Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

emodin on osoitti apoptoosin haimasyövän soluja ja estää kasvaimen kasvua edellisessä tutkimuksessa. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia emodin voi estää angiogeneesiä haimasyövän kudosten ja sen mekanismi.

Menetelmät /Principal löytäminen

mukaisesti edellisessä tutkimuksessa emodin esti haiman syöpäsolujen kasvua, aiheuttama apoptoosin, ja parannettu anti-kasvain vaikutus gemsitabiinin haiman syöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

inhiboimalla NF-KB. Tässä ensimmäistä kertaa, osoitimme, että emodin esti tuumoriangiogeneesissa

in vitro

ja ihonalaista haimasyövän kudoksiin, vähentynyt ilmentyminen angiogeneesiin liittyvien tekijöiden (NF-KB ja sen säännellyn tekijät VEGF, MMP-2 MMP-9, ja eNOS), ja vähentää eNOS fosforylaatio, mistä on osoituksena sekä immunohistokemialla ja western blot -analyysillä istutettujen kasvainten. Lisäksi olemme havainneet, että emodin ollut vaikutusta VEGFR ilmaisun

in vivo

.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset viittasivat siihen, että emodin on potentiaalia antituumorivaikutuksen haiman syöpä kautta kaksoisrooli edistämisessä apoptoosin ja tukahduttaminen angiogeneesin, luultavasti kautta ekspressiota säätelevät NF-KB: n ja NF-KB-säännelty angiogeneesiin liittyviä tekijöitä.

Citation: Lin SZ, Wei WT, Chen H, Chen KJ, Tong HF, Wang ZH, et ai. (2012) antituumorivaikutuksen emodin vastaan ​​haimasyövän riippuu sen kaksoisrooli: edistäminen Apoptosis ja Suppression Angiogeneesin. PLoS ONE 7 (8): e42146. doi: 10,1371 /journal.pone.0042146

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, France

vastaanotettu: 22 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 02 elokuu 2012

Copyright: © Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisia rahoitusta tukea: hallinto Traditional Chinese Medicine of Zhengjing maakunnassa Kiinassa (Grant nro 2011ZZ010), Zhejiangin maakunnan Science Fund for Distinguished Young Scholars (Grant nro LR12H280001) ja The National Natural Science Foundation of China (Grant nro . 81173606). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tällä hetkellä hoito haimasyöpä riippuu kirurginen resektio. Kuitenkin vain noin 25% potilaista, joilla haimasyöpä ovat toteutettavissa resektioleikkaukselle takia hyökkäyksen haimasyövän. Monet potilaat, joilla on paikallisesti edennyt tai metastaattinen haimasyöpä luottaa gemsitabiini kemoterapiaa [1]. Kuitenkin haimasyöpä on edustaja pisimmälle vascularized ja angiogeenisen kiinteiden kasvainten, joka reagoi epätarkasti gemsitabiinia kemoterapiaa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että gemsitabiinihoidon tuloksia mediaani elinaika noin 6,2 kuukautta [2]. Niinpä etsivät uusia hoito strategioita, joiden tarkoituksena on parantaa antiangiogeenisen kyky on kiireellinen kliinisessä työssä parantamiseksi terapeuttinen teho ja estävät etäpesäkkeiden haimasyövän.

konstitutiivisen aktivaation Nukleaaritekijä-KB (NF-KB ) voi edistää solujen proliferaatiota, inhiboivat apoptoosia, ja säätelevät geenien ilmentymistä, jotka liittyvät angiogeneesiin [3], [4]. Lisäksi kertynyt todisteita viittaa siihen, että NF-KB on merkittävä rooli kasvun, apoptoosin estäminen, ja angiogeneesin haimasyövän [5]. Gemsitabiini voi parantaa ekspressiota ja NF-KB: n haiman syöpäsoluissa [6], joka liittyy kehittämiseen chemoresistance haimasyövän. Näin ollen, uuden lääkkeen, joka estää NF-KB: n ilmentyminen ja aktivaatio voi indusoida apoptoosia peruuttaa solujen ja vähentää angiogeneesiä haimasyövän, mikä parantaa antituumorivaikutuksen gemsitabiinin ja mahdollisesti hyötyä potilaille, joilla on haimasyöpä.

