Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on erittäin aggressiivinen keuhkojen kasvain, johon liittyy erittäin huono hoitotuloksia ja hyväksyttyä kohdennettuja hoitoja. Voit valaista niitä vastaava ajo SCLC fenotyyppi toiveita paljastaa uusia terapeuttisia kohteita, olemme tutkineet kopiomäärä ja metylaatio profiilit SCLC. Löysimme häiriöitä E2F /Rb-reitti oli piirre vapautettiin 96% SCLC näytteiden tutkitaan ja oli voimakkaasti yhteydessä lisääntyneen ilmentymisen EZH2, onkogeenin ja ydin jäsen Polycomb tukahduttavia monimutkainen 2 (PRC2). Kautta katalyyttinen rooli PRC2 monimutkainen, EZH2 tavallisesti toimintoja epigeneettiseltä hiljentää geenejä kehityksen aikana, mutta se poikkeuksellisesti vaientaa geenejä ihmisen syövissä. Tarjoamme todisteita, joiden mukaan EZH2 on toiminnallisesti aktiivinen SCLC kasvaimissa, kiinnostavuus pro-kasvaimia toiminnot

in vitro

, ja liittyy poikkeava metylaatio profiilit PRC2 kohdegeenien osoitus ”kantasolun kaltainen” hypermethylator profiilin in SCLC kasvaimia. Lisäksi lentivirus- välittämää knockdovvn EZH2 osoitti vähentää merkittävästi kasvua SCLC solulinjojen, mikä viittaa EZH2 on keskeinen rooli ajo SCLC biologiassa. Lopuksi todettakoon, että tiedot vahvistavat rooli EZH2 kriittiseksi onkogeenin SCLC, ja antaa tukensa priorisointia EZH2 mahdollisena terapeuttisena kohteena kliinisen taudin.

Citation: Coe BP, to KL, Aviel- Ronen S, Vučić EA, Gazdar AF, Lam S, et ai. (2013) Perimän sääntelyn purkaminen E2F /Rb Pathway Johtaa aktivointi Oncogene EZH2 vuonna pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (8): e71670. doi: 10,1371 /journal.pone.0071670

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 tammikuu 2013; Hyväksytty: 2. heinäkuuta 2013. Julkaistu: 15 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Coe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Kanadan Institutes for Health Research (CIHR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on erittäin aggressiivinen keuhkojen kasvain, johon liittyy erittäin huono kliininen tulos, joka on nähnyt vähän parannusta viimeisten 25 vuoden aikana [1]. Koska sen ainutlaatuinen kliininen kurssi, SCLC usein järjestetään erillisellä kliininen lavastus järjestelmän standardin TNM järjestelmää käytetään useimmissa syövät mukaan lukien kaikki ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC), joko rajoitettu (33%) tai laaja (67% ) vaihe tauti perustuu laajuudesta kasvaimen leviäminen. Potilaat, joilla on rajoitettu vaiheessa sairaus on mediaanielossaolosta 18 kuukaudeksi ja että potilaille, joilla on laaja vaiheessa on 9 kk [2] – [4]. Koska sen erittäin aggressiivinen luonne, leikkaus on harvoin ja kemoterapia tai ilman samanaikaista sädehoitoa on tavallinen hoito. Huolimatta SCLC aluksi esittää kuin kemiallis-herkkä sairaus, lähes kaikki potilaat relapsi hoidon aloittamisesta, eikä kohdennettuja hoitomuotoja on hyväksytty SCLC mennessä [5] – [9]. Siksi uudet tavoitteet terapeuttiseen interventioon tarvitaan kiireesti tähän sairauteen.

tunnistaminen onkogeenien jotka aktivoidaan selektiivisesti ja toiminnallisesti ajaa kasvain fenotyyppejä, tekevät ihanteellinen terapeuttisia kohteita potilaille kätkeminen näitä poikkeavuuksia. NSCLC, löytö tällaisten tapahtumien on johtanut kehitystä ja kohdennettujen chemotherapies, kääntää parempaan ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika varten NSCLC valituille potilaille [10]. Viimeaikaiset genomista profilointi kohti tämän tavoitteen SCLC ovat löytäneet tuhansia mutaatioiden ja poistot, esiintyvät monituumorisuppressori väyliä (esim.

TP53

,

RB1 ​​

,

PTEN

,

EPHA7

), ja geenit osallistuvat chromatin muutos (esim.

CREBBP

,

MLL

) sekä monistuksia otaksuttu SCLC syöpää kuljettaja geenejä, kuten

Sox2

[5], [8]. Nämä havainnot ovat merkittäviä, ja ne voivat johtaa kehitystä ja soveltaminen uusia hoitomuotoja kehitettäessä hyvin erityisiä alaryhmiä SCLC potilaiden kuitenkin selvittäminen entistä kaikkialle aktivoitu tavoite SCLC olisi vielä enemmän hyötyä.

