Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tuore tutkimus osoitti, että korkeampi ilmentyminen N-myc vaimentua geeni 1 ( NDRG1) korreloi huonon ennusteen mahalaukun syöpäpotilailla. Tässä tutkimuksessa, kysyimme, onko NDRG1 on keskeinen rooli pahanlaatuisia etenemisen lukien etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsoluja. By geenien ilmentymisen mikrosiruanalyysi ilmaus NDRG1 osoitti suurempi kasvu keskuudessa yhteensä 3691 asti geenien on erittäin metastaattinen mahasyövän solulinja (58As1) kuin niiden vanhempien alhainen metastaattinen vastine (HSC-58). Erittäin metastaattinen solulinjat osoitti vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin sekä paremman ilmentymisen vimentiinista ja Snail. Tämä vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin palautettiin Snail Knockdown erittäin metastaattinen solulinjoissa. Me seuraavaksi vakaa NDRG1 pudotus solulinjoja (As1 /Sic50 ja As1 /Sic54) päässä erittäin metastaattinen solulinja, ja molemmat näistä solulinjoista osoitti lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen vimentiinista ja Snail. Ja myös E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasiaktiivisuus havaittiin korotetaan NDRG1 pudotus on erittäin metastaattinen solulinja. NDRG1 Knockdown mahalaukun syöpäsolujen osoitti tukahdutti invaasiota syöpäsolujen osaksi surround kudoksiin, tukahdutetaan etäpesäke vatsakalvon ja laski askitesta kertymistä hiirillä merkittävästi parantaa eloonjäämisaste. Tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että NDRG1 pelaa keskeinen rooli pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän epiteelin mesenkymaalitransitioon.

Citation: Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M , et ai. (2012) N-myc Loppupään Säännellyt Gene 1 (NDRG1) Edistää Etäpesäke Ihmisen Scirrhous Mahalaukun Syöpäsolut kautta epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 23 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan-in-tuki Cancer Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (Dr. Ono), ja jonka kolmas Term Kattava ohjaus Research for Cancer alkaen terveysministeriön, Labor, ja hyvinvointi Japanin (Dr. Kuwano). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten Japanissa ja muissa Aasian maissa. Potilas ennustetta scirrhous mahakarsinooman on erityisen huono. Scirrhous mahakarsinoo- liittyy usein vatsakalvon levittäminen ja etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin ja maksa, jotka ovat vakavia ongelmia, on valvottava. Geeniekspressioprofiili paljasti geenin amplifikaatioita K-sam ja c-Met: in 30-40% scirrhous syöpien, ja että yli-ilmentyminen erilaisia ​​kasvutekijöitä, kuten transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β), verihiutalekasvutekijän tekijä (PDGF), insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) ja fibroblastikasvutekijä-2 (FGF-2) [1]. Viimeaikaiset DNA microarray-analyysi osoitti erityistä säätelyä useita geenejä, mukaan lukien

SPARC

,

RGEIII

,

S100A10

, ja I-tyyppistä kollageenia [2] – [4].

eläinten malleja, jotka heijastavat ominaisuudet syöpä vatsakalvotulehdus ja etäpesäke vatsakalvon ovat tärkeitä ymmärtämisen kehittämisessä pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän. Yanagihara

et al.

[5] määritti ensin HSC-58-solulinja ihmisen scirrhous mahasyöpä, ja sitten perustettiin kaksi alilinjat, 58As1 ja 58As9, joilla on korkea potentiaali vatsakalvon levittämistä ja imusolmuke etäpesäke toistuvilla ortotooppisten inokulaation HSC-58-solujen kohdalla mahalaukun seinämän kateenkorvattomissa hiirissä [6], [7]. Nämä alalinjoja aiheuttavat usein kertymistä askites jälkeen ortotooppinen implantaatio ja näyttää lisääntyneen ilmentymisen geenejä, jotka koodaavat proteaaseja ja proteiinien liittyi solun tarttumiseen, solun liikkuvuus, proliferaation ja angiogeneesin [6]. Ne myös kasvaa valikoidusti mahalaukun submukoosassa, ja tunkeutua syvemmälle kerros päästä herakalvon tason vatsa [7]. On kuitenkin vielä epäselvää, miksi ne ovat saaneet niin suuri potentiaali etäpesäkkeitä valinnan aikana.