emodiinia (1,3,8-trihydroksi-6-metyyliantrakinoni), luonnollinen antrakinonijohdannaiseksi eristetty Rheum palmatum L, kykenee inhiboimaan kasvua haimasyöpäsoluissa osoituksena aikaisempien tutkimusten [6], [7], [ ,,,0],8]. Silmiinpistävän, on raportoitu, että emodiini on kyky estää useiden angiogeenisten prosessien [9], [10]. On ehdotettu, että emodin voivat estää syöpäsolujen kasvua estämällä verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin (VEGFR) signalointia ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, mikä osoittaa, että emodiini voidaan käyttää mahdollisena estäjän tuumorin angiogeneesiä [11]. On kuitenkin vielä epäselvää, emodin voi estää angiogeneesiä haimasyövän. Mielenkiintoista on, että on havaittu, että emodin voi estää ilmentymisen ja NF-KB: n [6], [12]. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa, pyrimme tutkia emodin voi estää kasvua haimasyövän soluja ja angiogeneesin haimasyövän kautta mahdollinen NF-KB: n mukana mekanismi. Huomasimme, että hoito emodin tehosti gemsitabiinia aiheuttama kasvun esto ja apoptoosin haimasyöpäsoluissa

in vitro

. Olemme edelleen osoitti kasvaimen kasvun esto ja anti-angiogeneesiä vaikutuksia emodin on haimasyövän

in vivo

, jossa vähen- tämisessä ilmentymistä NF-KB: n ja NF-KB-säännelty proteiinit (eli VEGF, MMP-2, MMP -9, ja eNOS) sekä roolit angiogeneesissä eston ja vähentää enos fosforylaatiota.

tulokset

sytotoksisuus emodin vastaan ​​SW1990 Cells, Panc-1 solut, HPNE ja EC

testaamiseksi sytotoksisuuden emodiinia, SW1990-soluissa ja Panc-1-soluja käsiteltiin eri annoksilla emodiinia (10 uM, 20 uM, 40 uM, ja 80 uM) 72 tuntia, ja elinkykyä näitä soluja määritettiin käyttämällä CCK-8-määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, hoito emodiinia yksinään vähensi solujen elinkelpoisuutta sekä SW1990-soluissa ja Panc-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. CCK-8-analyysi paljasti, että kun SW1990-soluissa ja Panc-1-soluja käsiteltiin emodiinia (40 uM) 12 tuntia, 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia, emodin vähensi solujen elinkelpoisuuden molemmissa solulinjoissa on ajasta riippuva tavalla (Fig. 1 B). Mielenkiintoista on, emodiini (40 uM) hoitoa 72 tuntia vähensi solujen elinkelpoisuuden SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa 46,4% ja 40,8%, vastaavasti. Kuitenkin yhdistelmähoito sekä emodiinia ja gemsitabiinin vähensi solujen elinkelpoisuuden SW1990 solujen ja Panc-1-soluissa 72,4% ja 54,7%, tässä järjestyksessä, mikä osoittaa tehostetun sytotoksisuuden yhdistetyn lääkehoidon vastaan ​​SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa verrattuna yhden agentti hoitoa (Fig. 1 C) (

P

0,05). Lisäksi olemme havainneet, että emodiini, gemsitabiini, ja niiden yhdistelmä ei muuttanut kasvua ihmisen haiman normaalissa epiteelisolujen (HPNE) (Fig. 1 D). Olemme havainneet, että gemsitabiini (20 umol /l) hoito vähensi merkittävästi solukuolemaa haimasyövän johdettu hankittua, kun taas emodiinia (40 umol /l) hoitoon ja yhdistetty hoito emodiinia ja gemsitabiinin parantaa solukuolemaa näissä soluissa, mikä osoittaa, että emodiini on estävä vaikutus proliferaatioon haimasyövän johdettujen hankittua.

soluja ilman lääkehoitoa käytettiin kontrollina. (A) emodiinia inhiboivat SW1990-soluissa ja Panc-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. (B) emodiinia inhiboivat SW1990-soluissa ja Panc-1 solujen aikaan riippuvalla tavalla. (C) emodin parannettu leviämisen estäminen SW1990 solujen ja Panc-1- soluissa gemsitabiinia. (D, E) elinkelpoisuus HPNE ja hankittua arvioitiin jälkeen käsiteltiin laimennusainevertailunäytteenä, gemsitabiini (20 mikromol /l), emodin (40 mikromol /l), tai niiden yhdistelmä 72 tuntia. Kvantifiointi suoritettiin laskemalla suhde arvo kontrolliin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD jokaisen ryhmän solujen kolmesta erillisestä kokeesta. Emo: emodin; Gem: gemsitabiini. *,

