Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maksan Nukleaaritekijä HNF4α on monipuolinen transkriptiotekijä ja valvonnan ilmaisun monien geenien kehitykseen , aineenvaihdunta ja sairaus. Rajata sen säätelygeenillä verkon paksusuolensyöpä ja määritellä uusi geenikohteet kattavan genominlaajuisten scan suoritettiin resoluutiolla 35 emäsparin kromatiinin IP DNA on saatu ihmisen koolonkarsinoomasolulinja Caco-2, joka on erityisen rikas lähde HNF4α. Enemmän kuin 90% HNF4α sitoutumiskohdat kartoitettiin, kuten promoottorin distaalinen sekvensseihin tehostajaelementit voitaisiin määritellä edistää kromatiinin silmukoita vuorovaikutus muiden promoottori-sidottu transkriptiotekijöiden. Sekvenssimotiivissa analyysi eri geneettiset algoritmit osoituksena ainutlaatuinen enhanceosome joka koostui tumaproteiinien ERa, AP1, GATA ja HNF1α kuin yhteistyössä transkriptiotekijöitä. Kaiken 17500 DNA sitoutumiskohtia tunnistettiin geenin /sitoutumiskohta suhde, joka poikkesi 6-kertaiseksi välillä kromosomia ja ryhmitelty erillisten kromosomialueita keskuudessa 6600 geenejä kohteena HNF4α. Todisteet on esitetty ytimen reseptorin rajat puhua HNF4α ja estrogeenireseptorin α joka kertasi on sekvenssin tasolla. Merkillistä, Y-kromosomi puuttuu HNF4α sitoutumiskohdista. Toiminnallinen merkitys rikastamiseen sivustoja vahvistettiin genominlaajuisten geeniekspressiotutkimuksissa vaihtelevilla HNF4α proteiinin tasoja. Kollektiivisestikaan genomin laajuinen skannaus HNF4α sitoutumiskohtien raportoidaan paremmin ymmärtää perusmekanismit transkriptionaalisen säätelyn HNF4α kohdennettujen geenien. Novel promoottori distaalinen sitoutumiskohdat tunnistetaan muodostavien enhanceosome mikä helpottaa RNA käsittely tapahtumia.

Citation: Weltmeier F, Borlak J (2011) High Resolution genominlaajuisten Scan HNF4α Recognition Sites päättelee säätelygeenissä verkoston Paksusuolen syöpä. PLoS ONE 6 (7): e21667. doi: 10,1371 /journal.pone.0021667

Editor: Ying Xu, University of Georgia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2011; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2011; Julkaistu: 28 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Weltmeier, Borlak. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti Niedersachsenin kulttuuriministeriö ja ammattikorkeakoulun ja Volkswagen perusta, Saksa. Grant numero: 25A.5-7251-99-3 /00. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Maksan Nukleaaritekijä HNF4α on jäsen tumareseptorisuperperheen ja erittäin monipuolinen transkriptiotekijä [1]. Tämä sinkkisormen proteiini ilmentyy maksassa, suolessa, haimassa ja muissa kudoksissa, ja se sitoutuu sukulais-DNA-sekvenssejä, homodimeerinä [2]. Aiemmin kymmenkunta promoottori sitoutumiskohtia raportoitu. Käyttö kromatiinin immunosaostus ja mikrosirujen hybridisaatio ChIP-chip menetelmiä osoittivat, että nämä ovat vain pienin osa todellisen HNF4α sitoutumiskohdista. Käyttämällä laatoituksen array kattaa ENCODE alueille, jotka edustavat 1% perimän ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2 [3] 194 HNF4α sitoutumiskohtien voitiin kartoittaa. Toisessa tutkimuksessa HNF4α sitoutumiskohdat maksasoluissa ja haiman saarekkeiden kartoitettiin, mutta toimintatavassa keskityttiin promoottorialueet vain [4]. Kuten tänään, genomin laajuinen jalanjälki HNF4α ei ole raportoitu. Erityisesti HNF4α on päällikön säätelyproteiini ja toimintahäiriöitä HNF4α on liittynyt metabolisia ja syöpätaudit. Olimme erityisen kiinnostuneita tutkimaan HNF4α genomista jalanjälki ihmisen paksusuolen adenocarcinmoa Caco-2 solulinja, joka on laajalti käytetty tutkimaan HNF4α toimintaa [5] siten tunnistetaan verkoston säännellyn geenejä. Erityisesti solulinja erottaa osaksi enterosyytteihin kun yhtymäkohta [6] ja ilmentää HNF4α proteiinin verrattavissa maksan [7]. Kirjoittajat raportoivat ensimmäisestä genominlaajuisia scan joka mahdollisti tunnistaminen 17500 sidoskohdissa kohdistettu HNF4α ja kuvata niiden kromosomi jakelua. Lisäksi olemme tutkineet seurauksia HNF4α proteiinin induktion transkriptionaalista aktiivisuutta

de novo

tunnistaa geenejä ja osoittaa hyvää välisen geenisiirtoja tavoitteet ja niiden ilmaisun Caco-2-solut. Lopuksi analysoidaan HNF4α sitoutumiskohdat rikastettu sitovia motiiveja ja tunnistettiin yhteistyössä transkriptiotekijöiden, joka näytti toimivan yhteistuumin HNF4α käytettäessä enhanceosome transkription sääntelyn.