Meidän Tässä tutkimuksessa käytimme näitä erittäin metastaattinen solulinjojen selvittämään, miten ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa voisi hankkia metastaattista potentiaalia. Ensin verrataan geeniekspressioprofiilien välillä erittäin metastaattinen ja alhainen metastaattinen vanhempien solulinjoissa mikrosiruanalyysillä. Olemme keskittyneet yksi geeni nimeltä N-myc alavirtaan säännelty geeni 1 (NDRG1), koska se havaittiin selvästi voimistunut on erittäin metastaattinen mahasyövän solulinjoja verrattuna niiden vastine soluihin. Lisäksi aiemmin raportoitu, että NDRG1 ilme oli predicative merkkiaine pahanlaatuinen etenemisen ja huonon ennusteen mahalaukun potilailla [8]. Tämän mukaisesti tutkimuksessa havaitsimme, että korkean NDRG1 ilmentyminen korreloi merkitsevästi kasvaimen angiogeneesiä ja pahanlaatuiset etenemisen yhdessä huonon ennusteen mahasyövässä [9]. Meillä on myös raportoitu, että NDRG1 pudotus indusoi tuotannon vähenemiseen tehokkaita angiogeenisten tekijöiden ja kasvaimen angiogeneesin keuhkosyövän soluja, ja lisäksi, että NDRG1 on ennustava markkeri kasvaimen angiogeneesiä ja huonon ennusteen potilailla, joilla ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10]. NDRG1, yksi neljästä NDRG perheen geenejä, mikä osoittaa erilaisia ​​toimintoja [11], ja NDRG1 toimii joko etäpesäke vaimennin tai onkogeenisten ja pahanlaatuisten promoottorin, riippuen kasvaintyypeissä [11], [12]. Lisäksi ilmentyminen NDRG1 geenin valvotaan tarkasti N-Myc: llä ja niihin liittyvät Myc proteiinit [13], ja yli-ilmentyminen c-Myc indusoi epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) in nisäepiteelisoluissa [14]. Tärkeän roolin EMT viitataan usein sen lähellä kehitystä vasten ja syövän etenemistä lukien syövän etäpesäkkeiden [15], [16]. Kuitenkin näissä tutkimuksissa, sääntelyn rooli NDRG1 ei ole tutkittu. Meidän Tässä tutkimuksessa tutkimme metastaattista potentiaalia mahalaukun syöpäsolujen sen korrelointia EMT-pohjainen rooli NDRG1.

Tulokset

vertailu Cell Growth, Solumorfologia, Tumor Growth, levittäminen ja Gene Expression Profiles välillä Helposti metastasoitunut mahasyöpä syöpäsolulinjoista ja niiden Low metastaattinen Counterpart

yhdenmukainen aiempien tutkimusten [6], [7], erittäin metastaattinen solulinjoissa 58As1 ja 58As9 kasvuvauhti oli kuin niiden vanhempien vastine, HSC-58, jossa on kaksinkertaistaa aikoina 23-26 tuntia verrattuna 30 tuntia vanhempien soluja (kuvio 1A). 58As1 solut helposti irrotettavissa ja osoitti jousitus-tyyppinen solujen kasvun kanssa pyöreä morfologia, kun taas HSC-58 ja 58As9 solut kiinnitetään ja osoitti kerroksellinen solujen kasvua fibroblastisella morfologia (kuvio 1 B). Sekä 58As1 ja 58As9 solut osoittivat paljon korkeampi kasvaimen kasvulukuja ihonalaisen ksenograftimallia verrattuna vanhempien HSC-58-solut (kuvio 1 C). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että potilaalle tehdä elinsiirron 58As1 solujen aiheuttama paljon korkeampi vatsakalvon levittämistä ja askitesta kertymistä kuin HSC-58-soluissa [6], [7]. Olemme edelleen vahvisti vatsakalvon levittämistä solujen istuttamalla ne vatsaonteloon hiirien. Hiiret istutettiin 58As1 solut osoittivat ulkonäkö keskimäärin 8 ± 3 näkyvä kyhmyjä suoliliepeessä kunkin hiiren ja kertymistä askites (vaihteluväli 0,7-2,5 ml /hiiri) (kuvio 1 D, E). Sitä vastoin, hiiret istutettu vanhempien HSC-58-solut osoittivat muodostumista vähän jos ollenkaan pieniä kyhmyjä, ja mitään ilmeistä kertymistä askites.