P

0,05.

vaikutus emodin on apoptoosi SW1990 Solut ja Panc-1 solut

Lisäksi virtaussytometria-analyysi paljasti, että hoito emodin alone lisäsi apoptoosin määrä SW1990 soluja 3,7%: sta 15,3% ja Panc-1 solut 7,7%: sta 26,0%. Verrattuna yhden lääkehoitoa, yhdistetty hoito molempien lääkkeiden aiheuttama huomattavasti suurempia apoptoosin (

P

0,05), mikä oli 41,2% varten SW1990 soluja ja 38,7% for Pancin-1-soluissa (2A ja B). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aikaisempien tutkimusten solujen kasvun inhibition käyttäen MTT-määritystä, mikä osoittaa, että menetys elinkelpoisten solujen emodiinia ja /tai gemsitabiinin on ainakin osittain induktion apoptoosin.

(A) edustavia dot-havainnollistavat apoptoottisen tilan SW1990 solujen ja Panc-1-soluissa. (B) prosenttiosuus apoptoottisten SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa. *,

P

0,05.

vaikutus emodin angiogeneesistä haimasyövän johdettujen hankittua

angiogeneesimääritys suoritettiin vaikutuksen tutkimiseksi emodin angiogeneesistä

in vitro

. Huomasimme, että gemsitabiini (20 mikromol /l) käsittely sääteli indeksi angiogeneesin, kun taas emodin (40 mikromol /l) hoito ja yhdistetyn hoidon gemsitabiinin ja emodin alassäädetty indeksi, mikä osoittaa, että emodin voi estää spontaani ja gemsitabiinin angiogeneesiä (kuvio 3).

(A) edustaja micrographs (200 x), angiogeneesin käsittelyn jälkeen laimentimen ohjaus, gemsitabiini (20 umol /l), emodiini (40 umol /l), tai niiden yhdistelmä 72 tuntia. Solut maljattiin Matrigel-esipäällystetty kuoppiin (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja viljeltiin 10% FBS-DMEM-alustassa. Alkuperäinen suurennus. (B) Angiogeneesi endoteelisolujen (EC) eristetty haimasyöpä kudoksista.

In vitro

angiogeneesi analysoitiin kvantitatiivisesti, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. *,

P

0,05.

vaikutus emodin on Expression ja toiminta NF-KB

tulokset EMSA-analyysi osoitti, että käsittely emodin merkittävästi alas-säädellä DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: SW1990-soluissa ja Panc-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4A ja B). Suhteelliset tasot NF-KB: n /p65: n in SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa määritettiin käyttämällä Western blot -määritys. Huomasimme, että gemsitabiini sääteli ilmentymistä NF-KB /p65 in SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa. Kuitenkin, käsittely emodin yksin tai yhdessä gemsitabiinin vähensi merkittävästi spontaania ilmentymistä NF-KB: n /p65: n molemmissa soluissa. NF-KB on voimakas transkription tekijä ekspressiota sääteleviä apoptoosiin liittyvien geenien (4C ja D). Nämä tiedot osoittivat, että emodin esti ilmentymistä NF-KB: n ja edistää haiman syöpäsolujen apoptoosia

in vitro

, mikä parantaa solujen kasvun esto ja lisääntymistä yhdistetty hoito.

(A) edustavat kuvat osoittavat, että hoito emodiinia 72 tuntia inhiboi NF-KB: n annoksesta riippuvalla tavalla in SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa. (B) Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona% ± SD suhteellisten tasojen NF-KB: n aktivaation SW1990-soluissa ja Panc-1-solut puusta erillisestä kokeesta. Equal Proteiinilisäyksen varmistettiin immunoblottauksella 10 ug tumaproteiinin anti-retinoblastooma vasta-aine. Ydin- otteet stimuloimaton mahasyöpä SGC7901 soluja käytettiin negatiivisena kontrollina, ja SGC7901 soluja stimuloitiin 50 ng /ml TNFa käytettiin positiivisena kontrollina. +: Positiivinen kontrolli; -: Negatiivinen kontrolli. (C) emodin heikennettyä spontaani ja gemsitabiinin aiheuttama NF-KB ilmentymistä SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa. (D) kvantifiointi suoritettiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. *,

