Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kysymystä yksisoluiset ohjaus on viime aikoina herättänyt valtavaa kiinnostusta. Kuitenkin huolimatta nykyisin saavutettavissa solunsisäisen tason fysiologinen hyvää kautta bio-fotoniikan, nano-koetin-pohjainen, ja joitakin muita tekniikoita, kysymys asiakkuutta valikoiva, yksisoluiset tarkkuuden apoptoosin vaikuttamatta naapurisolujen pysyy olennaisesti auki. Täällä ratkaista tämän ongelman ja raportoida tehokkaasti yksisoluiset tarkkuuden syöpäsolun hoitoon käytetään reaktiivista kemiaa lokalisoidun korona-tyyppinen plasmapurkausta ympärille neulamaisia ​​elektrodia paikalla koko ~ 1 um. Kun elektrodi on sijoitettava niin, että mikrometrin tarkkuudella vastaan ​​valitun solun, kohdennettua ja erittäin paikallista mikro-plasmapurkaus indusoi apoptoosin valitun yksittäisten HepG2 ja HeLa syöpäsolujen vain, vaikuttamatta mihinkään ympäröiviin soluihin, pieniinkin soluklusterien. Tämä on vahvistettu reaaliaikainen seuranta morfologiset ja rakenteellisia muutoksia solutasolla ja solujen tuman tason jälkeen pitoisuuteen plasmassa.

Citation: Tan X, Zhao S, Lei Q, Lu X, hän G, Ostrikov K (2014) Single-Cell-Precision mikroplasma aiheuttama syöpä solukuoleman. PLoS ONE 9 (6): e101299. doi: 10,1371 /journal.pone.0101299

Editor: Mohammed Yousfi, University Paul Sabatier, Ranska

vastaanotettu: 10 joulukuu 2013; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2014; Julkaistu: 27 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Tan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: XL myöntää tukea National Science Foundation of China (Grant nro 51077063, 51277087). KO myöntää tukea ARC ja CSIRO OCE Science Leadership Scheme. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kyky eristää, manipuloida, rajoittaa, kuulustella ja ohjaus elävien solujen kanssa yksisoluiset tarkkuus on nopeasti tulossa ongelma ensiarvoisen tärkeää, koska äskettäin löydetty yleinen ilmiö solusta soluun vaihtelua niiden vasteita ulkoisille ärsykkeille [1] – [3]. Apoptoosi on yksi tärkeimmistä ja laajimmin tutkittu soluvasteita, koska sen merkitystä ja toimintaan kudosten ja organismien kaikissa elämän syntyyn ja kehittymiseen sairauksien sekä vasteita solujen kemiallisten hoitojen [4].

Koska hyvin suuri määrä fysiologisia, biokemiallisia, sähkökemialliset ja muut tekijät, jotka vaikuttavat solujen vasteita, suuri määrä lähestymistapoja nähden [5] – [12]. Nämä yksisoluiset tason lähestymistapoja ovat microelectrochemistry [5], tähystys ja kuulustelut perustuva yksiulotteinen nanorakenteiden [6], [10], aktiivisia ja osoitteellinen mikrokaivo /mikroelektrodilla taulukot [7], [9], solutekniikan, kuviointi, levottomuus, ja stimulaatiota räätälöityjä, korkean tarkkuuden kudosteknologian [8], [11], [12], ja monet muut. Huolimatta nykyisin saavutettavissa solunsisäisen tason fysiologinen hyvää kautta bio-fotoniikan ja nano-koetin-tekniikat, kysymys asiakkuutta valikoiva, yksisoluiset tarkkuuden apoptoosin vaikuttamatta naapurisolujen pysyy olennaisesti auki.

äskettäin ilmakehän paineen kaasun plasmat ovat nousseet tehokkaat välineet aiheuttavan erilaisia ​​fysiologisia vasteita elävissä soluissa ja kudoksissa, kuten korkea apoptoottisia valikoivuus välillä pahanlaatuisen syövän ja normaalin kudoksen solujen [13] – [15]. Vähentäminen plasmakäsittely paikalla kokoja heittokellon mitat on äskettäin pohjaisia ​​sovelluksia plasman jet ja korona-tyyppinen vastuuvapauden aiheuttama reaktiivinen kemia yksisoluiset tason käsittely ja erittäin lokalisoitu nanohiukkasten synteesi [16] – [20].

vaikka paikalla koot plasmasuihkujen voi olla niinkin pieni kuin 15 pm [17], joka on verrattavissa tai jopa pienempi kuin tyypillinen solukoko, valikoiva ohjaus yksisoluiset tarkkuutta ei ole osoitettu. Todellakin, viimeaikainen edistys yksisoluiset tason käsittely mahdollisti samanaikaisesti altistaa melko suuri määrä eristetyt yksittäiset solut plasma jet sattunut helium läpi ohuen optisen kuidun [16], [17]. Tämä altistus tuottaa cocktail suhteellisen pitkäikäisten kemiallisesti aktiivisia (esim reaktiivisia happi /typpi lajeja, ROS /RNS) lajeja, jotka ovat vuorovaikutuksessa solujen [13].

Kuitenkin puuttuessa tarkka mikromanipulaatiota ja asemointi plasma jet paikalla, plasma-syntyvän elektronit ja ROS /RNS lajit jaetaan satunnaisesti volyymin soluviljelyväliaineesta ja vaikuttaa ainakin useita soluja, jotka joutuvat kosketuksiin plasman syntyvän lajeja. Tämä päätelmä on yhdenmukainen tulosten kanssa tilastollisen analyysin soluvasteiden, jotka viittaavat siihen, että suuri määrä soluja (huomattava osa tyypillinen määrä ~ 3 x 10

4 solua /kuoppa) voi vaikuttaa myös silloin, kun lyhyen ( esimerkiksi -10 s) plasma-altistuksen ja kehittää apoptoottisten vastauksia 24 tunnin kuluessa hoidon [16], [17]. Lisäksi suunnatun Hän kaasuvirtausaukkoa nopeasti etenevän plasma luoteja plasmassa jet voi häiritä viljelyalustan, siirrä solut tai jopa aiheuttaa niiden kuivumista. Siksi kysymys plasmasta käytössä solukontrolli kanssa yksisoluiset tarkkuus pysyy olennaisesti auki.

Täällä ratkaista tämän ongelman ja raportoida tehokkaasti yksisoluiset tarkkuuden syöpäsolun hoitoon käytetään lokalisoidun korona tyyppinen plasmapurkausta ympärille neulamaisia ​​elektrodia paikalla koko ~ 1 um. Kun elektrodi on sijoitettu tietyn etäisyyden vastaan ​​valitun solun, kohdennettua ja erittäin paikallinen plasmapurkaus indusoi apoptoosia valitun yksittäisten HepG2 ja HeLa syöpäsolujen vain, vaikuttamatta mihinkään ympäröiviin soluihin, mukaan lukien pienet solujen ryppäitä. Tämä on vahvistettu reaaliaikainen seuranta morfologiset ja rakenteellisia muutoksia solutasolla ja solujen tuman tason jälkeen pitoisuuteen plasmassa. Lisäksi plasmapurkaus voimanlähteenä on 12 V: n akku ja syntyy ilman ulkoista kaasuvirtauksen tai virtalähde.

Materiaalit ja menetelmät

Micro-plasmakäsittely

Elektrofysiologiset mikro- manipulaattori (CFT-8000D, Jiangsu, Ruiqi Co., Ltd) käytetään ohjaamaan elektrodin kärjen aseman tarkkuuden kanssa muutaman kymmenen nanometrin (kuten kuviossa 1), joka mahdollistaa potentiaalisesti sekoittamiseksi valittu alueet (esimerkiksi erityiset reseptorit tai soluelimiin) solun pinnalla. Lähtö virtalähde on yhdistetty elektrodiin kautta painolasti vastuksen R 10 MQ käyttää rajoittamaan purkuvirran. Tämä mikroplasma ohjaa mittatilaustyönä verkkovirtaa vetämänä 12 voltin akku sijasta ulkoista generaattorin tai seinään virtaa. Koko paino mikroplasma laitteen, kuten virtalähde, on alle 200 g. Lähtö AC booster pääsee 5 kV ja taajuus 25 kHz. Mikro-manipuloitavissa volframi käytetään elektrodina. Kärki säde volframielektrodin on alle 0,5 um, joiden kartio 13 ° kartiokulma. Halkaisija volframi koetin kärki on pienempi kuin tavanomainen soluja (kymmeniä mikrometriä). Kaasun lämpötila mikroplasma on lähellä huoneen lämpötilaa, mikä viittaa siihen, että solun vastaus on ei, koska lämpöshokki. Yksittäinen kiinnittynyt solu valittiin ja hoitaa mikroplasma. Plasman altistus kesti vain ~10-15 s ja hoidon vaikutuksia tutkittiin välittömästi tai sen jälkeen useita tunteja myöhemmin.

Soluviljely

Ihmisen hepatoma tasyöpäsolulinja (HepG2) ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa) ja normaali maksan solulinjasta (L-02) ostettiin Kiinasta Center for Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, Kiina). Soluja viljeltiin korkean glukoosin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Hyclone, Logan, UT), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone), inkubaattorissa, joka sisältää kostutetussa ilmakehässä 5 % CO

2 37 ° C: ssa. Saavutettuaan yhtymäkohta, solut irrotettiin 0,25% trypsiiniä (Hyclone), ympättiin 35 mm Soluviljelymaljassa (Corning, New York, USA) tiheydellä 2 x 10

4-solut, ja inkuboitiin yön yli, jotta solujen kiinnittymistä .

reaaliaikainen seuranta morfologisten muutosten

arvioimiseksi apoptoottista vaikutusta mikroplasma valotuksen käsitellyn yksisoluisia, reaaliaikainen morfologiset havainnot tehtiin käänteisen vaihekontrasti valomikroskoopilla ( XD-202, Nanjing Jiangnan Novel Optics Co., Ltd). Reaaliaikainen havaintoja solujen morfologian muutoksia tehtiin ja valokuvattiin. Ympäröivä soluja käytettiin kontrolleina.

Reaaliaikainen fluoresenssin kuvantamisen solukalvon muuttuu

mikroplasma-käsitellyt solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä seuraten valmistajan ohjeita (Beyotime, Jiangsu, Kiina). Lyhyesti, elatusaine poistettiin ja pestiin kerran PBS: llä. Sitten 500 ui sitomispuskuria 5 ui anneksiini V-FITC lisättiin soluihin, ja viljeltiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan pimeässä. Ilman pestiin minkä tahansa nesteen kanssa tapahtuneen reaktion jälkeen fluorokromi, yhteen soluun valittiin ja käsiteltiin mikroplasma (15 s). Riittävä määrä anneksiini V-FITC jäi keskipitkällä jotta sitomiseksi kulkeutua PS kuluvan apoptoosin prosessi ja reaaliaikaisen kuvantamisen prosessi suoritettiin pimeässä on fluoresenssimikroskoopilla (Olympus TH4-200, Olympus Optical Co Ltd, Tokio, Japani) välittömästi sen jälkeen, kun mikroplasma hoidon. Tutkimuksessamme valkoinen ja fluoresenssi kuvat otettiin heti anneksiini V-FITC merkintöjä menettely tallentaa alkuehdot ja solujen paikkatietoja. Apoptoosi puhkeaminen voitaisiin seurata, kun fluoresenssin intensiteetti ylitti havaitsemisrajaan.

Reaaliaikainen fluoresenssin kuvantamiseen tuman muuttuu

analysoimiseksi morfologiset merkkejä apoptoottisten tumien, Hoechst 33342 värjäys suoritettiin. Lyhyesti, live HepG2 ja HeLa-soluja inkuboitiin Hoechst 33342 (Beyotime, Jiangsu, Kiina) huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Oltuaan pestiin 3 kertaa viljelyalustan, yhden Hoechst 33342-värjätty solu valittiin ja sitä hoidettiin mikroplasma. Reaaliaikainen seuranta tuman muutosten suoritettiin käyttäen Nikon fluoresenssimikroskooppia.

Tulokset ja keskustelu

yksisoluiset tarkkuuden plasmakäsittely

Kuvassa 2 yksisoluisia -precision mikroplasma hoitoon HepG2-solu. Kuten nähdään kuviosta 2 (a), plasman töyhtö syntyy ympäri powered mikroelektrodi kärjellä halkaisija ~ 1 um on erittäin pieni (~ 2 um) ja soveltuu siten tarkka käsittely yksittäisten solujen vastaavia tai suurempia kokoja. Kun elektrodin kärki lähestyy solun solukalvon toimii kelluva vastaelektrodi samalla kun plasma tuodaan suoraan kosketukseen sen pinnan, kuten kuviossa 2 (b).

Purkaus jännitteen ja virran mitattiin P6015 Tektronix HV koetin ja TCP202 Tektronix nykyinen koetin, vastaavasti. Ne merkitään jonka Tektronix DPO7104 laajakaistaisen digitaalisen oskilloskoopin ja kuvassa 3. Kuva 3 näkyy selvästi, että vastuuvapauden todella näkyy ajoittain pulssin toistotaajuus on noin 25 kHz. Vastuuvapauden aaltoa osoittaa, että vastuuvapaus tapahtuu vain kerran yhdellä jännite ajalta jännitteen nousu vaiheessa. Purkuvirran on täydet puolileveys-enintään noin 270 ns ja huippuarvo on noin 1 mA. Keskimääräinen teho toimitetaan plasmassa on noin 4 mW. Kaasun lämpötila mikroplasma on lähellä huoneen lämpötilaa, ja plasma voidaan käyttää suoraan ihon tai jopa sisäelinten hoitoja, ilman toivottuja lämpö- tai sähköiskun vaikutuksia.

Cell tason morfologiset muutokset

vaikutuksen tutkimiseksi microplasmas käsiteltyihin yhden HepG2 solu, morfologiset muutokset on tutkittu. Näitä muutoksia ovat solun kutistuminen, kalvo kupliminen, kromatiinin tiivistyminen, DNA pirstoutuminen jne ja ovat osoitus apoptoosin [21]. Kuten nähdään kuviossa 4, ennen mikroplasma altistusta, kaikki solut olivat terveitä ja kara-muotoinen selkeät ääriviivat. Välittömästi sen jälkeen kun kosketus mikroplasma, kyseinen yksittäinen solu alkoi kutistuu ja vähitellen muuttaneet tavanomainen muoto tulee enemmän romahtanut Pyöreähköt joka on melko yleinen apoptoottisia kappaleita.

Yksi kiinnittynyt HepG2 solu valittiin ja käsiteltiin mikroplasma 15 (vasen yläkulma). Solut merkitty sinisellä koko linjan käsittelemätön kontrolli soluja (oikeassa alakulmassa).

Voidaan nähdä, että kalvo blebs näkyä, kun 20 min jälkeen 15 s plasman hoitoa. Solu kalvo muodonmuutos on myös selvästi nähtävissä. Toisaalta, ei-hoidettuun kontrolliryhmään solut ennallaan ja terveenä koko inkuboinnin ajan. Nämä erottuva morfologiset muutokset ovat yksinkertaisin indikaattorit solukuoleman etenemistä, mutta eivät riitä määrittelemään apoptoottisen luonteen vasteen. Siksi solun membrane- ja tuma-erityisiä fluoresenssivärjäys Kokeet suoritettiin.

Kalvo-tason muutokset

vahvistaa vaikutuksen mikroplasma, reaaliaikaisen kuvantamisen avulla vihreä fluoresoiva leima anneksiini V-FITC visualisoimiseksi tehtiin HepG2 solukalvon muutoksia (kuvio 5). Anneksiini-V on voimakas affiniteetti fosfatidyyliseriini (PS), joka on kalvon fosfolipidi, joka ilmaistaan ​​yleensä vain sisäpinnalla solukalvon. Koska apoptoosin vaste etenee, PS nopeasti kulkeutua ulompaa kalvon pintaan, jossa se on käytettävissä anneksiini-V: n sitoutumisen. PS translokaatio kalvoon edeltää muutoksista tumaan ja pidetään yhtenä varhaisimmista tunnusmerkkejä solujen apoptoosin [22], [23]. Näin ollen sitoutumisen kautta anneksiini V, apoptoottisten ja ei-apoptoottiset solut voidaan helposti erottaa visuaalisesti fluoresenssi.

solun merkintä on sama kuin kuviossa 4.

Vertailunäytteissä emme voineet havaita mitään sitovaa anneksiini V-FITC HepG2-soluissa ennen mikroplasma hoitoa. Sitovat anneksiini V-FITC plasma-käsitellyn solun tuli havaittavissa 5 min käsittelyn jälkeen ja vähitellen kasvanut sen jälkeen. Kuitenkin, ei-käsiteltyjä soluja, ei-fluoresenssi havaittiin jopa kuusi tuntia myöhemmin. On huomionarvoista, että kalvon rakkuloituminen havaittiin 10 minuutin kuluttua loppuun pitoisuuteen plasmassa. Solu tuli kirkkaampi ja suurempi kanssa selvästi loisteputki rajan päälle lisäinkubaatioon. Kalvo kupliminen on toinen elimellisen muutoksen tyypillinen apoptoosin, joten tämä havainto vahvistaa esiintyminen apoptoosin ainoastaan ​​mikroplasma saaneista solujen [24].

Nucleus-tason muutokset

Nucleus muutoksia, jotka tapahtuivat suhteellisen myöhään prosessissa apoptoosin, oli kuvattu DNA värjäys Hoechst 33342 väriainetta. Samanlainen solukalvojen värjäytymistä, valkoinen ja fluoresenssi kuvat otettiin heti Hoechst 33342 merkintöjä tallentaa alkuehdot ja solujen paikkatietoja (kaksi ensimmäistä kuvaa kuviossa 6). Solun vasemmassa yläkulmassa käsiteltiin plasman 15 s, kun taas solun oikeassa alakulmassa oli säätökennotyyppi. Alussa, sekä käsitellään ja un-käsitellyt solut värjättiin sininen sama kirkkaus. Koska ytimen muutoksia tapahtuu suhteellisen myöhään prosessissa apoptoosin, ei ole selvää eroa voidaan nähdä jopa 20 minuutin kuluttua mikroplasma hoidon. Kuitenkin 30 minuutin kuluttua plasma-altistus, tuma käsitellään yhden solun tuli kirkkaampi verrattuna ei-käsitellyn solun.

solun merkintä on sama kuin kuviossa 4.

havaittu ero fluoresenssin intensiteetti voi johtua, toisaalta, toimintahäiriö P-glykoproteiinin, kalvo kuljettaja, joka voisi poimia Hoechst 33342 solussa. Kuitenkin P-glykoproteiinin pumppu toiminto on yleensä heikentynyt eikä voinut tehokkaasti kuljettamaan Hoechst 33342 ulos apoptoottisten solujen. Tämä aiheuttaa kertymistä ja siten vahvempi päästöjen Hoechst 33342 päässä apoptoottinen solu [25], [26]. Toisaalta, tuma alkoi tiivistyä, mikä aiheuttaa suhteellisen vahvempi fluoresenssi. 6 tuntia myöhemmin, nucleus tiivistymistä oli selvästi nähtävissä käsitelty yhdessä solussa. Sen jälkeen tumakalvoa selvästi häiriintynyt, mukana leviää DNA-fragmentteja. Maan, ei-käsitellyt solut säilyttänyt normaalin ydin- morfologia.

mahdolliset vaikutukset reaktiivisia lajeja

Luonnehtia kemiallisesti aktiivisia lajeja mikroplasma, optinen emissiospektroskopia (OES) käytetään, joka mahdollistaa analyysin säteilyn atomien, ionien, molekyylien, ja radikaalit. Täten puoli metriä spektrometri (Princeton Instruments Acton SpectraHub 2500i; spektriresoluutiolla: 2 nm, ritilä: 1200 g mm

-1, uran leveyden: 150 um) mitataan optisen emission mikroplasma töyhtö. Kuvio 7 esittää optisen emissiospektreissä (OES) on mikroplasma töyhtö on 250-800 nm spektrialueella. Kuten voidaan nähdä, optinen emissiospektrit hallitsevat viritetyn typen ja hapen lajeja.

ROS on ratkaiseva rooli syöpäsolun kuoleman, ja voi indusoida apoptoosia vaikuttamalla DNA, samoin kuten lipidejä ja proteiineja, jotka ovat osallisina solujen väliseen signalointiin laskeutuu [27]. Liiallinen tuotanto ROS voi suoraan vahingoittaa solurakennetta aiheuttaa solun kuolion tai epäsuorasti vaikuttaa normaaliin solun signalointireittien ja geenisäätelyn apoptoosin [28]. Reaktiivinen typen lajit voivat myös vaikuttaa solu-inaktivointia [13]. Erityisesti NO radikaalit voivat aiheuttaa apoptoosin, kuolion tai vaihtoehtoisesti suojaavat soluja kuolemalta, riippuen solutyypistä, radikaali keskittyminen, sekä kesto ja tietyillä altistuksen [29]. Numeeristen simulaatioiden aktiivisten lajien syntyy tip jatkuvissa korona-tyyppinen plasma päästöt [30] ja niiden laajentamista kohti biologisesti tärkeiden media siksi erittäin perusteltua lähitulevaisuudessa.

Plasma vs. sähkökentän vaikutuksia

pieneliöt vihjeet meidän kokeita myös tuottaa merkittäviä aika-muuttujan sähkökentät niiden läheisyydessä. Kuten aikaisemmin on raportoitu [31], pulssitetun sähkökentän voi myös aiheuttaa solukuolemaa, esim kautta sähköinen pulssi aiheuttama elektroporaatio solukalvon. Välittömässä läheisyydessä mikro-kärkeä käytetään kokeissa, suuruus sähkökentän voi tavoittaa kymmeniä ja jopa satoja kilovoltin senttimetrillä. Kuitenkin sähkökenttä hyvin nopeasti pienenee matkan päässä kärjestä. Meidän kokeissa elektrodin kärki sijoitetaan tyypillisesti noin 150 pm päässä solun pinnalla. Siksi solukalvojen kokenut paljon heikompi sähkökentät kuin lähellä kärkeä pintaa, jossa arvioitu suuruus on noin 1-2 kertaluokkaa pienempi. Tämän vuoksi todennäköisyys vain sähkökentän aiheuttama solukuolema on pienempi kokeissa verrattuna vaikuttaa sähkökenttä raportoitu aiemmin [31].

osoittamiseksi ensisijaisen tärkeää reaktiivisen lajin tuottama mikroplasma purkautuu verrattuna sähkökentän liittyvät vaikutukset, olemme suorittaneet joukon valvonta kokeissa, joissa mikrokärjellä päällystettiin erittäin ohuella kerroksella parafiinivahaa, joka estää plasman sukupolven, mutta ei kovin merkittävästi häiritsee suuruus sähkökentän (at ainakin se on edelleen sitä samaa suuruusluokkaa kuin plasman tuottavan päällystämätön mikrokärjellä). Päällystämätön ja parafiini-pinnoitettu microtips, joita käytettiin näissä tutkimuksissa on esitetty kuviossa 8.

On tärkeää, että solut käsiteltiin vahapäällysteisistä mikrokärjellä ei kokenut apoptoosia, mikä voidaan tulkita niin, että havaittu apoptoottisten vasteet solut ovat todellakin liittyvät enemmän plasma syntyvän lajeja eikä vain sähkökentän vaikutuksia. Erityisesti selvittämiseksi vaikutukset plasman altistumisen funktiona sähkökentän liittyvät vaikutukset, käsittelimme neljä HepG2-soluissa käyttäen sekä koskematon ja vahapäällysteisistä microtips kuvioissa 8 (a) ja (b), vastaavasti.

Morfologiset tutkimukset solujen altistettiin altistus plasmassa on suoritettu. Kuten kuviosta 9 nähdään, ennen mikroplasma altistusta, kaikki HepG2 solut olivat terveitä ja kara-muotoinen selkeät ääriviivat. Neljä solut valittiin satunnaisesti ja käsiteltiin koskematon mikrokärjellä (esitetty kuviossa 8 (a)) 15 s. Kalvo blebs esiintyi noin 10 minuuttia altistuksen jälkeen ja niiden kalvon muodonmuutos on myös selvästi nähtävissä pitkittyneen inkubaatioajan. Toisaalta, ei-käsitellyt solut olivat ennallaan ja terveenä koko inkuboinnin aikana.

Täsmälleen samaa hoitoa neljän satunnaisesti valitun HepG2-soluissa käyttämällä vahapäällysteisistä mikrokärjellä kuviossa 8 ( b) osoitti täysin erilaisia ​​tuloksia. Kuviossa 10, voi selvästi nähdä, että neljä solut eivät vaikuta merkittävästi.

Nämä havainnot selvästi tukevat päätelmää, että havaitut vaikutukset meidän mikroplasma kokeiden läheisemmin reaktiivisen lajien sukupolven plasmassa. Nämä vaikutukset voivat olla myös aivan erilainen kuin yleisesti tunnettu sähkökentän vaikutuksia, kuten elektroporaatiolla.

Normaalit solut eivät vaikuta plasmakäsittely

Olemme myös arvioitiin vaikutuksia mikroplasma-altistumisen normaali maksan solulinja (L-02), joilla on sama mikroplasma ja käsittelyn parametrit. Kuten kuviossa 11 on esitetty, plasmakäsittely neljän satunnaisesti valitun L-02-solut eivät aiheuta merkittäviä vaikutuksia, vaikka 2 tunnin havainto. Tämä tulos avaa mahdollisuuden yksityiskohtaisten muuttujien ja prosessin optimointi tutkimuksia, joka on aiheena tulevaisuuden työ ja mahdollisesti työtä muiden tutkijoiden.

Vaikutukset plasman muihin syöpäsoluihin

Toinen tasyöpäsolulinja (HeLa) käytettiin selvittämään vaikutusta mikroplasma altistumista. Kuvissa 12-14, käsitellyt solut ja käsittelemättömien solujen läheisesti kosketuksissa muodostavat pieniä kompakti soluklusterien. Tärkeää on vain plasman käsiteltyjä soluja kuoli, kun taas viereisten solujen ei vaikuttanut merkittävästi. Tämä voidaan selvästi nähdä 2 tunnin mittainen tarkastelu morfologiset muutokset on esitetty kuviossa 12.

sininen fluoresenssi plasmasta käsiteltyjä soluja on paljon vahvempi kuin käsittelemättömästä soluja.

tulokset anneksiini V-FITC: tä (kuvio 13) ja Hoechst 33342 (kuvio 14) värjäämällä edelleen vahvistivat nämä tulokset. Vain mikroplasma käsiteltyjen HeLa-solut osoittivat tuman tiivistyminen ja PS: Hoechstin 33342 keskittymisen ja anneksiini V värjäystä, jotka ovat indikaattoreita solun apoptoosin. Siksi voimme päätellä, että mikroplasma altistuminen on todellakin riittävä indusoimaan apoptoosin selektiivisesti vaikuttamatta viereisiin soluihin.

Rajoitukset yksisoluiset tarkkuuden tutkimukset

Näiden tutkimusten rajoittuu yksinkertaiseen indikaattorit solun apoptoosin, pyrkimättä tutkimaan solusyklin tai solunsisäisiä mekanismeja verrattuna uusien julkaisujen [32], [33]. Tärkein syy on, koska rajoitukset virtaussytometrialla, Western blot, ja q-PCR-tekniikoita määrittämiseksi apoptoottisen vastaukset yksittäisiä soluja. Kuten voidaan nähdä kuvioissa 9-14 yläpuolella, lyhyt mikroplasma altistus on riittävä apoptoosin juuri käsitellyn syöpäsoluja, kun taas viereisten solujen ei vaikuta. Kuitenkin virtaussytometrillä ja Western blot menetelmät vaativat tyypillisesti vähintään 10

4-solut, ja menetelmiä käytetään usein tutkia muutoksia suhteellisen suuri solupopulaatio. Yhden solun tarkkuus apoptoosia ei välttämättä näytä muutoksia havaittavissa virtaussytometrialla ja Western blot menetelmiä. Siksi käytimme yksinkertaista anneksiini V ja Hoechst 33342 värjäytyminen indikaattoreina solujen apoptoosin, ja totesi, että mikroplasma käytetään tässä työssä todellakin johtaa apoptoosin kanssa yksisoluiset tarkkuus.

Mahdollisia sovelluksia

tulokset työmme ovat tärkeitä useiden tulevien biolääketieteen sovelluksissa. Esimerkiksi, kynnyksellä alkuvaiheen havaita pieni määrä syöpäsolujen se voi olla mahdollista selektiivisesti käsitellä pahanlaatuisia soluja, samalla kun normaalit solut koskemattomaksi. Se nykyisin yhä erittäin haastavaa tunnistaa hyvin pieniä klustereita syöpäsolujen alle tietyn vähimmäismäärän soluja. Kun asiaa yksiselitteinen varhaiseen havaitsemiseen tekniikoita ovat saatavilla, niiden mikroplasma lähestymistapa tämän työn voi mahdollisesti olla merkittävä vaikutus syövän hoidot.

Muita mahdollisuuksia ovat levottomuus valittuja alueita solujen pinnalla indusoi tietyn solun vaikutuksia kuten kohdennettua kyseeseen kantasolujen (mahdollisesti myös syöpää kantasolut) halutun tehon ja kohtalo valinta tuloksia, sekä solunsisäinen hyvää ja levottomuus valitun organelles. Näissä tapauksissa vaikutukset aikariippuvat sähkökenttiä myös oltava yksiselitteisesti mukana ja tulkitaan.

Johtopäätös

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että yksittäiset HepG2 ja HeLa syöpäsolut voidaan tehokkaasti inaktivoitua kautta yksisoluiset-tarkkuus, mikroplasma aiheuttama apoptoottisen vasteen, kun taas normaali L-02 maksasoluja ei vaikuta samalla pitoisuuteen plasmassa. Mikroplasma voidaan rajoittaa pienten (~ 1 pm) tilavuudesta ympärille kärki neula, joka voidaan sijoittaa mihinkään tiettyyn alueella käyttämällä mikromanipulaattoria. Tehonsyöttö soluun on hyvin pieni (muutaman mW), mutta joka on riittävä indusoimaan apoptoosin selektiivisesti, ilman että se vaikuttaa viereisiin soluihin, jopa pieni klustereita tiiviisti yhteyttä soluja. Plasma lähde on paristokäyttöinen eikä perustu mihinkään ulkoiseen virtalähteeseen tai kaasu, joka voi olla erityisen hyödyllinen tilanteissa, joissa ulkoista virtalähdettä ei ole käytettävissä tai laite siirrettävyys on kysymys.

Tämä ennakko on geneerinen ja sovelletaan erilaisia ​​syöpäsoluja. Se voi johtaa seuraavan sukupolven yksisoluiset tarkkuuden microsurgeries. Vaihe muutokset ovat myös mahdollisia kyky osoitteellista mikrosiruja kohti hetkellinen inaktivointi as-havaittiin pahanlaatuisten solujen, joissa neulat matriisia voidaan käyttää sekä elektrofysiologisiin antureista ja elektrodit plasman sukupolvi.