(A) Vertailu soluproliferaation hinnat

in vitro

. Solut siirrostettiin päivänä 0 (5 x 10

4 solua /malja) ja kasvu mitattiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kaksinkertaistaminen ajat olivat 34, 27, ja 23 h HSC-58 (musta), 58As1 (harmaa) ja 58As9 soluja (valkoinen), tässä järjestyksessä. (B) morfologiset mahasyövän solulinjan

in vitro

. HSC-58 ja 58As9 solujen kasvua näkyi kiinnitetään kerrokset fibroblastisella morfologia. 58As1 solut osoittivat suspension-tyyppinen solujen kasvua pyöreä morfologia. (C) Kasvaimen kasvu mahalaukun syövän solulinjojen päivänä 14 ja 28. HSC-58 (musta), 58As1 (vaaleanharmaa) ja 58As9 (tummanharmaa) implantoitiin ihon alle 1 x 10

7-solut päivänä 0 . 58As1 tai 58As9 solut osoittivat merkitsevästi (*

p

0,01) korkeammat kasvaimen kasvu kuin HSC-58 soluihin. (D, E) Peritoneaalisille levittämistä ja askites muodostuminen

in vivo

. Tyypillisiä luvut osoittavat korkean ja matalan vatsakalvon levittämisen ja askites kerääntyminen päivänä 55 siirrostuksen jälkeen 1 x 10

6 soluja vatsaonteloon. Kukin hiiri osoitti askites kertymistä 0,7-2,5 ml ja 5-12 kyhmyt suoliliepeessä seuraavat 58As1 rokotus, mutta tämä ei ollut ilmeinen kanssa HSC-58 soluihin. N.D., ei havaittavissa. (F) Microarray analyysi geenien ilmentymisen, jotka ovat ylä- tai alaspäin säännellään erittäin metastaattinen solulinjassa, 58Asl verrattuna HSC-58. Suhteelliset ekspressionopeuksia esitellään kuuluvien geenien kolme biologisia toimintoja.

Seuraava verrattuna geeniekspressioprofiilien välillä 58As1 solujen ja niiden vanhempien vastine, HSC-58, käyttämällä DNA mikrosiruanalyysillä. Ja 41000 RNA-transkriptien ja variantteja, olemme määritelleet 3691 differentiaalisesti ilmentyvien geenien, jotka ilmentyivät 2-kertaiseksi, ja 3536-geenit, jotka olivat vaimentua 0,5-kertainen tai vähemmän 58As1 soluissa verrattuna HSC-58-soluissa. Kuvio 1F esitetään geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti 58As1 soluissa verrattuna HSC-58-soluja, rajoittumatta ne, jotka kuuluvat NDRG perheen, ja geenit, jotka liittyvät metastaasiin, mukaan lukien matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) /katepsiinit, tarttuvuus ja epiteelin-mesenkymaaliset-siirtymä ( EMT). Neljän geenien NDRG perheen [17], ilmentyminen NDRG1 ja NDRG4 on yliaktiivista erittäin metastaattinen solulinja (58As1) verrattuna emo-solulinja (HSC-58). Ilmaisu EMT liittyvien geenien 58As1 soluissa vaikutti erityisesti hankinta korkean metastaattisen potentiaalin. Ekspression epiteelin-spesifisten geenien, kuten E-kadheriinin (

CDH1

), P-kadheriinin (

CDH3

) ja β-kateniinin (

CTNNB1

), säädeltiin vähentävästi . Sen sijaan vain MMP-1 (

MMP-1

) ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut; ilmaus katepsiini L (

CTSL1

) lisättiin, mutta se katepsiini B (

CTSB

) ei ollut. Ilmentyminen mesenkyymispesifisissä geenejä, vimentiinistä (

VIM

) ja Snail (

SNAI1

), keskeinen transkriptio tekijä tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentyminen oli upregulated.

Tehostettu NDRG1 Gene Expression in Erittäin Metastaattinen mahasyövän Cell Lines

entisestään verrattuna proteiinin ilmentyminen useiden geenien HSC-58, 58As1 ja 58As9 solut (kuvio 2A). Ilmentyminen NDRG1 oli merkittävästi lisätty, ja että vimentiinin, Snail, p-ERK1 /2, p-Akt, ja p-GSK-3β lisättiin myös, sekä 58As1 ja 58As9 soluja verrattuna HSC-58-soluissa. Ei ollut mitään näkyvää ilmentymistä Wnt3a ja Wnt5a näissä solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Sen sijaan havaitsimme, vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin ja β-kateniinin 58As1 ja 58As9 soluja verrattuna HSC-58-soluissa (kuvio 2A). Fosforylaatiota β-kateniinin Ser33 /37 ja Ser552: n havaittiin olevan paljon vähemmän 58As1 ja 58As9 kuin HSC58. Sopusoinnussa proteiinin ekspressiotasoja, mRNA: n ekspressiotasot NDRG1, vimentiinin, Snail ja MMP-1-oli korkeampi sekä erittäin metastaattinen solulinjoissa kuin vanhempien vastine (kuvio 2B). Oli paljon vähemmän mRNA: n ilmentymisen E-kadheriinin ja β-kateniinin sekä 58As1 ja 58As9 kuin HSC-58.

(A) Western blot -analyysi kokosoluliuotteista osoittaa proteiinin ekspressiotasot NDRG1, kasvutekijän reseptorin EMT-sukuiset proteiinit, Wnt /β-kateniinin liittyviä proteiineja, ja muut tekijät HSC-58, 58As1 ja 58As9 soluja. (B) vertailu mRNA ekspressiotasot NDRG1, E-kadheriinin, vimentiinistä, Snail, MMP-1 ja β-kateniinin HSC-58, 58As1 ja 58As9 solujen qRT-PCR-analyysillä. (C) Immunosytokemialliset analyysi E-kadheriinin ja β-kateniinin HSC-58 ja 58As9, käyttäen spesifisiä vasta-aineita E-kadheriinin, β-kateniinin ja DAP1. Suurennus × 200. (D) Western blot analyysi osoittaa ekspressiota β-kateniinin ja Snail nucleus ja sytosoliin osa. CREB, ydinvoima merkki, ja α-tubuliinin, joka on solulimaan merkki. (E, F) Vertailu lusiferaasiaktiivisuuden ohjaavat E-cadhrin promoottorin ja β-kateniinin (TopFlash) ohjaa promoottori HSC-58 ja sen erittäin metastaattinen solulinjat. Suhteellinen promoottoriaktiivisuus esitetään suhteutettuna oleva toiminta HSC-58. * P 0,01.

immunosytokemiallinen analyysi paljasti, että lokalisoinnin E-kadheriinin sekä sytoplasmassa ja kalvo, ja β-kateniinin oli enimmäkseen sijaitsi sytoplasmassa sekä HSC-58 ja 58As9 soluja (kuvio 2C) . Immunosytokemiallisessa analyysi 58As1 ei voitu suorittaa, koska 58As1 kasvaa suspensiossa. Lisäksi ilmentyminen β-kateniinin oli suhteellisesti pienempi sekä sytoplasmassa ja tumassa, mutta että Snail havaittiin olevan paljon suurempi ytimen 58As1 ja 58As9 kuin HSC-58 (kuvio 2D). Tutkimme myös E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta (kuvio 2E) ja β-kateniinin aiheuttama toimittaja aktiivisuutta TopFlash reportterianalyysi (kuvio 2F) ja totesi, että oli merkittävä lasku lusiferaasiaktiivisuutta ohjaavat E-kadheriinipromoottorin ja myös β-kateniinin sekä 58As1 ja 58As9 verrattuna HSC-58, vastaa mRNA-tasot molempien geenien.

NDRG1 knockdown indusoi lisääntymisen merkkejä E-kadheriinin ja vaimennussäätely vimentiinista ja Snail erittäin Metastaattinen Solut

Me seuraavaksi tutkittava, onko NDRG1 knockdown erityisesti kohdistuu ilmentymistä EMT liittyvien geenien erittäin metastaattinen solulinjan, 58As1. Perustimme kaksi stabiilia NDRG1 pudotus solukloonien, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 transfektoimalla NDRG1 shRNA osaksi 58As1 soluihin. Molemmat As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluista osoittivat samanlaisia ​​kasvuvauhti toisiinsa ja niiden vanhempien vastine As1 /Mock3, jossa kaksinkertaistaa aikoina 25-27 tunnin viljelmässä (kuvio 3A). Molemmat NDRG1 vaiennetaan solulinjat osoittivat tarttuu tiukasti solujen kulttuuriin lautasen ja sidekudosta morfologia, kun taas As1 /Mock3 solut osoittivat suspension-tyyppinen solujen kasvua pyöreillä solumorfologiaan (kuvio 3B). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus NDRG1 hiljentäminen on kasvaimia aktiivisuutta 58As1 solujen käyttäen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun määrityksessä. Molemmat NDRG1 vaiennetaan solulinjat osoittivat merkittävästi vähentää niiden kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, kuten on osoitettu pesäkkeiden määrä pehmeässä agarissa (

*

p

0,01) (kuvio 3C).