P

0,05.

vaikutus emodin kasvuun ortotooppisesti Transplanted Haimasyöpä

Hoitoprotokolla näkyy Kuvio 5A. Päivänä 56 sen jälkeen, kun kasvaimet istutettiin, keskipaino kasvaimia käsiteltiin normaalilla suolaliuoksella, emodiini (40 mg /kg), gemsitabiini (100 mg /kg), ja emodiinia (40 mg /kg) plus gemsitabiinin (80 mg /kg) oli (1,721 ± 0,149) g, (1,021 ± 0,109) g, (0,794 ± 0,082) g, ja (0,393 ± 0,057) g, vastaavasti. Havaitsimme merkittävä lasku (

P

0,05) kasvaimen painoa emodin tai gemciatabine ryhmässä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin ja suurin estävä vaikutus kasvaimen kasvua yhdistelmä ryhmässä (Fig.5B ja C) (

P

0,05, verrattuna kontrolliryhmään tai yksittäinen lääke ryhmä).

(A) Kaaviokuva tutkimussuunnitelma. (B) Valokuvia ortotooppisesti istutettu haimatuumorien päivänä 28 hoidon jälkeen. Yhdistetty hoito emodiinia ja gemsitabiinin estivät merkitsevästi kasvaimen kasvua. (C) Kasvaimen painot yksittäisten ryhmien hiirten viimeisenä päivänä kokeen (päivä 37). *,

P

0,05.

vaikutus emodin kasvuun ortotooppisesti implantoidut Haimasyöpä tunnistanut MicroPET

Kun hoidetaan 4 viikon nude-hiiret kuvattiin korkean resoluution positroniemissiotomografia (MicroPET) (Fig. 6A) ja fluori-18-leimattua fluorideoksiglukoosi (

18F-FDG) suhteen määrittämiseksi kasvaimen normaaliin lihaskudoksen (T /NT-suhde) samankokoisina kiinnostavat alueet (ROI) ja standardi oton arvot (SUV). Verrattuna T /NT suhde kontrolliryhmän (2,78 ± 0,042), ne on gemsitabiinin ryhmän (1,88 ± 0,043) ja emodin ryhmän (2,20 ± 0,052) olivat merkittävästi vähentynyt (

P

0,05 ), ja yhdistelmä ryhmän (1,55 ± 0,058) väheni edelleen (

P

0,05 verrattuna yhden lääkeryhmien) (Fig. 6B). SUV on gemsitabiinin ryhmän (3,61 ± 0,12) ja emodin ryhmän (4,10 ± 0,35) olivat merkittävästi laski verrattuna kontrolliryhmään (5,49 ± 0,22) (

P

0,05), ja yhdistelmä ryhmä ( 2,72 ± 0,08) olivat jopa alhaisempi ottoa kuin yhden lääkeryhmien (

P

0,05) (Fig. 6C).

(a) MicroPET osoittaa suuri koronan poikkipinta potilaalle tehdä elinsiirrot kasvain on nude mouse. (B ja C) T /NT-suhde ja maastoautojen että gemsitabiinin ryhmä, emodiinia ryhmä ja yhdistelmä ryhmässä olivat alhaisempia kuin kontrolliryhmässä (0,9% natriumkloridi) (

P

0,05), ja yhdistelmä ryhmä osoitti jopa alhaisempi T /NT-suhde ja maastoautojen kuin emodiinia ryhmä ja gemsitabiinin ryhmä. *,

P

0,05.

vaikutus emodin angiogeneesistä of ortotooppisesti implantoidut Haimasyöpä tunnistanut Kasvain Vascular Imaging

Kuten osoitettu 7A ja B, kasvaimen verisuonten kuvantamiseen analyysi paljasti, että gemsitabiini lisääntynyt aluksen jakelu (

P

0,05), vaikka se vähensi tuumorin tilavuuden verrattuna kontrolliryhmään, kuten on esitetty MicroPET (

P

0,05) (kuvio 7A ja B). Edelleen, immunohistokemia analyysi osoitti, että gemsitabiinihoidon merkittävästi sääteli ilmentymisen tasot CD31 ja CD105, jotka voidaan merkittävästi pienensi emodiinia hoitoon ja yhdistetyn hoidon emodiinia ja gemsitabiinin (Fig.7C ja D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että emodin voi estää angiogeneesin ortotooppisesti istutettu kasvaimia.