Tulokset

Kromatiini IP kokeet suoritettiin Caco-2 soluviljelmissä ja vasta-aineen erittäin spesifinen HNF4α. Erityisesti kokonaispanos sekä IP-DNA kolmesta itsenäisestä biologisista rinnakkaisnäytteiden saatiin ja alistettiin optimoitu protokolla puolueeton vahvistus mukaan valmistaa suosituksen (katso myös Materiaalit ja menetelmät -kappaleessa). Monistettu DNA itsenäisestä kokeesta hybridisoitiin Affymetrix Human laatoitus 2.0R paneelit, joiden genominlaajuisten päätöslauselman 35 bp. Sitten raakadataa tutkittiin rikastettu alueiden käyttämällä kolmea riippumatonta algoritmeja (TAS [8], MAT [9] ja Tilemap [10]). Alustavat raja kriteerit asetetaan heikosti rikastettu positiivisen kontrollin (

OTC

) ja edelleen parantaa perustuu usein HNF4α -motifs sisällä rikastettua alueilla, määritettynä MATCH algoritmilla [11]. Saada luottamusta tietoja, tuloksia kolmen algoritmeja leikkaavat. Päällekkäisyys rikastus sivustoja (ES) tunnistetaan kolmea lähestymistapaa oli erittäin korkea (Fig. 1), vaikka pieniä eroja havaittiin mahdollisesti johtuen eri toista kirjastoja käytetään. Kaiken kaikkiaan tämä lähestymistapa johti tunnistamiseen 17561 ES (taulukko S1). Lisäksi matalan vaativuuden tietojoukko muodostettiin yhdistämällä ES data havaitaan MAT ja Tilemap algoritmeja. Tämä johti yhteensä 25419 ES (taulukko S2).

Raaka analysoitiin kolmella eri ohjelmia (Tilemap, MAT ja TAS) tunnistaa HNF4α sitoutumiskohtiin. Vaikka eri parametrien asetukseen (esim. Kaistanleveys on 200, 300 ja 400 nukleotidin) ja erilaisia ​​algoritmeja käytettiin, päällekkäisyys oli yllättävän korkea. Venn kaavio laskettiin leikkaavat toiminta Galaxy [47].

Lisäksi 15 ES tunnettuja HNF4α geenikohteet valittiin ja niiden rikastumista ensisijaisen IP-DNA määritettiin reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR . Kaikkien valittujen sivustojen rikastamiseen voitaisiin vahvistaa. Näin luotettavuutta ja tietojen laadun validoitiin (Fig. 2). Niistä tunnistettu ES oli HNF4α sitoutumiskohtia jo kuvattu kirjallisuudessa tai muualla ilmoitettuihin kuten

AAT

(R00114),

GCC

(R08885),

PCK

(R12074 ),

APOB

(R01612),

CYP2C9

(R15905),

AKR1C4

(R13037),

ACADM

(R15923) tai

CYP27A1

(R15917). Siinä tapauksessa, SHBG (R15941), ES määritettiin muutaman sadan emäsparin suhteen raportoitu sitoutumiskohtiin. Muut sitoutumiskohtia kuvattu kirjallisuudessa, kuten

ALDH2

(R15845), ei voitu vahvistaa. Kuitenkin kvantitointiin reaaliaikainen PCR osoitti, että

ALDH2

sivusto ei rikastunut ensisijainen IP-DNA. Kuten HNF4α proteiini toimii kudosspesifisellä tavalla, ei ole odottamatonta, että jotkut ES eivät sido Caco-2-soluissa; niiden saatavuutta pikemminkin riippuu kromatiinin organisaatiota, joka puolestaan ​​riippuu solutyypistä. Tätä tukee riippumattomia tutkimuksia, joissa merkittäviä eroja DNA sitoutumiskohtia eri solutyyppejä oli havaittu [12].

rikastaminen novel HNF4α sidoskohdissa havaita chip chip varmistettiin reaaliaikainen PCR. ChIP-DNA kolmesta itsenäisestä kokeesta on käytetty. Normalisointi tehtiin käyttäen β-aktiini negatiivinen kontrolli, ja arvot näkyvät kertaa runsaammin verrattuna kokonaispanoksen. HNF1α ylävirtaan on toinen negatiivinen kontrolli, joka sijaitsee ylävirtaan tunnetun HNF4α sitova sivusto HNF1α promoottori ja käytetään vahvistamaan SS-aktiini negatiivinen kontrolli.

Euroopan HNF4α motiivi on korkeasti rikastettua sisällä siru alueet

ChIP rikastetun alueita tutkittiin HNF4α sidosmotiivien Ottelua algoritmilla [11]. Käyttämällä tiukat minimoimiseksi vääriä positiivisia, 14-kertainen rikastus havaittiin HNF4α kohdennettuja sekvenssejä verrattuna genomista tausta (taulukko S3).

alueet 500 emäsparin ympäröivä 17561 tunnistettu sitoutumiskohdat analysoitiin HNF4α kuviot asetukset minimoimaan väärien negatiivisten käyttämällä MATCH algoritmin [11]. Pohjimmiltaan alueet olivat jakautuneet jäteastioita 25 bp, ja tapahtumien määrä eri motiivien kussakin bin laskettiin. Tämä johti yhteensä 23145 motiiveja ja vastaa 1,32 motiiveja /ChIP alue. Sillä 98,1% sirun alueiden ainakin yhden motiivin havaittiin. Tämä viittaa siihen, että suurin osa ChIP alueiden rikastettiin johtuu suoraan sitoutumisen HNF4α. Sama lähestymistapa sitoutumiskohdista raportoitu ENCODE alueille [3] tutkittiin ja 1,13 kuviot /Chip alue arvioitiin mikä on vähemmän kuin havaittu tässä tutkimuksessa mahdollisesti ehdottaa korkean resoluution laatoitus paneelit tunnistaa paremmin ES. Sen jälkeen, jakelu HNF4α motiivien ympäri keskellä ChIP rikastettu alueet analysoitiin (Fig. 3a). Valtaosa motiiveja sijaitsee alueella vain ~500 emäsparia. Kun rikastettu alueita piikkien paikat havaita MAT algoritmia linjassa vastaan ​​keskiasennossa, määrä HNF4α motiiveja kasvanut, mikä osoittaa, että huippu aseman paremman arvion todellinen sitoutumiskohdan. Lisäksi Gibbs motiivi näytteenottolaitteen on sovellettu tunnistamaan ES alueille, jotta on helppo

de novo

määritelmä HNF4α motiivin (Fig. 3b).

a) HNF4α motiiveja alueella 1000 bp ympäröivä rikastus päällä (ES) huipun tai keskikohdat havaittuna MATCH käyttäen cutoffs minimoimiseksi vääriä positiivisia. Etäisyys keskustasta havaittu kuviot piikin tai keskiasennossa ES laskettiin. Histogrammi luotiin jäteastioita 50 nukleotidin ympäri keskustaa tai huippukohdat. Sininen viiva osoittaa poikkeaman HNF4α motiiveja suhteen ES keskus, punainen viiva osoittaa poikkeaman vastehuipusta asentoon. b) HNF4α chip chip ES mahdollistaa helpon

de novo

ennustaminen HNF4α sitova motiivi. Kun analyysi sekvenssin alueiden rikastaa HNF4α chip siru Gibbs motiivi sampleri, The HNF4α-motiivi juuri havaittua kaksi kertaa, toisen motiivi esittää vain puoli sivusto. c) säilyttäminen kaikkien HNF4α sitoutumiskohtia (sininen viiva). ES keskukset (sininen) tai Peak asemissa (punainen) laajennettiin 1000 emäsparin molempiin suuntiin, ja kunkin nukleotidin keskimääräinen säilyttämistä pisteet, joka perustuu laadukkaiden Phast-Miinukset tietoja UCSC GoldenPath Genome Resource, laskettiin. Keskimääräinen säilyttäminen pisteet piirrettiin nukleotidien asentoon. Analyysit tehtiin turvapaikkajärjestelmän [43].

korostavat biologisen merkityksen tunnistetun sitoutumiskohtien niiden keskimääräinen säilyttäminen tutkittiin samoin. Nukleotidit keskellä, jossa on sitoutumiskohta voidaan odottaa, näyttää kaksi kertaa suurempi säilyttäminen kuin päissä juoni (genominen tausta) (Fig. 3c). Jälleen kun siru rikastettu alueet olivat linjassa piikin asema, säilyttämistä huippu oli jopa parempi määritelty.

HNF4α sitoutuu ensisijaisesti tehostinelementteihin

Etäisyyden HNF4α sitoutumiskohdan lähimmälle transkriptio aloituspaikan (TSS) on RefSeq geenin määritettiin. Tässä lähes 5-kertaisesti yliedustettuina sitoutumiskohdat promoottorialueen -1000-0 suhteessa TSS havaittiin (Fig. 4a, b). Kuitenkin vain 5,8% kaikista sitoutumiskohtien kartoitettu promoottori-proksimaalisen alueille ja 3,6% kaikista RefSeq promoottorit sitoo HNF4α. Samanlainen ja merkittävä puute parempana sitoutumalla 5 ’promoottorin proksimaalinen alueilla oli ilmoitettu transkriptiotekijöille SP1, P53, cMyc ja ERa [13], [8]. Vaikka jotkut transkriptiotekijöiden kuten E2F1 osoita, että 5 ’promoottorin proksimaalinen alueilla [14], varaamiseen näyttöä on hyvin vaikuttava promoottorin-proksimaalisen alueiden muodostavat vain pienen murto-osa nisäkäsgeeni säätelysekvenssejä. Itse asiassa, jotkut tumareseptorien näyttää korkeampi aktiivisuus edistäjän sijaan promoottorin sitoutumiskohtia [13], [15]. Niinpä tutkimukset promoottori paneelit ovat rajallinen.

a) sijainti HNF4α sitoutumiskohtien suhteen lähin TSS on RefSeq geenejä verrattuna satunnainen jakauma. Alueet 100000 nukleotidin ympäröivän kunkin TSS jaettiin jäteastioita 5000 nukleotidia, ja sitoutumiskohtien lukumäärä kussakin bin laskettiin. b) Perimän jakelu HNF4α sitoutumiskohdista. Määrä sitoutumiskohtia löydy määritetystä alueilla RefSeq selityksin geenien laskettiin työkalu CisGenome. TSSup1k: 1000 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS); TESdown1k: 1000 bp alavirtaan transkription loppusivustoon. c) jakautuminen HNF4α sitoutumiskohtien sijoitettu lähelle TSS of RefSeq geenien verrattuna satunnainen jakauma. Alueet 5000 nukleotidin ympäröivän kunkin TSS jaettiin jäteastioita 200 nukleotidin, ja sitoutumiskohtien lukumäärä kussakin bin laskettiin. d) yliedustus HNF4α sitoutumiskohdista tuotantoketjun TSS proksimaalinen alueilla ja ensimmäisen, toisen kolmas intronit RefSeq selityksin geenejä, verrattuna satunnaisen valvonnan alueilla. Kannat TSS ensimmäinen, toinen ja kolmas intronit RefSeq selityksin geenien haettiin UCSC, ja määrä HNF4α sitoutumiskohtien sijaitsevat määrätyillä alueilla laskettiin. TSSup600: 600 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta; TSSdown600: 600 emäsparia alavirtaan transkription aloituskohdasta; TSSup10k: 10000 bp ylävirtaan TSS; TSSdown10k: 10000 bp alavirtaan TSS.

analyysi jakelun ES 600 emäsparin ympäröivä TSS esittänyt näyttöä etuuskohteluun sitovia ylävirran (Fig. 4c ja d). Kuitenkin, etäisyydellä yli 800 emäsparia TSS, sitovampi alueet sijaitsevat alavirtaan. Erityisesti monet transkriptiotekijät sitoutumiskohtia sijaitsevat ensimmäisen intronin; toinen piikki kuviossa. 4c johtuu sitoutumisesta introni alueilla. Taajuus HNF4α sitoutumiskohdista RefSeq selityksin geenit analysoitiin edelleen. Tämä osoittaa yliedustus ES ensimmäisessä intronit, mutta vähemmän toisen tai kolmannen (Fig. 4d).

On tärkeää, äskettäin HNF4α chip chip tutkimuksessa esitettiin promoottori-proksimaalisen ES johtuvat epäsuorat vuorovaikutukset of HNF4α muiden transkriptiotekijöiden [3]. Näin ollen kehitettiin malli, jossa HNF4α sitoutuu kaukaisiin tehostinelementit ja luo chromatin silmukoita vuorovaikutuksessa muiden promoottori-sidottu transkriptiotekijöiden. Valitettavasti tämä malli, joka perustuu alle 1% genomisekvenssien. Perustuen genomin laaja scan raportoitu tässä HNF4α sidosmotiivia promoottori-distaalinen alueita ovat yliedustettuina verrattuna promoottori-proksimaalisen alueen (Fig. 5a), kuitenkin harvaan rikastamiseen näyttää suurempi prosenttiosuus promoottori-proksimaalisen sitoutumiskohtien kuin alueilla, joilla on suuri rikastus (Fig. 5b). Mahdollisesti HNF4α yhteydet promoottori-proksimaalisen alueiden fyysinen vuorovaikutus muiden transkriptiotekijöiden, ja näin ollen näyttää promoottori sekä tehostajan sitova aktiivisuus.

a) Bootstrapping analyysi HNF4α sitova motiivi (matriisi M01031) promoottorin-proksimaalisen ja promoottori distaalinen alueilla. 100 promoottori-proksimaalisen ES (-138 -2 suhteessa TSS) verrattiin 100 promoottori-distaalinen ES (-24972–23489 suhteessa TSS), jonka bootstrap analyysityökalun Pobo [48]. Promoottori-proksimaalisen ES osoittavat huomattavasti pienempi määrä HNF4α motiiveja. b) ES (300 emäsparia ympäröivät huippukohta) on lajiteltu niiden P-arvo (laskettuna MAT algoritmi) ja jaetaan jäteastioita 1000 ES. Kunkin bin määrä HNF4α motiivi tapahtumien prosenttiosuus promoottori-proksimaalisen ES laskettiin. Kuten voidaan nähdä, ES, joilla on korkea P-arvo (heikko ES) ovat todennäköisesti sijaitsee promoottorin proksimaalinen mutta ei sisällä HNF4α sitova motiivi.

jakauma tunnistettiin ES pitkin kromosomeja monipuolinen 6 kertaiseksi. On silmiinpistävää, Y-kromosomi puuttuu HNF4α ES (taulukko S6) ja kromosomaalinen jakautuminen ES ei ole satunnaisesti jakautunut; pikemmin klustereita muodostetaan (Fig. 6a, Fig. 7). Nämä klusterit eivät liity eroihin geenin tiheys näillä alueilla, kuten esitetty kromosomissa 10. alueen tihein sitoutumiskohtia kromosomissa 10 sisältää kaksi klustereiden sitovien kohtien kanssa päällekkäisiä loci ACSL5 ja VTI1A1 (Fig. 6b ). Skannaamalla genomisen sekvenssin ikkunoiden 100000 emäsparin jotka sisältävät ≥10 HNF4α sitoutumiskohtia, viisitoista klustereita voitaisiin määritellä (taulukko S7). Useimmat parantajia näyttävät olevan siveetön ja siten säädellä useita geenejä [16]. Vaikka tehostajana toiminta voi tapahtua satoja kiloemäksen [17] ja jopa tapauksia välisten kromosomi sääntelyn parantajia on raportoitu [18], useimmat ovat 100000 emäsparin niiden TSS. Määritellä paremmin mahdollisen enhanceosome varten kohdegeenien sekvenssit lähinnä RefSeq geenien kanssa TSS erotettu alle 100.000 nukleotidin valittiin (taulukko S8).

a) jakelu HNF4α sitoutumiskohtia (violetti viivakaavioksi, ylempi puoli) verrataan jakelun tunnettuja geenejä kromosomissa 10. Vihreä nuolet merkitsevät kaksi geenien harva alueilla, joissa ES löytyy. Punaiset nuolet merkitsevät kaksi aluetta, joilla on suuri määrä HNF4α sitoutumiskohtia ja pieni määrä geenejä. Analyysit suoritettiin käyttäen Ensembl työkalun Karyoview (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview). b) Klusterit HNF4α sitoutumiskohdista genomialue kromosomissa 10 korkea pitoisuus sitoutumiskohtia (alue merkitty toinen punainen nuoli a)). Sitoutumiskohdat tunnistettu tässä tutkimuksessa, näytetään sininen huiput yläosassa, on esitetty käyttäen IGB genomin selain. Sitoutumiskohdat jaetaan kahteen klustereiden transkription aloituskohdasta ja ACSL5 lokuksen ja 3′-alueen VTI1A lokukseen.

Kukin kromosomi jakautuu 150 ’

säiliöt

”, ja kunkin bin määrä ES laskettiin. Vuonna sininen viiva kaavioon, määrä HNF4α sitoutumiskohtien kussakin bin on esittää yhtenä datapiste. Alla kukin kromosomi vähimmäis- ja enimmäismäärä sitoutumiskohtia sijaita yhdessä bin annetaan. Analyysit suoritettiin käyttäen Ensembl työkalun Karyoview (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview).

HNF4α transkriptiotekijä cross-talk

Jos haluat etsiä transkriptiotekijän ylikuuluminen sirun alueet yliedustettuna motiivien pidettiin. Niistä kuviot korkeimman rikastamiseen ovat matriiseja samanlainen HNF4α sitovaan motiiviin, esim. ottamatta COUP-TF, PPAR tai LEF1 (Fig. 8, taulukot S3, S4, S5). Nämä transkriptiotekijät ovat tunnettuja kilpailla HNF4α yhteisiä sitoutumiskohtien [19] – [21]. Kuitenkin monet kuviot erilainen kuin HNF4α, esim. sitova motiivit HNF1α, AP1 tai GATA transkriptiotekijät, olivat myös merkittävästi rikastettu. Jos nämä tekijät toimivat yhteistä HNF4α, voidaan olettaa, että usein ne motiivien kasvaa pienenee etäisyyden HNF4α sitoutumiskohtiin. Siksi taajuus tällaisten motiivien suhteen HNF4α sitoutumiskohtiin analysoitiin (Fig. 9a ja 9b). Rikastamista nämä motiivit on rajoitettu alueelle muutaman sadan emäsparin huipun ympärille asennossa, tukee siksi ajatusta, että ne ovat osa enhanceosome määritelty HNF4α. Paitsi lisääntymisenä sitovien motiivien varten AP1, GATA, ERa ja HNF1α käänteinen suhde HNF4α ja CART motiiveja havaittiin, mutta ei ollut suhdetta SREBP1 (Fig. 9). On houkuttelevaa spekuloida, että tämä on sääntelyn merkitys HNF4α. Muut analysoitiin motiiveja oli vain niukasti korrelaatio määrä motiiveja ja etäisyys huippukohta, vaikka ne olivat selvästi rikastuneet ChIP alueilla (esimerkiksi USF, CREB, HNF6).

10000 Merkittävin siruihin rikastettu alueet analysoitiin yliedustettuina motiivien käyttämällä turvapaikkajärjestelmän työkalun [43]. Siinä on esitetty 10 kuviot merkittävimmät rikastamiseen, kun tarpeeton motiiveja (eli useita motiiveja samaan transkriptiotekijä) poistettiin. Samankaltaisuus tai erilaisuus motiivien visualisoidaan käyttämällä Weblogo kuvaus (https://weblogo.berkeley.edu/). Motif rikastamiseen analyysi Genomatix RegionMiner ja MATCH [11] löytyy taulukoissa S3, S4, S5.

a) Peak tehtävissä (edustettuina 0) laajennettiin 500 bp molempiin suuntiin, ja Motifs havaittiin käyttämällä MATCH algoritmin [11] käyttäen cutoff perusteita minimoimiseksi summa vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia. Alueet olivat jakautuneet jäteastioita 25 bp, ja tapahtumien määrä eri motiivien kussakin bin laskettiin. b) Plot suhteellisen etäisyyden HNF4α kuviot muita motiiveja rikastettu ChIP alueella. Sisällä ChIP alueilla eniten konservoituneet HNF4α motiiveja jossa tunnistettu. Sekvenssit 500 nukleotidin ympäröivän nämä eniten konservoituneet HNF4α motiiveja, jossa palautetut ja analysoitiin niiden motiivien muiden TF, joka myös on rikastettu ChIP alueilla. Sitten välinen etäisyys nämä motiivit ja HNF4α motiivi laskettiin CisGenome varten motiivi havaitsemiseen ja piirretään histogrammin avulla laatikot 20 bp. HNF4α motiivi löytyy keskellä, ulottuen bp -6 emäsparin +6. HNF4α ja ERa: yhteiset ja päällekkäiset sitoutumiskohdista. c) näyttö päällekkäistä sitovien motiiveja HNF4α ja estrogeenireseptorin (ERa) käyttämällä Weblogo kuvia. Molemmat kuviot esittävät osittaista päällekkäisyyttä. d) päällekkäisyys ERa sitoutumiskohtiin ja HNF4α sitoutumiskohdista. Korkea tiukkuus joukko ERa sidoskohdissa tunnistetaan chip chip [13] saatiin. Prosenttiosuus ERa sitoutumiskohtien tunnistettu tässä tutkimuksessa ja myös sitoo HNF4α näytetään pylväsdiagrammi. Päällekkäisyys ERa sitoutumiskohtia satunnaisella ohjaus alueiden määritettiin.

korkea sekvenssi samankaltaisuus sitoutumiskohdat HNF4α ja estrogeenireseptorin (ERa) on huomattava merkitys (Kuva. 9c). Analysoida edelleen todennäköisyyttä yhteistyön täyttöaste rikastetun motiivien HNF4α sitoutumiskohdat määritettiin tarkalleen motiivi analyysi. Genomisen asema eniten pisteitä HNF4α motiivi sisällä ChIP alueilla on haettu, ja laajennettu 500 nukleotidia vasemmalle ja oikealle viereiset sekvenssit. Näiden sekvenssit, muut rikastettua motiiveja havaittiin, ja etäisyys HNF4α motiivi on laskettu (Fig. 9b). Kuten odotettua, useimmat ERa motiiveja yhteistyötä paikantaa HNF4α ES aiheuttaa korkea huippu keskellä. Sen sijaan, HNF1α, AP1 ja GATA kuviot näyttää rikastamiseen etäisyydellä 20-60 nukleotidin HNF4α motiivi. Myös rikastuminen vähemmän säilynyt HNF4α sitoutumiskohtia lähellä eniten pisteitä HNF4α motiivi. Tämä yliedustus vähemmän konservoitunutta HNF4α motiivit saattavat olla merkitystä lisää todennäköisyyttä HNF4α sitoutumisen paikallisella sekvenssikontekstissa ympäröivä sitoutumiskohtaan.

Koska ERa motiivi menee päällekkäin osittain kanssa HNF4α aihe, on houkuttelevaa spekuloida että tällaiset rikastamiseen sisällä chIP alueilla johtuu välisen toiminnallisen yhteyden kahdesta tekijästä. Äskettäin genomin laajuinen kartta ERa sitoutumiskohdista raportoitu [13]. Siksi tiedot ERa: n ja HNF4α sivustoja analysoitiin ja todettiin merkittävästi päällekkäin (Kuva. 9d). Käyttäen joko alhaisen tai korkean tiukkuuden joukko HNF4α tai ERa sitoutumiskohtien jopa noin 15% ERa sitoutumiskohtien myös kohteena HNF4α, mikä tukee ajatusta yhteistyöstä HNF4α ja ERa: n ydin- reseptoriin. Tärkeää on, useat riippumattomat tutkimukset raportoivat synergistisyyttä transkriptiotekijää aktiivisuus HNF4α ja ERa geenissä sääntelyn esimerkiksi apolipoproteiini A1, apoVLDII ja pieni heterodimeerin kumppani.

Genomi laajuinen skannaus paljastaa HNF4α päällikön toiminto

tiedot Tässä tutkimuksessa verrattiin julkaistuihin tietoihin, jotta voidaan tunnistaa alueet, jotka ovat päällekkäin keskuudessa näitä tutkimuksia (Fig. 10). Niistä 194 ES raportoitu sisällä ENCODE alueilla [3], 76 päällekkäin havaintojen tämän tutkimuksen. Valitettavasti ENCODE alueet käsittävät 1% koko genomin vain. Lisäksi promoottori keskittynyt tutkimus [4] 1553 sitoutuneet sekvenssit raportoitu hepatosyyttien. Tässä tutkimuksessa ja valitsemalla verrattavissa sekvenssialueisiin yhteensä 575 sitoutumiskohtien voitaisiin tutkia. Näistä 200 sitoutumiskohdat olivat yhteisiä, siis vahvistaen 13% ehdotetun promoottorin sitoutumiskohdista. Lisäksi sama tutkija raportoitu ES haiman saarekkeiden mutta vain 9% voitiin vahvistaa tässä tutkimuksessa, jossa IP DNA Caco-2 cell line. Tällaisia ​​eroja voi syntyä erilaisia ​​kokeellisia protokollia ja erot solutyypeissä.

Suhteellinen HNF4α sidoskohdissa tunnistetaan Rada-Iglesias et al. [3] tai Odom et ai. [4], joka voitaisiin vahvistaa tässä tutkimuksessa. Sillä Rada-Iglesias et al. kontrolliryhmään satunnaisia ​​genomisten sekvenssien laskemiseen käytetty satunnainen päällekkäin. Sillä Odom et ai., Kontrolliryhmää luotiin valitsemalla satunnaisesti useiden promoottorialueiden päässä Huk13 array käytetään niiden tutkimuksessa, yhtä monta promoottorien he havaittu sitoutumatta HNF4α.

Biologiset ontologiat on

de novo

tunnistettu HNF4α geenikohteet

Perustuu Gene ontologia

de novo

tunnistettu geenejä ryhmiteltiin (taulukko S9). Monet suunnattu geenit osallistuvat eri aineenvaihduntaan, esim. lipidejä, orgaaninen happo tai hiilihydraattiaineenvaihdunta. Luokat liittyvät kuljetukseen, so lipidikuljetukseen, olivat merkittävästi yliedustettuna kuten rasvahappojen ja kolesterolin aineenvaihduntaan [1], [22]. Lisäksi monet geenit kehityksen ja erilaistumisen tunnistettiin siis rauhoittavaa HNF4α roolia kehitysyhteistyössä [23] ja epiteelisolujen erilaistumisen [22], [24] – [26]. Tämä proteiini myös säätelee insuliinin erityspolulle [27], ja siihen liittyy harvinainen yhden häiriö, eli juoksuaika diabetes nuoren (MODY) [28]. Täten geenit kohteena HNF4α insuliinia signalointireitillä sekä sellaisenaan liittyvät solukuoleman ja tuumorisuppressoriproteiinia aktiivisuus tunnistettiin [29].

Määrittely toiminnallinen sitoutumiskohtia – Korrelaatio genominlaajuisten HNF4α chip siru ja geenien ilmentyminen tietojen

yhteinen lähestymistapa geenien tunnistamiseksi kohteena transkriptiotekijä on määrittää mRNA runsautta aiheuttanut sen lisääntynyt tai vähentynyt transkriptionaalista aktiivisuutta tutkittiin ihmisen alkion munuaisen (HEK293 [30]) ja hepatoomasolut (Huh7 [31], HepG2 [32]). Yllättäen HNF4α transfektion kokeissa vaikuttanut transkriptioon pieni määrä geenejä vain. Vaikka tiedetään, että kopioinnin säätely ei välity tasolla DNA: ta sitovaa yksin [33] tällaisissa kokeissa useimmissa transkriptiotekijät sitoutuvat alle ”ei-aktivoivan” olosuhteissa. Vahvista toiminnallinen sitoutumiskohdat on

de novo

tunnistettu HNF4α geenikohteet, Caco-2-soluviljelmiä käsiteltiin indusoija HNF4α proteiini [34]. Käsittelyn jälkeen Caco-2-solujen Aroclor 1254, sitoutuminen HNF4α proteiinin

HNF1α

promoottori lisättiin [7] ja myös induktion proteiinin vahvistettiin Western-blottauksella (Fig. 11). Aroclor 1254 käsitelty viljelmät altistettiin genominlaajuisten transkriptin profilointi. Käyttämällä tiukat kriteerit, 536 ainutlaatuinen RefSeq-selityksin geenejä määriteltiin ilmentyvät eri (taulukko S10). Näistä 383 geeniä säädellään ylöspäin ja 153 säädeltiin. Promoottori sekvenssit säänneltyjen geenien analysoitiin HNF4α sitoutumiskohtiin ja verrataan listan vasta havaituille ChIP-chip geenikohteet. Päällekkäisyys 63% tai 336 ilmentyvät eri geenit (taulukko S11) tunnistettiin HNF4α geenikohteet, mikä vahvistaa, toiminnallinen merkitys ES yksilöityjen chip siru määrityksessä.

a) HNF4α Western blottaus 20 ug Caco-2-uutetta. Selkeä induktio HNF4α proteiinin ekspressiota nähtiin 48 tunnin jälkeen ja 72 h Aroclor1254 hoitoon. b) Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset 2,5 ug Caco-2-solujen tuman uutetta ja oligonukleotideja, jotka vastaavat A-sivustolla HNF1α promoottorin (HNF1pro), kuten 32P-leimattu koetin. Vuonna supermuutoksena määrityksissä vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu HNF4α (+) lisättiin. Sitovat HNF4α oli merkittävästi lisääntynyt kuluttua 72 h Aroclor1254 induktion.

Lopuksi julkaistua tietoa HNF4α yli-ilmentävät nisäkässolulinjoille verrattiin tietoihin tämän tutkimuksen. Päällekkäisyys vaihteli 65-94%: n identifioitujen geenien (taulukko S10). Tärkeää on, että korkein päällekkäisyys saatiin tutkimuksista, jotka työskentelevät knock-down siRNA kokeiluja vahvistamaan havaintonsa [32]. Siksi geenikohteet raportoitu tässä voidaan pitää luotettavampia.

Keskustelu

Aiemmin tutkimus trans-toimivia tekijöitä ja niiden vastaavat

cis

-elementin keskittynyt promoottori -proximal sitoutumiskohtia. Kehittämisen siru-siru määritykset, genominlaajuisten skannaa transkriptiotekijän sitoutumiskohdista tuli toteutettavissa. Tämä parantaa huomattavasti ymmärrystä perusmekanismien transkriptionaalisen säätelyn ja tunnistamisen promoottorin distaalisen sitoutumiskohtien helpottaa RNA käsittely tapahtumia.

Esillä olevassa tutkimuksessa, genomin laajuinen kartta HNF4α sitoutumiskohtien rakennettiin. Tämä proteiini on keskeinen rooli maksan kehitykseen, ja sen isäntä sääntelytehtäviin ylläpidossa metabolisen toimivalta maksassa on kannustanut tutkimusta HNF4α suunnattu syöpähoitojen sen kyky palata maksasyövän on vähemmän aggressiivisia fenotyyppi [35].

tämä tutkimus todisteiden 90% HNF4α sitoutumiskohtien sijoitettavaksi promoottori-distaalinen alueita ja tämä jakauma ES on samanlainen kuin raportoitu ERa [13]. Erityisesti lukuun ottamatta alueiden lähempänä kuin 600 emäsparia TSS, sitoutumiskohdat olivat useammin alavirtaan. Siksi, siru-siru määritykset keskittyen promoottorialueille vain [4], [36] saattavat menettää enemmistön sitoutumiskohtien.

Lisäksi analyysi HNF4α motiivien sisällä chip rikastettua alueilla osoittaa niin suurella tarkkuudella kuin