DNA-tasolla inaktivaatiota n TSG

RB1 ​​

on lähes universaalia SCLC. RB1 normaalisti estää leviämisen eston kautta E2F transkriptiotekijöiden. E2F perheenjäsenet ovat yleisesti yliekspressoituvat erilaisten kasvainten, kuten SCLC [11] – [15]. Työ meille ja muut on tunnistettu DNA-tasolla voittoja

E2F

perheenjäsenten SCLC solulinjojen, kasvaimet ja hiiren malleissa [5], [16]. EZH2, ydin jäsen Polycomb tukahduttavia monimutkainen 2 (PRC2), on myötävirtaan kohde RB1 /E2F monimutkainen. EZH2 on kriittinen epigeneettiset ylläpitoon alkion solujen ”varsi-ness” ja perustamalla sukua erityisyyttä aikana normaalia kehitystä.

EZH2

on hiljattain perustettu kuljettajana onkogeeni, jossa se on mukana poikkeava hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille (APT) useita syöpätyyppejä. Yliekspressio EZH2 äskettäin kuvattu SCLC, jossa se on ehdotettu uutena SCLC terapeuttinen tavoite [11].

mekanismit EZH2 hyperaktiivisuus on havaittu muiden syöpien ja sisältää mutaation

EZH2

itse joka aiheuttaa yli-aktivointi sen histoni muokkaamalla valmiuksia ja DNA hypermethylator fenotyyppien, jotka liittyvät huono tulos, kemo- vastus ja erittäin aggressiivinen kasvain fenotyyppejä. Tutkitaan mekanismit ajo EZH2 aktivointia ja vahvistaa onkogeenisen roolia EZH2 vuonna SCLC, tutkimme kopioluku profiilit 14 SCLC kasvaimia ja 14 SCLC solulinjojen ja arvioitiin solujen elinkyky EZH2 knockdown. Olemme havainneet, että DNA-tasolla häiriöt E2F /Rb-reitti komponentteja, joko menetys

RB1 ​​

tai monistamiseen

E2F

, ilmeni 100%: n SCLC näytteistä tutkittiin, josta löysimme vahvasti sidoksissa lisääntynyt ilmentyminen EZH2. Vahvistamme toimiva kasvaimia synnyttävän rooli EZH2 vuonna SCLC, ja siihen liittyvä ja DNA hypermethylator profiilin SCLC kasvaimia. Ehdotamme, että genominen häiriöt E2F /Rb johtaa aktivoitumiseen histoni metyylitransferaasi EZH2 joka toimii onkogeenin SCLC, mikä edelleen tukee lupauksensa terapeuttisena kohteena SCLC potilaille.

Methods

Sample Hankinta ja Array Vertaileva Perimän Hybridisaatio

valtaosa SCLC potilaat eivät ole kirurgisia ehdokkaita, mikä vain arkistointia biopsianäytteissä ovat käytettävissä. Paneeli 14 formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin SCLC kasvain näytteet saatiin arkistosta yliopiston Health Network (UHN) Patologian osasto, jossa on tutkimusprotokollan hyväksymä UHN Ethics Board, joka ei vaadi erityistä ilmoittanut suostumuksensa materiaaleille alkaen ennen vuotta 2000 ja potilaille, jotka olivat kuolleen (taulukko S1). Tissue ytimet valittiin alueilta kasvainkudospalasta joka osoitti riittävän puhdasta 2 mm ydin. Sen jälkeen histologinen tarkastelu, näytteet uutettiin standardin ksyleeniä perustuu deparaffinization ja tavallinen proteinaasi K perustuu DNA: n eristys protokolla lisäämällä emäshydrolyysi (10 minuuttia 70 C inkubaation ½ tilavuus 1 M NaOH jälkeen neutraloidaan ½ tilavuus 1 M HCl) poistamiseksi kontaminoivaa RNA: ta. Array CGH suoritettiin alustalle kannekelpoisten FFPE materiaalia, ja kopioi hätäpuheluja syntyy aikaisemmin kuvatulla [16], [17].