V: verisuonten kuva kasvainten vangiksi röntgenlaite. B: Vascular tiheys laskettiin koko kasvain verisuonen määrä jaettuna kasvaimen tilavuus, ja sitten normalisoidaan kontrolliryhmään. (C) emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin esti ilmaus CD31 ja CD105. (D) määrälliset tiedot esitetään. Kvantifiointi suoritettiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. *,

P

0,05.

vaikutus emodin on Expression of Angiogeneesi liittyvien proteiinien in Orthotopic Haimasyöpä Kudokset tunnistanut immunohistokemia ja Western Blot

kuten on esitetty kuviossa. 8, immunohistokemia-analyysi paljasti, että emodiinia ja gemsitabiini alassäädetty ilmentymistä Ki-67 verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05), ja niiden yhdistelmä edelleen alassäädetty Ki-67 ilmentyminen verrattuna yksittäinen lääkehoidot (

P

0,05). Sekä immunohistokemia analyysiä ja Western-blot-analyysi osoitti, että gemsitabiini sääteli VEGF: n ilmentymistä, MMP-2, MMP-9, eNOS, ja NF-KB: ortotooppisesti thanspanted kasvaimissa verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05). Lisäksi emodiinia hoito ja yhdistetty hoito emodiinia ja gemsitabiinin estivät merkitsevästi Enos fosforylaatiota. Havaitsimme kuitenkin, että yksikään kolme hoitoa muuttunut ilmentymisen taso VEGFR haimasyövän kudoksissa.

(A) Immunohistokemia analyysi ekspression Ki-67, NF-KB: n, VEGF, MMP-2, MMP-9, ja eNOS vuonna potilaalle tehdä haimasyövän kudoksiin. (B) Western blot analyysi ilmentymisen NF-KB: n, VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, VEGFR, ja p-eNOS in potilaalle tehdä haimasyövän kudoksiin. (C) määrällinen data Immunohistokemian analyysi on esitetty. (D) kvantifiointi Western blot tulokset suoritettiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. *,

P

0,05; #,

P

0,05.

vaikutus emodin NF-KB Aktiivisuus Transplanted Haimasyöpä Kudokset

onko yhdistelmä hoitoon emodiinia ja gemsitabiini on mitään vaikutusta NF-KB: n aktivoitumisen, DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: n arvioitiin käyttämällä EMSA-määritystä. Yhdenmukainen immunoblottaus tuloksia, emodiini joko yksinään tai yhdessä gemsitabiinin kanssa vähensi DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: n haimasyövän ortotooppisesti istutettu Panc-1-soluissa (kuvio. 9A, B).

(A) NF KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus määritettiin EMSA ja supermuutoksena kokeessa. Equal Proteiinilisäyksen varmistettiin immunoblottauksella 10 ug tumaproteiinin anti-retinoblastooma vasta-aine. +, Positiivinen kontrolli; -, Negatiivinen kontrolli. (B) määrälliset tiedot esitetään. *,

P

0,05.

vaikutus emodin mRNA- ekspressiotasot NF-KB: n, VEGF, MMP-2, MMP-9, ja eNOS in Haimasyöpä kudokset havaittu RT-PCR

mukaisesti tulosten immunohistokemian ja Western blot-analyysi, mRNA: n ekspressiota NF-KB: n, VEGF, MMP-2, MMP-9 ja eNOS haimasyövän kudoksessa oli ylös- säännellä gemsitabiinin ryhmässä, mutta alas-säädellä emodiinia ryhmässä ja yhdistelmä ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään haimasyövän kudoksissa (

P

0,05) (Fig. 10A, B).

(A) mRNA-tasot NF-KB: n, VEGF, MMP-2, MMP-9 ja eNOS haimasyövän kudoksen eri hoitoryhmissä havaittiin RT-PCR: llä. (B) määrälliset tiedot esitettiin. *,

P

0,05.

Keskustelu

Yhdenmukainen aiempien havaintojen [8], hoitoon solujen emodin merkittävästi parannettu estyminen solun kasvu gemsitabiinin, joka korreloi hyvin tuloksia apoptoosin analyysillä. Samoin huomasimme, että emodin esti haiman syöpäsolujen kasvua

in vivo

. Tässä ensimmäistä kertaa, huomasimme, että emodin esti angiogeneesiä haimasyövän in vivo, vaimentua ilmentymistä NF-KB: n ja NF-KB-säänneltyjen proteiinien kanssa rooleja angiogeneesin esto (VEGF, MMP-2, MMP-9, ja eNOS). Tutkimus keskittyi antiangiogeneettiset vaikutus emodin

in vivo

ja mahdollinen mekanismi.