( A) solujen lisääntyminen RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS seurasi jälkeen kylvö 5 x 10

4 solua /malja päivänä 0. Kahdentumisajat olivat samanlaiset As1 /Mock3 (musta), As1 /Sic50 (harmaa) ja As1 /Sic54 (valkoinen) soluja (26-30 h). (B) Solujen morfologiaa As1 /Mock3, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54. Tyypilliset solujen morfologia viljelmässä osoittaa As1 /Mock3 jousitus-tyypin solujen kasvuun ja kiinnitetty kerros-tyyppinen solujen kasvua sekä NDRG1 knockdowned solulinjoissa. (C) Kuvat ovat pesäkkeiden As1 /Mock3, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 kun inkuboitiin 14 päivää pehmeässä agarissa (vasen paneeli). Kvantitatiivinen analyysi pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta kolme solulinjojen kun 5 ruokia jokaiselle riville pisteytettiin (oikea paneeli). Merkittäviä eroja (*

p

0,01) pesäkeluvussa välillä 58As1 ja sen NDRG1 pudotus solulinjoissa.

Sitten verrataan geeniekspressioprofiilien välillä As1 /Mock3 ja As1 /Sic50 soluihin käyttäen DNA-siru-analyysi (kuvio 4A). NDRG1 pudotus lisännyt ilmentyminen E-kadheriinin (

CDH1

) ja P-kadheriinin (

CDH3

), mutta vähentynyt ilmentyminen vimentiinista (

VIM

) ja Snail (

SNAI1

). Me seuraavaksi suoritetaan Western blot ja qRT-RCR analyysit useita molekyylejä, jotka moduloidaan NDRG1 Knockdown vuonna mikrosiruanalyysi (kuvio 4B, C). Nämä kaksi solulinjaa osoitti paljon pienempi ilmentyminen sekä NDRG1 mRNA: ta ja proteiinia verrattuna As1 /Mock3 soluja. Tehostettu ekspressio E-kadheriinin havaittiin yhdenmukaisesti As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluja verrattuna As1 /Mock3 solujen Western blot -analyysillä. Vuonna As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluja, sekä western blot ja qRT-PCR-analyysit vahvistivat vähentynyt ilmentyminen vimentiinista ja Snail vaikuttamatta ilmentymistä p-ERK1 /2, ERK1 /2, s-Akt, Akt, p-GSK-3β ja GSK-3β (kuvio 4B, C).

(A) Microarray analyysi vaikutuksen NDRG1 knockdown on geenien ilmentymisen, jotka ovat ylä- tai alaspäin säännellään Asl /Sic50 versus As1 /Mock3. Suhteelliset ekspressionopeuksia esitellään kuuluvien geenien kolme biologisia toimintoja. (B) vertailu proteiinin ekspressiotasot NDRG1, EMT-sukuiset proteiinit, β-kateniinin, Akt, p-Akt, ERK1 /2, s-ERK1 /2, GSK-3β, p-GSK-3β ja EGFR Western blot analyysi kokosolulysaattia. (C) mRNA ilmentymä NDRG1, E-kadheriinin, vimentiinistä, Snail, MMP-1 ja β-kateniinin määritettiin qRT-PCR-analyysillä. (D) Vertailu Lusiferaasiaktiivisuuden ohjaavat β-kateniinin (TopFlash) välillä As1 /Mock3 ja sen NDRG1 knockdowned solulinjoissa. Suhteellinen luminenssi kertainen esitetään suhteutettuna arvo As1 /Mock3. Kukin sarake on keskimäärin kolmena kappaleena kokeiden ± SD.

Toisaalta, NDRG1 on tunnettu tukahduttaa etäpesäkkeiden ja soluproliferaatiota eturauhas- ja paksusuolen syöpäsoluissa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että NDRG1 moduloi Wnt-β-kateniinin signalointireitin, joilla on tehostunut ilmentyminen E-kadheriinin ihmisen eturauhas- ja paksusuolen syöpä solujen [18], [19]. Kuitenkin NDRG1 pudotus on 58As1 solut eivät vaikuta β-kateniinin ilmentymistä sekä proteiini- ja mRNA-tasolla (kuvio 4B, C). Ja myös β-kateniinin ohjaavat promoottorin aktiivisuutta TopFlash reportterianalyysi paljastanut mitään eroa promoottorin aktiivisuuteen As1 /Mock ja NDRG1 vaiennetaan solulinjoissa. Näin ollen, β-kateniinin ilmentymistä ei vaikuttanut NDRG1 pudotus. NDRG1 pudotus siis jatkuvasti lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen Snail ja vimentiinista vuonna erittäin metastaattinen solulinjassa. Kuitenkin, ei havaittu selvää muutosta ilmentymisen β-kateniinin by NDRG1 knockdown.