kvantifiointi E2F ja EZH2 eksressoitumistasojen

RT-PCR suoritettiin käyttäen TaqMan geeniekspression määrityksiä kanssa vakioprotokollia ABI 7500 Fast lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). TaqMan-määrityksissä käytettiin E2F1 (Hs00153451_m1), E2F2 (Hs00231667_m1), E2F3 (Hs00605457_m1), Rb (Hs00153108_m1), EZH2 (Hs00172783_m1), ja 18S RNA: n (HS99999901_s1). Absoluuttinen ilmaisu arvot laskettiin E2F1, E2F2, E2F3 ja RB1 skaalaamalla delta Ct-arvoja (geeni 18-vuotiaat) ja on välillä 0 ja 1000. Proteiini tasojen EZH2 ja E2Fs solulinjoissa arvioitiin käyttäen standardia Western blotting menetelmiä (Cell signalointi ensisijainen vasta: # 3147 (EZH2) ja # 2118 (GAPDH); Santa Cruz ensisijainen vasta: sc-251 (E2F1), sc-632 (E2F2) ja sc-878 (E2F3)) [18]. Juovien voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Immunohistokemia (IHC) suoritettiin käyttäen standarditekniikoita, jossa on ensisijainen anti-EZH2-vasta-ainetta (kanin polyklonaalinen, 18-7395, Life Technologies, Grand Island, NY). Kuvat pisteytettiin perustuvat värjäytymisen intensiteetti havaittu asteikolla 0 (matala) 3 (korkea).

DNA metylointianalyysi

Saimme DNA: n metylaatio profiilit 12 SCLC kasvaimia, ja 21 ohjaus keuhkoputken pienet hengitysteiden epiteelin (SAE) yksilöt käyttävät Illumina n Infinium Human metylointi (HM27) määritys. SAE saatiin keuhkoputkien siveltimellä aikana rutiini bronkoskopia pienistä hengitysteiden (määritelty 2 mm halkaisijaltaan) yksilöiden ilman läsnäoloa tai aiemmin ollut keuhkosyöpään tai keuhkoahtaumatauti [19]. DNA-näytteet olivat bisulfiitti konvertoidaan käyttämällä Zymo EZ DNA Metylointi bisulfiittikonversion kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) ja HM27 profiilit tuotetaan, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Infinium HM27 metylaatio sentrix array-tiedostot (Sdf) and.idat kuvatiedostoja ladattiin Illumina GenomeStudio. Raakadataa vietiin ja luetaan R: A Language ja ympäristö Tilastollinen Computing, ja korjataan punainen vihreä väri kanava bias ja erän vaikutus välillä useita metylaation kokeita käyttäen Bioconductor paketti lumi, joka soveltaa värinkorjaus ja SSN normalisointi algoritmi [21 ]. Koettimet, joiden Illumina array havaitseminen p 0,05, esittämään 58% tapauksista kussakin ryhmässä olivat säilyneet. Prosenttia metylaatio kunkin koetin on esitetty β-arvot (max (yi, metyyli, 0) /(max (yi, unmethy, 0) + max (yi, metyyli, 0)) +100). Luettelo EZH2 sidottuja tavoitteita alkion hiiren kantasoluja saatiin julkaisun Ku

et

ai [22]. Tavoitteet linjattu ortologiset ihmisen geenejä hiirellä Genome Database [23]. Tunnistaa EZH2 kohdennetut geenien, jotka on differentiaalisesti metyloitiin välillä SCLC ja normaalin ryhmiä, ei parametrinen permutaatio testejä käyttäen 10000 permutaatioiden suoritettiin, kuten on kuvattu julkaisussa Chari

et ai

. [24]. M-arvo laskettiin log

2 suhde metyloitua luminoivan yli metyloitumaton luminoivan, ja käytettiin hyväksi permutaatiosymbolia testi [25]. Metylointi permutaatio tulokset korjattiin useita testejä käyttäen Benjamini ja Hochberg (B-H) menetelmällä. Keskimäärin β arvot SCLC kasvaimia vähennettiin keskimäärin β arvoista normaalista hengitysteiden ohjaa saamiseksi delta β arvo. Hypermetyloitunut ja hypometyloidut koettimien SCLC kasvaimet määriteltiin ne, joilla delta β arvot = 0,2 tai = – 0,2, vastaavasti. Koettimet, jotka täyttivät seuraavat kriteerit:

i

) permutaatio B-H korjattu p 0,05,

ii

) delta beeta-arvon = 0,2 tai = -0.2 Ja

iii

) keskihajonta (SD) ≤2 kussakin ryhmässä, katsottiin erilaisesti metyloituja (DM) välillä SCLC kasvainten ja normaali hengitysteihin.

korrelaatio EZH2 ja E2F Expression tasot

Voit selvittää yhdistyksen välillä

EZH2

ja

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, ja

RB1 ​​

mRNA ekspressiotasot SCLC näytteissä, me kysyi julkisesti saatavilla ilmaisun tietoja Peifer et al. [5] ja laajojen instituutin Sanger Cell Line hanke (broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). GraphPad Prism 6 avulla laskettiin Spearmanin korrelaatiokertoimet välillä

EZH2

ja E2F /Rb-reitti geenit.

knockdovvn

EZH2 ja E2F

vuonna SCLC linjat ja

E2F

ilmentäminen HBEC Solut

293T, HTB-175 ja H524 SCLC-solulinjat saatiin ATCC: stä ja niitä kasvatettiin mukaisesti ATCC ohjeita. Kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) kasvatettiin KSFM alusta täydennettynä naudan aivolisäkeuutetta ja EGF. Lentivirusvektorikonstruktit PLKO-puromysiiniresistenttejä plasmidit koodaavat shRNAs kohdistaminen

