Krooninen sairaus

tiivistelmä

Käytimme proteiinin ilmentymisen profiilien kehittää luokitussääntöä havaitsemiseksi ja ennustetekijöiden arviointi virtsarakon syövän mitätöity virtsanäytteistä. Käyttämällä Ciphergen PBS II ProteinChip Reader, olemme analysoineet proteiiniprofiileja 18 paria näytteitä virtsarakkokasvain ja viereisen uroteelin kudos, koulutus sarja 85 mitätöidään virtsanäytteiden (32 valvontaa ja 53 virtsarakon syöpä), ja sokaissut testaus joukko 68 mitätöidään virtsanäytteitä (33 valvontaa ja 35 virtsarakon syöpä). Käyttäen t-testejä, tunnistimme 473 huiput osoittaa merkittävää ero ilmaisun eri luokkiin pariksi virtsarakon kasvain ja vieressä urothelial näytteitä verrattuna normaaliin uroteeliin. Sitten voimakkuudet näitä 473 huippujen tutkittiin koulutus joukko mitätöidään virtsanäytteitä. Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme 41-proteiinin piikkiä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti molemmat näytteet. Ekspressiokuviota 41-proteiinin piikkiä käytettiin luokitella mitätöidään virtsanäytteitä pahanlaatuinen tai hyvänlaatuinen. Tämä lähestymistapa tuotti herkkyys ja spesifisyys 59% ja 90%, vastaavasti, koulutusta asettaa ja 80% ja 100%, vastaavasti, testauksesta asetettu. Proteomiikan luokitussääntöä suoritettiin samanlainen tarkkuus matala- ja korkea-asteen virtsarakkokarsinoomat. Lisäksi käytimme hierarkkinen klusterointi kaikkien 473-proteiinin piikkiä 65 hyvänlaatuinen mitätöity virtsanäytteitä, 88 näytettä potilaista, joilla kliinisesti todettu virtsarakon syöpä, ja 127 näytettä potilailta, joilla on ollut virtsarakon syöpä luokitella näytteet Cluster A tai B. kasvaimet Cluster B leimasi kliinisesti aggressiivista käyttäytymistä huomattavasti lyhyempi etäpesäkkeitä-vapaa ja tautikohtaista säilymiseen.

Citation: Majewski T, Spiess PE, Bondaruk J, Black P, Clarke C, Benedict W, et al. (2012) havaitseminen Virtsarakon syövän käyttäminen proteomiikan profilointi Virtsan sedimenttien. PLoS ONE 7 (8): e42452. doi: 10,1371 /journal.pone.0042452

Editor: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2012; Julkaistu: 03 elokuu 2012

Copyright: © Majewski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institute of Health Avustukset R01 CA 151489 (BC) ja GU SPORE Grant P50 CA91846 (Project 1, BC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: CC alunperin työntekijä Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Kalifornia klo aika alkuperäisen tutkimuksen liittyy tähän hankkeeseen. Tällä hetkellä hän työskentelee toimiston johtaja translaatiotutkimusta The University of Texas M D Anderson Cancer Center. Hänen kuuluminen Ciphergen ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Nykyinen patogeneettisiin käsitteitä olettamus, että yhteinen kasvaimet virtsarakon syntyy sen epiteelin vuori (uroteeliin) kautta kahta erillistä mutta jonkin verran päällekkäisyyttä reittejä: papillaarilihaksessa ja nonpapillary polkuja. [1] Noin 80% kasvaimista, joita syntyy virtsarakon ovat exophytic papillaarisen vaurioita, jotka ovat peräisin hyperplastic urothelial muutoksista. Ne yleensä uusiutua, mutta eivät yleensä hyökätä virtsarakon seinämään tai etäispesäkkeitä. Loput 20% rakkokasvaimista aggressiivisia, nonpapillary karsinoomien Jonka halukkuutta tunkeutuvat ja metastasizing. Invasiivinen virtsarakon syöpien tyypillisesti esiintyy potilailla, joilla ei ollut papillaarinen kasvaimia ja peräisin

in situ

esineoplastiset vauriot vaihtelevat lievästä kohtalaiseen dysplasia (low-grade intraurothelial neoplasia, LGIN) -kar- ja syövän

vuonna situ

(high-grade intraurothelial neoplasia, HGIN). [2] Suurin osa aggressiivinen laadukkaat ei-papillaarinen virtsarakkokarsinoomat läsnä edennyt pitkälle ja edellyttävät kemoterapiaa ja /tai radikaali cystectomy parantaa selviytymistä.

tutkimuksissa biomarkkereiden, virtsarakon karsinooma on ihanteellinen sairaus malli , koska sen kehittymistä ja etenemistä voidaan seurata käyttämällä invasiivisen tai mahdollisimman vähän invasiivisia menetelmiä. [3] virtsarakon limakalvolla voidaan tutkia, ja biopsiat saadaan kautta endoskopiaa. Lisäksi morfologia kuorinnan urothelial solujen ja niiden rakenneosien sekä erittyy tuotteita voidaan tarkastettava virtsaan ilman vaaraa potilaalle.

proteomiikan tekniikoiden, joissa massaspektrometria yhdistettynä ProteinChip Systems on osoitettu helpottamaan proteiini profilointi biologisia näytteitä. [4] – [6] Alustavien havaintojen dokumentointia tunnistaminen seerumin ja virtsan proteiinin sormenjälkien diagnosoimaan useita syöpiä [7] – [9] on seurannut raportit nostamalla huoli ongelmia tutkimuksen suunnittelu, toistettavuus, kalibrointia, ja analyyttisiä menettelyjä [10] – [13].

proteomic profiilia virtsarakon syövän kehittämiseen

in situ

neoplasia kehitettiin kokoelman proteomic spektriä pariksi näytteistä urothelial karsinooma (UC) ja viereisen uroteeli verrattuna normaaliin uroteeliin. Tätä lähestymistapaa käyttäen 473-proteiini huiput ilmentyy normaaleissa uroteeliin havaittu. Samat 473 sittemmin tunnistettu koulutus joukko mitätöity virtsanäytteiden kontrollista koehenkilöillä ja UC. Proteiini huiput Ensimmäinen tunnistettu poikkeuksellisen ilmaistu kudosnäytteistä (suodatus vaihe 1) ja sitten koulutukseen joukko mitätöidään virtsanäytteiden (suodatus vaihe 2) käytettiin suunnitella luokitussääntöä. Suorituskyky luokitussääntöä arvioitiin ensin harjoitussarjassa ja sitten sokea testaus asetettu. Lopuksi, klusterin analyysi suoritettiin käyttäen 473 proteiinia piikkejä kaikissa valvontaa ja UC näytteitä tunnistaa proteomic allekirjoitus aggressiivinen virtsarakon syöpään.

Tässä raportissa esitetään strategia proteiinin profilointiin käyttäen pinta-avusteisen laserdesorp- ja ionisaatio-of-lennon (seldi-TOF) massaspektroskopia muotoilla luokitussääntöä havaitsemiseksi virtsarakon syövän mitätöidään virtsanäytteistä ja luokittelemalla kliinisesti selvä luokat taudin.

(A) Digitalized proteomic profiilia virtsarakon syöpä kehittämiseen

in situ

neoplasia. Ekspressiotasot proteiinin piikkiä analysoitiin pariksi näytteistä viereisistä uroteeliin (AU) ja UCS verrattuna normaaliin uroteeliin (NU). Jokainen sarake edustaa UC tai AU näytteitä ja kukin rivi vastaa digitalisoidun proteiinin piikit on järjestetty mukaan

M /Z

suhteet. Tunnusluvut yksittäisten

M /Z

huippu suhteessa NU on esitetty värikylläisyyden mittakaavassa kuvan alapuolella. Näytteet, jotka vastaavat AU ja UC on ryhmitelty niiden patogeeniset alaryhmiä, jotka edustavat huonolaatuisen (Grade 1-2) pinnallinen papillaarisen UC (LGPUC) ja korkean asteen (Grade 3) invasiivisia UC (HGNPUC). Palkki kuva oikealla näkyy yksittäinen proteiini huiput korkeampi (punainen) ja alempi (sininen) ekspressiotasoja verrattuna NU. Sarake 1: vertailu NU ja AU LGPUC, 2: vertailu NU ja LGPUC, 3: vertailu NU ja AU HGNPUC, 4: vertailu NU ja HGNPUC. (B) proteomiikan profiilia mitätöity virtsanäytteiden verrokeilla (normaali kontrolli, NC) ja potilailla, joilla on UC kahtia osaksi LGPUC ja HGNPUC luokkia. Palkki kuva oikealla näkyy yksittäinen proteiini huiput korkeampi (punainen) ja alempi (sininen) ekspressiotasoja verrattuna NU. Sarake 1: vertailu NC ja LGPUC; Sarake 2: vertailu NC ja HGNPUC. (C) määrä proteiinia huiput korkeampi (kastanjanruskea) ja alempi (violetti) ekspressiotasoja verrattuna NU tunnistettu pariksi kudosnäytteistä AU ja mitätöity virtsanäytteistä sairastavien potilaiden UC verrattuna NC. (D) osuus proteiinien huiput samanlaisia ​​ja erilaisia ​​ilmaisun malli.

Methods

Kasvain ja virtsanäytteet

Kaikki ihmisen kudokset kerättiin wpith kirjallinen suostumus alle protokollia hyväksymä MD Anderson Institutional Review Board ja näytteet analysoitiin anonyymisti. Analysoimme proteiinin ilmentymisen profiilit 18 paria näytteitä virtsarakkokasvain ja viereisen uroteelin kudos, 88 mitätöity virtsanäytteistä potilaista, joilla kliinisesti todettu virtsarakon syöpä, ja 127 mitätöity virtsanäytteiden potilailta, joilla on ollut virtsarakon syöpä (HiUC) eikä kystoskopialaitteita tai patologisen näyttöä (negatiivinen virtsarakon biopsia ja /tai mitätöity virtsan sytologia) virtsarakon syöpä aikaan virtsan keräys. Parittaisin vierekkäisten uroteeliin ja virtsarakon kasvainkudoksen, saimme perustason proteiini profiileja urothelial solususpensioista 13 ureters ei ollut näyttöä urothelial neoplasian aikana poistetun nephrectomy munuaissyövän. Sillä virtsanäytteitä, saimme perustason proteiiniprofiileja 65 terveitä yksilöitä. Profiilit alun perin analysoitiin pariksi näytteitä vierekkäisten uroteeliin ja virtsarakon kasvain kudosta. He olivat sitten verrataan profiileihin tunnistettu alkuperäisen 85 näytteiden virtsan (32 valvontaa ja 53 virtsarakon syöpä) kutsutaan opetusjoukolla. Myöhemmin proteiinit, jotka olivat huomattavasti ylä- tai alassäädetty kummassakin käytettiin diagnostisessa algoritmin ensin opetusjoukolla (n = 85) virtsanäytteiden ja sitten on sokaissut testaus sarja (n = 68, 33 valvontaa ja 35 virtsarakon syöpä). Lopuksi proteomic profiilit kaikista näytteistä (65 terveillä, 88 virtsarakon syöpiä, ja 127 HiUCs) analysoitiin valvomatta klusterointia.

(A) Up säännelty (punainen) ja säädeltiin (sininen) proteiinin piikkiä tunnistettiin AU ja UC (ylärivi) ja mitätöity virtsanäytteistä (mid rivi) ja proteiini huiput johdonmukaisesti löytyy sekä näytesarjaa (alarivi). (B) Lämpö kartan 41 proteiinin piikkiä tunnistettiin suodattamalla vaiheessa 2. (Katso kuva 1) (C) Luokitus yksittäiset näytteet (vasen paneeli) ja ROC käyrä (oikea paneeli) koulutuksessa asetettu. (D) Luokitus yksittäiset näytteet (vasen paneeli) ja ROC käyrä (oikea paneeli) testauksessa asetettu.

intraurothelial esiaste olosuhteissa luokiteltiin rinnakkaisleikkeitä alueilta viereisten limakalvon kuten LGIN tai HGIN . [2] on normaali, dysplastisia tai pahanlaatuisia soluja raaputtamiin viereisistä uroteeliin kudoksesta varmistettiin käyttämällä mikroskooppisia arvioinnin Sytospin valmisteluja. Kasvaimet luokiteltiin kolmen porrastetusti Maailman terveysjärjestön histologisen pisteytysjärjestelmä kasvutapaan (papillaarilihaksessa vs. nonpapillary). [14] syvyys hyökkäys kirjattiin mukaan TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) lavastus järjestelmä. [15] vaihe T

1 (lamina propria hyökkäys) on jaettu T

1a (ei muscularis limakalvoja invaasio) ja T

1 b (muscularis limakalvoja invaasio), joka on huomattavasti suurempi riski etenemisen. [16] kasvaimet kahtia osaksi pinnallinen (T

a-t

1 a) ja invasiivisia (T

1b ja korkeampi) ryhmät, kuten aiemmin on kuvattu. [17]

(A) Yksityisen näytteiden (vasen paneeli) ja ROC käyrä (oikea paneeli), joka perustuu 65 hyvänlaatuinen vertailunäytteet sekä 53 näytettä potilaista, joilla LGPUC. (B) Classificatin yksittäiset näytteet (vasen paneeli) ja ROC käyrä (oikea paneeli), joka 65 hyvänlaatuiset kontrollinäytteistä 35 näytettä potilaista, joilla HGNPUC. (C) Luokitus yksittäiset näytteet (vasen paneeli) ja ROC käyrä (oikea paneeli), joka perustuu 65 hyvänlaatuinen vertailunäytteet sekä 88 näytettä potilaista, joilla UC. (Yhdistetty koulutus ja testaus sarjat) (D) vertailu diagnostinen tarkkuus proteomiikka ja sytologia 39 näytettä potilaista, joilla UC. (E) Yksityisen näytteiden proteomiikka perustuu yhdistettyyn testaus ja koulutus asettaa sekä LGPUC ja HGNPUC erikseen.

Solususpensioita viereisistä uroteeliin ja virtsarakon kasvainkudoksen valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. [16] Lyhyesti, cystectomy näytteitä aikaisemmin hoitamattomista urothelial karsinoomia käytettiin saatuaan tietoon perustuvan suostumuksen potilailta. Kukin cystectomy näyte avattiin pitkittäin pitkin etuseinämän virtsarakon ja puristuksiin alas parafiiniblokkiin. Yksi edustaja -osio keskiosassa selvästi tunnistettu kasvain saatiin Proteomiikan profilointia. Läsnäolo kasvaimen kudoksessa vahvistettiin analyysin avulla jääleikkeitä. Minimoida saastuminen nontumor kudos, me leikellään alueen kasvain kudosta pakastetun kappaleen. Valmistimme urothelial solususpensioista viereisistä uroteeliin kudoksesta kaapimalla limakalvon pinnalla. Puhtaus näytteistä määritettiin kautta cytologic tarkastelu cytospin valmisteiden. Vain näytteet, jotka tuottivat yli 90% mikroskooppisen ehjä normaali, dysplastinen, tai pahanlaatuinen urothelial soluja käytettiin proteiinin analyysiin. Käsittelyä, solut siirrettiin kartiomaiseen putkiin, jotka sisältävät fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Jäädytetty kasvain kudos siirrettiin samanlainen kartiomainen putki, joka sisälsi PBS: ää, joka oli sekoitetaan mekaanisesti vapauttaa kasvainsoluja. Ennen valmistamiseksi solulysaatit, me precleaned solususpensiot kautta Ficoll Histopague-1077j (Sigma Diagnostics, Inc. St. Louis, MO, USA) gradienttisentrifugoinnilla. Varastointiin, solupelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 20% dimetyylisulfoksidia ja jäädytettiin nestetypessä. Mitätöidään virtsanäytteet käsiteltiin samalla tavalla. [3]

ryhmä koostui 65 terveillä (NC), 88 potilaalla on kliinisesti todettu virtsarakon syöpä (UC) ja 127 potilasta, joilla on ollut virtsarakon syöpä (HiUC). Klusterointi suoritettiin käyttäen Euklidinen etäisyys ja matriisi ilmaisun intensiteetit 473 proteiinia huippuja. Kukin pylväs edustaa huokoiset virtsanäyte ja kukin rivi vastaa digitalisoitu proteiinin piikit on järjestetty mukaan

M /Z

suhteissa.

prosessointi virtsanäytteistä päätökseen 1-4 tunnin kuluessa. Virtsan määrä vaihtelivat 10 ja 50 ml. Virtsanäytteet sentrifugoitiin 2500 rpm: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan Dulbeccon modifioitua Eaglen elatusaineessa (DMEM). Uusi kartiomainen putki (50 ml) täytettiin 20 ml: lla DMEM ja 5 ml Ficoll on sijoitettu pohjalle. Virtsan solut siirretään sitten liuoksen pinnalle. Kun oli sentrifugoitu 2500 rpm: ssä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, 10 ml: n ylempi kerros poistettiin, ja liitäntä (~8 ml) ja virtsan soluja siirrettiin uuteen kartioputkeen (25 ml). Näyte sentrifugoitiin jälleen 2500 rpm 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lopuksi solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan DMEM, jossa 10% dimetyylisulfoksidia, ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten.

(A) jakelu mitätöidään virtsanäytteet klusterin A ja B normaalien säätimet (NC), potilailla, joilla on kliinisesti todettu virtsarakon syöpä (UC) ja potilaat, joilla on ollut virtsarakon syöpä (HiUC). (B) jakelu mitätöidään virtsanäytteet klustereissa A ja B mukainen histologinen ja vaihe kahtia osaksi huono laatu invasiivisia pinnallinen papillaarinen UC (LGPUC, pT

a – pT

1 a) ja korkealaatuista kuin papillaarinen UC ( HGNPUC, T

1b ja korkeampi). (C) Kaplan – Mayer koealojen metastaasin ja sairauksien erityisten eloonjäämistä potilailla, joilla on virtsarakon syövän klusterit A ja B

valmistaminen solulysaateista ja proteomiikan analyysi

Solulysaatit valmistettiin kuten kerrotaan Bio-Rad verkkosivustosta. [18] Lyhyesti, näytteet hinattavan, sentrifugoitiin 5000 g: ssä 10 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin (10 mM Tris [pH = 9], 10 mM NaCl, 0,1% dodekyyli mattoside). Proteiini lysaatit valmistaa sonikoimalla käyttäen sonikaattorin (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, USA) asetettiin 5 wattia 10 kertaa 15 sekuntia 45 sekunnin välein, jäillä jäähdyttäen. Yhteensä proteiinipitoisuus mitattiin jokaisen näytteen käyttäen Micro BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Pierce, Rockford, IL, USA). Immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia IMAC3 talteenotto pelimerkkejä (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA) käytettiin proteomiikka-analyysi. Chips aktivoidaan kuparisulfaattia lyhyesti pestiin deionisoidulla vedellä ja inkuboitiin 100 mM natriumasetaattia (pH 4,5) 5 minuutin ajaksi poistaa kaikki ylimääräinen Cu

+2 ja jälleen pestiin deionisoidulla vedellä. Haketta lyhyesti tasapainotettiin soluhajotuspuskurin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan proteiinia lysaateista, joka sisälsi 1 ug kokonais-proteiinin määrä 3-8 ui lyysipuskuria. Ennen lukemista, hake pestiin kolme kertaa hajotuspuskurilla, kaksi kertaa deionisoidulla vedellä, kuivattiin ilmassa, ja kiteytyi 0,3 ui sinapiinihappoa 50% asetonitriili /1% trifluorietikkahappoa. Kaikki valmistelevat vaiheet suoritettiin huoneenlämpötilassa. Proteiini profiilit analysoitiin käyttämällä Ciphergen PBS II ProteinChip Reader (Ciphergen Biosystems Fremont, CA, USA). Ennen mittauksia, järjestelmä oli kalibroitu käyttäen ”all-in-1” standardin Ciphergen Biosystems, ja proteomiikka profiilin normaalin viittaus kudokseen, eli normaalin uroteeli kudoksen tai virtsan sedimentin normaalien yksilöiden, oli testattu.

(A) Protein profiilit välillä 3300 ja 3600 m /z edustavia näytteitä, jotka vastaavat NC, LGPUC ja HGNPUC esittää ekspressiokuviota kolmen proteiinin piikit 3370, 3440 ja 3490 ± 10 m /z tarkoitettua niin huiput 1-3 (pK 1-3), joka edustaa klusterin α-defensiinit. (B) Zoomed lämpö kartan ekspressiokuviota α-defensiini klusteri harjoitussarjassa. (C) Ilmaisulla intensiivisyys α-defensiini klusterin vastaa Pk 1-3 veti näytteitä testausta ja koulutusta sarjaa NC, LGPUC ja HGNPUC. Ristissä punaiset viivat ja pystypalkit edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa. Kaksi näytettä T-testiä käytettiin vertaamaan log2 transformoitujen huippuintensiteetit syövän ja kontrollit määrään kunkin piikin (p 0,001).

arvioimiseksi mittausten tarkkuus, suoritimme useita opinnot. [19] Arvioimme voimakkuudet 26 huippujen 24 toisinto spektrejä samasta näytteestä normaalista uroteeli kudoksesta tarkistaa toistettavuutta (kuva S1). Peak variaatiokertoimet (CV: t) vaihtelivat 13,7%: sta 63,1% keskimääräisestä. Mediaani CV oli 22,7%, ja kvartiiliväli oli 19,4%: sta 27,7%. Testasimme myös herkkyyttä massa-varaus-suhde (M /Z) arvojen määrään kokonaisproteiinista vaihtelemalla kuormitukset 0,5-2 ug, ja M /Z lukemat vaihtelivat alle 1% (tuloksia ei ole esitetty).

Analyysimenetelmät

Kaikki spektrit viety * .xml tiedostoja Ciphergen ohjelmistoa. Raaka spektrit käsitelty MATLAB skriptejä kehitettiin talon (a) poistaa kohinaa, (b) vähennetään matalataajuisen perustason, ja (c) havaita ja mitata yksittäisen näytteen piikit. Denoising ja perusviivan vähennystä suoritettiin käyttäen wavelet kynnystyslohkosta lähestymistapaa. [20] Kun denoising, spektrit normalisoida. Peak havaitseminen hyödynsi keskimääräisen spektrin jälkeen denoising. [21] tietoja kaikista spektrit koottiin matriisin huippuintensiteetit, jossa kukin rivi vastaa tiettyä

M /Z

arvon (huippu) ja kukin sarake vastaa tiettyä näytettä.

Classification tarkkuutta arvioitiin kautta herkkyys ja tarkkuus sekä positiiviset ja negatiiviset ennustearvot. Luokittelu sääntö arvioitiin myös käyttämällä vastaanotin toimii (ROC) käyriä. Vaihteleva parametri ROC-käyrän alla oli välinen kulma päätöksen rajaviiva ja normaali X-akseli: n kulmassa 0 ° siihen, että kaikki näytteet luokitellaan normaalisti, ja kulmassa 90 ° siihen, että kaikki näytteet luokitellaan syövän. Lisäksi mitätöity virtsa spektrit tutkittiin käyttämällä valvomatta klustereiden asteen arvioimiseksi yhdistysten välillä klustereiden ja eri ennusteeseen viittaavia covariates, seuranta mukaan lukien.

Tulokset

analyyttiset käytettävä strategia Tutkimuksemme muotoilla proteiiniprofiili havaitsemiseksi virtsarakon syöpä on esitetty yhteenvetona kuviossa 1. tunnistaa optimaalinen yhdistelmä proteiinia huiput diagnostisten virtsarakon syövän, ensin analysoidaan Proteomisten profiilia sen kehittämiseen

in situ

neoplasiaa ja verrattuna sen proteomic profiilia mitätöity virtsan sedimentin virtsarakon syöpäpotilailla. Tunnistaa proteiinit, jotka olivat poikkeuksellisen ilmaistiin alkupuolella virtsarakon syövän kehitystä, olemme analysoineet malleja niiden ilmaisun 18 pariksi näytteitä virtsarakkokasvain ja viereisen uroteeli kudosten ja vertasi heitä ilmentämiskuviota 13 näytettä normaalin uroteeliin. Ensin valitut piikit, jotka olivat selvästi tunnistettavissa kudosnäytteistä ja käyttää t-testejä tunnistamaan piikit, joilla oli merkittävä ero ilmaisun eri luokkiin pariksi virtsarakon kasvain ja vieressä urothelial näytteitä. Tätä lähestymistapaa käyttäen nimitystä suodatus vaiheessa 1, tunnistimme 473 proteiinia huippuja ilmentyy normaaleissa uroteeliin kudosten ja sarjaa ylös- ja alas-säädellä proteiineja, jotka olivat jonkin verran päällekkäisiä mutta erillisiä, mikä merkitsee kehitystä virtsarakon syövän

in situ

neoplasian kautta papillaarikuvioiden ja nonpapillary polkuja. Koska mitätöidään virtsa sedimenteissä voi olla yhdistelmä kasvain ja ei-kasvainsoluissa, kuten tulehduksellinen, strooman ja ääreisverenkierron solujen sekä nekroottisen solujen degeneroituneille proteiineja, olemme keskittyneet samalla 473 huiput yksilöidyt kudosnäytteistä ja tutkittiin niiden intensiteetti on koulutus joukko mitätöity virtsanäytteiden 53 potilaalla on kliinisesti todettu virtsarakon syöpä ja 32 terveillä henkilöillä. Tässä vaiheessa kutsutaan suodatus vaiheessa 2, etsittiin käyttäen jälleen t-testit, sillä huiput merkittäviä ero ilmaisun välillä syövät ja valvontaa.

Esimerkkejä seldi-TOF-spektri näytteistä normaalista uroteeliin kudosten ja pariksi näytteitä vierekkäisten uroteeliin ja kasvainkudoksen sekä tulokset suodatuksen vaiheessa 1 on esitetty kuviossa 2A. Spektrit alkaen mitätöity virtsasta sedimenteistä virtsarakon syövän potilaiden ja normaalin valvonnan ja tulosten suodatuksen vaiheessa 2 on esitetty kuviossa 2B. Erot proteiinin ilmentymisen profiilit kasvainten tunnistettu kudos- ja mitätöity virtsanäytteet on esitetty yhteenvetona kuvioissa 2C ja D. On selvää, että HGINs tai korkea-asteen nonpapillary urothelial karsinoomat (HGNPUC) on jonkin verran päällekkäisyyttä, mutta erilliset proteiinin ilmentymisen kuvioita, jotka voivat olla havaitsi viereisissä uroteeliin kudokseen. Tämä havainto viittaa siihen, että epänormaali proteiinin ilmentyminen profiileja voidaan tunnistaa pinnalle uroteeliin kudoksen ennen kehittäminen kliinisesti todettu syöpä. Vertaamalla kuvioita poikkeuksellisen ilmaistu proteiinien rakkokasvaimista, niiden vieressä urothelia, ja mitätöity virtsanäytteistä päässä harjoitussetti tunnistimme joukko erillisiä ylä- ja alassäädetty proteiineja, jotka olivat läsnä molemmissa virtsarakkokasvain kudosten ja mitätöity virtsan sedimentin näytteitä virtsarakon syöpä säilyi jälkeen molemmat suodatusvaiheista. (Kuviot 3A ja B).

Käyttämällä vain piikit, jotka kulkivat molemmat suodatusvaiheista, käytimme matriisi 41 proteiinin huippuintensiteetit rakentaa luokitussääntöä yksittäisille näytteille koulutuksessa ja testaus sarjaa. (Kuva 3C) asennot Yksittäisten näytteiden suhteen X (normaali) ja Y (syöpä) akseli määriteltiin käyttämällä paria numerot osoittavat niiden yhteenliittymien kanssa sekä normaalia syöpää proteiiniprofiilit. Tässä luokitussääntöä näytteet korkea yhdistysten normaali proteiiniprofiileja ja alhainen yhdistysten syöpä profiilit ryhmittyneet alueella 1 ja luokiteltiin hyvänlaatuinen. Sitä vastoin näytteissä alhainen yhdistysten normaali sekä suuri assosiaatioita syövän profiilit ryhmittyneet alueella 2 ja luokiteltiin syöpää. Näytteet, joissa yhtä heikkoja tai vahvoja yhdistysten normaali ja syövän profiilit muodostetaan ryhmittyivät alueella 3 ja nimettiin epäselvä. Rajoja Näiden klustereiden määriteltiin käyttäen jätettävissä one-out ristivalidointi.

luokitustarkkuudesta alun perin arvioitiin koulutusta asetettu suhteen herkkyys 0,59, spesifisyys 0,90, positiivinen ennustearvo sisällä opetusjoukolla 0,92, negatiivinen ennustearvo sisällä koulutusta asetettu 0,53, ja ROC käyrä alueella 0,84. (Kuva 3D) Kun määritellään luokittelun sääntö training set me sitten validoitu sen tarkkuuden sokaisi testaus joukko 33 normaalin vertailunäytteet sekä 35 virtsarakon syöpä näytteitä, jotka saatiin herkkyys 0,80, spesifisyys 1,0, positiivinen ennustearvo on testaus joukko 1,0, negatiivinen ennustearvo testauksesta joukko 0,83 ja ROC käyrä alueella 0,91. (Kuva 3D) Tapaukset pidettyjen epäselvä jätettiin laskettaessa herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo ja negatiivinen ennustearvo. Kaikki tapaukset olivat säilytettiin asennusta ROC käyrät.

Jotta voitaisiin arvioida, miten luokitussääntöä perustuu matriisiin 41 proteiinin huippuintensiteetit suoritetaan eri osa virtsarakon syöpä, yhdistimme koulutusta ja testaus sarjaa ja arvioidaan sen diagnostinen tarkkuus huonolaatuisia papillaarinen urothelial karsinooma (LGPUC) ja HGNPUC erikseen. Analyysi 65 hyvänlaatuinen vertailunäytteet sekä 53 LGPUC näytteet tuottivat herkkyys 0,74, spesifisyys 0,95, positiivinen ennustearvo 0,91, negatiivinen ennustearvo 0,84, ja ROC käyrä alueella 0,88. (Kuvio 4A) Samanlaisia ​​analyysi 65 hyvänlaatuinen vertailunäytteet sekä 35 HGNPUC näytteet tuottivat herkkyys 0,77, spesifisyys 0,95, positiivinen ennustearvo 0,90, negatiivinen ennustearvo 0,88, ja ROC käyrä alueella 0,88. (Kuva 4B) analyysi yleistä luokitustarkkuudesta yhdistetyn koulutus- ja testaus sarjaa saatiin herkkyys 0,75, spesifisyys 0,95, positiivinen ennustearvo 0,95, negatiivinen ennustearvo 0,75, ja ROC käyrä alueella 0,88. (Kuviot 4C ja D) analyysi 39 näytettä virtsarakon syöpä, joille rinnakkaisen tiedot tuloksista mitätöidään virtsan sytologia oli käytettävissä osoitti, että luokittelu perustuu proteomic tietoja oikein diagnosoitu 28 (72%) näytteistä, kun taas mitätöityy virtsan sytologia oikein diagnosoitu 19 (49%) näytteistä. (Kuvio 4E) testaaminen ero positiiviset näytteet tunnistetaan proteomiikka ja sytologia käyttäen z-testi mittasuhteet tuotti kaksipuolinen p-arvo 0,032.

valvomaton klustereiden toteutettiin käyttäen Euklidinen etäisyys ja täydellinen linkitys kaikki 65 normaali kontrollinäytteistä, 88 näytettä potilaista, joilla kliinisesti todettu virtsarakon syöpä, ja 127 näytettä potilailta, joiden HiUC. (Kuva 5) Käyttäen matriisi ilmaisun intensiteetin kaikille 473 proteiinia piikit, me luokitellaan näytteet kahteen pääryhmään. Ensimmäinen ryhmä (klusteri A) koostui enemmistö (97%) hyvänlaatuista kontrollinäytteistä. (Kuvio 6A) Toinen ryhmä (klusteri B) koostui 56% näytteistä potilailta, joilla oli kliinisesti todettu virtsarakon syöpä. Mielenkiintoista on, että vain 24% näytteistä potilailta, joilla on HiUC yhteistyössä erillisiä näytteitä potilaista, joilla on kliinisesti todettu virtsarakon syövän klusterin B. Loput 76% näytteistä potilailta, joilla on HiUC ja 44% näytteistä potilailta, joilla oli kliinisesti todettu virtsarakon syövän yhteistyössä erillisiä hyvänlaatuinen kontrollinäytteistä klusterin A. Oletimme, että tämä yhteistyö eriytyminen voi merkitä erillisiä luokkia virtsarakon syöpään ja analysoi patologisen ja kliinisen parametrin näytteiden klustereissa A ja B (kuvio 6B) Cluster koostuu pääasiassa normaali vertailunäytteet (62%), lisäksi 27% LGPUC ja 11% HGNPUC. Sen sijaan, klusteri B käsitti vain 4% normaalista vertailunäytteet 49% LGPUC, ja 47% HGNPUC. Kasvaimet klusterin B oli ominaista huomattavasti lyhyempi etäpesäkkeiden-vapaa ja tautikohtaista eloonjäämisen kuin kasvaimia klusterin A. (kuviot 6C ja D) Kaiken kaikkiaan todennäköisyys kuolla virtsarakon syövän potilaiden klusterin B oli noin 12%, kun taas todennäköisyys kuolla kuin klusterin A oli alle 5%.

Vaikka emme suorita tunnistamista huippujen käytetään luokitussääntöä, käsittelemme niiden potentiaalia luonteen keskittymällä kolmeen näkyvin piikkiä analyysissä käytetyt meidän proteiinin ilmentymisen profiilit. Klusterin kolme proteiinia huiput m /z-arvot todennäköisimmin vastaavat a-defensiinit sisällytettiin luokitussääntöä. [22] – [24] Esimerkkejä SELDI-TOF-spektri profiilien välillä 3300 ja 3600 m /z edustava virtsanäytteistä negatiivisen kontrollin, LGPUC ja HGNPUC kuvaa ekspressiokuviota kolme piikkiä, jotka vastaavat a-defensiinit ja suurennetussa lämmön kartta koulutukseen set on esitetty kuviossa 7A ja B ekspressiokuviota saman proteiinien yhdistetyssä koulutus ja testaus sarjaa osoittaa niiden yli-ilmentymisen LGPUC ja HGNPUC. (Kuva 7C) yli-ilmentyminen kuvio α-defensiinit on suuri merkitys sekä LGPUC ja HGNPUC verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja vaikka asiayhteydestään n 41 anonyymi proteiinin piikkiä käytetään luokitussääntöä nämä proteiinit suorittavat kohtuullisen sekä diagnostisia markkereita (herkkyys 0,77 ja spesifisyys 0,84). (Kuva 7C).

Keskustelu

tutkimuksen suunnittelu Proteomiikan profilointiin koostuu tyypillisesti vertailun proteomic kuvioita näytteitä syöpäpotilaiden ja hyvänlaatuisia kontrollinäytteiden avulla tekoälyä algoritmeja kuten geneettiset algoritmit tai puu analyysi. [25] – [29] Tällainen lähestymistapa yksilöidään rajoitettu määrä anonyymi proteiinin huippujen erotteleva syövän hyvänlaatuinen kudoksesta. Kun tällaisia ​​piikkejä tunnistettiin peptidisekvensoinnilla, niiden osuus yleensä ns akuutin vaiheen proteiineja ennemmin kuin tuumori-spesifisiä tuotteita [28].

Useat tutkimukset käyttäen proteomic profilointi mitätöidään virtsan virtsarakon syövän havaitsemiseen jossa seldi alustan äskettäin julkaistu. [30], [31] Näitä tutkimuksia käytetään erilaisia ​​lähestymistapoja proteiini spektrien analyysi, jotka vaihtelevat käytöstä tekoälyä algoritmeja yhdistettynä valvotun klusterointi yksittäisten huippu ja piikkiryhmän tunnistaminen diagnostisia syrjivä parametreja. [30], [31] Kuten odotettua, automaattinen klusterointialgoritmi erillisiä tarkastuksia syöpään näytteistä suurella herkkyydellä (80%) ja spesifisyys ( 90%) vuonna harjoitussarjassa mutta liittyi voimakas lasku sekä herkkyys ja spesifisyys testauksessa asetettu likimäärin 50% ja 60% vastaavasti. [30] kombinatorisista lähestymistapa yksittäisten biomarkkereiden ja biologisten merkkiaineiden klustereita edellyttäen herkkyys 87% ja spesifisyys 66%, mutta tässä tutkimuksessa ei erillinen koulutus ja testaus näytesarjaa. [31] Mielenkiintoista on, että yksittäisiä merkintöjä Tämän lähestymistavan avulla tunnistetuista sisälsi vastaavat piikit a-defensiini perheen.