Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

erytroblastoosin virus E26 muuttamassa sekvenssit (

ETS

) perheen transkriptiotekijöiden koostuu erittäin konservoitunut joukko geenejä, jotka tärkeä rooli solun lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike ja hyökkäystä. Kromosomitranslokaation fuusioimalla ETS tekijät edistäjille androgeeniresponsiivinen geenejä on löydetty eturauhasen syöpiä, mukaan lukien kaikkein kliinisesti aggressiivista muotoja. ERG ja ETV1 ovat yleisimmin siirtämisellä ETS proteiineja. Yli-ilmentyminen näiden proteiinien eturauhassyövän soluissa johtaa invasiivisten fenotyyppi. Inhibitio ETS aktiivisuuden pienmolekyylisalpaajilla voi tarjota uusi menetelmä eturauhassyövän hoitoon.

Menetelmät ja havainnot

viime aikoina osoittaneet, että pieni molekyyli, YK-4-279 inhiboi biologista aktiivisuutta ETV1 fuusio-positiivisten syöpäsolujen mikä alentaa motiliteetin ja invaasio

in vitro

. Täällä esittelemme dataa

in vivo

hiiren ksenograftimallissa. SCID-beige hiiriin ihon alle istutettiin fuusio-positiivisten LNCaP-luc-M6 ja fuusio-negatiivinen PC-3M-luc-C6 kasvaimia. Eläimiä hoidettiin YK-4-279, ja sen vaikutukset primaarikasvaimen kasvun ja keuhkometastaasitestissä arvioitiin. YK-4-279 hoito johti vähentyneeseen kasvuun primaarikasvaimen vain LNCaP-luc-M6 kohortti. Kun ensisijainen kasvaimia kasvatettiin vastaavia kokoja, YK-4-279 inhiboi kasvaimen etäpesäke keuhkoihin. Expression of ETV1 kohdegeenien MMP7, FKBP10 ja GLYATL2 vähenivät YK-4-279 hoidettujen eläinten. ETS fuusio-negatiivinen PC-3M-luc-C6 -ksenografteja reagoimatta yhdistettä. Lisäksi YK-4-279 on kiraalinen molekyyli, joka esiintyy raseemisena seoksena R- ja S-enantiomeerit. Perustimme että (S) -YK-4-279 on aktiivinen enantiomeeri eturauhasen syöpäsoluja.

Johtopäätös

Tuloksemme osoittavat, että YK-4-279 on voimakas estäjä ETV1 ja estää sekä primaarikasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden fuusion positiivisen eturauhassyöpäksenografteissa. Näin ollen, YK-4-279 tai vastaavia yhdisteitä voidaan arvioida mahdollisesti terapeuttinen työkalu hoitoon ihmisen eturauhassyövän eri vaiheissa.

Citation: Rahim S, Minas T, Hong SH, Justvig S, Çelik H , Kont YS, et ai. (2014) pieni molekyyli estäjä ETV1, YK-4-279, Estää eturauhasen syövän kasvua ja etäpesäke on hiiri ksenograftimallissa. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10,1371 /journal.pone.0114260

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 21, 2014; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2014; Julkaistu: 05 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Rahim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Nämä kokeet olivat lähinnä tuettu avustusta puolustusministeriön congressionally Suunnattu Medical Research Program (PC111510, PI: Aykut Uren, http: //cdmrp.army.mil/). Farmakokineettiset kokeet tukevat Analytical farmakologian ydin Sidney Kimmel Kattava Cancer Center Johns Hopkins (NIH avustukset P30 CA006973 ja UL1 RR025005, ja Jaetut välineen Grant (1S10RR026824-01), https://grants.nih.gov/avustukset /oer.htm). Biacore kokeet tehtiin klo Genomics ja Epigenomics resurssin, jota tukevat CCSG Grant P30 CA051008-16 (Lou Weiner, PI), https://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia edut: USPTO palkitaan YK-4-279 Georgetown University, keksijät kuuluu. Y.K., M.B., J.T. ja A.U. Lisenssisopimus on suoritettu välillä Georgetown University ja Tokalas Inc näistä patenteista, joissa J.T. on perustajajäsen osake haltija. Georgetown University on patenttihakemuksia on YK-4279 sekä niihin liittyviä yhdisteitä ja johdannaisia ​​näiden molekyylien. Alla on yhteenveto liikkeeseen ja vireillä olevaa patenttihakemusta, jotka liittyvät näiden yhdisteiden. I. ”kohdentaminen EWS-FLI kuin kasvainhoitojen” (GU viite 2006-041) 1. US Väliaikainen soveltaminen (60/877856), jätetty 29. joulukuuta 2006. 2. PCT /US07 /089118 jätetty 28 joulukuu 2007 . 3. USA väliaikainen soveltaminen (61/177932), jätetty 13. toukokuuta 2009. 4. USA: n väliaikaisesta 12/494191 jätetty 29 kesäkuu 2009 ((CIP) etuoikeuden sekä PCT ja Yhdysvaltojen väliaikaisesta sovellusten kansallinen vaihe tulo PCT); myönnetty US-patentti 8.232.310. 5. USA: n väliaikaisesta 12/720616 jätetty 09 maaliskuu 2010 (CONT). 6. Eurooppa +07872364,0 jätetty 28 joulukuu 2007 (kansallinen vaihe tulo PCT). 7. Kanada 2711003 jätetty 28 joulukuu 2007 (kansallinen vaihe tulo PCT). 8. Australia 2007341977 jätetty 28 joulukuu 2007 (kansallinen vaihe tulo PCT). 9. Yhdysvallat Väliaikainen 61/405170 jätetty 20 lokakuu 2010 (sisältää lisätietoja). 10. Eurooppa +13186704,6 jaettu Euroopan +07872364,0 etusijalle 28. joulukuuta 2007. II. ”Menetelmät ja koostumukset Hoitoon Ewingin sarkooma Family of kasvaimia” (GU viite 2012-019) 1. US väliaikainen patenttihakemus 61/623349 jätetty 12. huhtikuuta 2012. 2. Patenttiyhteistyösopimus PCT /US2013 /036234 jätetty huhtikuun 11. 2013. III. ”Menetelmät ja koostumukset syövän hoitamiseksi” (GU viite 2014-012) 1. US väliaikainen patenttihakemus 61/895308 jätetty 24. lokakuuta 2013. Kaikki tiedot käsikirjoitus ovat vapaasti käytettävissä. Tekijät myöntävät ja noudata PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kromosomi Toisiintumisreaktio yhteisen mekanismin ajo onkogeneesiin vuonna sarkoomat ja hematologiset maligniteetit [1]. Äskettäin fuusiot johon erytroblastoosin virus E26 transformoivan sekvenssit (

ETS

) perheen transkriptiotekijöiden on löydetty eturauhassyövän kasvaimissa [2].

ETS

perheen transkriptiotekijöiden on erittäin konservoitunut ryhmä geenejä kuuluu 27 jäsentä, joista monet on osoitettu tärkeitä rooleja taudin aloittamista, etenemistä, erilaistuminen, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi [3] [4]. ETS-proteiinien on merkitsevää homologiaa toistensa kanssa ja ne sisältävät C-terminaalisen

ETS

-domeenin, joka on osallisena DNA: ta sitovista ja N-terminaalinen PNT domeeni osallistuu proteiini-vuorovaikutuksia [5]. Kromosominen uudelleenjärjestelyt, joihin liittyy ETS tekijät eturauhassyövän soluissa asettaa ne suoraan sääntelyyn androgeeniresponsiivinen geenin promoottorit, aktivoiden niiden ilmentyminen vasteena Androgeenit. Toisin kuin proteiini tuotteet kromosomitranslokaation on leukemiat ja sarkoomat, geeni uudelleenjärjestelyjä eturauhasen syöpä ei luoda kimeerisiä fuusioproteiineja. Sen sijaan useimmat kromosomitranslokaation ja geeni uudelleenjärjestelyt joihin ETS tekijät eturauhassyövän tulos ilmentymisessä täyspitkä tai lähes täyspitkää ETS proteiinit.

Translokaatioita joihin ERG ja ETV1 muodostavat suurimman ETS uudelleenjärjestelyjä löytyy eturauhassyövän . Ottaa huomioon, että ERG on pääasiassa fuusioitu TMPRSS2-promoottori, ETV1 voidaan järjestellä uudelleen kanssa 5′-alue useiden geenien, kuten TMPRSS2, SLC45A3 ja HNRPA2B1 [2], [6].

ETV1

translokaatiota johtaa ilmentyminen täyspitkän tai N-terminaalinen katkaistu ETV1 [7]. Yli-ilmentyminen ETV1 hyvänlaatuisen eturauhasen epiteelisolujen solulinjoja johtaa induktioon osajoukko geenien muuttoliike ja invaasiota [6]. ETV1 myös lisää ekspressiota AR kohdegeenien, sekä geenien steroidien biosynteesissä ja aineenvaihduntaa. Yhteistyö muiden kasvaimia synnyttävän tapahtumia, kuten PTEN menetys, altistaa ETV1 ilmentävät eturauhasen solujen kehittyä aggressiivisempi sairautena [8], [9]. Tutkimukset hiirimalleissa viittaavat siihen, että ETV1 ilmaisu on perimmäinen syy eturauhassyövän aloittamista. ETV1 siirtogeenisiä hiiriä kehittää eturauhasen intraepiteelisen neoplasia. Lisäksi yhdistyminen ETV1 ilmaisu on ennestään genomista vaurioita, kuten PTEN menetys, johtaa kehitys invasiivisia adenokarsinooma [10], [11].

raportoi äskettäin, että YK-4-279, estäjä EWS-FLI1 onkoproteiinin in Ewingin sarkooma, estää myös ERG ja ETV1 aktiivisuus eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

, mikä vähentää muuttavien ja invasiivisia fenotyyppien [12], [13]. Pohjautuu ennen

in vitro

tutkimuksia, testasimme antimetastaattisia kykyä YK-4-279 in hiiren ksenograftimallissa. Eläimet käsiteltiin YK-4-279 oli vähensi kasvainten kasvua ja vähentää etäpesäke kasvaimen ensisijainen sivuston keuhkoihin. Osoitamme myös, että vaikutukset YK-4-279 on ETV1 ja eturauhassyövän solulinjoissa ovat enantiospesifisen ja (S) -YK-4-279 enantiomeeri on aktiivinen komponentti vahvistaa samanlaisia ​​havaintoja muiden kasvainten mallit [14].

tulokset ja keskustelu

YK-4-279 on pieni molekyyli antagonisti ETV1

keskityttiin aluksi vaikutuksia arvioitaessa YK-4-279 kasvaimen etäpesäkkeitä

vuonna -vivo

, koska meidän

in vitro

kokeet eturauhassyöpäsolulinjoissa ehdotti, että se pääasiallisesti estää liikkuvuutta ja hyökkäys [13]. Voit testata tehokkuutta YK-4-279

in vivo

, käytimme hiiren ksenograftimallia [15], [16]. LNCaP-luc-M6 ja PC-3M-luc-C6 eturauhassyöpäsolulinjoissa muodostetaan stabiili transfektio vanhempien LNCaP-ja PC-3-solujen kanssa ilmentävää vektoria lusiferaasigeeniin. Solut injektoidaan subkutaanisesti alapuolella selkä kylkeen 8-10 viikkoa vanhoja SCID /beige uroshiirillä. Keuhkometastaasitestissä voidaan nähdä jo 6-7 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen näillä eläimillä [15], [16].

aiemmin osoitettu, että esto ETV1 biologinen aktiivisuus LNCaP-soluissa johtaa laski invaasio ja muuttoliike vaikuttamatta kasvu kulttuuri [13]. Solulinjat käytetään nykyisessä tutkimuksessa olivat kaupallisesti hankittu muusta lähteestä kuin aiemmissa työn ja tehtiin selektiivinen paine saada vakaa lusiferaasi ilmentävien kloonien. Ensin validoitu vaikutusta YK-4-279 näihin soluihin ennen kuin jatkat

in vivo

malleja. LNCaP-solut sisältävät geneettistä translokaatio, jossa koko ETV1 lokus on asetettu viimeisen intronin prostataspesifisen MIPOL1 kromosomi 14. varmistimme läsnä ETV1 translokaatio LNCaP-luc-M6-soluissa genomista DNA: ta PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka reunustavat rekombinaatiokohta (Fig. 1a). ETV1 uudelleenjärjestely oli yksinomaan LNCaP-luc-M6-soluissa ja ei ole läsnä PC-3M-luc-C6-soluissa. Näin ollen PC-3M-luc-C6-solulinja valittiin negatiivisena kontrollina meidän tutkimuksia.

a) Genomi-DNA: ta eturauhasen solujen analysoitiin ETS uudelleenjärjestelyn tila suorittamalla PCR käyttämällä uudelleenjärjestelyä alukkeita. LNCaP-luc-M6-soluissa kanna ETV1 uudelleenjärjestely taas PC-3M-luc-C6 solut fuusio-negatiivisia. b) LNCaP-luc-M6-soluja käsiteltiin 1 uM YK-4-279 48 tuntia ja ETV1 kohdegeenin tasot arvioitiin reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää. YK-4-279 hoito johti vähentynyt geenin ilmentyminen MMP7, MMP13, GLYATL2 ja FKBP10 ilman merkittävää vähenemistä ETV1 tasoilla. *; p 0,01, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä. c) LNCaP-luc-M6 ja PC-3M-luc-C6 oli esikäsitelty 1 uM YK-4-279 48 tunnin ajan. Sähköinen impedanssi, joka perustuu Kemotaksismääritys tarkkailuun käytettiin solujen vaeltamiseen, kun läsnä on YK-4-279 kohti alempaa kammion 10% FBS kaltevuus. YK-4-279 esti migraation LNCaP-luc-M6, mutta ei PC-3M-luc-C6-soluissa. *; p 0,005, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä. d) Motilities solujen lopussa 24 tunnin aikana laskettiin perustuen niiden solujen suhteellisen indeksin arvot. *; p 0,01, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä.

Käsittelimme LNCaP-luc-M6 solujen sub tappavan annoksen (1 uM) YK-4-279 48 tuntia ja arvioitu endogeenistä ETV1 kohdegeenien reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. Keskityimme tunnettujen ETV1 tavoitteet, jotka osallistuvat eturauhasen synnyssä [17] – [19]. Altistuminen LNCaP-luc-M6-soluissa 1 uM YK-4-279 johti merkittävästi vähentää mRNA-tasojen useita ETV1 kohdegeenien, kuten MMP7, MMP13, FKBP10 ja GLYATL2, vaikuttamatta ilmentymisen ETV1 (Fig. 1b).

Seuraavaksi suoritetaan sähköinen impedanssi-pohjainen kemotaksista sen määrittämiseksi vaikutukset YK-4-279 on motiliteettia LNCaP-luc-M6 ja PC-3M-luc-C6-soluissa. Tässä tekniikassa käyttämällä Boyden jaoston kaltainen setup mikroelektroniikan anturit yhdistelty mikroreikäiseen polyeteenitereftalaatti (PET) kalvo. Anturit tallentaa sähköisen impedanssin kuin solut siirtyvät ylemmästä kammiosta, kalvon läpi, ja pohjalle kammioon vastauksena kemoattraktantti. Tämä tekniikka mahdollistaa reaaliaikaisen seurannan solumigraation lisääntymiseksi sähköisen impedanssin korreloi yhä useammat siirtynyt solujen alaosaan. YK-4-279 hoitoon LNCaP-luc-M6-soluissa johti merkittävä lasku solujen vaeltamiseen, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu motiliteettia negatiivisen kontrollin solulinjaan, PC-3M-luc-C6 (Fig. 1 c ja 1d). Nämä havainnot vahvistivat, että kaupallisesti saatavilla LNCaP-luc-M6 ja PC-3M-luc-C6-soluissa oli sama fenotyyppien ja YK-4-279 vasteen profiileja kuten LNCaP ja PC-3-solut, jotka käytimme aiemmissa tutkimuksissa.

YK-4-279 kasvaimen kasvu estyy

in vivo

YK-4-279 hoito kokeet tehtiin kahdessa eri muodossa: 1) varhainen Hoitokokeissa jossa YK-4 -279 anto aloitettiin seuraavana päivänä ksenograftin istutuksen. 2) Late Hoitokokeissa jossa YK-4-279 annon jälkeen alkanut ensisijaisen ksenograftissa kasvain saavutettu ilmeni selvänä koko (-200 mm

3). Nämä kaksi lähestymistapaa pystyimme arvioimaan vaikutuksia YK-4-279 kasvaimen ylös ottaa, kasvu ja keuhkojen etäpesäke sekä ennen muodostamista vakiintuneet kasvainten sekä jälkeen kouraantuntuva kasvainten muodostumisen.

Olemme perustettu eturauhasen ksenografteissa by ihon alle ruiskuttamalla LNCaP-luc-M6 tai PC-3M-luc-C6 solujen selkäpuoli kylkeen SCID /beige hiiret. Varhaisessa hoitotutkimuksessa aloitimme vatsaonteloon huumehoitoon 75 mg /kg YK-4-279 tai ajoneuvon hallinnan ylihuomenna tuumorisoluinjektion. Eläimet käsiteltiin 3 kertaa viikossa ja kasvainten mitattiin viikoittain. Tutkimus lopetettiin 14 viikon jälkeen, että LNCaP-luc-M6 ryhmä ja 6 viikon PC-3M-luc-C6 ryhmä johtuen suhteellisen nopeampi kasvuvauhti PC-3M-luc-C6-soluissa. Vaikka vain 4 13 hiirtä, jotka injektoidaan subku- LNCaP-luc-M6 soluja ja käsiteltiin YK-4-279 kehittynyt kasvaimia, jyrkässä ristiriidassa, 9 13 eläinten vehikkelikontrolliryhmään kehittyi kasvaimia. Tällaista eroa ei ollut läsnä fuusio-negatiivinen PC-3M-luc-C6 kohortti (Fig. 2). Eläimillä, joka kehittyi kasvaimia, oli merkittävä pieneneminen kasvaimen kokoon YK-4-279: lla hoidetussa ryhmässä verrattuna DMSO-kontrollin. Kasvaimen koon pienentyminen oli läsnä vain LNCaP-luc-M6 ryhmä ja ei havaittu PC-3M-luc-C6 ksenografteissa (Fig. 3a). Meidän ennen

in vitro

tutkimukset osoittivat, että ETV1 esto YK-4-279 johtaa vähentyneeseen liikkuvuuteen ja invaasio vaikuttamatta solujen kasvua ja selviytymistä. Siksi emme odota nähdä eroa kasvaimeen tai primäärikasvain kasvu näillä eläimillä. Varhainen hoito koe suunniteltiin mittaamaan keuhkojen etäpesäkkeiden ja kaikki eläimet tapettiin ennalta määrätyssä päätepisteen (6 viikkoa PC-3M-luc-C6 ja 14 viikon LNCaP-luc-M6) sato kudoksiin tarkempaa analysointia.

Eturauhasen -ksenografteja perustettiin ihon alle ruiskuttamalla solujen alapuolella selkä kylkeen 8-10 viikkoa vanhoja SCID /beige uroshiirillä. Eläimiä hoidettiin 75 mg /kg kehon painoa YK-4-279 kolmesti viikossa, alkaen päivänä sen jälkeen, kun ksenografti injektioita. LNCaP-luc-M6 eläimiä hoidettiin yhdisteellä näkyvissä vähentynyt kasvainten muodostumiseen (4/13) verrattuna ajoneuvon ohjaus (9/13). PC-3M-luc-C6 eläimistä ei osoittanut merkittävää eroa kasvainmuodostusta välillä yhdistettä käsitellään (12/13) ja ajoneuvon hallinnan (13/13) eläimet. *; p 0,05, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä.

a) SCID /beige hiiriin injektoidaan subku- LNCaP-luc-M6 tai PC-3M-luc-C6 solujen alapuolella selkä kylki. Varhaisessa hoidossa Study Group, eläimiin injektoitiin 75 mg /kg YK-4-279 alkaa päivä jälkeen ksenograftin injektion. b) Toinen joukko eläinten alkoi vastaanottaa YK-4-279 hoito, kun kasvaimia kouraantuntuva (-200 mm

3). Nämä eläimet jaettiin edelleen sisään 2 erillistä ikäluokat: yksi ryhmä hoidettiin kolme kertaa viikossa 75 mg /kg YK-4-279 (myöhäinen hoitotutkimuspopulaatioon pieni annos). c) Toinen ryhmä käsiteltiin 5 kertaa viikossa 150 mg /kg yhdistettä (myöhäinen hoitotutkimuspopulaatioon suuri annos). Tuumoritilavuudet mitattiin viikoittain. YK-4-279 vähensi kasvainten kasvua LNCaP-luc-M6 eläinten, mutta ei PC-3M-luc-C6 eläimiä. *; p 0,01, **; p 0,001, ***; p 0,0001, N.S. .; ei-merkitsevä.

Myöhään hoitotutkimuksissa alkoi ksenografti istutusta ja lähellä seurata. Kun eläimet osoittivat ilmeni selvänä kasvain (-200 mm

3), ne satunnaistettiin YK-4-279 ja ajoneuvon hallinnan (DMSO) ryhmät. Loppupiste myöhäistä hoitotutkimuspopulaatioon valittiin primaarikasvaimen koko saavuttaa 2 cm

3 kaikissa ryhmissä niin, että metastaattinen taakka ryhmien välinen voitiin arvioida yhtä primäärikasvain koko kaikissa ryhmissä. Lisäksi myöhäinen hoito tutkimus toistettiin kahdesti kahdella eri YK-4-279 annoksilla 75 mg /kg YK-4-279 kolme kertaa viikossa ja 150 mg /kg YK-4-279 viisi kertaa viikossa.

Ensisijainen kasvaimen kasvu oli merkittävästi vähentynyt lopulla hoidossa tutkimuksessa sekä (Fig. 3b ). Tämä ero on parantunut, kun lääkkeen annostusta ja lisättiin (Fig. 3c). Vuonna Suurannosryhmän kuitenkin eläimet alkoivat osoittaa merkkejä hyperventilaatio ja uneliaisuus, kehotukset annoksen pienentäminen 150 mg /kg 4 päivää viikosta toiseen 4 ja 3 päivää viikossa viikon 8 jälkeen lääkehoito ei vaikuttanut kasvuun fuusion nopeus-negatiivisten PC-3M-luc-C6 ksenografteissa kummallakaan annoksella.

ryhmä primaarikasvaimen näytteet arvioitiin myös histopatologisia parametrien (Fig. S1). Alueet tuumorinekroositekijän tunnistettiin H p 0,05, **; p 0,005, ***; p 0,0001, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomalla Studentin t-testiä.

Sitten suoritetaan sama lusiferaasianalyysissä keuhkoihin ja ksenografti kuljettaa hoidettujen eläinten YK-4-279 tai ajoneuvon hallinnan. Kaikissa 3 kokeita (varhainen hoito tutkimus, myöhäinen hoito tutkimus pienellä annoksella, myöhäinen hoito tutkimus korkea annos), yhdiste hoito johti merkittävään vähenemiseen keuhkometastaasitestissä LNCaP-luc-M6 vierassiirrettä eläimiä, mutta ei PC-3M-luc- C6 eläimiä (Fig. 4c). Käytimme myös PCR-määrityksessä määrällisesti keuhkometastaasitestissä myöhään hoidon tutkimus suuren annoksen kohortin käyttäen ihmisen spesifisiä alukkeita ribonukleaasi P RNA komponentin H1 (RPPH1) ja hiiren spesifisiä alukkeita, jotka tunnistavat transferriinireseptori geenin (TFRC). Tämä määritys vahvistaneet aikaisempien havaintojen paljastava vähensi keuhkojen etäpesäke YK-4-279 käsitellyn LNCaP-luc-M6 ryhmä (Fig. S4) ja validoitu että lusiferaasin mittaamiseen keuhkokudoksessa oli luotettava menetelmä. Kahdessa kokeessa (varhainen hoito tutkimus ja myöhäinen hoitotutkimuspopulaatioon korkea annos), keuhkot kerättiin LNCaP-luc-M6 vierassiirrettä eläimiä, jotka näytetä vähensi primäärikasvain koot hoitoryhmässä ajankohtana kudoksen hankinta (Fig. 3a ja Fig. 3c ). Näin ollen on mahdollista, että erot keuhkometastaasitestissä voi olla suoraa seurausta pienemmät kasvainten hoidossa ryhmissä. Kuitenkin myöhään hoitotutkimuspopulaatioon matalan annoksen ryhmässä oli samanlainen primaarikasvaimen tilavuudet (2 cm

3), kun kudokset kerättiin eläimistä (Kuva. 3b). YK-4-279 keuhkojen etäpesäke näillä eläimillä samoin, mikä viittaa siihen, että lääkehoitoa vaikuttaa tuumorietäpesäke estämällä ETV1 aktiivisuutta, joka on riippumaton ensisijaisen kasvaimen koon.

arvioitiin myös ETV1 kohdegeenin ilmentymisen primaarikasvaimia upon YK-4-279 hoitoon. ETV1 esto YK-4-279 vähensivät MMP-7, FKBP10 ja GLYATL2 ilme, vaikuttamatta ETV1 ekspressiotasoja (Fig. 5a ja Fig. 5b). Voit selvittää erot lääkevaste välillä LNCaP-luc-M6 ja PC-3M-luc-C6 eläimillä on tekijä ero kasvaimen tunkeutuminen yhdisteen välillä ikäluokat, mittasimme pitoisuus YK-4-279 plasmassa ja eläinten kasvaimissa sen jälkeen, kun viimeinen annos YK-4-279. LNCaP-luc-M6 hiirillä näkyy keskimääräinen pitoisuus on 106,9 ± 64,1 ng /ml YK-4-279 plasmassa ja 27,8 ± 14,5 ng /g kasvain kasvain: plasma-suhde on 0,30 ± 0,20. PC-3M-luc-C6 eläimet osoittivat, 174,8 ± 53,5 ug /ml YK-4-279 plasmassa ja 23,3 ± 12,3 ng /g kasvaimen kasvain: plasma-suhde on 0,15 ± 0,10. Ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa tunkeutumista YK-4-279 ryhmien välinen verrattuna jonka chi-neliö testi.

a) RNA uutettiin kasvaimista yhdistettä ja ajoneuvon käsiteltiin LNCaP-luc- M6 eläimet (myöhäinen hoitotutkimuspopulaatioon pieni annos) 15 minuuttia viimeisen injektion jälkeen. Geeniekspression tasot määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset normalisoitiin 18s rRNA ilme. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 5 hiirtä analysoitiin ryhmää kohti. YK-4-279 hoito johti vähentynyt geenin ilmentyminen MMP7, GLYATL2 ja FKBP10 ilman merkittävää vähenemistä ETV1 tasoilla. *; p 0,05, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä. b) ETV1 kohdegeenin ilmentymistason myöhään hoitotutkimuksessa suuren annoksen ryhmässä. *; p 0,05, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomalla Studentin t-testiä.

enantiospesifisen vaikutuksia YK-4-279

YK-4-279 on kiraalinen keskus, ja raseeminen yhdiste voidaan erottaa sisältämiensä R- ja S-enantiomeerit korkean paineen nestekromatografialla (HPLC), tai kukin enantiomeeri voidaan syntetisoida erikseen. Vuonna Ewingin sarkooma malleissa, S-enantiomeeri on perustettu aktiivisena komponenttina, joka estää EWS-FLI1, kun taas R-enantiomeeri on lähes olematon spesifinen aktiivisuus [14], [21]. Testasimme, onko sama ilmiö pätee esto ETV1 eturauhassyöpäsoluissa. Pintaplasmoniresonanssin (SPR) suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi sitova raseemisen YK-4-279 ja kukin yksittäinen enantiomeeri ETV1: een. Yhdisteet injektoitiin yli Biacore sirun pinta sisältäviä yhdistelmä-ETV1. Raseeminen YK-4-279 ja S-enantiomeerin sitoutunut ETV1 kun taas R-enantiomeeri oli heikompi sitoutuminen ETV1 (Fig. 6a). Sitten arvioidaan YK-4-279 sen vaikutus ETV1 transkriptioaktiviteettia käyttäen transfektoitiin lusiferaasireport- konstrukti, joka sisältää minimaalisen Id2 promoottorialueen kaksi sitoutumiskohtia ETV1. Kotransfektoimalla ETV1 ja Id2 reportteri COS-7-soluissa johti lisääntymiseen lusiferaasiaktiivisuudessa. Promoottorin aktiivisuus väheni käsittelemällä soluja raseemisen YK-4-279 ja (S) -YK-4-279. Kuitenkin, (R) -YK-4-279 ei inhiboinut ETV1 transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 6b).

a) Raseeminen YK-4-279, (R) -YK-4-279 ja (S ) -YK-4-279 ruiskutettiin yli Biacore sirun pinta sisältäviä yhdistelmä-ETV1. Raseeminen YK-4-279 ja S-enantiomeerin sitoutunut ETV1 kun taas R-enantiomeeri oli pienempi sitoutumisaffiniteetti ETV1. b) Lusiferaasimääritys suoritettiin Cos-7-soluissa kotransfektoitiin ETV1 ja Id-2 toimittaja lusiferaasi-konstrukti. Id-2-promoottorin aktiivisuus laski käsiteltäessä raseemisen YK-4-279 ja (S) -YK-4-279. *; p 0,0005, N.S. .; ei-merkitsevä, parittomia Studentin t-testiä.

Kiraalinen syrjiä enantiomeerien on tärkeä ominaisuus monissa huumeiden kuten molekyylejä, yksittäisinä aktiivista enantiomeeria voi parantaa selektiivisyyttä niiden biologinen tavoitteensa, parantaa terapeuttista indeksiä, ja näyttää paremmin farmakokinetiikkaa kuin raseeminen seos [22]. Se voi myös vähentää koko lääkeannos ja vähentää lääkkeiden yhteisvaikutuksista ja myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Jättäessään uusi lääke hyväksyttäväksi Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) edellyttää kehittäjät voivat perustella mahdollisuuden käyttää raseemisen seoksen yli yhden enantiomeerin muotoiluja.

Meidän

in vivo

kokeissa, LNCaP-luc-M6 kasvaimen kasvun inhibitio oli suurempi 150 mg /kg YK-4-279 verrattuna 75 mg /kg. Kuitenkin eläimet saada suuremman lääkkeen annosta ei voitu hoitaa yli 10-12 viikko johtuen ilmentymä nekroottista kasvaimia, mikä edellytti eläinten lopetettiin. Siten lisäksi etäpesäkkeiden estoa, YK-4-279 voi olla suora vaikutus proliferaatioon in ETS-positiivisten syöpäsolujen. Ainoa haittapuoli kohdella eläimiä suuremmat annokset YK-4-279 oli ulkonäkö lääkkeen myrkyllisyyden oireita alkoi 4 viikon ajan. Tässä tutkimuksessa olemme onnistuneet oireita vähentämällä lääkehoitoa taajuus, mikä antaa eläimille enemmän toipumisaika injektioiden välillä. Jotta siirtää tämän yhdisteen klinikalle, lisätutkimuksia tarvitaan parantamaan

in vivo

tehoa ja käsitellä oireita, jotka syntyvät suuremmilla annoksilla. Olemme tällä hetkellä tutkitaan eri annostelua ja muotoiluja löytää ihanteellinen hoito skenaario, joka maksimoi paikan tavoite vaikutuksista minimoiden off-tavoite lääkkeiden haitta-. Koska sen hydrofobinen rakenne, hyötyosuus YK-4-279 on vain 2% -15%, kun se annettiin hiirille suun kautta letkuruokinnalla [14]. Lisäksi viimeaikaiset farmakokineettisistä kokeista laboratoriossamme ovat osoittaneet, että intraperitoneaalitestissä hallintojen 75 mg /kg YK-4-279 aluksi johtaa jyrkkään nousuun plasmassa, mutta on oleellisesti poistunut johtaa ~ 1 uM tasot 2 tuntia [ ,,,0],14]. Farmakokineettiset ominaisuudet YK-4-279, sekä kyvyttömyys toimittaa kestävää suuri annos ajan mittaan bolusinjektioina ehdottaa tarvetta kehittää jatkuvana infuusiona malli varmistaa riittävä lääkeannostelun. Olemme testanneet tämän ajattelutavan käytettäessä Ewingin sarkooma ksenograftimallia nude rotilla. Nämä eläimet saavat jatkuvana lääkeinfuusion kautta Keskuslaskimokatetria ja näyttää paremmin vastata YK-4-279 hoidon kuin päivittäin intraperitoneaalitestissä tai suonensisäiseen injektiot [21]. Lisäyhdistämisvälineet farmakokineettiset mittauksia,

in vivo

mallintamista ja laboratoriotutkimukset ansiosta voimme luoda optimaalinen lääkeaineen muotoilu, joka sopii kliiniseen käyttöön. Lisäksi onnistunut validointi (S) -YK-4-279 aktiivisena komponenttina YK-4-279 voi sallia rajusti hoitoannoksesta

in vivo.

Kasvava todisteet osoittavat, että ETS fuusioita toimivat samanaikaisesti muiden genomisen muutoksia aloittamisen ja ylläpidon eturauhasen syöpäsairauksia. Androgeeni-indusoituva prostataspesifisen yliekspressio ETV1 siirtogeenisissä hiirissä indusoi eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN), mutta ei johda karsinooma muodostumiseen. Ylittävät näitä siirtogeenisiä hiiriä osaksi PTEN

+/- tausta tai konstitutiivisesti aktiivinen prostataspesifisen PI3K /Akt-reitin indusoi invasiivisen kohdunkaulan 6 kuukauden kuluessa, mikä viittaa siihen, että ETS toiselle siirtäminen yhteistyötä muiden geneettisten vaurioiden aiheuttamaan eturauhasen syöpää ihmisille [10 ], [11]. Viimeaikaiset havainnot ovat myös tunnistettu Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), keskeinen DNA korjaus proteiinia, vuorovaikutuksessa ETS tekijöitä DNA riippumattomalla tavalla [23]. PARP1 on osoitettu olevan tärkeä ETS proteiinien toiminnan, ja esto PARP1 heikentää ETS välittämä kasvaimen kehittymisen ja solujen invaasiota. PARP ja PI3K /Akt-reitin inhibiittorit kuten olaparib, rucaparib, perifosine, ja miltefosiinin ovat edenneet tilassa kliiniseen testaukseen [24] – [26]. Tärkeä kliininen hyöty näistä havainnoista on mahdollista yhdistää YK-4-279 muiden lääkkeiden saavuttaa vankempi ja synergistisen vasteen, avaamaan laaja kirjo uusia strategioita kohdistaa ETS tekijöistä.

transkriptio tekijät