On raportoitu, että gemsitabiini indusoi NF-KB: n ja myöhemmin aiheuttaa lääkeresistensseihin [ ,,,0],13]. Yhdenmukaisesti aiempien havaintojemme, esillä oleva tutkimus osoitti selvästi, että emodin esti spontaanin NF-KB: n annoksesta riippuvalla tavalla in SW1990-soluissa ja Panc-1-soluissa, ja kumosi gemsitabiinin-indusoidun NF-KB: n aktivaation molemmissa solut. Lisäksi olemme havainneet, että emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin esitteli antituumorivaikutuksia koskevasta potilaalle tehdä haimasyöpä malli, osoituksena väheneminen kasvaimen painoa. Vastaavasti emodin yksin tai yhdessä gemsitabiinin on osoitettu olevan voimakas kasvaimen vastainen vaikutus käytettäessä ihonalaisen kasvaimen malli edellisessä tutkimuksessa [8].

kriittinen vaihe angiogeneesin kuuluu paikallinen endoteelisolujen proliferaatiota. Hee-Jin Kwak et al. osoittivat, että emodiinia estää tehokkaasti VEGF-A-indusoidun angiogeneesin in vitro ja in vivo [10]. Alexander D. Crawford et al. kertoi, että emodin esti nisäkkään endoteelisolujen proliferaation ja putken muodostumiseen in vitro [14]. Ja se on raportoitu, että emodin voi estää kasvaimeen liittyvän angiogeneesin ihmisen koolonin karsinooman

in vitro

[9]. Tutkimuksemme osoitti, että leviämisen haimasyövän johdettujen hankittua ja verisuonten muodostuminen estyi emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinia. Konstitutiivisen NF-KB: n on havaittu monissa syövissä, mukaan lukien ihmisen haimasyövän [15]. Strategioita kohdistaminen NF-KB-säädellään reitti voi olla hyödyllistä parantaa vaikutuksia kemoterapeuttisten aineiden, kuten gemsitabiini kasvaimen johdettujen endoteelisolujen [16]. Meidän tutkimuksessa todettiin, että emodin voi estää angiogeneesiä haimasyövän johdettujen hankittua kautta NF-KB säännellyn signalointireitin. Lisäksi kasvaimen verisuonten kuvantamisen tulokset osoittivat, että verisuonten tiheys emodiinia ryhmässä ja emodin /gemsitabiinia yhdistelmä ryhmässä merkitsevästi pienempi verrattuna kontrolliin ja gemsitabiinin ryhmiä. Lisäksi, verrattuna kontrolliin ja gemsitabiinin ryhmien emodiinia hoitoon ja yhdistetyn hoidon emodiinia ja gemsitabiinin vähensi ekspressiotasot CD31 ja CD105. Meidän tulokset viittasivat siihen, että emodin voi estää angiogeneesiä ortotooppisesti istutetaan haimasyöpä.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NF-KB voidaan säätelemään useita angiogeneesiin liittyviä proteiineja, kuten MMP-2, MMP-9, VEGF , ja eNOS [12], [17], [18], [19]. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut, että emodin vaimentua aktivointi ja ilmentymistä NF-KB: SW1990 soluistutusryhmä aiheuttama haimasyöpä [20], NF-KB analyysi potilaalle tehdä kasvain kudosten tässä tutkimuksessa osoitti, että emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin tukahdutetaan NF KB: n ilmentyminen ja sen aktiivisuuden haimasyövän kudoksissa. Lisäksi huomasimme, että emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin vaimentua ilmentymistä NF-KB-geenien (VEGF, eNOS, MMP2 ja MMP-9), jotka liittyvät läheisesti angiogeneesiin.

MMP-2 ja MMP-9 voi liittyä kasvaimen angiogeneesiin [9], [17]. On raportoitu, että emodin voi estää kasvaimeen liittyvän angiogeneesin kautta tukahduttaa MMP-9 ilmaisun [9]. Tässä tutkimuksessa, immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että emodiinia yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin vaimentua ilmentymisen MMP-2 ja MMP-9 potilaalle tehdä haimasyövän kudoksissa, kun taas gemsitabiini ei ollut vaikutusta MMP-2 ja MMP-9. Nämä tulokset viittaavat siihen, että emodin voi estää angiogeneesiä haimasyövän kudosten kautta tukahduttaminen MMP-2 ja MMP-9.

Koska angiogeneesi säätelytekijän, VEGF liittyy läheisesti angiogeneesiä [21] ja etäpesäke haimasyövän [22]. On raportoinut Aggarwal et al., NF-KB-riippuvainen lisäys VEGF-ilmentyminen voidaan edistää kasvainsolun eloonjäämistä, ja verisuonten angiogeneesiä [23]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että emodin voi estää VEGF: n ilmentymistä ihmisen neuroblastoomasoluja [24]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että emodin yksin tai yhdistettynä gemsitabiinin merkittävästi vaimentua VEGF ilmaisun ortotooppisesti istutettu haimasyöpä. Tuloksemme ehdotti, että emodin voi estää VEGF ilmaisu tukahduttaa angiogeneesiä haimasyövän. Edelleen kokeet osoittivat, että emodin, gemsitabiini, ja niiden yhdistelmä ei ollut vaikutusta VEGFR ilmaus, mikä osoittaa, että angiogeneesin inhibitiota emodin haimasyövän ei liittynyt VEGFR.

eNOS stimuloi vapauttaa NO mikä puolestaan voi edistää leviämisen EPC [25]. Esto eNOS ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) voi estää proliferaatiota ja putken muodostumiseen endoteelisolujen [10]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että emodiinia yksin tai yhdistettynä gemctabine esti eNOS ilmentymistä ortotooppisten haimasyövän kudoksiin, mikä osoittaa, että inhibitio eNOS ilmentyminen voi olla mukana tuumorin angiogeneesin emodiinia. Edelleen kokeet osoittivat, että emodiinia hoito ja yhdistetty hoito emodiinia ja gemsitabiinin esti merkittävästi eNOS fosforylaation, mikä osoittaa, että emodin voi merkitsevästi estävän gemsitabiinia aiheuttamaa eNOS fosforylaatio joka osallistuu EY maahanmuuton lisääntymistä, ja putken muodostumiseen

in vitro

[26].

NF-KB liittyy läheisesti paitsi apoptoosin esto, mutta myös angiogeneesin kasvaimia. Tutkimuksemme osoitti ensimmäistä kertaa, että NF-KB voi myös olla tärkeä rooli angiogeneesissä esto emodin haimasyövän

in vivo

, ja tehostettu vaikutus gemsitabiinin on haimasyövän voidaan saavuttaa emodin välittämää downregulation ilmentymisen NF-KB: n ja NF-KB: n säädelty proteiinien rooleja angiogeneesin inhibition (eli VEGF, MMP-2, MMP-9 ja eNOS). Kuitenkin miten emodin downregulates NF-KB ilmentyminen vielä tutkittava.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kokeelliset protokollat ​​hyväksyi Institutional Review Board of First Affiliated sairaala, Zhejiangin yliopistossa School of Medicine.

solulinjat ja eläimet

ihmisen haimasyövän solulinjoissa SW1990 ja Panc-1 hankittiin American Type Culture Collection. Ihmisen haiman normaali epiteelisolujen (HPNE) (CHI Scientific INC, Maynard, MA) istutettiin laboratoriossamme. Naaras, joilta puuttuu kateenkorva BALB /c nu /nu-hiiriä (4-6 viikkoa vanhoja) hankittiin Shanghai Cancer Institute tuumorin implantaatioon. Kaikki eläimet pidettiin steriilissä ympäristössä sisällä eläinkoe ​​keskus Zhejiang University School of Medicine, mukaan Laboratory Animal sovellettavien tiede- ja teknologiaministeriön kansantasavallan Kiinan (https://www.most.gov. cn /kytj /kytjzcwj /200411 /t20041108_32465.htm).

