Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa selvitettiin korrelaatio RhoC ilmaisun ja syövän kantasoluja (CSCS ) muodostumista pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC). Estyminen RhoC funktion saatiin aikaan käyttämällä shRNA. Ilmaisu kantasolujen pinnan markkereita, ALDH ja CD44 olivat huomattavan alhainen kahdessa RhoC köyhdytetyn HNSCC solu- sinoomasolulinjoja. Lisäksi silmiinpistävää väheneminen tumorsphere muodostus saavutettiin RhoC knockdown linjat. MRNA ilmentyminen RhoC vuonna RhoC pudotus kiinnittyvä ja tumorspheres dramaattisesti säädeltiin verrattuna salattu ohjaus. MRNA ilmentyminen kantasolujen transkriptiotekijöiden; Nanog, Oct3 /4 (Pouf1), ja Sox2 merkittävästi köyhdytetty RhoC knockdown klooneja. Edelleen, fosforylaatio STAT3

ser727, ja STAT3

tyr705 laskivat tuntuvasti säännelty RhoC pudotus klooneja. Yli-ilmentyminen STAT3: in RhoC pudotus ei osoittanut mitään muutosta ekspressiomalleja joko-STAT3

tyr705 tai kantasolujen transkriptiotekijöitä, merkitsee rooli RhoC on STAT3 aktivointi ja siten ilmentymisen Nanog, Oct3 /4 ja Sox2 in HNSCC. Ilmaisu Inter leukin-6 (IL-6) on RhoC pudotus HNSCC solulinjat oli dramaattisesti alhainen verrattuna sekoitettua kontrollipeptidiä. Lisäksi olemme osoittaneet pelastus STST3 fosforylaatiota IL-6 stimulaation RhoC knockdown linjat. Tämä tutkimus on ensimmäinen laatuaan vahvistaa osallistumista RhoC vuonna STAT3 fosforylaatiota ja edistää siten aktivointi ytimen syövän kantasoluja (CSCS) transkriptiotekijöitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että RhoC voi olla uusi kohde HNSCC terapia.

Citation: Islam M, Sharma S, Teknos TN (2014) RhoC säätelee Cancer Kantasolut pään ja kaulan Okasolusyöpä yliekspressiolla IL-6 ja fosforylaatio STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10,1371 /journal.pone.0088527

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 lokakuu 2013; Hyväksytty: 07 tammikuu 2014; Julkaistu: 12 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Islam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Ohio State University Kattava Cancer Center ja Slomin Family Foundation (Florida, USA) Ted Teknos. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kymmenen parhaan kohtalokas syöpiä maailmanlaajuisesti [1], [2]. Lisäksi ilmoituksen mukaan American Cancer Society, noin 41380 uutta tapausta diagnosoidaan vuonna 2013, josta noin 19% potilaista todennäköisesti kuolee tautiin samana vuonna [3]. Eloonjääneet kasvot toissijainen oireita taudin seurauksena on jatkuvan ja laaja hoito. Tilannetta pahentaa se, että tauti näyttää tiheä uusiutuminen. Tämän seurauksena HNSCC potilaat joutuvat pitkän taistelun tautia aiheuttaa suurta taloudellista ja emotionaalista taakkaa [4]. Näin ollen raportin Brown

et al

(2002) mainitsee HNSCC niistä kahdeksasta kallein syövät Medicare-ohjelman [5].

epätavallisen korkea sairastuvuus ja kuolleisuus johtuu pahanlaatuinen luonne HNSCC ja sen laaja esiintyminen useimmissa pään ja kaulan syövät. Näin ollen, se ei ole harvinaista löytää metastaasin imusolmukkeisiin kaulan alueen, joka johtaa paikallista alueellista vajaatoiminta (yleisin), jota seurasi keuhkojen ja luun etäpesäkkeiden [6], [7]. Tämän seurauksena potilaille, joilla on HNSCC on huono ennuste, ja viiden vuoden eloonjäämisaste vain 50-60% [3]. Näin ollen on olemassa suuri tarve ymmärtää geneettisiä mekanismeja säätelemällä pahanlaatuisuuden HNSCC ja käyttää niitä suunnitella parempaa hoitoa strategioita, jotka voivat estää etäpesäkkeiden ja uusiutuminen.

RhoC kuuluu hyvin tunnettu Rho perhe of GTPaasit jotka ovat mukana monenlaisia ​​solujen aktiviteetteja, kuten solunsisäinen signalointi, solun tukirangan organisaatioon, solujen lisääntymistä ja geeniekspression säätelyssä [8]. Mielenkiintoista, Rho geenit kuuluvat Ras superperheeseen, joista monet on tunnistettu onkogeenejä [9], [10]. Vaikka hyvin vähän geneettisiä mutaatioita havaitaan RhoC geeni, on raportoitu yli-ilmentynyt monissa muodoissa invasiivisia karsinoomia, kuten HNSCC [11], [12]. Erityisesti tutkimuksissa kaikissa syöpien missä RhoC ilmentyminen analysoitiin paljastui erittäin vahva korrelaatio huomattavasti lisääntynyt ilmentyminen ja etäpesäke. Lisäksi kun RhoC toiminto on estetty

in vitro

, se johtaa voimakas väheneminen soluinvaasiota ja liikkuvuus [13]. Mielenkiintoista,

in vivo

tutkimuksissa tuumorigeneesiä RhoC hiirien osoittavat kasvaimia kanssa suuresti vähentynyt kyky etäispesäkkeitä keuhkoihin [10]. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset viittaavat vahvasti siihen RhoC on pro-etäpesäke onkogeeni, joka on merkittävä rooli muuttamassa ei-invasiivisia kasvainsoluja invasiivinen fenotyyppi.

Tutkimus RhoC toiminta keskittyy pääasiassa sen rooli uudelleenjärjestelystä solun tukirangan indusoimalla muodostumista stressin kuitujen ja fokaalisen adheesion, jotka ovat kriittisiä askeleita kohti muuttamalla solujen liikkuvien ja invasiivisia [14]. Kuitenkin prosessi etäpesäkkeiden syöpäsolujen on monimutkainen ja monivaiheinen prosessi, joka liittyy lisääntyneeseen geenien ilmentymisen, jotka parantavat liikkuvuutta ja invasiivisuus ja selektiivinen down-regulation geenien, jotka estävät tämän prosessin. Esiintyvyys RhoC monenlaisia ​​invasiivisia karsinoomia ja sen toimintaa signaloinnin GTPaasia ehdottaa, se voi säädellä muita reittejä, jotka ovat mukana muutosta tuumorisolujen metastaattinen fenotyypin.

Cancer kantasolut (CSCS) ovat alapopulaatio erilaistumattomien kasvainsolujen tuumorimassan sisällä, jotka kykenevät itsestään uudistuminen. Ne osoittavat myös voimakasta vastarintaa chemo-sädehoitoa. Lisäksi CSCS voi itsepintaisesti kasvaimet erillisenä väestöryhmästä, joka voi relapse ja etäispesäkkeitä muodostamalla uusia kasvaimia [15], [16]. Nämä ainutlaatuiset ominaisuudet on merkittävä rooli syövän solujen selviytymistä johtavat uusiutumiseen. Tärkeää on, ne voivat myös aiheuttaa solujen invasiivisen fenotyypin, ovat siten avainasemassa etäpesäkkeitä.

melkoinen määrä tutkimuksia on tehty läsnäolosta ja roolia CSCS pään ja kaulan syöpä, joka on käynyt läpi kattavasti Minnelli ja Gallo (2012) [17]. Eräässä tutkimuksessa primaarikasvainten pään ja kaulan syöpien käyttämällä markkereita CD44 ja ALDH tunnistettu osajoukko syöpäsolujen ainutlaatuisia CSCS ominaisuuksia kuten Itseuudistumisen, kykyä muodostaa uusia kasvaimia hiirissä ja näytteillä korkea metastaattinen potentiaali (Prince

et al

2007 Davis

et al

, 2010, Clay

et al

2010) [16], [18], [19]. Mielenkiintoista on, että ALDH-positiivisia kasvainsoluja esiintyi enemmän Tuumorigeenisuustutkimuksissa verrattuna CD44-positiivisten solujen [19]. Lisäksi Chen

et al

(2010) [20] ilmoitetaan primaarikasvainten jossa on korkeampi ilmaus CD44 ja ALDH ssä, jossa hyvin huonon ennusteen HNSCC potilailla. Näiden tutkimusten perusteella voidaan päätellä, että CSCS voi olla merkittävä rooli etäpesäke HNSCC; mikä viittaa tarve ymmärtää molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät niitä.

CSCS on myös tunnistaa ja kuvata HNSCC solulinjoissa, joissa ne on osoitettu olevan tärkeä rooli epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [ ,,,0],21]. Tutkimuksessamme olemme analysoineet vaikutuksia RhoC estoa toiminnallisia ominaisuuksia syöpäsolut näytteille CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia HNSCC solulinjoissa. Osoitamme, että estävä RhoC aktiivisuuden HNSCC solulinjoissa johtaa merkittävään vähenemiseen solupopulaation ilmentävät CD44 ja ALDH, merkkiaineiden CSCS pään ja kaulan kasvaimet.

Lisäksi olemme myös tunnettu molekyylitason mekanismi, jolla RhoC säätelee kasvua ja itsensä uudistamista CSCS. Tuloksemme osoittavat, että RhoC voidaan merkittävästi alentaa ekspressiotasot ytimen kantasolujen transkriptiotekijöitä, Nanog, Sox2 ja Oct3 /4. Olemme osoittavat lisäksi, että tämä saavutetaan vähentämällä tasot fosforyloitua STAT3 kautta IL-6 /JAK signalointireitin. Tämä tutkimus on ensimmäinen laatuaan, joka yrittää leikellä roolia RhoC GTPaasi signalointireitin sääntelyssä ja aktivoitumisen kantasolujen transkriptiotekijöiden. (Nämä tekijät edistävät ja ylläpitävät kasvainsolujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia pään ja kaulan alueen syöpä).

Siksi perustuu havaintomme voimme päätellä, että RhoC on tärkeä onkogeeni, joka tarvitaan ylläpito ja lisäys CSCS in HNSCC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjojen UM-SCC-1 ja -47 (University of Michigan okasolusyöpä ) hankittiin alkaen Michiganin yliopistossa. Nämä ovat hyvin tunnettu linjat, jotka ovat peräisin potilaista, joilla T2N0 lattian suun ja T3N1 emäksen kielen vastaavasti [22], [23]. Solulinjat kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [13].

lentivirustartunnat transduktion infektio ja valinta positiivisten RhoC pudotus klooneja

Jotta saat vakaan RhoC pudotus klooneja edellä mainituista solulinjoista käytimme RhoC knockdown ja sekoitetun askelohjaus konstruktioita GFP tagged ja puromysiiniresistenssin sivustojen kuvattu aiemmin julkaistu työ [13]. Valinta RhoC Knockdown stabiilien kloonien saavutettiin käyttämällä 2,0 ja 1,6 ug /ml puromysiiniä UM-SCC-1 ja -47 vastaavasti. Nämä kloonit edelleen lajiteltu virtaussytometrialla saada maksimimäärä GFP-positiivisten solujen, jota käytettiin myös myöhemmissä tutkimuksissa.

ohimenevä transfektointi RhoC-siRNA

Koska emissiospektrien GFP koodattu RhoC shRNA oli sama kuin emissiospektrit fluoresenssin vasta-ainetta, jota käytetään tunnistamaan ALDH-positiivisia soluja, transfektoidut RhoC-shRNA /GFP pudotus klooneista tuotettu UM-SCC-1 ja -47 solulinjoja ei voida käyttää tunnistamaan ja lajitella CSC osapopulaatiosta. Sen sijaan knockdovvn RhoC saavutettiin ohimenevästi sekä UM-SCC-1 ja -47 käyttäen RhoC-siRNA (Ambion /Life technologies, USA) ja lipofactAMIN 2000 kantajana. Onnistunut transfektio ja inhibitio RhoC osoitettiin, ettei sen ilmentymisen Western blot -analyysillä käyttämällä anti RhoC vasta-ainetta.

Quantitative käänteistranskriptaasi polymeraasiketjureaktioissa (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin by TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Quantitative käänteistranskriptaasi polymeraasiketjureaktioilla (qRT-PCR) suoritettiin Taqman koetin järjestelmän Applied Bio Systems (Foster City, CA) käyttämällä seuraavia tuotteita RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 ja Oct3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 ja G3PDH käytettiin datan normalizers. Suhteelliset muutokset geeniekspressioiden laskettiin käyttäen 2

– (- Δ) C

T-menetelmä [24].

Western blot-analyysi

Western blot-analyysit suoritettiin vakioyhteyskäytäntöä. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat polyklonaalisia RhoC, ja p-STAT3

ser 727, p-STAT3

tyr705 (1:1000 laimennokset) ja αβ Tubulin (latauskontrollina) (1:2000 laimennoksia). Nämä vasta-aineet olivat tuotteen Cell Signaling (Cell Signaling Technologies, Inc., Boston, USA). Inkuboinnin jälkeen primaarisilla vasta-aineilla kalvot blotattiin yhden tunnin johdetun HRP-konjugaatti anti-kani-vasta-aine (1:2500) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). ECL-super-signaali järjestelmä (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) käytettiin proteiinien visualisoinnin.

määritys aktiivisten RhoC tai [RhoC-GTP]

[RhoC- GTP] UM -SCC-1 ja -47 sekoitetun ohjaus ja RhoC pudotus kloonit määritettiin G-LISA kuten aiemmin on kuvattu [25], käyttäen G-LISA kit (Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA) ja seuraten valmistajan protokollaa käyttäen RhoC primaarinen vasta-aine Cell Signaling Inc.

Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) B

Seerumittomuuteen supernatanteista salatun ohjaus- ja RhoC pudotus solulinjat saatiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 48 tuntia lähetettiin ELISA sytokiini Core Lab University of Maryland, Baltimore, MD. Keskiarvot IL-6 (normalisoinnin jälkeen kanssa solujen määrän josta supernatantit kerättiin) suhteen pg /ml kuvattu pylväskaaviona.

Virtaussytometria analysoi

Flow cytometry analyysi selvittelyssä GFP, ALDH ja CD44-positiivisten solujen tehtiin käyttämällä BD FACS Aria iiu virtaussytometrillä varustettu 488 nm, 15 mW, ilmajäähdytteinen Argon laser. ALDEFLOUR Kit (Kantasolujen Technologies, Vancouver, BC, Kanada) käytettiin ALDH värjäystä. FACS-analyysi suoritettiin virtaus lab ydin laitokseen The Ohio State University Kattava Cancer Center.

Tumorspheres muodostumista

tumorsphere muodostumisen määritykset me selvittäneet GFP-positiivisten solujen ja käyttää niitä kaikissa myöhemmissä kokeissa . Tumorspheres alkaen salatun ohjaus ja RhoC knockdown linjat saatiin kasvattamalla yhtä monta solujen (1 x 10

6) ultra low kiinnityslevyt in keratinosyyttien seerumivapaassa täydennä EGF 20 ng /ml, bFGF 20 ng /ml insuliini 100 ng /ml, ja hydrokortisonia 400 ng /ml. Lisäystarkoituksessa pallot seuraavalle sukupolvelle, palloset suodatettiin ulos 40 uM solusiivilän ja lyhyesti trypsiinillä vesihauteessa 37 ° C: ssa. Sen jälkeen pyörivät 300 x g solujen Lavat suspensoitiin uudelleen tumorsphere median ja maljattiin tuoretta alhainen kiinnityslevyjä. Määrittää tehokkuuden tumorsphere muodostumista, 500 soluja salatun ohjaus- ja RhoC pudotus maljattiin 96-kuoppaisille matalan kiinnityslevyt. Numerot pallojen laskettiin kahden viikon kuluttua kylvön. Ultra-low kiinnityslevyt olivat tuote Corning Incorporated, Corning, NY, Yhdysvallat.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit (Studentin t-testi) suoritettiin käyttäen Sigma kaavio pad prisma 4 ohjelmisto . Keskimääräinen oli raportoitu keskihajonta (± SD). Erot katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä, kun

p

-arvot olivat alle 0,05.

Tulokset

RhoC ilmentyminen on vähentynyt merkittävästi RhoC pudotus HNSCC solulinjoja

inhibitio RhoC ekspressio suoritettiin käyttäen pientä hiusneula-RNA (shRNA) ja lentiviruksen transduktiolla ja infektio kuvattua menetelmää menetelmät jaksossa. Jälkeen lentiviruksen infektio, RhoC pudotus kloonit valittiin käyttäen puromysiinille (1,6 ug /ml) antibiootin. Solujen lukumäärä, jotka olivat onnistuneesti tartunnan analysoitiin virtaussytometrialla. Tämä paljasti huomattavan alhainen määrä ei-tartunnan saaneiden solujen (Kuva. 1A-C yläpaneeli). Lisäksi, fluoresenssimikroskopiaa ja stabiilien kloonien osoittaa vahva vihreä fluoresenssi suurin osa soluista, joka ilmentää korkea hyötysuhde lentivirus transduktion ja infektio (Fig. 1A-C alapaneeli). Nämä GFP-positiiviset solut tarkemmin selvitetty ja uudelleen kasvatettiin seuraavissa kokeissa. Kuvio 1C on negatiivinen kontrolli osoittaa emolinjan ilman lentivirus infektio. Tämä vastaa eroa GFP ilmentävien (tartunnan) ja ei-GFP ekspressoivat solut.

lentivirustartunnat tartunnan saaneiden solujen osoittavat GFP ekspression UM-SCC-47. (A) histogrammit sekoitetun ohjaus (sr kontrolli) ja (B) RhoC pudotus (RhoC kd), joka on saatu virtaussytometrialla. (C) Negatiivinen kontrolli. Edustus GFP ilmaisun fluoresenssin ja kirkas valo näkyvät pohjassa paneelit. Noin 90% soluista oli GFP-positiivisten merkitsee onnistuneen transduktion shRNA käyttämällä rekombinantti-lentiviruksen.

Sitten testattiin tehokkuuden shRNA in heikentävien RhoC mRNA: n ilmentymisen reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä (qRT-PCR) in meidän valittu solulinjoista. Kuten kuviossa 2 on esitetty, mRNA: n ekspression tasojen RhoC geenin pudotus kloonit olivat huomattavan alhainen (Fig. 2A lisäksi, että ekspressiotasot muiden Rho-proteiinit eivät vaikuttaneet UM-SCC-solulinjat [13]. Siten käytimme samoja RhoC shRNA rakentaa meidän nykyinen tutkimuksessa.

(A ja D) mRNA ilmentymistä RhoC saadaan reaaliaikainen RT-PCR; (B ja E). Western blot-analyysi osoittaa RhoC ilmentymisen salatun ohjaus ja RhoC pudotus klooneja (C ja F). Pylväsdiagrammi, joka esittää ilmentymisen aktiivisen RhoC [RhoC-GTP] muokatussa ohjaus ja RhoC pudotus UM-SCC-1 ja-47 vastaavasti. Merkittävä väheneminen RhoC mRNA, proteiini ja [RhoC-GTP] tasot saatiin RhoC pudotus solulinjat.

Seuraavaksi analysoimme RhoC proteiinin ilmentymisen käyttäen Western-blot ja havaittiin dramaattinen väheneminen RhoC proteiinin RhoC taintumisen kloonia (Fig. 2B F). Nämä tutkimukset tarjotaan selkeä kuva siitä ”sammuttamisen” ja RhoC signalointi aktiivisuutta vähentämällä yhteensä tasot RhoC mRNA ilmaisun. Yksityiskohtaisemmat tutkimukset sen toiminnallisten roolien syövän etäpesäkkeiden voitaisiin pyrkiä tulevaisuuden tutkimusta. Yksi perustason kliiniset kysymyksiä, joihin on osoitettu tässä vaiheessa on se, miten kaatamalla of RhoC toiminto vaikuttaa kasvainsolujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia pään ja kaulan alueen syöpä. Käsitellä tätä kysymystä, me tutkinut useita biologisia ominaisuuksia CSCS jotka sisältävät kantasolu- biomarkkereiden analyysiin ja kyky muodostaa tumorspheres. Seuraavaksi tutkimme molekyylejä, jotka säilyttävät itseuudistumisen ominaisuuksia CSCS.

inhibitio RhoC ilmaisun johtaa vähentyneeseen väestöstä ALDH ja CD44-positiivisten solujen HNSCC solulinjoissa

Jotta tunnistaa CSC väestön UM-SCC solulinjoja, käytimme kantasolujen merkkiaineita CD44 ja ALDH yhdessä fluoresenssi aktivaattori solujen lajittelu (FACS) erottamiseksi ja laskea, kuinka monta niitä ilmentäviä soluja. Lisäksi on tärkeää huomata, että RhoC-siRNA klooneja UM-SCC-1 ja -47 käytettiin FACS-analyysi määrittää ALDH positiivinen solupopulaatioiden sijasta lentivirusta tartunnan GFP-RhoC-shRNA klooneja. Tämä oli välttää päällekkäin GFP fluoresenssin yli fluoresoivasti leimattuja ALDH-vasta-aine, koska niiden emissiospektrit päällekkäin.

Vertasimme määrä ALDH-positiivisten solujen salatun ohjaus- ja vastaavat RhoC pudotus linjat. Vuonna ohjaus solulinjoissa, havaitsimme 18% ja 10% ALDH solujen määrässä koko väestöstä UM-SCC-1 ja UM-SCC-47 vastaavasti. Sitä vastoin vain 13% (UM-SCC-1) ja 4% (UM-SCC-47), ALDH-positiivisia soluja havaittiin vastaavan RhoC pudotus linjat (Fig. 3A). Samanlainen malli havaittiin käyttämällä CD44, mutta osuus CD44-positiivisten solujen oli erittäin korkea. Mielenkiintoista, kloonit salattu askelohjaus UM-SCC-1 ja -47 osoitti noin 98% CD44-positiivisia soluja. Vastaavassa RhoC pudotus kloonit oli 60% ja 41% CD44 positiivisia soluja vastaavasti (kuva S1). On syytä huomata, että tämä oli epätavallisen suuri määrä CD44-positiivisten solujen sekä UM-SCC-1 ja-47 solulinjoissa ( 95%) ja siksi CD44 ei voitu käyttää kantasoluja merkkiaine näistä solulinjoista. Lisäksi tuloksemme ovat samanlaisia ​​kuin aiemmin raportoidussa tutkimuksessa, jossa havaittiin, CD44 voidaan ilmentyy runsaasti kasvainsoluissa on HNSCC [26].

FACS-analyysi osoittaa ekspressiota (A) ALDH salattu ohjaus ja RhoC knockdown klooneja. (B) toinen tumorspheres muodostuminen sekoitetun ohjaus ja RhoC pudotus UM-SCC-1 ja -47cell linjat. (C) edustus tumorspheres muodostumisen tehokkuutta salattu ohjaus ja RhoC pudotus UM-SCC-1 saatu 96-kuoppaisilla levyillä. Merkittävä väheneminen ALDH ilmentyminen nähtiin. Tumorsphere muodostuminen oli dramaattisesti alhainen RhoC pudotus UM-SCC-1 ja -47 vastaavasti. (D) Merkittävä lasku RhoC mRNA ilmentyminen saatiin RhoC pudotus kiinnittyneet solu ja tumorspheres. (E) Kantasolujen transkriptiotekijöitä, Sox2, Oct3 /4, ja Nanog osoittaa merkittävää alas sääntely niiden mRNA, joka käy ilmi reaaliaikaisen RT-PCR salatut ohjaus ja RhoC knockdown pallojen saatu UM-SCC-1.

RhoC pudotus HNSCC linjat vähenevät huomattavasti niiden kyky muodostaa tumorspheres

tuumorisoluja kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia pystyvät muodostamaan kelluvan pallojen kun kasvatettu ei kiinnittynyt seerumivapaassa. Siksi edelleen vahvistaa asemaa RhoC CSC kasvuun ja ylläpitoon, tutkimme tumorsphere muodostumista valmiuksia näissä solulinjoissa. Ensinnäkin, yhtä monta solujen (1 x 10

6) salatun ohjaus ja RhoC knockdown solulinjoja ympättiin ultra-low kiinnityslevyyn havainnointiin. Valitsimme viisi eri alojen visualisoida määrä tumorspheres joka oli muodostunut. Kun sekoitetun ohjaus, oli suuri määrä tumorspheres kanssa harvempiin soluaggregaatteja. Sitä vastoin selvän laskun tumorsphere muodostuminen havaittiin RhoC pudotus klooneista sekä UM-SCC-1 ja-47 solulinjoissa. Lisäksi on huomattava, että hyvin määritellyt rajat, luonteenomainen piirre tumorspheres, ovat läsnä vain niissä on johdettu sekoitetun ohjaus soluissa, mutta ovat selvästi läsnä, kun johdettu RhoC pudotus solut (Fig. 3B). Sen sijaan, mitä näkyy ovat pieniä soluklusterien tai aggregaatteja, jotka ovat vailla mitään hyvin määritelty ulomman rajan. Lisäksi nämä soluklusterien eivät etene tai muodostaa palloja kun ne trypsinoitiin ja uudelleen pinnoitettu. Sen sijaan, palloset helposti syntyvät ohjaus solulinjojen (salattu sekvenssi) senkin jälkeen, kun uudelleen pinnoituksen ne ylös viidennen sukupolven. Analysoimme myös tumorsphere muodostumisen hyötysuhde 96-kuoppalevylle käyttämällä 500 solua kuoppaa kohden ja tarkkaili levy pallojen kahden viikon kuluttua. Merkittävä väheneminen pallojen (85%) havaittiin, että RhoC pudotus solujen kontrolliin verrattuna soluihin (Fig. 3C). Samanlainen kuin edellinen tumorsphere määrityksessä, soluaggregaatteja havaittiin soluista peräisin RhoC pudotus solulinjoja, jotka olivat aivan toisin kuin hyvin määritelty aloilla johdettu ohjaus klooneista. Saimme samanlaisen tumorsphere muodostumisen tehokkuutta, kun UM-SCC-47 sekoitetun ohjaus ja sen vastaava RhoC pudotus linjat testattiin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että RhoC on tärkeä kasvun ja ylläpidon syöpäsolujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia pään ja kaulan alueen syöpä.

Analyysi RhoC ja kantasolujen transkriptiotekijöiden ilmentymisen tarttuu ja tumorspheres in HNSCC

Differential ilmentymistä RhoC mRNA: kiinnittyneet solut ja tumorspheres

: Seuraavaksi analysoimme RhoC mRNA: n ilmentymisen on tumorspheres syntyvät UM-SCC-1-solulinjassa, ja sitä verrattiin niiden vastaavat tarttuneet solut käyttäen reaaliaikaista RT-PCR. On huomattava, että kiinnittyneet solut käytettiin kokeita viittaavat salattu ohjaus- tai RhoC pudotus yksikerrossoluissa että kasvatetaan standardi soluviljelmässä kasvualusta. Tuloksemme osoittavat, että on olemassa kohonnut ilmentyminen RhoC mRNA UM-SCC-1 sekoitetun ohjaus verrattuna RhoC pudotus kollegansa (Fig. 3d). Mielenkiintoista, RhoC ilmaisu on paljon suurempi salattu ohjaus tumorspheres verrattuna niiden kiinnittynyt solun kanssa. Tämä voi johtua siitä, että läsnä on suurempi konsentraatio RhoC in tumorspheres, joissa korkeammat numerot CSCS ovat paikallisia verrattuna kontrolliin kiinnittynyt solupopulaation, jotka osoittavat solujen seoksesta sekä varsi ja ei-kantasolun kaltaisia ​​piirteitä. Tämä edelleen tukee hypoteesia, että RhoC tarvitaan ylläpidosta CSC kaltaisia ​​piirteitä. Tuloksemme ovat samaa mieltä samanlaisella tutkimuksen RhoC ilmaisun rintasyövän solulinjoissa, joissa ALDH positiiviset solut osoittivat korkeampaa RhoC ilmaus verrattuna ei-ALDH ilmentävien solujen [27].

Kantasolujen transkriptiotekijät ovat alhaalla säännelty RhoC knockdownin tumorspheres.

kasvu ja itseuudistumisen kantasolujen lukien eteneminen riippuu asianmukaisesta ilmaisun ytimen kantasolujen transkriptiotekijöiden Nanog, Oct3 /4 ja Sox2. Siksi olemme analysoineet ekspressiotasot näiden kantasolujen transkriptiot tekijöitä RhoC knockdown ja salattu ohjaus tumorspheres syntyvät UM-SCC-1 solulinja reaaliaikaisella RT-PCR. Mielenkiintoista on, että ekspressiotasot kaikki kolme keskeistä transkriptiotekijöiden dramaattisesti pienentynyt RhoC pudotus soluja verrattuna salattu ohjaus tumorspheres (Fig. 3E). Sox2 on ekspressoitiin voimakkaimmin salattu ohjaus tumorspheres, kun taas Nanog ja Oct3 /4 olivat molemmat vähemmän ilmentyy voimakkaasti, mutta oli samanlaisia ​​ekspressiotasoja. Kuitenkin RhoC pudotus kollegansa, Sox2 ja Nanog osoittivat suurinta kevyemmästä seurasi Oct3 /4. Lisäksi olemme tarkasteltiin myös niiden ekspressiotasot kiinnittyneet HNSCC solujen linjat (salattu ohjaus ja RhoC knockdown), josta tumorspheres olivat peräisin. UM-SCC-1 sekoitetun ohjaus ja RhoC pudotus solulinjat, kolme transkriptiotekijät osoitti samanlaista ekspressiotasot kuin havaittu tumorspheres, jotka olivat peräisin niistä (Fig. 4A). UM-SCC-47 sekoitetun ohjaus, Oct3 /4 oli korkein ilmaus seuraa Sox2 ja Nanog. Samanlainen UM-SCC-1 RhoC pudotus linja, Nanog osoitti suurin vähennys, kun RhoC ilmaisua estyi seurasi Sox2 (Fig. 4B). Sekä UM-SCC-1 ja -47 RhoC pudotus linjat, Oct3 /4 osoitti vähiten vähentää ilmentymistä. Kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että RhoC välittää lisäykseen ja itsensä uudistamista CSCS säätelemällä ilmentymistason ytimen kantasolujen transkriptiotekijät.

Reaaliaikainen RT-PCR osoittaa mRNA ilmaus Sox2, Oct3 /4 ja Nanog in tarttuvat solut UM-SCC-1 (A) ja-UM-SCC-47 (B). Merkittävä väheneminen mRNA ilmentyminen havaittiin kantasolujen transkription tekijöitä RhoC knockdown HNSCC solulinjoissa.

inhibitio RhoC ilmaisun indusoi alas sääntely STAT3 signalointireitin

Seuraavaksi olemme tutkineet mahdollinen mekanismi, jolla RhoC säätelee ilmentymistä ytimen kantasolujen transkriptiotekijöitä. Aktivointi kantasolujen transkriptiotekijöiden, Nanog, Sox2, ja Oct3 /4 välittyvät signaalimuunta- ja aktivaattoreita Transcription3 (STAT3) signalointireitin on vakiintunut [28], [29]. Kuitenkin osallistuminen RhoC aktivoinnissa näiden transkriptiotekijöiden ei tunneta. Näin ollen, olemme analysoineet ilmentyminen koko ja fosforyloidun STAT3 (p-STAT3) on salattu ohjaus ja RhoC pudotus HNSCC solulinjat. Yllättäen havaitsimme, että kun koko tasot STAT3 pysyi suunnilleen samana salatun ohjaus ja RhoC pudotus solulinjoissa, p-STAT3 tasot väheni suuresti vasta RhoC pudotus klooneja. Erityisesti, Western blot-analyysi osoitti, vähentää fosforylaation STAT3 proteiinia ser-727 ja Tyr-705 tähteet (Fig. 5A ja B). On kiinnostavaa panna merkille, että fosforylaation jälkimmäinen jäännös tarvitaan STAT3 diffundoitua tumaan sitoutua promoottorin elementtejä STAT3 reagoivien geenien [30], [31]. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti ajatusta, että RhoC signalointireitin tarvitaan aktivointiin STAT3 in HNSCC linjat.

(A ja B) Western blot-analyysi osoittaa fosforylaatiota STAT3

ser727 ja STAT3

tyr705 on salattu valvontaa ja RhoC pudotus UM-SCC-1 ja -47 vastaavasti. Normalisoidun arvon suhteen yhteensä STAT3 annetaan numeeriset arvot. Merkittävä aleneminen fosforylaation STAT3 nähtiin RhoC knock-down UM-SCC-1 ja -47 solulinjoissa vastaavasti. (C) Proteiini analyysi osoittaa p-STAT3

tyr705 että ektooppisesti yli-ilmentynyt (OE) salattu ohjaus ja RhoC pudotus UM-SCC-1. Fosforyloitua muotoa havaittiin ainoastaan ​​salattu Hallinnan STST3 oli yli ilmaistu. Paksu bändi yhteensä STAT3 näkyy alemmassa paneelissa, vahvistaa onnistuneen transfektion STST3 näissä klooneja. (D) Reaaliaikainen RT-PCR osoittaa ilmentymisen STAT3, Sox2, Oct3 /4 ja Nanog ennen ja jälkeen STAT3 yli ilmentymistä RhoC pudotus klooni. MRNA ilmaus STAT3 oli dramaattisesti korkea, kun se on ohi ilmaisua, kun taas mitään merkittävää muutosta ilmentymistä havaittiin Sox2, Oct3 /4 ja Nanog että RhoC knockdown klooni.

Sen varmistamiseksi, että fosforylaatio STAT3 kautta tapahtuvaa RhoC signalointireitin, me ektooppisesti yliekspressoitujen STAT3 on RhoC taintumisen linja (UM-SCC-1). Yhteenlaskettu STAT3 tasot salatun ohjaus ja RhoC pudotus kloonien kun STST3 oli yli-ilmentynyt näytteillä vankka bändejä, merkitsee onnistunut transfektiota STAT3. Tuntuvasti, p-STAT3

tyr705 voidaan nähdä selvästi STAT3 yli-ilmentävät sekoitetun ohjaus solulinjaa. Tarkemmin sanottuna, kun RhoC pudotus yli-ilmentynyt STAT3 klooni oli mukavalta fosforylaation STAT3 on tyr-705, jotka voitiin havaita, ja se oli hyvin samanlainen kuin ekspressiotasot havaittiin alkuperäisessä RhoC pudotus kloonia (Fig. 5C).

Lisäksi olemme analysoineet mRNA: n ilmentymisen tasot Nanog, Sox2, ja Oct3 /4 on STAT3 yli ilmaistuna RhoC taintumisen klooni (UM-SCC-1). Kuten kuviossa 5D, merkittävä lisääntyminen STST3 mRNA ilmentyminen havaittiin tässä solulinjassa, mutta ilmaus ytimen kantasolujen transkriptiotekijöitä, Nanog, Sox2, ja Oct3 /4 ovat-ennallaan ja samanlainen kuin havaittiin RhoC knockdown linjat.