Enhanced E-kadheriinipromoottorin Activity by NDRG1 Knockdown läpi Snail mahasyövän Cells

eri transkriptiotekijöitä, jotka tukahduttaa ilmentyminen E-kadheriinin kuten Snail, Slug, Twist, TCF4 ja SIP1 [20], ilmentyminen Snail oli nimenomaan moduloitu NDRG1 mahalaukun syöpäsoluja. Tutkimme, onko ilmaus E-kadheriinin ja /tai vimentiinista voitaisiin säädellä Snail HSC-58 soluihin. Ohimenevä hoito Snail siRNA lisännyt ilmentyminen E-kadheriinin, mutta ei että vimentiinista ja NDRG1, aika-riippuvaisella tavalla (kuvio 5A). Oli vain hieman jos lisääntymiseen β-kateniinin ilmentymisen Snail knockdown. Lisäksi E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi tukahdutti transfektoimalla Snail komplementaarisen DNA: n kahdessa syövän testatut solulinjat (kuvio 5B). Seuraavaksi me verrattuna E-kadheriinipromoottorin aktiivisuuden välillä As1 /Mock3 ja sen NDRG1 vaiennetaan solulinjoissa. Kuten nähdään kuviosta 5C, oli merkittävä (*

p

0,05) lisääminen E-kadheriinin promoottorin aktiivisuutta NDRG1 pudotus.

(A) Vertailu proteiinin ekspressiotasoja E- kadheriinin, β-kateniinin, NDRG1 ja vimentiinistä kun lyhytaikaisesti hoidettiin Snail siRNA 0, 48 ja 96 h western blot analyysi HSC-58 solu. (B) E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasiaktiivisuus puuttuessa tai läsnä Snail ilmentymisen HSC-58 ja BxPC-3-soluja. E-kadheriinin-luc transfektoitiin kanssa tai ilman pcDNA3-Snail, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Jokainen pylväs on keskimäärin kolmena kokeiden (*

p

0,05). (C) vertailu E-kadheriinipromoottorin perustuva lusiferaasiaktiivisuutta (E-kadheriinin-luc) in As1 /Mock3, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54. Jokainen pylväs on keskimäärin kolmena kokeiden (*

p

0,05). (D) vaikutus CT99021 proteiinin ilmentymisen NDRG1 ja eri EMT-sukua olevien molekyylien Western blot -analyysillä. 58Asl-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksia lääkettä 24 tunnin ajan. (E) vaikutus β-kateniinin pudotus sen siRNA ilmentymiseen E-kadheriinin. HSC-58-solut transfektoitiin siRNA: illa 24 tunnin ajan, ja koko solulysaatit analysoitiin Western blot-analyysi.

GSK-3β on keskeinen entsyymi aktivoinnin EMT reitin [20], [21 ], ja myös fosforylaation NDRG1 [22], [23]. Expression of p-GSK-3β nostettiin erittäin metastaattinen solulinja, 58As1 (katso kuvio 2A). Me tutki GSK-3β oli mukana NDRG1 aiheuttama muuttunut ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinista. Hoidon inhibiittoria (CT99021) GSK-3β johti vähentyneeseen ekspressioon p-NDRG1 ja p-GSK-3β, ja myös lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin 58As1 soluissa (kuvio 5D). Kuten kuviossa 5E, β-kateniinin Knockdown ei vaikuttanut ilmaus E-kadheriinin, vimentiinistä ja Snail.

NDRG1 Knockdown indusoi mesenkyymikasvaimia Epithelial Siirtyminen ja vaimentaa Etäpesäke vatsakalvon by Highly Metastasoitunut mahasyöpä syöpäsoluja

vertailu kasvaimen kasvuvauhdin As1 /Mock3, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 solujen ksenograftimallia paljasti hitaampi kasvaimen kasvu sekä As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 esittäjä NDRG1 taintumisen (kuvio 6A, B). NDRG1 Knockdown tukahdutti paikallisen invaasion As1 /Mock3 kasvainsoluja ympäröivän strooman ja vieressä rasva- ja /tai lihaskudoksen ja kapseloitu kasvaimen kasvua (kuvio 6C). Korkea ilmentyminen E-kadheriinin havaittiin As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 kasvaimia, kun taas korkea ekspressio vimentiinista havaittiin syöpäsoluja As1 /Mock3 kasvaimia (kuvio 6D). Sitä vastoin ei ollut juuri mitään muutosta ilmentymistä β-kateniinin As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 kasvaimissa verrattuna As1 /Mock3 kasvain.

(A) Kasvaimen kasvu seurasi ihon alle inokulaation 5 x 10

6 As1 /Mock3 (♦), As1 /Sic50 (▪) ja As1 /Sic54 soluja (▴). Imu ei osoita ilmeistä NDRG1 ilmentymistä joko As1 /Sic50 tai As1 /Sic54 kasvaimia. (B) Kasvaimen tilavuuden As1 /Sic50 (

p

= 0,87) ja As1 /Sic54 solut olivat hieman pienempiä kuin As1 /Mock3 (day28). Jokainen pylväs on keskimäärin neljä eläintä (± SD) (*

p

0,05). (C) edustaja H 0,01) vähentynyt, noin 10%, joka indusoi As1 /Mock3 soluja (kuvio 7C). Lisäksi oli merkittävä (*

p

0,01) kasvu eloonjäämisaste hiirillä, jotka inokuloitiin As1 /Sic50 soluja (51 ± 16 vuorokautta) verrattuna 35 ± 14 vuorokauden hiiriä inokuloitiin As1 /Mock3 soluja, mikä osoittaa, että NDRG1 taintumisen pidensi elinaikaa (kuvio 7D).

(A) MAKROSKOOPPINEN kuvat osoittavat laajentuneen vatsaonteloon ja etäpesäkenystyröiden by As1 /Mock3 ja As1 /Sic50. Arrowheads näyttää kyhmyt. (B) määrä etäpesäkenystyröiden vuonna suoliliepeessä oli 51 ± 16 (As1 /Mock3) ja 35 ± 14 (As1 /Sic50) (

p

= 0,21), mutta As1 /Mock3 kyhmy koko oli 3- 4 kertaa suurempi kuin As1 /Sic50. (C) Vertailu määrän askites välillä As1 /Mock3 (3,9 ± 1,0 ml) ja As1 /Sic50-soluja (0,5 ± 0,6 ml) sen jälkeen, ortotooppinen implantaatio (n = 7) (*

p

0,01 ). (D) Eloonjäämiskäyrät osoittavat eloonjääntiaste As1 /Sic50 kasvainta kantavien hiirten oli merkitsevästi (*

p

0,01) pitempi kuin As1 /Mock3 on kasvain (n = 6). (E) Meidän hypoteettinen malli miten NDRG1 yliekspressio edistää etäpesäkkeiden myös vatsakalvon levittäminen merkittävissä EMT mukaan scirrhous mahasyövässä soluja, mahdollisesti muuttamalla Snail ilmaisun.

Keskustelu

Olemme aikaisemmin kertoi, että NDRG1 korreloi kasvaimen angiogeneesiä ja huono eloonjäämisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän, viittaa siihen, että NDRG1 ennakoiva biomarkkeri pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän [9]. Meidän Tässä tutkimuksessa havaitsimme seuraavat ominaisuudet liiketoimen taustalla korkean metastaattista potentiaalia mahasyövässä: microarray, western blot ja RT-PCR-analyysit yhdessä paljasti säätelyä NDRG1 on erittäin metastaattinen solulinjat, 58As1 ja 58As9 verrattuna niiden alhainen metastaattinen vanhempien vastine, HSC-58; korkeampi ilmentyminen vimentiinista, Etana, ja MMP-1, ja alempi ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin näkyivät erittäin metastaattinen solulinjoissa verrattuna niiden vanhempien vastine; geenien vaimentua siinä erittäin metastaattinen solulinja, NDRG1 knockdown johti ylösajon E-kadheriinin ja downregulation vimentiinista ja Snail, mutta melkein mitään vaikutusta ilmentymistä β-kateniinin; E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus merkittävästi täydennetty NDRG1 knockdown; NDRG1 Knockdown myös tukahdutti vatsakalvon levittäminen ja kertymistä askites, ja invaasion erittäin metastaattinen solujen ympäröiviin normaaleissa kudoksissa.

Tässä tutkimuksessa, NDRG1 Knockdown johti tukahduttaminen etäpesäkkeiden erittäin metastaattinen mahalaukun syöpäsoluja (kuva 6 , 7), mikä viittaa siihen, että NDRG1 voi olla etäpesäke promoottori geenin sijasta etäpesäke vaimennin geeni mahasyövässä. Nykyinen tutkimus tukee vahvasti ajatusta, että onko NDRG1 edistää tai estää pahanlaatuinen etenemistä ihmisen syövän riippuu kasvaintyyppeihin ja /tai erilaistumista status [11], [12]. On kuitenkin vielä epäselvää, miksi NDRG1 toimii tuumorisuppressoriproteiinia tai promoottori riippuen kasvaintyypeille tai histologisia tyyppejä. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että NDRG1 tukahduttaa kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä haimasyöpä kautta NDRG1 ajettu vaimennus NF-KB signalointireitistä [24], [25]. Tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että ilmentyminen etäpesäke estävä geeni,

KAI1

geeni, on mukana NDRG1 välittämää etäpesäkkeiden tukahduttaminen eturauhassyövän kautta ATF3-NF-KB-reitin [26]. Edelleen tutkimus vaaditaan ymmärtää mikä sääntelymekanismiin on erityisesti vastuussa NDRG1 ajetaan edistämiseksi pahanlaatuisten etenemisen mahalaukun syöpäsoluja.

EMT on viime kohokohta, joka voisi olla tiiviisti liittyy syövän pahanlaatuisia etenemisen lukien acquirement erittäin metastaattista potentiaalia [15], [16]. Meidän olevassa tutkimuksessa, NDRG1 Knockdown tehostettu ilmentyminen E-kadheriinin ja tukahdutti ilmaus vimentiinista sekä

in vitro

ja

in vivo

. NDRG1 voi olla keskeinen rooli siirtyminen polarisoitunut epiteelisolujen fenotyyppi erittäin liikkuvia mesenkymaaliset fenotyyppi. Osittainen tai täydellinen menetys E-kadheriinin usein havaittu etenemisen kohti maligniteetti lukuisissa kasvaimissa, mukaan lukien mahasyöpä [27], [28]. Oliveira et ai. [29] ilmoitetaan läheinen yhteys E-kadheriinin tappio ja korkea metastaattista potentiaalia mahasyövässä. Chan, et ai. [30] Lisäksi on raportoitu liukoisen E-kadheriinin biomarkkerina pitkäaikaiseen selviytymisen mahasyöpäpotilaista. NDRG1 Knockdown johti suhteellisesti suurempi E-kadheriinin ilmentymisen As1 /Sic50 kasvaimia kuin As1 /Mock3 kasvaimia, mikä viittaa siihen, että NDRG1 voi erikseen ohjata EMT mahdollisesti transkriptiotekijän Snail mahalaukun syöpäsoluja (kuva 7E).

Wnt signalointi on keskeinen roolit pahanlaatuinen etenemisen ja etäpesäkkeiden keuhkojen ja rintasyövän solujen [31], [32], ja Wnt signalointia myös indusoi EMT johon liittyy metastasointiin epiteelin syövän [31], [33]. NDRG1 tunnetaan etäpesäke vaimennin geeni eturauhasen ja peräsuolen syöpä solujen [11], [12]. Liu et al [18] on raportoitu, että NDRG1 estää etäpesäkkeiden kautta Wnt /β-kateniinin signalointireitin eturauhassyöpäsoluissa. Asiaankuuluva tutkimus Chen et al [19] on myös osoittanut, että NDRG1 moduloi TGF-β-aiheuttama EMT kautta muuttunut ilmentyminen β-kateniinin ja E-kadheriinin peräsuolen syöpäsolun. Nykyinen tutkimus osoitti vähentynyt ilmentyminen β-kateniinin molemmissa erittäin metastaattinen solulinjoissa verrattuna vanhempien vastine, HSC-58. Kuitenkin sekä western blot ja qRT-PCR-analyysit ei havaittu merkittävää muutosta ekspressiotasot β-kateniinin ja β-kateniinin ajettu promoottorin aktiivisuuteen erittäin metastaattista 58As1 soluissa ja sen kaksi NDRG1 vaiennetaan solulinjat. Vaikuttaa epätodennäköisempää, että β-kateniinin on keskeinen rooli tukahduttaminen etäpesäkkeiden mukaan NDRG1 Knockdown erittäin metastaattinen syöpäsoluja.

Toisaalta, GSK-3β tunnetaan myös olevan rooli valvonnassa EMT [20], [21], ja GSK-3β on olennainen entsyymi fosforylaation NDRG1, erinomainen alitilaan GSK-3β [22], [23]. Ilmaisu p-GSK3p oli suhteellisesti korkeampi erittäin metastaattinen solulinjoissa kuin niiden emosolulinjassa (kuvio 2B). Hoito tehokas estäjä GSK-3β johti tukahdutetaan ilmaisu p-NDRG1, mukana säätelyä E-kadheriinin ja β-kateniinin (kuvio 5D). Kuitenkaan ollut juuri mitään eroja ilmentymisessä GSK-3β ja p-GSK-3β by NDRG1 Knockdown on erittäin metastaattinen soluja (kuvio 4B), mikä viittaa siihen, että GSK-3β ei saa olla merkittävä rooli induktioon EMT kautta NDRG1 mahalaukun syöpäsoluja.

Snail on edustava transkriptiotekijä, joka ohjaa ilmentymistä E-kadheriinin [20]. Erilaisten sääntely tekijät kopiointia ohjaavat E-kadheriinin ilmentyminen Snail oli nimenomaan moduloitu NDRG1 mahasyövän solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt.