPN ilmentyminen havaittiin myös normaaleissa hepatosyyteissä ympäröivän CRC etäpesäkeleesioita. Kaksi tunnettua reseptorit OPN, integriini av ja CD44v6 proteiinit, voimakkaasti ilmaistu hepatosyyteissä normaalista maksasta. CRC solut pakotettiin OPN ilme ilmeni kohonneita heterotypic tarttuvuus endoteelisolujen ja heikensi solujen välistä viestintää. OPN on merkittävä rooli CRC etäpesäkkeitä maksaan vuorovaikutuksessa sen reseptorien hepatosyyteissä, vähentynyt homotyyppisessä tarttuvuus, ja parannettu heterotypic tarttuvuus.

Citation: Huang J, Pan C, Hu H, Zheng S, Ding L ( 2012) Osteopontin-Enhanced Maksan metastaasin peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10,1371 /journal.pone.0047901

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 11, 2012; Hyväksytty: 18 syyskuu 2012; Julkaistu: 24 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Natural Science Foundation of China (81102012, https://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang Qianjiang kykyjä hanke (2011R10029; https://kjt.zj.gov.cn/), ja Zhejiang lääketiede tieteellinen tutkimus rahastohanketta (2010ZB073, https://www.zjtcm.gov.cn/) LD. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. Noin 50% CRC potilailla on etäpesäkkeitä maksassa, mutta vain 10% -20% näistä potilaista voi suorittaa kirurginen resektio. 5 vuoden pysyvyys seuraavan resektioleikkaukselle etäpesäkekasvainten on vain 30% -40% [2], [3] kantavassa molekyylitason mekanismit CRC etäpesäkkeitä ei täysin ymmärretä, mutta viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että osteo- (OPN) on tärkeä rooli säätelemällä paksusuolen syöpäsolumetastaasi [4].

OPN on phosphoglycoprotein, joka on alun perin eristetty mineralisoitunutta luuta [5], on myös usein erittävät erilaisia ​​syöpäsoluja, olennaista kasvun ja etäpesäkkeiden rintasyövän [ ,,,0],6], eturauhassyöpä [7], [8], maksan [9], melanooma [10], ja muut tuumorit [11]. OPN signaaleja soluadheesiomolekyylit, kuten integriinit ja CD44 [12], [13]. Gene-profilointi tutkimuksissa on havaittu korrelaatiota kehittynyt ja metastasoituneen Kolorektaalituumorien ja korkea ilmentyminen OPN [14]. Merkittävä vaikutus OPN on metastaattisen potentiaali on matkapuhelinverkon kiinnitys ja siirtymät soluväliaineen proteins22. Kuitenkin toiminnallisten roolien ja taustalla mekanismeja OPN peräsuolen etäpesäkkeitä ei ole tutkittu.

Täällä tutkimme roolia OPN paksusuolen etäpesäkkeitä maksaan ja mekanismeja, joilla OPN edistää paksusuolen syövän metastaattisen aktiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Kasvain yksilöitä 44 tapauksia CRC ja 20 maksan etäpesäke on toinen Affiliated sairaala Zhejiangin yliopistossa saatiin tuoreena kirurginen resektiota kanssa ennen suostumusta. Mediaani-ikä potilailla oli 57 vuotta toimintaa, jotka vaihtelevat 25 84. patologiset ominaisuudet kuten kasvain sijainti, vaihe, ja erilaistumista kirjattiin. Tämä tutkimus on saanut ihmisen tutkimusetiikkaan hyväksyntää eettisen komitean toisen Affiliated sairaala, School of Medicine, Zhejiangin yliopistossa.

Cell Culture

Kaksi peräsuolen adenokarsinooma solulinjoja Colo-205 ja SW480-soluissa saatiin Cancer Institute Zhejiangin yliopistossa ja ylläpidetään RMPI 1640 10% vasikan seerumia, 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Quantitative Reaaliaikainen PCR

kudosnäytteitä snap-pakastaa heti kirurgisen resektion. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen) noudattamalla valmistajan ohjeita. RNA eheys tutkittiin geelielektroforeesin 1% formaldehydiä geeliä. 2,0 ug kokonais-RNA käänteisesti transkriptoidaan yläindeksoi II RTPCR (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin lopputilavuudessa 50 ui, joka sisälsi 1 ui RT-transkriptin, 5 uM kutakin aluketta, 0,5 yksikköä AmpliTaq DNA-polymeraasia (Invitrogen). Sisäisenä positiivisena kontrollina, reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin GAPDH-geenin rinnakkain. Seuraavia alukkeita käytettiin: OPN forward-aluketta 5′-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3 ’; OPN reverse-aluke 5’-TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 ’; GAPDH forward-aluke 5’-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 ’; GAPDH reverse-aluke 5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 ’. OPN-TaqMan-koettimella 5’-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 ’; GAPDH-TaqMan-koettimella 5’-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 ’. PCR-monistukset suoritettiin 96-kuoppaisella reaktion levyn muodossa, ja fluoresenssisignaalit detektoitiin PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Fluoresenssisignaaleita käännettiin C

T-arvot (syklin kynnys, joka vastaa syklin numero, josta merkittävä kasvu fluoresenssisignaali havaittiin ensimmäisen kerran). MRNA: n ilmentymisen OPN = OPN C

T arvo /GAPDH C

T arvo.

PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin. PCR-tuotteet odotetun kokoisia kloonattiin pGEM-T-Easy -vektoriin (Promega) ja sekvenssit Tuloksena saadut plasmidit vahvistettiin.

antisense- ja sense-OPN Eukaryotic Ekspressioplasmidien

jotta obtainan anti-sense-OPN-ekspressioplasmidin, olemme tuottaneet 201 bp: n cDNA-fragmentti (210-368) käyttämällä PCR: ää OPN-alukkeita, kuten edellä on mainittu. cDNA-fragmentti kloonattiin sitten

EcoRI

I -kohtaan pcDNA 3.1 (+). Vastakkaiseen suuntaan Kloonatun cDNA varmistettiin DNA-sekvensoinnilla (vektori on nimetty OPN-antisense).

avoin lukukehys (ORF) OPN saatiin RT-PCR: llä. OPN pohjamaali F: 5′- CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT – 3 ’, R: 5′- CTC CTT TTA ATT GAC CTC AG – 3’. 974 bp: n PCR-tuotteet kloonattiin pGEM-T-easy-vektoriin ja sen molemmat juosteet sekvensoitiin käyttämällä ABI PRISM ™ 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer). ORF OPN kloonattiin sitten eukaryoottiekspressiovektoriin pcDNA 3.1 (+) tuottamiseksi pcDNA 3.1-OPN (ORF). (Vektori nimetty OPN-sense).

Stable Expression Solulinjat

plasmidit OPN-antisense, OPN-sense ja pcDNA3.1 (+) on linearlized kanssa

Bgl ?

ruoansulatus 4 tuntia. DNA-transfektio suoritettiin käyttämällä Superfect Transfection Reagent (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita. 48 h jälkeen, transfektoituja soluja valittiin G418: ssa 3 päivää. Valitut kloonit yhdistettiin ja laajennettiin. Vakiintuneet solulinjat varmistettiin RT-PCR ja Western pultti analyysi.

In situ

mRNA hybridisaatio (

ISH

) B

Spesifiset koettimet täydentävät OPN mRNA suunniteltiin perustuen GenBank J04765 (Human osteopontiiniin mRNA, täydellinen cds). Nämä oligonukleotidisekvenssit on 100% homologia OPN geenin ja minimaalinen homologia muiden nisäkkäiden geenisekvenssien kuin etsitään GenBank jonka räjähdys. DIG RNA Label Kit (SP6 /T7) (Roche) käytettiin tuottamaan sekä sense ja antisense. Parafinoidut leikeltiin 4 μ m. Objektilasit poistettiin parafiini ja käsiteltiin 0,2%: M. HCl: ssa 20 min. Sen jälkeen digestoitiin proteinaasi K: laseja inkuboitiin ennalta hybridisaatioliuosta (joka sisälsi 500 ug /ml poly (A)) 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan kosteuskammiossa. Liuos korvattiin hybridisaatioliuosta (joka sisälsi 0,3 ug /ml sense- tai anti-sense-RNA: n yksisäikeisen koettimen vastaavasti, 50% formamidia, 10% dekstraanisulfaattia, ja 2 x SSC), ja hybridisoitiin 42 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen pestiin 2 x SSC ja 1 x SSC: ssä 15 minuutin ajan peräkkäin, levyt blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia 10 minuuttia, inkuboitiin biotiini-leimattu hiiren anti-digoksiini-vasta-aine 30 minuutin ajan ja sitten emäksinen phosphoesterase -affinitin 30 min. NBT-BCIP käytettiin värjäämään dioja pH 10 substraattipuskuria. Dehydraation jälkeen, levyt asennettiin vesipitoisella asennusainetta (Sigma).

immunohistokemia Analyysi

Rat anti-ihmisen osteo- monoklonaalinen vasta-aine (Chemicon, Billerica, MA) käytettiin

IHC

. Kaikki osiot (5 pm paksu) päässä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokseen lohkoja kiinnitettiin gelatiinilla päällystetty lasilevyille. Parantaa antigeenin altistuminen, levyt käsiteltiin 1 x EDTA 98 ° C: ssa 10 min antigeenin hakea. Levyjä inkuboitiin endogeenisen peroksidaasin blokkausliuoksella estää endogeenisen peroksidaasin, sitten inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (joko anti-OPN hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Akm2A1; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) laimennoksena 1:200, tai integriini a v monoklonaalinen vasta-aine (P2W7; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) laimennoksena 1:200 tai CD44v6 monoklonaalinen vasta-aine (MAB-0038; Maixin, Fujian, Kiina) laimennoksena 1:100) huoneenlämpötilassa 60 min. Sen jälkeen huuhdeltiin Tris-puskuroitu suolaliuos, kalvot inkuboitiin 15 min biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, pestiin ja inkuboitiin sitten entsyymin konjugaattia HRP (piparjuuriperoksidaasi) -streptavidin. Juuri valmistettua DAB (Zymed, South San Francisco, CA) käytettiin substraattina havaita HRP. Lopuksi, diat vasta- värjättiin hematoksyliinillä ja kiinnitettiin vesipitoisen kiinnitysväliaineet.

Soluadheesiokoe

Yksikerroksinen Colo-205-solut ja SW-480-soluja ylläpidettiin Ø 35 mm astiat ja normaali keskisuurten asti 70% -80% konfluenssiin. Liitteenä solut päällekkäin yksikerrossoluissa, sekoitettiin hyvin ja inkuboitiin eri aikoja.

Kelluvat solut kerättiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 10 min, 20 min, 30 min ja 40 min, ja määrä laskettiin hemosytometrillä. Soluadheesion suhde laskettiin sitten: tartunta-suhde = (solujen summa tuomasta suspendoidut solut) /summa näytteen soluja. Homotyyppisessä adheesiomääritys suoritettiin samalla solulinjojen, joista kukin on välillä navan aluksen endoteelisolujen ECV 304-soluja käytettiin vastaavasti heterotypic adheesiomäärityksellä.

virtaussytometria-analyysi

1 x 10

6 /ml solun näytteitä suspendoitiin perusteellisesti PBS: ään, sekoitettiin 20 ul: CD44-FITC-vasta-ainetta, ohjataan 20 ul IgG1 /2a-vasta-ainetta, solun inkuboitiin Ab huoneenlämpötilassa 20 min. Huuhdeltiin PBS, sekoitettu 1% paraformal-telmillä, sitten havaita FAC Scan (BD yritys, Cell Quest TM Versio 3.3 ohjelmisto).

Gap-fluoresenssi uudelleenjakautumista jälkeen Valovalkaistuminen (Gap-FRAP) Menetelmä

Solut 80% konfluenssiin tutkittiin fluoresenssin uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen. Solut huuhdeltiin Hanks (Ca

2+, Mg

2 +), inkuboitiin 15 min 10 ug /ml 5 (6) -carboxyfluorescein diasetaatti (CFDA) 37 ° C, 5% CO

2 . Sen jälkeen huuhdeltiin PBS, solu vieressä muihin soluihin valittiin ja sen fluoresenssi photobleached alle LEICA TCS-SP laser co-keskittyä mikroskooppi (Argonioni lasersäde, 518 nM, Time /lampse ohjelma Valovalkaistuminen ja skannata, fysiologia ohjelmisto kuvien ja data). Digitaalisia kuvia fluoresenssiemissiomittausten viritetään heikko laserpulssien kirjattiin säännöllisin väliajoin 12 min (skannaus ajan 1 minuutti ennen ja jälkeen Valovalkaistuminen) ja varastoitiin myöhempää analyysiä. Kussakin kokeessa yhden leimatun, eristetty solu jäi valkaisematonta referenssinä menetyksestä fluoresenssin johtuvat toistuvista skannauksen ja väriaine vuoto, ja eristetty, valkaistut solu toimi verrokkina.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Parilliset-näytteet

t

testi, itsenäinen-näytteet

t

testi ja yksisuuntainen ANOVA käytettiin. Laskelmat tehtiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistolla.

P

arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

OPN ilmentäminen Ensisijainen CRC, CRC etäpesäkeleesioita Liver, ja normaali kudokset

Based määrällistä reaaliaikainen PCR, C

T-arvot ovat kääntäen verrannollinen log arvo alkuperäiseen kopion numerot kohdesekvenssin. Huomasimme, että OPN mRNA ilmentyi 44 tapausta CRC kudoksissa, mutta eri tasoilla; maksimi C

T arvo oli 1,47 ja pienin arvo oli 0,85, ±

s

= 1,15 ± 0,14. Kun pariksi viereisen normaali näytteitä, suurin C

T arvo oli 1,75 ja pienin arvo oli 0,94, ±

s

= 1.32 ± 0,18. (Pariksi-näytteet

t

testi,

t

= 5,81,

P

= 0,000). OPN mRNA-ekspressio lisääntyi merkitsevästi ensisijainen CRC kudoksessa verrattuna naapurimaihin normaaleissa kudoksissa.

ISH

, positiivinen tahra esittelee sini-violetti mikroskoopilla. OPN mRNA, joka osoittaa positiivista signaalia, löydettiin sytoplasmassa CRC solujen ensisijainen vaurioita (x 400). b, The tahra viereisissä normaaleissa peräsuolen kudoksiin oli negatiivinen (x 400). c, OPN mRNA havaittiin syto- CRC solujen maksan metastaattisen kudosta. Vieressä normaali maksan kudoksissa tahrat negatiivinen (x 100).

20 tutkittiin maksan metastasoituneen kudoksia CRC, maksimi C

T arvo oli 1,30 ja pienin arvo oli 0,92, ±

s

= 1,07 ± 0,10. Verrattuna ensisijainen syöpä, OPN mRNA: n ekspression maksassa metastaattisen kudoksissa oli suurempi (itsenäinen-näytteet

t

testi,

t

= 2,12,

P

= 0,038).

Perustuu Dukes vaiheessa seitsemän yhteensä 44 CRC potilasta oli vaiheessa A ja OPN mRNA tarkoittaa C

T-arvo oli 1,49 ± 0,38, 1,21 ± 0,28 vaiheessa B (17 potilasta), 1,11 ± 0,29 vaiheen C (18 potilasta), ja 0,92 ± 0,32 vaiheen D (2 potilasta). Ilmaisu taso OPN mRNA CRC kudoksissa varhaisessa vaiheessa oli huomattavasti korkeampi kuin mikä jo pitkällä (yksisuuntainen ANOVA,

P

= 0,031).

Sitten käytimme

ISH

analyysi edelleen arvioida OPN mRNA: n ilmentymisen ja lokalisointi. Tässä analyysissä positiivinen näkyy sinisenä-violetti mikroskoopilla. OPN mRNA, joka esiintyy signaalin värjäytymistä, havaittiin sytoplasmassa CRC-solujen sekä ensisijainen vaurioita ja maksan metastaattisen kudosta. Värjäytyminen signaali ei havaittu viereisissä normaalin peräsuolen ja normaali maksan kudoksissa (

Fig. 1

).

Käyttäen immunohistokemiallinen menetelmä, olemme edelleen vahvisti, että OPN ekspressoitiin sytoplasmassa CRC solut sekä primäärivamma ja metastaattinen kudoksiin. Ruskea positiivinen tahroja löydettiin myös normaalissa hepatosyyteissä ympärillä metastaattisen kudosta. Vieressä normaali peräsuolen kudosten näytteillä ei signaalia. Kontrollina OPN proteiinit värjäytyvät normaalissa maksassa kudoksissa ilman CRC etäpesäke

(

Fig. 2

)

.

IHC

, OPN proteiinit (ruskea positiivinen tahra) on lokalisoitu sytoplasmassa CRC solujen ensisijainen leesioita (x200). b Vieressä normaali peräsuolen kudosten olivat negatiivisia (x200). c Positiivinen tahra todettiin sekä CRC-soluissa ja viereisen normaalin hepatosyyteissä maksassa metastaattisen kudoksissa (x100). d Verrokeiksi OPN proteiinit värjäytyvät normaalissa maksassa kudoksissa ilman CRC etäpesäkkeitä oli negatiivinen (x100).

Expression of OPN Reseptorit-integriini av ja CD44v6 värjäytymistä Normaali Hepatosyyttejä

OPN on on esitetty vuorovaikutuksessa useiden eri integriinien kautta RGD-sekvenssin, mukaan lukien a vp3, αvβ1 ja a vp 5. CD44v6 on silmukointimuunnosta CD44 (CD44v) voivat myös sitoutua OPN ja todennäköisesti edistää syöpäsolujen sitoutuminen verisuonten endoteelin ja pohjan kalvoja, sitten lisää ja metastaasit koolonin karsinoomien. Voit tarkistaa nämä reseptorit normaalissa maksassa, me testattiin integriinin αvβ1 ja CD44v6 IHC. Huomasimme, että molemmat integriini αvβ1 ja CD44v6 värjättiin positiivisesti hepatosyyteissä normaalissa maksakudoksissa

(

Fig. 3

).

IHC

, integriini av proteiinit (ruskea positiivinen tahra) on lokalisoitu sytoplasmassa hepatosyyttien (x 400). b, CD44v6 proteiinit (ruskea positiivinen tahra) on lokalisoitu sytoplasmassa hepatosyyttien (x 400).

ilmentyminen CD44 solukalvon virtaussytometrialla

CD44 on tärkeä rooli solu-soluadheesion, solu-alustan vuorovaikutus, lymfosyyttien itseohjautuva ja kasvainmetastaasit. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat ilmentymistä CD44 tietynlaisella kasvaimia liittyy hematogenic syöpäsolujen leviämiseen.

Olemme havainneet CD44 ilmentyminen siirretään solulinjoissa käyttämällä virtaussytometria. Huomasimme, että sen jälkeen kun alas-säätely OPN ilmaisun, CD44 ilme Colo-205-OPN-antisense solukalvojen alennettiin 54,28 ± 0,11-35,35 ± 0,24 Colo-205,

P

0,01. Sen sijaan arvo lisääntyi SW-480- OPN-sense solut, joissa OPN ilmentyminen oli säädelty alkaen 2,65 ± 0,21-33,12 ± 0,15,

P

0,01.

homotyyppisessä ja Heterotyyppisten Cell Adhesion

Soluadheesio on tärkeä tekijä aikana syövän etäpesäke. Irtoaminen syöpäsolujen vanhempiensa kasvaimista on ensimmäinen tapahtuma etäpesäke ja liittyy homotyyppisessä tarttuvuus vähenee. Kun kasvainsolut paeta primaarikasvaimen, ne vuorovaikutuksessa ennestään isäntä tyvikalvoissa klo monipuolinen vaiheissa metastaattisen Cascade. Heterotyyppisten tartunta auttaa syöpäsolujen täydellisen koko prosessin.

havainnut homotyyppisessä ja heterotyyppisten tarttuvuus kyky Colo-205-OPN-antisense ja SW-480-OPN-sense erikseen. Napa aluksen endoteelisolujen ECV 304 käytettiin kohdesoluina heterotypic tarttuvuus. Homotyyppisessä tarttuvuus kyky tehostui jälkeen OPN-antisense transfektion Colo-205, mutta heikensivät SW-480-OPN-sense. Sen sijaan heterotypic tarttuvuus kyky heikensivät Colo-205-OPN-antisense, mutta vahvistui SW-480-OPN-sense.

(tuloksia ei ole esitetty)

.

Gap junktionaalinen Intercellular Communication (GJIC) Gap-FRAP

GJIC koostuu solujen välisen vaihdon matalan molekyylien, ja se on ainoa välineet välinen suora kosketus cytoplasms vierekkäisten eläinsolujen. Häiriöt GJIC on yhdistetty moniin patologisiin tiloihin, kuten karsinogeneesi tai perinnöllinen sairaus [15], voivat myös vapauttamisen helpottamiseksi mahdollisesti neoplastisen solun ohjaava ympäröivän kudoksen, joka johtaa kasvaimen edistämisen [16].

Käytimme kuilu-FRAP mitata GJIC vuonna OPN transfektoiduissa soluissa (SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN) taas Colo-205 olivat puoliksi suspension solut, joita ei ole tarkoitettu tätä menetelmää. Solun signaalin vaihto oli heikentynyt ja GJIC toiminta estyi. Verrattuna kontrolli soluja (vektori transfektoidaan SW-480-OPN soluja, SW-480-pcDNA3.1 (+)), fluoresenssi ei uudelleen hyvin SW-480-OPN-sense solujen jälkeen molemmat 5 minuutin ja 10 minuutin fotobleknande. 5. minuutilla Valovalkaistuminen prosenttiosuus fluoresenssin uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP%) oli 24,65 ± 4,08% vuonna SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN verrattuna 44.74 ± 6,23% vuonna SW-480-pcDNA3.1 (+ ) (

t

= 17,07,

P

0,001), ja sen jälkeen 10 minuutin FRAP% oli vielä inhiboitui 25.98 ± 4,48% vuonna SW-480-pcDNA3.1 ( +) – OPN kun se oli jaettu uudelleen 64.92% ± 5,39% SW-480-pcDNA3.1 (+) solut (

t

= 35,16,

P

0,001) (

Fig. 4

). Nämä tulokset osoittavat, että OPN voi estää GJIC toiminta ja heikentynyt signaali vaihtaa näiden joukossa transfektoitujen SW-480-soluissa.

yhtenäinen fluoresenssin voimakkuutta ennen Valovalkaistuminen SW-480-pcDNA3.1 (+). a2, heikentynyt fluoresenssin voimakkuus jälkeen Valovalkaistuminen SW-480-pcDNA3.1 (+). a3, fluoresenssi uudelleenjako jälkeen 10minutes SW-480-pcDNA3.1 (+). b1, yhtenäinen fluoresenssin intensiteetti ennen Valovalkaistuminen SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN soluja. b2, heikentynyt fluoresenssin intensiteetti jälkeen Valovalkaistuminen SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN soluja. b3, heikko fluoresenssi uudelleenjako jälkeen 10minutes SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN soluja. c prosenttiosuus fluoresenssin uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP%) SW-480-pcDNA3.1 (+) ja SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN soluja. 5. minuutilla Valovalkaistuminen prosenttiosuus fluoresenssin uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP%) 24,65 ± 4,08% vuonna SW-480-pcDNA3.1 (+) -OPN verrattuna 44.74 ± 6,23% vuonna SW-480-pcDNA3.1 (+) (

t

= 17,07,

P

0,001), ja sen jälkeen 10 minuutin FRAP% oli vielä inhiboitui 25.98 ± 4,48% vuonna SW-480-pcDNA3.1 (+ ) -OPN kun se oli jaettu uudelleen 64.92% ± 5,39% SW-480-pcDNA3.1 (+) solut (

t

= 35,16,

P

0,001).

keskustelu

Ihmisen paksusuolen syöpä koskettaa lähes 150000 potilasta ja 60000 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuosittain. Maksa on ensisijainen extra-paksusuolen sivuston CRC etäpesäke ja edustaa yleisintä sijainti ja kliininen esitys uusiutuva sairaus potilailla, jotka eivät locoregioal hoito [17]. On olemassa muutamia kasvainmerkkiaineet että on kliinistä hyötyä hallinnassa CRC etäpesäke. Jopa soveltaminen laajimmin käytetty merkki, carcinoembryoni antigeeni (CEA), on viime aikoina asetettu kyseenalaiseksi [18]. OPN on kandidaattigeeni etäpesäkkeiden CRC. Soveltamisessa geenien ilmentymisen profilointi tekniikka ja yhdistetyn näytteen ilmaisun profilointi [19], [20], OPN on tunnistettu johtavana ehdokkaana kliininen markkeri CRC etenemisen. Siksi tutkittiin miten OPN säätelyssä maksan end-elimen etäpesäke.

Käyttämällä kvantitatiivisen tosiaikaisen olemme varmistaneet, että OPN oli hyvin ilmaistu metastaattinen maksan vauriot CRC verrattuna ensisijaisen CRC kudokseen ja vieressä normaali limakalvo. Lisäksi, ekspression OPN mRNA kasvainkudoksissa merkittävästi liittyvät CRC vaiheessa. Nämä tulokset osoittavat, että OPN on mahdollinen merkki kasvaimen invaasion ja maksan etäpesäkkeiden CRC.

On huomattava, että OPN mRNA havaittiin sytoplasmassa CRC-solujen

in situ

-hybridisaatio, mutta ei niiden vieressä normaalien kudosten tai ympäröivän normaaleissa kudoksissa maksojen. Immunohistokemiallinen määritys osoitti, että OPN-proteiini esiintyy myös luonnollisesti sytoplasmassa viereisen normaalin hepatosyyttien ympäröivän CRC kudoksissa, ja että ilmentyminen OPN proteiinin normaali maksan kudos on negatiivinen. Olemme kuitenkin havainneet kaksi reseptoreihin OPN, integrinαv ja CD44v6, normaalissa maksan kudosta. Sen vuoksi oletamme, että kun CRC kasvainsolut poiketa ensisijainen vaurioita, porttilaskimon, joka on välttämätön circumfluence laskimoon, mahdollistaa sen, että syöpäsolujen läpi maksassa. Kasvainsolut sisältävät OPN voivat kerääntyä maksassa välinen vuorovaikutus ligandin ja reseptorin.

tutkittiin kahden eri solulinjojen roolin tutkimiseksi OPN säätelyssä etäpesäkkeitä. Colo-205-solulinja transfektoitiin OPN-antisense eukaryoottisia plasmidin inhiboimaan OPN-proteiinin ilmentymisen tässä solulinjassa. SW-480-soluja transfektoitiin OPN-sense eukaryoottisia plasmidi siten, että OPN proteiini ilmentyy tässä solulinjassa.

jälkeen solujen transfektion, Colo-205-OPN-antisense-transfektoiduissa soluissa klusteroitu (tietoja ei ole esitetty ), homotyyppistä adheesiota on parannettu näissä soluissa verrattuna Colo-205-pcDNA3.1 (+). Kuitenkin tarttumista heikensivät SW-480-OPN-sense soluja, ja liikkuvuutta on parannettu näissä soluissa, jotka ilmentävät OPN (tuloksia ei ole esitetty). Samaan aikaan olemme tutkineet heterotyyppisten tarttuvuus ECV304 kohdesoluina, heterotypic tarttuvuus heikensivät vuonna Colo-205-OPN-antisense solujen ja vahvistui SW480-OPN-sense soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että OPN vähentää homotyyppistä adheesiota keskuudessa CRC-soluja ja lisää heterotyyppisten tarttumista kyky välillä CRC-solujen ja endoteelisolujen.

Invasion ja etäpesäkkeiden ovat tärkeitä ominaisuuksia pahanlaatuisten kasvainten. Koko prosessi etäpesäkkeiden sisältää angiogeneesiä tarttuvuus, hajoaminen, liike, ja kiinnityksen [21]. Adheesiotekijöitä olennaisesti mukana prosessissa. OPN on luultavasti yksi lukuisista ennustavat tekijät liittyvät etäpesäkkeiden CRC.

Koska OPN, homotyyppisessä tarttuvuus kyky on heikentynyt CRC soluihin ja solut poiketa ensisijainen sivuston helpommin, ja anna verenkiertoa. Ensimmäinen vaihe etäpesäkkeiden on puhkeamista. Kuitenkin, CRC-solut ovat helposti hyökätä ECM (soluväliaineen), kun heterotypic tarttuvuus paranee. Nämä kaksi vaihetta ovat tärkeitä etäispesäkkeiden pahanlaatuinen syöpä.

GJIC on arveltu olevan tarpeellinen, jos ei riitä, biologiset toiminnot metazoan solujen sääntelyä kasvun säätelyn, erilaistumista ja apoptoosia normaalien progenitorisolujen [22 ]. Intersellulaarinen viestintä monissa elimissä säilyy kautta solujen välistä aukkoliitos kanavia koostuu konneksiinit, suuri proteiini perhe useita isoformeja. Tämä GJIC mahdollistaa etenemiselle aktiopotentiaalien (esimerkiksi aivojen, sydämen), ja siirto pienten molekyylien, jotka voivat säädellä solujen kasvua, erilaistumista ja toiminta. Viimeksi mainittu on osoitettu olevan osallisina syövän kasvua: vähennetään GJIC usein liittyy lisääntynyt kasvaimen kasvu tai prosessin de-erilaistumista. Fluoresenssi uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP) annettiin tarkkailemaan elpyminen fluoresenssin intensiteetin valkaistu soluissa ja siten arvioida solujen väliseen viestintään aukkoliitokset.

Tutkimuksessamme fluoresenssi uudelleenjako jälkeen Valovalkaistuminen heikensivät SW-480 – OPN-sense soluissa. GJIC toiminta estyi ja signaalin vaihto oli heikentynyt, joten nämä tuumorisolut helpommin irti ensisijainen vaurioista aloittaa ensimmäisen vaiheen etäpesäkkeiden incidently.

perusteella tutkimukset korreloivat välisiä ilmaus OPN ja etäpesäkkeiden yhdessä asiaa kirjallisuuden solmimme että mahdollinen mekanismi OPN edistää CRC maksa etäpesäke on seuraava: CRC ilmentävät OPN, tasalaatuisuus kiinnittyminen kyky pienenevät, toiminta GJIC estyy, kyky hyökkäyksen ja liike on kasvanut, mikä helpottaa CRC solujen poiketa primäärivamma, päästä liikkeelle ja aloittaa etäpesäkkeiden. Samaan aikaan, koska OPN, ilmentymisen CD44, etäpesäke liittyvä tekijä, on myös lisääntynyt. Heterotyyppisten välistä tartuntaa CRC solujen, ECM ja verisuonten endoteelisolujen paranee. Vuoden porttilaskimon refluence, OPN avulla syöpäsolut hyökätä Ääreisverisuonille, asettuminen ja istutus maksassa. Lisäksi reseptorit OPN, CD44v6 ja integriini av havaittiin maksassa. Vuorovaikutusta ligandien ja reseptorien voisi selittää maksa-takertuvat CRC soluja.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että OPN on yksi tärkeimmistä tekijöistä kasvaimen infiltraatiota ja etäpesäkkeiden. Vaikutus homotyyppisessä ja heterotypic tarttuvuuden CRC soluissa OPN on välttämätöntä prosessissa maksan etäpesäke.

Kiitokset

Olemme kiitollisia Dr. Jiaping Peng ja Dr. Xiaoming Fang arvokkaasta tieteelliset lausunnot tutkimuksen aikana.