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, ja

EZH2

ostettiin Open Biosystems (RHS3979-201768515 , RHS3979-201745380, RHS3979-201745384 ja RHS4533-NM_004456). Lentivirukset tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Infektiokertoimella (MOI) määritettiin sekä PLKO (tyhjä vektorisäätö) ja E1 (EZH2 kohdistaminen shRNA) Virukset muokatuilla TaqMan alukkeita (eteenpäin 5 ’- GCGGTGTTCGCCGAGAT – 3’ ja reverse 5 ’- GAGGCCTTCCATCTGTTGCT – 3’). Transfektio suoritettiin, kuten on kuvattu Lockwood et ai [26]. Lyhyesti, jokaisen rivin ja virusten 150000 solut infektoitiin (käyttäen MOI 15 EZH2 viruksia) alusta täydennettynä 2 ug /ml polybreeniä. Kasvualustat oli täydennetty 1 ug /ml puromysiiniä valitsemiseksi infektoituneita soluja. Arvioida elinkelpoisuutta

EZH2

pudotus suhteessa kontrolleihin solujen MTT-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26].

E2F1

(EX-Z8212-M46),

E2F2

(EX-F0378-M46),

E2F3

(EX-T0731-M46), ja lusiferaasin ohjaus (EX -hLUC-M46) ORF kloonien hankittiin GeneCopoeia. Ohimenevä ekspressio suoritettiin kokeita käyttäen Lipofectamine LTX seuraten valmistajan ohjeita. Tehokkuuden E2F Knockdown ja yli-ilmentyminen, ja niiden vaikutukset EZH2 ilmentymisen tasot määritettiin Western-blottauksella.

Tulokset ja keskustelu

Perimän profilointi SCLC Kasvaimet, ja Vertailu SCLC Cell Lines

tiedot DNA kopioluvun profiileja näistä kasvaimista yhdessä 14 etuyhteydettömien SCLC solulinjoja esitetään kuviossa S1, ja tiedot ovat saatavilla Gene Expression Omnibus. Silmiinpistävän, havaitsimme toistumisen DNA kopioluvun muutoksia SCLC kasvaimissa, mukaan lukien alueet kattavat top polku ehdokkaita aikaisemmista solulinjasta tutkimuksessa kuten

TCF4

(18q21),

STMN1

(18q21) ja

E2F2

(1p36) [16].

E2F /Rb Pathway on Tarkemmin vapautettiin SCLC

aiempien havaintojen meitä ja muita, me arveltu, että solusyklin aktivaatio SCLC saattaa esiintyä pitkälle alavirtaan transkription tekijöitä, jotka säätelevät solusyklin etenemisen. Retinoblastoomaproteiinin polku on jo pitkään ollut vakiintunut keskeiseksi tavoitteeksi sääntelyn purkamisen SCLC.

RB1 ​​

usein katoaa tai mutatoitunut (60-90%) vuonna SCLC ja osoittaa vähensi ilmaisun useimmissa tapauksissa [5], [8], [11] – [13], [27]. Päätehtävä Rb on normaalin esto E2F transkriptiotekijöiden. Kun RB1 inaktivoivat fosforylaatio, E2F proteiinit ovat vapaasti toimimaan transkriptiotekijät aktivoimalla kokoelma solusyklin etenemisen tekijöitä. E2F geeniperheellä jaetaan aktivoimalla (E2F1, E2F2, E2F3) ja estävä (E2F4, E2F5) jäsenet, jotka fyysisesti vuorovaikutuksessa RB1 [15], [27] – [31].

Viimeaikaiset todisteet on osoittaneet E2F geenit voivat myös olla pääkohteita vapauttamisen. Muut tutkimukset ovat havainneet korkeat ekspressiotasot E2F1 ja E2F3 eri kasvaimissa, mukaan lukien SCLC [11] – [15]. Lisäksi Peifer ym huomattava korkea DNA monistaminen

E2F2

hiirimalleissa SCLC [5]. Yhdessä oman havaintoja

E2F2

kopioluvun voitto ja yli ilmaisun erityisesti SCLC solulinjoissa ja validointi

E2F2

kopioluvun muutoksia SCLC kasvaimissa, päätimme analysoida tarkemmin tämän väylän yhteydessä kopioluvun ja transkription vapauttaminen.

E2F /Rb keskittynyt analyysi kopioluku SCLC solulinjoissa (n = 14) ja kasvaimia (n = 14) paljasti lisäämään ainakin yhden aktivoivan

E2F

s tai menetys

RB1 ​​

in 14/14 tuumorinäytteissä ja 13/14 solulinjoissa (96% kaikista näytteistä; 95% CI 80%: sta 100%) (kuvio 1A). Tämä on sopusoinnussa genomi-profiilien äskettäin julkaisemassa Peifer et ai [5], jonka löysimme näytteille samaa mallia muutoksen 56/63 Tuumorinäytteissä (soveltamalla kopiomäärä kynnysarvot 1,7 genomi- menetyksen ja 2.3 genomista voitto segmentoidun datan tunnistettu tapahtumia 84% näytteistä, 95%: n luottamusväli 72%: sta 92%). Vaikka luottamus sidottu ei sisällä 100% vuonna Peifer et al tutkimus, on syytä huomata, että 29 tapauksessa, jossa järjestyksessä tiedot, 100% tapauksista oli joko

RB1 ​​

poistoa tai katkaisemalla mutaatio tapahtuma [5 ]. Tämä yhdessä aiempien arvioiden

RB1 ​​

mutaatio hintojamme SCLC (60%: sta 90%) [32], [33] viittaavat siihen, että E2F /RB1 häiriöitä on lähellä universaalia SCLC tapauksissa.

(A) Kopioi numero korjauksilla erityisiä E2F /Rb-reitti jäsentä SCLC solulinjoissa (ylhäällä) ja kasvaimet (alhaalla). Green varjostus merkitsee menetystä, kun taas punainen edustaa vahvistusta ja musta merkitsee mitään muutosta. (B) ekspressio E2F /Rb-reitti jäsentä RT-PCR: llä. Tiedot esitetään laatikko-kuvaajia absoluuttisen ekspressiotasoja johdettu mittakaavassa normalisoitu PCR tietoja. Keskiviivan jokaiseen laatikkoon edustaa mediaani tasolla, kun taas laatikon edustaa kvartiiliväli, jossa viikset ulottuu viimeisen ei-harha datapiste (määritelty 1,5 × neljännespisteiden välinen alue). Poikkeavien arvojen edustettuina ristejä. (C) Merkittävä yliekspressio EZH2 havaittiin SCLC verrattuna NSCLC näytteitä, jolloin myös ylimäärin aktivoitumisen E2F /Rb-reitti. (D) IHC suoritettiin käyttäen standarditekniikoita, jossa on ensisijainen anti-EZH2-vasta-ainetta ja kuvat otettiin 200-kertaisella suurennuksella. Esitetty ovat tyypillisiä esimerkkejä EZH2 proteiinin ilmentymisen keuhkoputkiepiteelissä, karsinoidien ja SCLC kasvaimia.

Reaaliaikainen PCR-analyysi transkriptitasot osoitti silmiinpistävää kuvio E2F aktivointi, ainakin kaksi aktivoimaan E2F jäseninä yli ilmaisemat 10 × niiden normaalille tasolle kaikissa SCLC solulinjassa, kun taas RB1 mRNA erittäin vähentyneet useimmissa SCLC solulinjoissa (kuvio 1 B ja taulukko S2). Nämä tasot vapauttamisen ovat merkittävästi suuremmat kuin havaittu paneelia NSCLC solulinjojen perustuu yhden pyrstö U-testi, tukemalla SCLC erityinen luonne näistä tapahtumista (SCLC vs NSCLC:

E2F1

p = 0,0034,

E2F2

p = 2,310 x 10

-5,

E2F3

p = 1,744 x 10

-5,

RB1 ​​

p = 0,0078; kuvio S2). Vapauttaminen E2F ja RB1 selostukset on ilmainen äskettäin tuloksiin Byers et al jotka havaitaan SCLC spesifistä proteiinia tason sääntelyn purkaminen Rb ja E2F1 on proteomic profilointi tutkimus SCLC, NSCLC ja normaali keuhkojen solulinjat [11].

Yhdessä näyttää siltä, ​​että Rb-reitti on vapautettu ei vain menetys Rb kopiota /toiminto mutta myös genomista voitot E2F transkriptiotekijöitä SCLC. Yhdessä tämä viittaa siihen, että E2F /Rb-reitti aktivoituu kaikissa SCLC näytteet tässä tutkimuksessa, joko menetys

RB1 ​​

tai kopioida vahvistuksen sellaisen

E2F

jäsen geeni. Analyysimme ulkoisten tietojen tämä pätee lisää kliinisiä SCLC kasvain ikäluokat [5].

yli-ilmentäminen E2F /Rb Target EZH2

Silmiinpistävä kuvio E2F /Rb sääntelyn purkamista SCLC solulinjat ja kasvaimet sai meidät tutkimaan geenien alavirtaan E2F transkriptiotekijöiden. Yksi kohde E2F /Rb-reitti, joka on hiljattain kuvattu onkogeenin useita syöpätyyppejä on

EZH2

. EZH2 on Polycomb (PCG) geeni rooli alkion kehitykseen erottautumistaan ​​epigeneettiset transkription säätelyyn geenien kriittisen tärkeä varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia alkion solujen ja luoda linjaa spesifisyys [34] – [36]. Se ohjaa suoraan DNA: n metylaatio useiden kohdegeenien kuten

WNT1

, joka vahvistaa aiemmat tutkimukset, joissa useita geneettisiä osumia havaittiin sulkemaan WNT väylän SCLC solulinjoissa [16], [36]. EZH2 yli-ilmentyminen on havaittu monissa syövän alatyyppejä, kuten: eturauhas-, rinta-, virtsarakko-, levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä ja hepatosellulaaristen karsinoomien [37] – [44]. Kun kyseessä on okasolusyöpä keuhkosyöpä, EZH2 ilmentyminen on havaittu dysplastic okasolujen ja kasvaimia, mutta ei normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa, mikä viittaa siihen,

EZH2

aktivointi voisi myös olla varhainen tapahtuma NSCLC [39]. Lisäksi tutkimukset useiden syöpätyyppien ovat sidoksissa ilmaus EZH2 aggressiivisuutta, invaasion ja sisplatiinin vastus syytetään rooli EZH2 in aggressiivinen kasvain käytös [43], [45] – [47].

Tutkimuksessamme ilmentymisen analyysi EZH2 NSCLC ja SCLC solulinjoja paljasti silmiinpistävä tila yliaktivoitumistilojen vuonna SCLC verrattuna NSCLC soluihin (U-testi, p = 4,52 x 10

-6; kuvio 1C). Tuloksemme viittaavat siihen, että EZH2 on keskimäärin 42-kertainen yliekspressoitiin SCLC linjat verrattuna 13-kertainen yliekspressoitiin NSCLC solulinjoissa. Vahvista jos yli-ilmentyminen EZH2 esiintyy myös kasvainten, olemme analysoineet tietoja riippumattoman cDNA ilmaisun array tutkimuksen [13], joka profiloitu erilliset 11 solulinjojen ja paneeli 15 ensisijaisen SCLC kasvaimia, lisäksi 12 adenokarsinoomat (NSCLC alatyyppi). Vaikka tarkkaa kertaluokkamuutos tasot olivat suoraan vastaa (mahdollisesti johtuen eroista RT-PCR ja cDNA microarray dynaaminen alue), suuntaus ekspressiotasot on silmiinpistävän samanlainen Tutkimuksessamme huomattavasti korkeampi ilmentyminen EZH2 vuonna SCLC solulinjoissa ja kasvaimia verrattuna NSCLC näytettä (kuva S2). Tämä on sopusoinnussa tulosten Byers ym joka äskettäin havaitaan lisääntynyttä EZH2 proteiinin ilmentymistä SCLC solulinjoissa [11].

Varmista, että mRNA-tasot kääntää lisääntyneestä proteiinin tasot kliinisissä kasvaimissa, suoritimme IHC on kudos joukko SCLC kasvainten, karsi- ja normaali keuhkojen kudoksia, ja havaitaan lisääntynyttä värjäytymistä EZH2 että SCLC kasvain näytteet (n = 13), verrattuna karsinoideja, ja keuhkoputken epiteelin (kuva 1D, taulukko S3). Bracken et al [38] ehdotetaan, että sekä suorat

E2F

DNA: n monistuksen ja

RB1 ​​

häiriöitä voi johtaa vapauttamisen EZH2 ilmaisua. Merkittävä EZH2 yliekspressio olemme kuvailleet SCLC todennäköisesti ole alhaisen tason kopiomäärä voitot havaittavat SCLC solulinjoissa ja kasvaimet, kuten aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että keskimäärin 2-kertainen kopioluvun vahvistusta liittyy keskimäärin 1,5-kertainen muutos liittyy mRNA tasoilla [38], [48], mikä viittaa siihen, että yli-ilmentyminen EZH2 vuonna SCLC, ensisijaisesti ohjaa E2F /Rb häiriöitä, pikemmin kuin suora kopio määrä muutoksia.

arvioidaan hypoteesia, että E2F /Rb häiriöitä johtaa EZH2 aktivointia, arvioimme assosiaatiot EZH2 ja E2F /RB1 mRNA ekspressiotasot kaksi julkista SCLC aineistoja. Vuonna microarray aineisto 56 SCLC linjat, löysimme positiivinen korrelaatioita EZH2 ja E2F1 (r

2 = 0,3957, p = 0,0013) ja E2F2 (r

2 = 0,3124, p = 0,0095), ja mitään merkittävää korrelaatioita välillä EZH2 ja E2F3 (r

2 = 0,1689, p = 0,1067) tai RB1 (r

2 = 0,0712, p = 0,6989) (taulukko S4). 15 SCLC kasvainten RNA-sekvensoinnilla data, havaitsimme vahva positiivinen korrelaatioita EZH2 ja E2F1 (r

2 = 0,5179, p = 0,0253) ja E2F2 (r

2 = 0,6357, p = 0,0064), ja ei merkittäviä korrelaatioita EZH2 ja E2F3 (r

2 = -0,1571, p = 0,7166) ja RB1 (r

2 = -0,1929, p = 0,2450) (taulukko S4). Se, että RB1 ei merkittävästi korreloi E2F ilmentymistä näissä aineistoja todennäköisesti heijastaa alhainen ilmaisee yleisesti RB1 poikki näiden näytteiden, ja rooli fosforylaation RB1 toiminto, jota ei ole otettu huomioon näitä tietoja. Nämä tulokset antavat lisänäyttöä siitä, että aktivointi E2F1 ja E2F2 liittyy aktivaatio EZH2.

vaikutus E2F manipulointia on EZH2 Expression

Seuraava suoritetaan E2F Knockdown kokeita suoraan arvioida seurauksia E2F modulaation EZH2 ekspressiotasoja SCLC. ShRNA välittämää knockdowns of E2F1, E2F2, ja E2F3 osoitti vähennykset EZH2 proteiinin tasot, istuva meidän hypoteesia, että E2Fs moduloida EZH2 ilmentymistä SCLC (kuva S3A). Lisäksi olemme suoritetaan yli-ilmentyminen kokeiluja kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) [49], jotka ovat ei-pahanlaatuinen malli, jota käytetään tutkimaan molekyyli synnyssä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, koska tähän mennessä ei ole ei-pahanlaatuiset neuroendokriini malli tällä hetkellä saatavilla arvioimiseksi muuttaen mahdollisuuksia geenien SCLC tietyn prekursorisolun tyyppi. Havaitsimme voimistunutta ilmentymistä EZH2 kun induktion E2F2 (kuva S3B). Vaikutukset E2F Knockdown ja ilmentymisen vaikutus EZH2 tasoilla yhdessä positiivisen korrelaation havaitsimme välillä E2F ja EZH2 mRNA ekspressiotasot viittaavat siihen, että aktivointi E2Fs johtaa vastaava kasvu EZH2 tasoilla. Nämä havainnot tukevat hypoteesia, että lisääntynyt ilmentyminen E2F jäsenten johtaa EZH2 aktivoitumisen SCLC.

PRC2 Tavoitteet hypermetyloitunut SCLC

PCG on ollut suurta kiinnostusta monissa kasvaintyypeissä viime vuosina , koska sen rooli kopiointia hiljentäminen ilmentyminen tuumorisuppressorigeeneille kautta chromatin remontin ja ohjaamalla DNA: n metylaatio. PcG proteiinit muodostavat multi-proteiini kompleksit, jotka tukahduttavat transkription kautta translaation jälkeisen modifikaation histonien, erityisesti tri-metylaatio 27. lysiini on histoni 3 (H3K27Me3). Suuri osuus (50-80%) geenejä, jotka poikkeavasti epigeneettiseltä vaiennetaan DNA promoottori hypermetylaation useimmissa ihmisen syövissä ovat ne merkitty Polycomb- Sortavat Complex 2 (PRC2) alkionkehityksen aikana, jossa tukahduttava histonimerkkien toimivat ”sammuttaa” solu kohtalo määritetään geenit, bestowing eriytymättömiä itseuudistumisen valmiuksia alkion kantasolut [50] – [53]. Koska EZH2 on kriittinen katalyyttinen jäsen PRC2 monimutkainen, ja kyky tämän monimutkaisen rekrytoida

de novo

DNA metyloinnin entsyymit (DNMT3a /b), olimme kiinnostuneita arvioitaessa CpG promoottori metylaation SCLC kasvaimia esiintyi ensisijaisesti geeneissä merkitty PRC2 alkion kantasoluja. Näin ollen, olemme analysoineet metylaatiostatuksen EZH2-PRC2 kohdegeenien ensisijainen Tuumorinäytteissä [22]. Data on saatavilla Gene Expression Omnibus.

Löysimme ylivoimainen osuus geenien kohteena EZH2 ja PRC2 monimutkaisia ​​hypermetyloitunut SCLC kasvaimissa verrattuna normaaleihin hengitysteiden epiteeli terveistä yksilöistä (kuva 2). Sovellettuaan tiukat suodatusehtoja tunnistimme 2756 hypermetyloitunut antureista (p-arvo 0,05, delta β = 0,2), ja 1372 hypometyloidut antureista (p-arvo 0,05, delta β = -0,2) in SCLC suhteessa terveisiin hengitysteiden epiteelin solut. Out of 3497 koettimet liittyvät geenit, joiden tiedetään olevan alkion kantasoluilla EZH2 tavoitteet [22], löysimme 18% (640 antureista) näiden geenien hypermetyloitunut, verrattuna vain 3% (93 antureista) hypometyloidut in SCLC. Silmiinpistävän, EZH2-PRC2 kohdegeenien osuus oli 23% kaikista hypermetyloitunut koettimien näissä kasvaimissa yleistä. Verrattuna ei-PRC2 tavoitteet, rikastaminen PRC2 kohdegeenien meidän hypermetyloitunut koetinsarjaa oli tilastollisesti merkitsevä (Fisherin tarkka testi, p = 2,2 × 10

-16). Nämä tiedot viittaavat siihen, että analoginen työskennellä useiden muiden ryhmien erilaisia ​​syöpiä [50] – [55], SCLCs näyttää promoottorin hypermetylaatio profiilin erittäin yhtäpitävä kuvion geenien vaiennettu alkion kantasoluja, jotka PRC2 monimutkainen. Ehdotamme, että SCLC, EZH2 yliekspressio aiheuttama DNA-tasolla E2F /Rb-reitti häiriöitä tuloksia rekrytoinnissa

de novo

DNA metyloinnin entsyymejä ja perustamalla ”kantasolun kaltainen” hypermethylator profiilin.

metylointi β-arvot 1683 geenien suunnattu PRC2 H3KMe3 hiiren alkion kantasoluja piirretään kullekin ryhmälle. Nämä 1683 geenit kartoitettiin 3497 Illumina HM27 antureista, joista 18% (640 antureista) ovat hypermetyloitunut ja 3% (93 koettimet) on hypometyloidut in SCLC kasvaimissa suhteessa normaaliin hengitysteihin. Geenit suunnattu H3KMe3 hiiren alkion kantasoluja EZH2 ja PRC2 monimutkaisia ​​ensisijassa hypermetyloitunut SCLC kasvaimia, jotka osoittavat, että EZH2 on toiminnallisesti aktiivinen SCLCs.

EZH2 tarvitaan nopea kasvu SCLC Cell Lines

vieressä arvioitiin kasvaimia synnyttävän potentiaalin EZH2 vuonna SCLC käyttäen lentivirus- välittämä knockdowns kahdessa SCLC solulinjoissa (H524, HTB175). Molemmat Knockdown linjat osoittivat silmiinpistävää hidastumista verrattuna tyhjän vektorin valvontaa (Studentin t-testi, p 0,05) (kuva 3). Vahvistavia meidän havainnot, tuore tutkimus, johon proteomic profilointi SCLC solulinjojen osoitettiin yliekspressio EZH2 vuonna SCLC ja osoitti kasvu vähenee H69 soluissa upon ohimenevä siRNA Knockdown [11]. Pro-proliferatiivisia ja anti-eriyttäminen toiminnot EZH2 ovat sopusoinnussa erittäin aggressiivinen ja erilaistumaton kliiniset ja patologiset esittäminen SCLC. Voimakas pro-proliferatiivinen luonne EZH2, voisi myös osittain selittää toleranssi SCLC-solujen tällaisten korkean tason E2F-mRNA: n, kuten jotkut E2F-proteiinit ovat kykeneviä antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottisten toimintoja, kun yli-ilmentynyt [15], [28] – [30], [38].

(A, E) vahvista knockdovvn EZH2, RNA uutettiin transfektoiduista linjat ja qPCR suoritettiin. Ekspressio taintumisen riviä (E1) on esitetty suhteessa PLKO valvontaa. (B, F) Vahvistus proteiinin tasot EZH2 että knockdown linjat suoritettiin käyttäen standardeja Western blotting menetelmiä. Sekä qPCR ja Western blotting todentaa EZH2 tasot alenivat yli 50% HTB-175 ja H524-solujen upon shRNA välittämän knockdown. (C, D, G, H) Arvioidaan kannattavuutta

EZH2

Knockdown suhteessa kontrolleihin soluihin suoritimme MTT määrityksissä. Knockdovvn EZH2 aiheutti merkittävän ja toistettavan vähentää solujen elinkelpoisuus molemmissa SCLC solulinjoissa (Studentin t-testi, p 0,05).

Johtopäätökset

Tämän työn, ehdotamme että E2F /Rb-reitti on keskeytyksiä ei vain menetys tai mutaatio Rb vaan myös DNA: n kopioiden lukumäärä voitot E2F transkriptiotekijöiden. Ehdotamme, että tämä mekanismi ajaa tietyn yli-ilmentyminen useiden kohdegeenien, kuten EZH2, joka johtaa aktivoinnin PRC2 monimutkainen ja edistäminen poikkeavan metylaation SCLC. Meidän havainnot tukevat aikaisempia tutkimuksia ja on vahva vaikutuksia hoitoon SCLC.

Useita mitogeenisestä reittejä, kuten MAPK sääntelyn purkaminen ovat myös pystyy kuljettamaan E2F funktion puuttuessa tietyn ylävirtaan osumia SCLC, kuten usein