Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vapautuminen

EGFR

signalointi on yleinen ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC) ja tämä havainto johti kehittämiseen tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), jotka ovat erittäin tehokkaita osajoukko NSCLC. Mutaatiot

EGFR

(m

EGFR

) ja kopioi numero voitot (CNGs) on

EGFR

(g

EGFR

) ja

HER2

(g

HER2

) on raportoitu ennustaa varten TKI vastausta. Mutaatiot

KRAS

(m

KRAS

) liittyvät ensisijaisesti kestävyys TKI.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkimme suhdetta mutaatioiden CNGs ja vastaus TKI suuressa paneelissa NSCLC solulinjoissa. Geenit tutkittu olivat

EGFR

,

HER2

,

HER3- HER4

,

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

. Mutaatiot havaittiin sekvensoimalla, kun taas CNGs määritettiin kvantitatiivisen PCR: n (qPCR), fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) ja joukko vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH). IC 50-arvot TKI gefitinibin (IRESSA) ja erlotinibi (Tarceva) määritettiin MTS-määrityksellä. Mille tahansa seitsemästä geenien testattu, mutaatioita (39/77, 50,6%), kopiomäärä voitot (50/77, 64,9%) tai joko (65/77, 84,4%) oli yleisiä NSCLC linjat. Mutaatiot

EGFR

(13%) ja

KRAS

(24,7%) oli tiivistä, kun he olivat harvemmin muiden geenien. Kolme tekniikkaa määrittämiseksi CNG korreloivat hyvin, ja qPCR tietoja käytettiin jatkotutkimuksiin. CNGs olivat suhteellisen tavallisia

EGFR

ja

KRAS

in adenokarsinooman. Vaikka mutaatiot olivat suureksi osaksi toisensa poissulkevia, CNGs eivät olleet.

EGFR

ja

KRAS

mutanttilinjoista usein osoittanut mutantti alleeli erityinen epätasapaino eli mutanttimuotoon oli yleensä suuri ylimäärä verrattuna villityyppimuodossaan. Moolipohjalta, herkkyys gefitinibi ja erlotinibi korreloivat voimakkaasti. Monimuuttuja analyysit johtivat seuraaviin tuloksiin:

1. m

EGFR

ja g

EGFR

ja g

HER2

olivat riippumattomia liittyvät tekijät gefitinibi herkkyys, alenevassa järjestyksessä.

2. m

KRAS

liittyi lisääntynyt in vitro resistenssi gefitinibille.

Johtopäätökset /merkitys

in vitro tutkimukset vahvistavat ja laajentavat kliiniset havainnot ja osoittavat suhteellinen merkitys sekä

EGFR

mutaatioiden ja CNGs ja

HER2

CNGs sisään herkkyyttä TKI.

Citation: Gandhi J, Zhang J, Xie Y, Soh J, Shigematsu H, Zhang W, et ai. (2009) Muutokset Geenit EGFR signalointireitin ja niiden suhdetta EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori Herkkyys Keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10,1371 /journal.pone.0004576

Editor: Alfred Lewin, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 syyskuu 2008; Hyväksytty: 18 joulukuu 2008; Julkaistu: 24 helmikuu 2009

Copyright: © 2009 Gandhi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli saadulla alkaen erikoistunut tutkimus- huippuyksikkö Lung Cancer (P50CA70907) ja Early Detection Research Network, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Varoja sekä avustuksia käytettiin palkan tuesta ja suorituskyvyn määrityksissä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Gazdar on maksettu konsultti /luennoitsija AstraZeneca PLC. Tohtori Garcia kumiankka tutkimusrahoitusorganisaatioita 10.000 AstraZeneca, Genentech ja OSI; Honorarium 10000 Rochelta. Dr. Minna saa tutkimuksen tukea AstraZeneca PLC.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy kaikista syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet diagnosoinnissa ja multimodaalisuuden hoitoja keuhkosyövässä, ennuste on edelleen huono ja 5-vuoden eloonjäämisluvut vain 16% kaikkien vaiheiden [2].

Keuhkosyöpä on ominaista kertyminen useiden geneettisten ja epigeneettisten muutoksia somaattisten mutaatioiden ja geenin kopioluku voittoja tai molempia, mikä johtaa aktivoinnin onkogeenien tai inaktivoida kasvaimen synnyssä [3]. Kasvutekijän reseptorin (

EGFR

) vapauttaminen on havaittu useita kasvaintyypeissä myös ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLCs) [4]. Hirsch et. al. tunnistettu usein

EGFR

proteiineihin lauseke (62%) vuonna NSCLCs of levyepiteelisyöpä ja adenokarsinooma alatyyppiä [5].

EGFR

yli ilmentyminen liittyy usein haitallisia ennusteeseen [6]. Reseptori tyrosiinikinaasin (RTK) super-perheen solun pinnan reseptorien toimii välittäjinä solusignalointia solun kasvutekijöitä. Jäsenet erbB RTK: iden, mukaan lukien

EGFR (HER1 /erbb1) B,

HER2 (ErbB2 /EGFR2) B,

HER3- (ErbB3 /EGFR3) B ja

HER4 (erbB4 /EGFR4) B ovat saaneet paljon huomiota antaneet vahvan yhdessä pahanlaatuinen leviämisen.

RAS /MAPK ja PI3K /AKT reitit ovat suuria signalointi verkot, jotka yhdistävät

EGFR

aktivointi solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [7]. Kuten jäljempänä

EGFR

signalointireitin geenien on raportoitu olevan mutatoitunut NSCLC. Riippuen maantieteellisestä sijainnista,

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita on tunnistettu -10% -30% of NSCLCs [3], [8].

EGFR

mutaatiot itsenäisesti liittyy adenokarsinooma histologia, Itä-Aasian etnisyys, koskaan tupakointi tila ja naissukupuoli. Mutaatiot

KRAS

myös kohdistaa histologialtaan adenokarsinoomaa, mutta muuten poikkeavat

EGFR

mutaatioita, koska ne ovat suhteellisen harvinaisia ​​Itäaasialaiset ja esiintyy useammin miehillä ja tupakoitsijat [9]. Harvemmin, somaattiset mutaatiot on löydetty myös muissa

EGFR

reitin geenejä, mukaan lukien

HER2

(~ 2%) [10],

HER4

(~ 2%) [ ,,,0],11],

BRAF

(~ 2%) [12], ja

PIK3CA

(~ 4%) [13], [14].

geenikopiomäärä voitot (CNGs) johtuen polttovälin vahvistus tai kromosomaalisesta polysomy, on yksi muista päämekanismia onkogeenin aktivaation [15]. Lockwood et ai. tunnistettu useita komponentteja

EGFR

reitin signalointi olivat usein monistettiin ja yliekspressoitu NSCLC. Kiinnostavaa kyllä, he havaitsivat myös, että

EGFR

polku geenimonistuman oli yleisempää adenokarsinooma alatyyppi NSCLC.

Koska usein vapauttamisen

EGFR

reitin geenien NSCLC, EGFR tuli yksi ensimmäisistä rationaalisesti valittu molekyylejä täsmähoitoihin. Vaikka alkuperäisen lähestymistapojen käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, jotka estävät ligandi-reseptori-vuorovaikutuksen, uudempia lähestymistapoja on käytetty pieni molekyyli palautuva tyrosiinikinaasin estäjät (TKI). Tyrosiinikinaasiaktiivisuutta on

EGFR

vaaditaan biokemiallisia indusoimat vasteet tätä reseptoria [7], [16], [17]. Kaksi TKI, gefitinibi (IRESSA, AstraZeneca) ja erlotinibin (Tarceva, Genentech) on laajalti käytetty hoidettaessa levinnyttä tai uusiutuva NSCLC. Vasteet todettiin osajoukkoja, erityisesti Itä-Aasian etnisyys, naissukupuoli, koskaan tupakointi tila ja histologialtaan adenokarsinoomaa [18], [19], [20]. Myöhemmin

EGFR

mutaatioita tunnistettiin tyrosiinikinaasidomeeniin, ja ennustettava vastaus TKI samassa potilasryhmässä [21], [22], [23]. Erään meta-analyysi 1170 potilasta, yli 70% NSCLCs kanssa

EGFR

mutaatioita vastasi TKI, kun taas 10% kasvaimista ilman

EGFR

mutaatio vastasi [24]. Kuitenkin lisätutkimukset osoittivat, että muut tekijät kuin

EGFR

mutaatiot voivat olla merkitystä määritettäessä vasteen ja selviytymisen jälkeen TKI-terapialle.

EGFR

geenikopiomäärä voitto liittyi parantunut huomattavasti TKI herkkyys ja eloonjäämisen suuri valitsemattomat tutkimuksen asianmukaiset tarkastukset [25]. Lisäksi muut jäsenet

EGFR

perhe eli

HER2

[26] ja

EGFR3

[27] voi olla tärkeitä tekijöitä TKI herkkyyttä. Lisäksi monimutkaisuus on kliininen havainto, että somaattisia mutaatioita

KRAS

antavat luontainen vastustuskyky TKI [28].

Edelleen ymmärtää suhde TKI herkkyyden ja vapautuminen

EGFR

reitin geenit tarkastelimme mutaatio ja kopioi määrä tila seitsemän näiden geenien (

EGFR

,

HER2

,

HER3-

,

HER4

,

KRAS

,

BRAF

, ja

PIK3CA

) suuressa paneelissa keuhkosyövän solulinjat ja korreloi datan in vitro herkkyys TKI.

Materiaalit ja menetelmät

tuumorisolulinioissa

Tutkimme yhteensä 112 solulinjojen koostuu 77 NSCLC ja 32 pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja kolme riviä pienisoluinen syövät at ekstrapulmonaalinen sivustoja (ekstrapulmonaalinen pienisoluista syöpiä, ExPuSC) [29]. Kaikki paitsi kolme näistä solulinjoista määritettiin tekijät [30] yhtä kahdessa paikassa. Solulinjat aloitettu NCI on etuliite NCI-H samalla linjat perustettu UT Southwestern on etuliite HCC. NCI-H3255 saatiin tri Bruce Johnson (Lowe Center for Thoracic Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) [22]. PC-9 (alunperin Tokion Medical University, Tokio, Japani) saatiin tri Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Calu-3 hankittiin American Type Culture Center (Manassas, VA). Tutkimme myös kahdeksan kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen solulinjoissa (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT ja HBEC34KT), joka aloitettiin meille [31].

Useimmat kasvainsolun linjat pidettiin RPMI1640 täydennetty 5-10% naudan sikiön seerumia (FBS). Muutama solulinjoja kasvatettiin ACL4 (for NSCLC riviä) ja HITES (varten SCLC riviä) lisätty 5% FBS. Kaikki HBEC solulinjoja ylläpidettiin keratinosyyttispesifisestä SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) naudan aivolisäkeuutteella (BPE) ja rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) [31]. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

geneettinen sormenjälki kustakin solulinjasta saatiin (Powerplex 1,2-järjestelmä, Promega, Madison, WI) ja kukin solulinja oli ainutlaatuinen geneettinen profiili, joka oli identtinen profiilit on saatu American Type Culture Collection.

DNA: n ja RNA

Genominen DNA saatiin solulinja pelleteiksi standardi fenoli-kloroformilla (01:01), jota seuraa etanolisaostuksella [32], tai käyttämällä DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Kokonais-RNA saatiin solulinjoista käyttämällä RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). cDNA valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [14].

Gene Sequencing

DNA sekvensointi ja mutaatioanalyysiin varten

EGFR

(eksonit 18-21),

HER2

(eksonit 19 ja 20),

KRAS

(kodonit 12, 13, ja 61),

BRAF

(eksonit 11 ja 15) ja

PIK3CA

(eksonit 9 ja 20) tehtiin ilmoittamat meille aiemmin [10], [14], [32].

HER3-

(eksonit 18-21) ja

HER4

(exons18-23) mutaatio tila analysoitiin PCR-monistuksella genomisesta DNA: sta tai cDNA: n ja suora sekvensointi PCR-tuotteiden [10]. Mutaatiot Näiden geenien määritettiin käyttäen PCR-alukkeita, jotka on lueteltu (taulukko S6). Kaikki PCR: t suoritettiin 25 ul: määriä, joka sisälsi 100 ng DNA: ta käyttäen HotStarTaq DNA-polymeraasia (QIAGEN Inc., Valencia, CA). DNA monistettiin 32-34 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 62 ° C: sta 68 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C 30 sekuntia, jota seuraa 7 minuuttia laajentaminen 72 ° C: ssa. Kaikki PCR-tuotteet inkuboitiin käyttäen eksonukleaasi I ja katkaravun alkalista fosfataasia (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ) ja sekvensoitiin suoraan Applied Biosystemsin PRISM dye terminator cycle sequencing menetelmällä (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Kaikki mutaatiot varmistettiin riippumattomien sekvensoimalla molempiin suuntiin.

Kopioi numero arviointi

Kopioi numero voitot voidaan arvioida useilla menetelmiä. Kliinisten näytteiden fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH), käytetään usein, koska se voi syrjiä kasvaimen ja ei-pahanlaatuisia soluja. Laboratoriotutkimukset kasvainsolulinjoissa (jotka ovat vapaita ei-pahanlaatuisten solujen) käyttävät usein kvantitatiivinen PCR (qPCR). Toinen tapa on joukko vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH). Koska suoria vertailuja näistä menetelmistä on harvoin raportoitu [33], me hyödyntää kaikilla tavoilla.

Reaaliaikainen qPCR

Gene kopio numerot määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR työllistää Chromo4 PCR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Määrittää kopioluvun kohdegeenin, käytimme ohjaus geenit sijaitsevat samassa kromosomissa kuin kohdegeenin (taulukko S6). Saatu suhteet verrattiin vastaaviin suhteet alkaen diploidisoluissa (keskiarvot kahdeksan HBEC solulinjat. TaqMan-menetelmää käytettiin, paitsi

PIK3CA

[14]. Alukkeet ja koettimet valittiin TaqMan Primer Express ™ 1.5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). alukkeet hankittiin yhtiöltä Invitrogen ja koettimet Biosearch Technologies (Novato, CA). sekvenssit alukkeiden ja koettimien on esitetty taulukossa S6. Standard konstruoitiin sarjalaimennoksilla erityisiä PCR-tuotteiden. monistus seoksilla (25 ui) sisälsi näytteen DNA: ta (20 ng), 10 x TaqMan-puskuria (2,5 ui), 200 uM dNTP, 1,25 U Hotstar Taq ™ DNA-polymeraasia, 200 nM kutakin aluketta ja 100 nM koetinta. terminen sykliolosuhteita käsitti 5 min 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena kappaleena. parametri C

t määritetään murto-syklin, jossa fluoresenssi syntyy koettimen katkaisua kulkee kiinteän kynnyksen yli lähtötason. Tavoitteena geenikopiomäärä tuntemattomissa näytteissä kvantitoidaan mittaamalla C

t-arvot ja käyttämällä standardikäyrän määrittämiseksi kopioluvun [34]. Geenikopiomäärä laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: g = (S

T /S

C) /(N

T /N

C).

PIK3CA

kopioluvun arvioitiin, kuten on kuvattu meidän aiemmin [14].

laatoitus polku aCGH

aCGH suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14], [15]. Genominen epätasapaino tunnistettiin käyttäen aCGH-Smooth [35] kuten aikaisemmin on kuvattu [36].

FISH määrityksissä

Dual-color FISH määritykset suoritettiin mukaan vakioprotokolla [37], [38 ]. Koetin sarjaa, EGFR /CEP7 ja PathVysion ja valvonta CEP7 saatiin Abbott Molecular (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 saatiin QBiogene; BRAF-koetin tuotetaan bakteerien keinotekoisten klooni (BAC) klooni käytetty aCGH. Kopiointi numerot kohdegeenien (merkitty punaisella fluoroforit) ja CEP koettimet (merkitty Spectrum Green) tarkastettiin vähintään 100 interphase solua ja 20 metafaasissa leviää. Kuvat otettiin ja yhdistettiin käyttäen Cytovision työasema (Applied Imaging, San Jose, CA).

Sub-kloonaus

Perimän DNA eristettiin mutantti

EGFR

tai

KRAS

NSCLC solulinjojen ja käytettiin templaattina PCR-monistuksessa

EGFR

tai

KRAS

. Alukkeet ja olosuhteet PCR-reaktiot, kuten on kuvattu aikaisemmin. PCR-tuotteet kloonattiin pCR2.1-TOPO-vektoriin käyttäen TOPO TA-kloonausvektoriin (Invitrogen). Noin 20 kloonia (range15-25) valittiin sekvensointiin käyttämällä joko M13 eteenpäin-aluketta tai vastaava

EGFR

tai

KRAS

alukkeita. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina mutanttialleelit läsnä kokonaismäärä kloonattu.

TKI herkkyys

MTS kolorimetristä määritystä (Promega) suoritettiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä määritys perustuu muuntaminen MTS liukoisiksi formatsaanin endogeeniset dehydrogenaasientsyymien löytyy metabolisesti aktiivisten solujen. Solut maljattiin 1 x 10

3-4 x 10

3 solua /kuoppa kudosviljelmässä käsiteltiin 96-kuoppaisilla levyillä. Seuraavana päivänä TKI (gefitinibi tai erlotinibi) lisättiin kullekin levylle on laimennussarja levyn poikki niin, että kahdeksaa eri pitoisuutta lääkettä testattiin. Päivänä 5, 20 ui MTS lisättiin, jota seurasi 1 tunnin inkubointi 37 ° C: ssa ja sitten absorbanssi luettiin 490 nm: ssä levylukijalla.

96-kuoppaisen levyn data tuotiin osaksi in-house Tietokanta in vitro lääkeaineen Herkkyys analyysit (Divisa Luc Girard, käsikirjoitus valmisteilla), jossa IC50-arvot lasketaan sekä erilaisia ​​tilastollisia analyysejä. Laskea IC 50-arvot, data oli vähennettävä tausta (sarakkeet 1 ja 12 sisälsivät tyypillisesti median ilman solujen tai huumeita ja toimi tausta-arvot), ja sovitettu DRC mallin (R paketin ”DRC” Christian Ritz ja Jens Streibig, https://www.bioassay.dk) generoimaan sigmoidal käyrä, jossa pitoisuus, joka estää 50% soluista (IC50), määritettiin.

tilastollinen analysointi

Fisher kaksi-tailed tarkka testit määritettiin käyttäen Prism 4 ohjelmisto (Graph Pad, San Diego, CA). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä. Muut tilastolliset analyysit on käsitelty luokkiin Tulokset osiossa.

Tulokset

Mutaatiot (m) ja CNGs (g) keuhkosyövän solulinjoissa

Tutkimme 32 SCLC ja kolme riviä pienisoluista syövistä peräisin ekstrapulmonaalinen sivustoja (ekstrapulmonaalinen pienisoluista syöpiä, ExPuSC), somaattisten mutaatioiden ja CNGs on

EGFR

reitin geenit. Löysimme yhteensä vain kolme mutaatioista 35 solulinjoissa ja kaikki kolme olivat

PIK3CA

mutaatiot (taulukko S1). CNGs varten

EGFR

reitin geenit harvoin kohdataan SCLC (taulukko S2). Koska somaattisten mutaatioiden ja CNGs varten

EGFR

reitin geenit olivat harvinaisia ​​SCLC, rajoitimme meidän lisätutkimuksia NSCLC.

Kaikkiin seitsemästä geenien testattu, mutaatioita (39/77, 50,6% ), kopiomäärä voitot (50/77, 64,9%) tai joko (65/77, 84,4%) oli yleisiä NSCLC linjat. Nämä havainnot käsitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

Mutaatiot (m)

EGFR

reitin geenien NSCLC

Tutkimme NSCLC linjat, somaattisten mutaatioiden

EGFR

reitin geenien lueteltu menetelmät jaksossa. Olemme löytäneet yhteensä 40 mutaatioiden 39 (50,6%) solulinjoja (kuvio 1 a, taulukko S3). Nämä mutaatiot koostui 19

KRAS

(24,7%), 10

EGFR

(13%), viisi

BRAF

(6,5%), neljä

PIK3CA

(5,2%), yksi

HER2

(1,3%), yksi

HER4

(2,2%) ja ei yhtään

HER3-

. m

EGFR

, m

BRAF

ja m

HER2

oli läsnä ainoastaan ​​adenokarsinooman kun m

KRAS

esiintyi useammin adenokarsinooma ja storcell histologialtaan. m

PIK3CA

olivat ainoat mutaatioita, jotka eivät ole kohdistettu histologialtaan adenokarsinoomaa (Fig. 1 c).

Kuva 1a. näyttää taajuus mutaatioiden ja kopion numero voitot

EGFR

reitin geenien (

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

,

HER2

,

HER3

ja

HER4

). Neljäkymmentä mutaatioita tunnistettiin 39 solulinjoissa. Mutaatiot ja kopioluvun voitot olivat useammin varten

EGFR

(13%, 40,3%) ja

KRAS

(24,7%, 14,3%) kuin muiden geenin. CNGs varten

HER2

(18,2%) olivat myös yleisiä. Havaitsimme vain yksi

HER2

ja yksi

HER4

somaattinen mutaatio. Numerot yläpuolella sarakkeet ilmaisevat määrä solulinjoja mutaatioita (sininen pylväät) tai kopiomäärä voitot (punainen pylväät). Kuva 1b. Tässä kuvassa joukko geenejä, jotka osoittavat CNGs mutantissa ja villityypin solulinjoilla. 77: solulinjoissa tutkittiin, 39 (50,6%) oli mutaatio ainakin yksi seitsemästä EGFR-polku geenejä tutkittiin. CNGs olivat usein niin mutantti ja villityypin solulinjoilla. Kuva 1c. esittää taajuus mutaatioiden pohjalta NSCLC-alatyypin. Mutaatiot

EGFR

ja

BRAF

olivat yksinomaan löytyi adenokarsinooma alatyyppiä. Yksittäinen

HER2

mutaatio oli joka adenokarsinooma verrattuna

HER4

somaattinen mutaatio, joka tunnistettiin levyepiteeliperäinen ca. Kuvio 1d. esittää taajuus kopioluvun voitot (CNGs) (g 4 qPCR) perusteella NSCLC alatyyppiä. CNGs varten

BRAF

ja

PIK3CA

nähtiin pääasiassa adenokarsinooma ja okasolusyöpä vastaavasti. CNGs muulle geenien ei suosi mitään alatyyppiä.

Mutaatiot ovat toisensa poissulkevia

tutkitaan tahansa yhteydestä somaattisista mutaatioista yksittäisissä solulinjoissa. Jotta hypoteesin testaamiseksi, että

EGFR

koulutusjakson geenimutaatioita ovat toisensa poissulkevia, käytimme Monte Carlo simulaatiot laskea empiirinen p-arvo. Nollahypoteesi on, että mutaatioita tapahtuu itsenäisesti. Me simuloitu yhteisjakauman mutaatiotapahtumasta Näistä seitsemän geenien avulla havaitut marginaalinen mutaationopeudet ja riippumaton olettamus. Kunkin simuloinnin, olemme huomanneet määrä solulinjoja, joissa on useita mutaatioita. Olemme toistaneet simulaatiot 10000 kertaa, ja saadaan empiirinen jakauma määrä solulinjoja, joissa on useita mutaatioita; sitten verrataan todettu määrä solulinjoja useita mutaatioita tällä empiiriset jakaumat laskea p-arvo.

Tässä tutkimuksessa yksipuolinen p-arvo on 0,0014; siksi, hylkäsimme nollahypoteesi ja päätteli, että geenimutaatioita ovat toisensa poissulkevia tapahtumia näiden geenien NSCLC solulinjoissa, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta (taulukko 1). Suuri cell carcinoma linja NCI-H460 olivat molemmat

KRAS

ja

PIK3CA

mutaatioita.

vertailu määrittelymenetelmiä kopiomäärä voitot

aCGH FISH ja qPCR käytettiin testaamaan geenin kopiomääriin NSCLC solulinjoja. Ei ole mitään selkeää biologinen kynnysarvoa määriteltäessä epänormaali kopiomääriin NSCLC ihmissolulinjat; valitsimme kynnysarvot joiden avulla voidaan saavuttaa paras positiivinen tai negatiivinen luokan keskinäisen sopimuksen kolme testiä. Erityisesti me lasketaan Kappa tilastoista [39] välillä aCGH ja qPCR kokeissa kaksiulotteinen cut-off verkkoja kuin 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ja 5; ja sitten teki saman FISH ja qPCR. Raja-arvot saavutetaan paras yksimielisiä kolmessa kokeessa olivat seuraavat: 4 qPCR, 3 CGH ja 4.5 FISH; ja käytimme näitä arvoja määritellä läsnäolo kopioluvun voittoja NSCLC solulinjoissa. Käyttämällä näitä cut-off-arvot ja kaikki saatavilla olevat tiedot, oli erittäin merkitsevä konkordanssin (p 0,001) välillä kolme menetelmää, kuten on esitetty taulukossa 2.

EGFR

koulutusjakson geeni CNGs

Koska qPCR tiedot olivat täydellisiä kaikki rivit (vaikka osajoukkoja testattiin kaksi muuta menetelmiä, jotka ovat työläitä ja kalliita), käytimme qPCR tiedot kaikista jatkotutkimuksiin. Kopioi numero voitot olivat usein ( 10%) ja

EGFR

,

HER2

,

HER3

ja

KRAS

(kuva 1a, taulukko S4) . Erityisesti voittoja

EGFR

olivat yli kaksi kertaa niin paljon (40%) kuin muiden geenin. Yleensä poikkeuksin g:

BRAF

(rajoitettu adenokarsinooma histologia), ja g

PIK3CA

(rajoittuu lähinnä levyepiteelikarsinooma), CNGs eivät osoittaneet mitään ilmeisiä histologiaa alatyypin bias ( kuva 1 c).

suhde mutaatiot ja Kopioi numero voitot

Toisin mutaatioita, kopioiden määrä voitot eivät sulje toisiaan pois myöskään muiden CNGs tai mutaatioita (kuva 2). Olemme löytäneet CNGs kahden tai useamman geenin 32,5% (25/77) solulinjoja (taulukko S4). Kuitenkin olemme huomanneet erittäin merkittävä assosiaatio mutaatioita

EGFR

tai

KRAS

ja CNGs niiden geenien (kuvio 3a, 3b).

Kuva 2a. osoittaa, että kopioluvun voitot ja mutaatioita eivät ole toisiaan poissulkevia. Kuten ilmenee kuvion CNGs varten

EGFR

ja

KRAS

ovat huomattavasti yleisempiä

EGFR

ja

KRAS

mutantti solulinjoissa vastaavasti (p 0,05 ). Oli vain yksi

HER2

ja

HER4

mutantti NSCLC solulinjassa ja siten ne eivät sisälly tähän lukuun. Kuva 2b. osoittaa, että kopioiden määrä voittoja eivät ole toisiaan poissulkevia ja voitot yksi geeni voi tapahtua, kun läsnä on voittoja muiden geenien.

EGFR

ja

KRAS

geenit ensisijaisesti on kopioluvun voitot (CNG) solulinjoissa kätkeminen vastaavien mutaatioita (paneelit a ja b). Mutantti-linjat, mutantti alleeli lähes aina on ylimäärin verrattuna villityypin alleelin (kaistat c ja d), joka on ilmiö, olemme kutsutaan MASI. Useimmissa MASI tapauksissa mutanttialleelin osoittaa CNGs; kuitenkin MASI voi myös olla läsnä solulinjoissa, joilla on diploidinen kopioluvun onkogeeni, (hankittu uniparentaalinen disomia) joko yhtenäinen (NCI-H460) tai heterogeeninen (NCI-H1975).

Mutant alleelispesifistä epätasapaino (MASI) varten

EGFR

ja

KRAS

geenien

Kuten edellä todettiin CNGs on

EGFR

ja

KRAS

olivat tavallisempia solulinjoissa kätkeminen nämä mutaatiot. Käyttävät osa-kloonaus aiemmin kuvatulla menetelmällä, tutkimme onko

EGFR

ja

KRAS

geenien ensisijaisesti osoittanut mutantti alleeli erityisiä CNGs solulinjoissa kätkeminen vastaavien mutaatioita (Fig. 3). Tiedot, testattaessa onko Mutanttialleelit monistetaan geeni mutantti solulinjat ryhmittyneet tietoja binary lopputulokseen. Kukin solulinja on klusterin ja nollahypoteesi on, että mutaatio korko on 0,5. Koska määrä Subkloonien kussakin solulinjassa vaihteli, käytimme analyysissä lähestymistapa ryhmittyneet binary lopputulokseen eri rypäskokoja [40]. Mutantti-linjat, mutantti alleeli oli lähes aina ylimäärin verrattuna villityypin alleelin, ilmiö olemme kutsutaan MASI. P-arvo

EGFR

mutantti solulinjoissa oli 0,019 ja

KRAS

mutantti solulinja oli 0,0003 osoittaa, että Mutanttialleelit olivat ensisijaisesti hallitseva kummassakin tapauksessa. Useimmat MASI tapaukset olivat lisääntyneen kopioluvun mutanttialleelin. Kuitenkin muutamissa tapauksissa MASI havaittiin myös soluissa, joilla on diploidi tai lähellä diploidi kopioida numeroita (hankittu uniparentaalinen disomia). Niinpä olemme käyttäneet termiä MASI vastakohtana mutanttialleelin erityisiä voittoja.

Ominaisuudet

EGFR

Mutant Cell Lines

kliinis-patologisen ja molekyylitason tietoja 10 NSCLC solu linjat, jotka satama

EGFR

mutaatiot on esitetty yhteenvetona taulukossa 3. Kaikki sisälsi yhden kaksi suurta mutaatioita kinaasidomeenissa, joko deleetiot eksonin 19 (n = 7) tai L858R eksonissa 21 (n = 3 ). Mutaatiot olivat yksinomaan nähty adenokarsinooma ja tupakoimattomia tai potilaalla on matala tupakan altistuksen (≤10 pack vuotta). Yksi

EGFR

mutantti solulinja kehitettiin Japanissa ja loput yhdeksän kehitettiin Pohjois-Amerikassa. Yhdeksästä kehitetty Pohjois-Amerikassa, vain yksi oli yksittäisen aasialaista alkuperää. Lisäksi olemme havainneet, että

EGFR

mutaatiot olivat yleisempiä verrattain nuorempien ikäryhmässä (alle 55 vuotta).

Seitsemän näistä solulinjoista olivat herkkiä gefitinibi. Kolme kestävät riviä oli toinen mutaatio: joko T790M resistanssi liittyy eksonissa 20 (n = 2) tai homotsygoottisia poistetaan

PTEN

geenin ja puuttuessa sen proteiini [41] (tekijöiden julkaisemattomia havaintoja ).

vaikutukset mutaatioiden ja kopioluvun voitot herkkyydestä TKI

vaikutuksen arvioimiseksi mutaatioiden ja kopioluvun voitot herkkyys TKI, olemme analysoineet IC 50-arvot 45 NSCLC solulinjojen . Koska TKI kliininen herkkyys ensisijaisesti suunnattu histologialtaan adenokarsinoomaa, me mukana 31 adenokarsinooman. Koko osajoukko sisältyvät kaikki

EGFR

,

HER2

ja

HER4

mutantti solulinjojen ja 12

KRAS

ja 3

BRAF

solulinjat. Koska

PIK3CA

mutaatiot suosivat ei-adenokarsinooma histologia vain yksi

PIK3CA

mutantti solulinja mukana. Koko osajoukon 17 riviä olivat villityypin kaikkien geenien testataan (taulukko S5).

löytäneet erinomaisen välistä yhdenmukaisuutta IC 50-arvot välillä gefitinibin ja erlotinibin (p 0,0001) (kuvio 4, taulukko S7). Koska meidän tietokokonaisuus gefitinibi herkkyys oli laajempi valitsimme hyödyntää gefitinibin tiedot jatkotutkimuksiin.

Neljäkymmentä viisi solulinjat testattiin herkkyyttä sekä huumeita viskositeettiluku oli erinomainen (p 0,0001).

Kuva. Kuvio 5 havainnollistaa herkkyys kuviot testattujen solulinjojen. In vitro pitoisuutena 1 uM käytetyn kudosviljelmässä korreloi plasman gefitinibin hoidetuilla potilailla standardin annoksen gefitinibin eli 250 mg vuorokaudessa. Tämä kynnys on käytetty tutkijoiden aiemmin erottaa herkkiä tunteeton ja /tai resistenttejä solulinjoja [7]. Sen perusteella edellä mainitun kynnyksen ja käyrän muoto, Jaoimme solulinjojen 3 ryhmään: herkkä (≤1 uM), väli- ( 1 uM mutta ≤10 uM) ja resistenttejä ( 10 uM ) kuten nähdään kuvassa Fig. 5. IC 50-arvot noudattavat linjaa, joka osoitti rinteessä vaihtopiste noin 10 uM, ja siten osoittanut näennäisesti bimodaalis- (Fig. 5). Kuten solulinjoja, joiden arvot alle 1 uM pidettiin herkkä, me mielivaltaisesti luokiteltu arvojen välillä 1 ja 10 uM olevan väli- herkkyyden.

Kuvio 5. esittää tukin käyrä gefitinibin IC 50-arvot 45 NSCLC solu linjat. Ne luokitellaan kolmeen luokkaan sen perusteella gefitinibin IC50: Sensitive (IC 50 1 uM), Intermediate (IC50 1, mutta 10 uM) ja vastustuskykyinen (IC50 10 uM). Yhdeksästä herkkä solulinjat, joista seitsemän satama

EGFR

mutaatioita, yksi on CNGs varten

EGFR

ja yksi on CNG varten

HER2

. Lopuista

EGFR

mutantti solulinjoissa, kahdella oli T790M mutaatio (yksi väli ja yksi kestävä) ja yhdellä oli homotsygoottinen deleetio

PTEN

(kestävä).

KRAS

mutantin ja villityypin solulinjat olivat kaikki resistenttejä gefitinibille.

Oli yhdeksän solulinjojen riskiryhmän ja niihin sisältyi seitsemän kymmenestä m

EGFR

linjat, yksi g

EGFR

solujen ja jonkin g

HER2

solulinjassa. Välissä luokka koostui vain kaksi solulinjojen; M

EGFR

solulinja, jossa on toissijainen T790M mutaatio ja g

HER2

solulinjassa. Resistenttiä solulinja luokka oli suurin ja sisälsi kaksi m

EGFR

solulinjoja, joista toisella on toissijainen T790M-mutaation ja toinen on homotsygoottinen deleetio

PTEN

geenin. Loput kestävä linjat sisältyvät kaikki villin tyypin linjat ja kaikki rivit, joilla on

KRAS

,

BRAF

,

HER2

,

HER4

ja

PIK3CA

mutaatioita.

käyttäen univariate testejä, olemme analysoineet yhdistyksen välillä gefitinibin herkkyyden ja mutaatiostatuksesta riippumatta tai CNGs erilaisten

EGFR

reitin geenit ja löysi merkittävä korrelaatio gefitinibille herkkyyttä

EGFR

mutaatio (p = 0,002) ja

EGFR

kopioluvun voitot (p = 0,001). Testasimme hypoteesia, että KRAS-mutaatiot antavat luontainen vastustuskyky TKI.