Reagenssit

emodiinia ostettiin Sigma (St. Louis, USA), liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), 0,2 mmol /L varastossa ja säilytetään -20 ° C: ssa. Lopullinen DMSO-pitoisuus oli 0,1%. Gemsitabiini ostettiin Ely Lillyn (Bad Homburg, Saksa) ja liuotetaan steriiliin suolaliuokseen 50 g /l varastossa. RPMI-1640 ja naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Apoptoosia reagenssipakkauksen (anneksiini V-FITC ja PI) ostettiin Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kiina). Cell laskenta kit-8 (CCK-8) ostettiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Haimen, Kiina). Fluori-18-leimattua fluorideoksiglukoosi (

18F-FDG) tarjosi Zhejiangin yliopiston (Hangzhou, Zhejiang, Kiina). Vasta-aineet saatiin seuraavista kaupallisista lähteistä: anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-VEGF ja anti-β-aktiini-vasta-aineet hankittiin Epitomics (Burlingame, Kalifornia, USA); anti-NF-KB, anti-CD31 ja anti-CD105-vasta-aineita ostettiin Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-eNOS ja anti-VEGFR (Flk-1) (C1158) vasta-aineet ostettiin Santa Cruz (Santa Cruz, USA); anti-fosfo- eNOS (Ser1177) vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Beverly, MA, USA); anti-Ki-67-vasta-aineen ja DAB pakki ostettiin Zhongshan Bio-Tech Co., Ltd (Peking, Kiina). Trizol reagenssi hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA nopeasti 200 puhdistustarvikepakkausta ostettiin Fastagen Biotech (Shanghai, Kiina).

eristäminen mikrovaskulaaristen endoteelisolujen (EC) välillä ihonalaista haimasyöpä kudoksiin.

istutetut haimasyöpä kudokset leikattiin 1 mm kudospaloista ja inkuboitiin 0,1% kollagenaasia I MEM 37 ° C: ssa 2 tuntia. Mikrovaskulaarinen hankittua eristettiin kudosblokeista käyttämällä magneettista helmi immunoaffiniteetti- endoteelisolujen eristyspakkausta (Dynal Biotech, Brown Deer, WI). Lyhyesti, Dynabeads M-450 ja lampaan anti-rotta-IgG yhdessä monoklonaalisen rotan anti-hiiri-CD31-vasta-ainetta (30 ul: n näyte per 5 ml: n putki) inkuboitiin 1 ml kudosten supernatanttia 4 ° C: ssa yön yli ja pestiin sitten kolme kertaa 10% FBS-DMEM; 1 ml solususpensiota pantiin putkeen, joka sisältää pestiin helmiä. Inkubaation jälkeen satunnaisesti sekoittaen 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, helmet sitoutuneet solut otettiin talteen, pestiin, ja sitten hajotettiin 1 ml trypsiiniä /EDTA: a (Gibco) vapauttamiseksi helmiä. Helmi-free-soluja sentrifugoitiin 10% FBS-RPMI-1640 ja sen jälkeen suspendoitiin uudelleen 7 ml: ssa elatusaineissa, kuten kuvattu alla. Saanto verisuonten hankittua oli 98%. Identiteetti eristettyjä soluja varmistettiin in vitro-putken muodostumiseen in matrigeeliä ja värjäyksen VE-kadheriinin, yksinomainen EY merkki.

Cell Culture

HPNE, EC, SW1990-soluissa, ja Panc -1-soluja viljeltiin RPMI-1640-viljelyalustaan, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inkuboitiin FBS (Invitrogen, New York, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä. Solut siirrostettiin 70-80% konfluenssiin. Luciferase-transfektoidut SW1990 solut kerättiin 70-80% konfluentteja viljelmiä jälkeen lyhyt altistus 0,25% trypsiiniä, jota oli täydennetty 0,2% EDTA: ta. Trypsinisaatiolla lopetettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut pestiin kerran seerumittomalla alustalla ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Suspensiot koostuu Pancin-1-solut, joissa 90% elinkelpoisuus, käytettiin injektioita.

Cell eloonjäämisaste tunnistanut CCK-8

HPNE, EC, SW1990-soluissa, ja Panc -1 kerätyt solut eksponentiaalisen vaiheen ympättiin alkutiheydellä 4 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Sitten solut jaettiin neljään ryhmään, joissa erilainen kohtelu 72 h: kontrolliryhmässä (0,1% DMSO), The gemsitabiinia ryhmä (gemsitabiini, 20 mikromol /l), The emodin ryhmä (emodin, 40 mikromol /l), ja yhdistelmä ryhmä (gemsitabiinin 20 umol /L + emodin 40 mikromol /l), jossa on viisi kaivoja kullekin ryhmälle. Kuopat ilman huumeita, mutta 0,1% DMSO käytettiin kontrollina. Yksi tunti ennen altistusta päättyi, 0,01 ml CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan.