Krooninen sairaus

tiivistelmä

kanoninen ohimenevä reseptorin potentiaali (TRPC) kanavat ovat Ca

2 + -permeable kationinen kanavia ohjaamalla Ca

2+ tulva herättämän G-proteiiniin kytketty reseptori aktivointia ja /tai Ca

2 + myymälän ehtyminen. Täällä tutkimme osallistumista TRPCs solun erilaistumiseen keuhkosyöpään. Ilmentyminen TRPCs ja korrelaatio syövän eriyttäminen luokan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja immunovärjäämällä käyttämällä kudossiruina 28 potilaan keuhkosyöpään näytteitä. Yhdistys TRPCs solujen erilaistumista tutkittiin myös keuhkosyöpä A549 PCR ja Western blottauksella. Kanavan aktiivisuus tarkkailtiin Ca

2+ kuvantaminen ja laastari tallennus hoidon jälkeen all

trans

retinoiinihappo (ATRA). Ilmentymisen TRPC1, 3, 4 ja 6 on korreloi erilaistumista luokan NSCLC potilailla, mutta mitään korrelaatiota ei ollut iän, sukupuolen, tupakoinnin historia ja keuhkosyövän solutyypistä. ATRA voimistunut TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 ilmaisun ja parannettu Ca

2+ tulva A549-soluissa, mutta ATRA ei todettu suoraa vaikutusta TRPC kanavilla. Inhibitio TRPC kanavien huokosia estäviä vasta-aineita vähensi solun mitoosia, joka vastavaikuttaa pitkäaikaisen hoidon ATRA. Saarto TRPC kanavien esti A549-solujen lisääntymisen, kun taas yli-ilmentyminen TRPCs kasvoi leviämisen. Olemme päätellä, että TRPC ilmaisu korreloi keuhkosyövän erilaistumista. TRPCs välittävät farmakologisen vaikutuksen ATRA ja tärkeä rooli säätelyssä keuhkosyövän solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon, joka antaa uutta ymmärrystä keuhkosyövän biologian ja mahdollisten syövän hoitoon.

Citation: Jiang HN, Zeng B, Zhang Y, Daskoulidou N, Tuuletin H, Qu JM, et al. (2013) osallistuminen TRPC kanavat Keuhkosyöpä solujen erilaistumista ja Korrelaatiotutkimus in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10,1371 /journal.pone.0067637

Editor: Peiwen Fei, Havaijin yliopiston Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 tammikuu 2013; Hyväksytty: 20 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Shanghai Leading Talent projektit (nro 036, 2010) ja Shuguang seuranta Project Shanghai koulutusvaliokunta (01SG06) (jotta JMQ); Leverhulme Trust Fellowship Award (jotta S.Z.X.); Natural Science Foundation of Shanghai (nro 09ZR1406100) ja Shanghai Johtava Academic Kuri Project (nro B115) (ja H.N.J.). B.Z. tukivat China Scholarship neuvoston ja yliopiston stipendi. N.D. sai 80 vuotta PhD stipendi yliopistosta Hull. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka eloonjäämisaste on parannettu käyttöönoton jälkeen kolmannen sukupolven syöpälääkkeiden ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät, keuhkosyöpä on edelleen johtava syy syöpäkuolemista maailmassa [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Siksi ymmärtäminen patogeneesi keuhkosyövän kehittäminen ja tunnistaakseen uusia potentiaalisia kohteita ovat tärkeitä terapeuttisia strategian kehittämiseen.

Ca

2+ on tärkeää signa- kasvaimen. Ohimenevä reseptorin potentiaali (TRP) ionikanavan perhe on ollut mukana säätelyssä syövän kasvua ja etenemistä kautta modulaatio Ca

2+ virtaa ja alavirran signaalit mukaan lukien geenien transkriptio [6], [7], [8] . Kuudesta subfamilies (TRPC, TRPM, TRPV, TRPP, TRPML ja trpA) ja TRP-kanavia, kanoninen TRP (TRPCs) on ehdotettu proteiinityrosiinikinaasin tai G-proteiiniin kytketty reseptori toimivat Ca

2+ kanavia ( ROCS) tai sisäinen Ca

2+ store toimivia kanavia (SOC), jotka välittävät Ca

2+ merkintä mieleen monet hormonit ja kasvutekijät. Siksi estäminen näiden kanavan toimintaa tai ilmaus aiheuttaa toiminnallisia muutoksia syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota, pesäkkeiden muodostumisen ja kasvaimen kasvu [6], [9]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa TRPC eri tyyppisiä syöpäsoluja tai syövän kudoksiin, kuten TRPC1, 3, 6 rintasyövän MCF7-soluja [10], [11] ja maksasyöpä HepG2-soluissa [12], TRPC1, 3, 4 eturauhassyövän LNCaP-soluja [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 munuaissolukarsinooma [15], TRPC1, 3, 5, 6 ihmisen pahanlaatuisten glioomien [16], TRPC1, 3- 7 neuroblastoomakasvaimissa IMR-32-soluissa [17], TRPC3 ihmisen astrosytoomassa 1321N1-soluissa [18], TRPC6 ruokatorven ja mahalaukun syöpä [19], TRPC1, 3, 4, 6 ja niiden saumattu muunnelmia munasarjasyöpä [9], [ ,,,0],20], ja TRPC1, 4 tyvisolusyöpä [21]. Lisäksi todisteet alkaen

in vitro

kokeet ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen TRPC kanavia tai hiljaisuus geeniekspression siRNA voi säädellä solujen lisääntymisen tai solujen eloonjäämistä, mikä viittaa siihen, nämä geenit ovat tärkeitä syövän biologian [6], [9] , [20].

ilmentyminen TRPC1, 3, 4, 6 keuhkosyöpä on havaittu [22], [23] ja yhdistyksen TRPC3 ilmaisun kanssa ennustetta keuhkoadenokarsinooma on kuvattu [ ,,,0],23]. Kuitenkin korrelaatio TRPC ilmaisun kanssa erilaistumista arvosana keuhkosyövän ja taustalla olevaa mekanismia ei juuri tunneta. Täällä tavoitteena oli tunnistaa ilmentymisen TRPCs ihmisen keuhkosyöpää ja määrittää roolit TRPCs säätelyssä syövän solujen erilaistumista ja lisääntymistä käyttämällä erityisiä TRPC salpaava vasta-aineita. Tutkimme myös mahdollisia korrelaatio TRPC ilmaisun syöpään erilaistumista luokalla solutyypin ja tupakointi reaaliaikaisella PCR ja immunohistokemia keuhkosyövän kudossiruina. Tutkimaan edelleen suhdetta TRPC ilmaisutapoja solujen erilaistumiseen, ATRA, voimakas solujen erilaistumiseen indusoijan monissa solutyypeissä, käytettiin käytettäessä

in vitro

keuhkosyöpäsolua malli.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja Lung Kudosnäytteiden

Kaksikymmentä-kahdeksan potilasta (17 miestä ja 11 naista) seisotettiin 61,1 ± 1,7 vuotta ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) rekrytoitiin marraskuun 2008 ja joulukuussa 2009. Kaikki potilaat NSCLC diagnosoitiin kliinisesti järjestetään I tai II keuhkosyöpä ja sai operaatio Torakaaliikirurgia Zhongshan sairaala. Tukikelpoiset potilailla oli aikaisemmin hoitamaton, histologisesti tai sytologisesti osoittautui NSCLC. Potilaat saivat joko ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa ei otettu tutkimukseen. Keuhkosyöpä kudosta ja normaali keuhkojen ympäröivään kudokseen kasvain yli 2 cm: n etäisyydellä saatiin samasta potilaasta. Snap-pakastetut kudokset käytettiin mRNA analyysiä ja formaliinilla kiinnitys- kudosten immuocytochemistry tutkimus. Projektin hyväksyi eettisen komitean Zhongshan sairaalan Fudanin yliopiston, ja potilaat kirjallisen suostumuksensa mukaisesti Helsingin julistuksen.

Keuhkosyöpä kudossiruina

Keuhkosyöpä kudossiruina olivat valmistettu käyttäen formaliinikiinnitetyt syövän kudoksissa [24]. Tissue kappaleet 2 millimetriä kerättiin perustuu visuaalisen yhdenmukaistaminen vastaavien hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys. Yksi ydin normaalin keuhkokudoksen ja kaksi ydintä kasvainkudoksen otettiin jokaisen potilaan ja sijoitetaan vastaanottajan parafiinilohkoihin. Kudos kohdat 5-um paksuus käytettiin immunovärjäyksen. Kaikki näytteet on kudossiruina tutkittiin patologi histologisesti luokittelun ja erilaistumisen arvosana mukaan WHO: n luokituksen [25].

Solut kulttuurin ja Gene transfektio

A549-solulinja, joka on yleisesti käytetty keuhkosyöpäsolua malli on johdettu adenocarcinomic ihmisen alveolaarisen pohjapinta epiteelisolujen, kasvatettiin DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen, Paisley, UK), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja pidettiin 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2. Ihmisen TRPC1, TRPC3 ja TRPC6 monistettiin cDNA ihmisen munasarjasyövän solujen ja ihmisen TRPC4 monistettiin cDNA ihmisen aortan endoteelisolujen 100% identtisyys sekvenssien Genbank (hakunumerot: X89066 (TRPC1); U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) ja BC093660 (TRPC6). trpC cDNA: t subkloonattiin pcDNA3.1 tai pEGFP-C1 vektorit ja niiden toiminnalliset ilmentyminen on vahvistettu kuten on raportoitu [9]. A549-soluja transfektoitiin TRPC1, 3, 4, ja 6 plasmidi-cDNA pcDNA3-vektorin kanssa käyttämällä Iipofectamine2000 (Invitrogen). transfektoidut solut maljattiin 48-kuoppaiselle levylle kokeessa.

Giemsa Värjäys, Mitosis ja soluproliferaatiomääritykset

A549-soluja maljattiin 3,5 cm astioita, joiden lopullinen tiheys 4 x 10

4 solua per malja. soluja käsiteltiin 1 uM ATRA tai ajoneuvon. elatusaine täydennettiin joka 24 h. solut kiinnitettiin metanolilla 10 min ja värjätään 1:09 laimennettua työskentelee Giemsa-liuoksella (Sigma) PBS: ssä pH: ssa 6,5 ​​45 minuutin ajan, ja pestiin vedellä ja kuivattiin ilmassa. Solujen kokonaismäärästä ja mitoosi solut laskettiin kuviin valokuvattiin 200 x suurennus. Solujen proliferaatio määritettiin myös käyttämällä WST-1-määritys (Roche, UK) [9].

RT-PCR: llä ja Real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin ihmisen keuhko- ja keuhkosyövän kudoksia tai A549-soluihin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, UK). RNA kvantitoitiin kanssa nanophotometer (Implen, saksa). MRNA: n (1 ug) käänteisfaasi-cDNA: ksi käyttäen Multiscribe käänteistranskriptaasia (Applied Biosystems, USA) ja satunnaisia ​​alukkeita (Promega, UK). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä StepOne ™ Real-Time PCR System tai ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, UK). Aluke suunniteltiin poikki introni ja sekvenssit annettiin taulukossa S1. Kukin reaktio sisälsi 1 x SYBR Universal Master Mix (Applied Biosystems) 10 ui cDNA 1 ui, ja eteen ja taakse alukkeita 1,5 gl. Ihmisen housekeeping-geeni glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi GAPDH käytettiin sisäisenä standardina. Non-mallia tai ei-RT asetettiin negatiivisena kontrollina. PCR-sykli koostui ensimmäinen sykli 50 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 95 ° C: ssa 10 minuuttia, sitten 50 toistuvien 95 ° C: ssa 15 s, 54 ° C annealing lämpötilassa 30 s, ja alukkeen pidennys 72 ° C: ssa 30 s.

vasta-aineita, Western-blottaus ja immunohistokemia

Kanin polyklonaalista anti-TRPC vasta-aineita (T1E3, T5E3, T367E3 ja T45E3) tuli vastaan ​​solunulkoista kolmannen silmukan (E3) alue lähellä kanavan huokosten [26]. Spesifisyys E3-kohdistaminen vasta testattiin ELISA, Western blotting ja toiminnalliset analyysit ja fluoresenssi soluerottelun (FACS) [9], [26]. Menettely Western blotting on kuvattu aiemmin [26]. Lyhyesti, solut hajotettiin RIPA-puskurissa (Sigma-Aldrich, Poole, UK) ja proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE-geelissä ennen kuin siirtää nitroselluloosakalvolle. Blottia inkuboitiin kanin anti-TRPC vasta-aineita (1:200) yön yli 4 ° C: ssa, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja niitä inkuboitiin vuohen anti-kani-lgG-HRP 1:2000 laimennus (Sigma). Kanin anti-β-aktiini (Santa Cruz Biotech, USA) 1:400 laimennosta käytettiin sisäisenä standardina proteiinin määrän. Visualisointi toteutettiin käyttämällä ECLplus detektioreagensseja (GE Healthcare, UK) ja altistuminen röntgenfilmit. Kvantifiointia analysoitiin käyttämällä Image J ohjelmisto (NIH, USA). Immunovärjäyksen menettely oli samanlainen kuin meidän raportit [9], [27] ja Vectastain ABC-järjestelmän (Vector Laboratories, Peterborough, Iso-Britannia) käytettiin. Kanin anti-TRPC1, 3, 4 ja 6-vasta-aineiden ostettu Abcam (Cambridge, UK) käytettiin ihmisen keuhkokudoksen ja keuhkosyövän osassa värjäystä. Värjäytyminen kvantifiointi arvioitiin pisteyttämällä positiiviset värjättyjen solujen ja värjäytymisen intensiteetti rankattu 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (väli) ja 3 (voimakas) [28].

Kokosolun Patch Clamp

koko solun virtaukset rekisteröitiin käyttäen Axoclamp 2B tai Axopatch B200 patch clamp vahvistimen ja ohjata pClamp 10 ohjelmisto. Menettelyt tallentamiseen TRPC virtaukset olivat samanlaisia ​​aiemmat raportit [29], [30]. A1-s ramppijännitteeseen protokollan -100 mV +100 mV levitettiin taajuudella 0,2 Hz peräisin pitopotentiaalissa 0 mV. Signaalit otettiin näytteet 3 kHz ja suodatettuna 1 kHz. Lasi mikroelektrodilla kanssa vastus 3-5 MQ käytettiin. 200 nM Ca

2+ pipettiliuoksella (115 CsCI, 10 EGTA, 2 MgCl

2, 10 HEPES, ja 5,7 CaCl

2 mM, pH säädettiin arvoon 7,2 CsOH: lla ja osmolaarisuus säädettiin jotta ~290 mOsm mannitolin). Laskennallinen vapaa Ca

2+ oli 200 nM käyttäen EQCAL (Biosoft, Cambridge, UK). Standardi kylpy sisälsi (mM): 130 NaCl, 5 KCI, 8 D-glukoosia, 10 HEPES, 1,2 MgCI

2 ja 1,5 CaCl

2. PH säädettiin arvoon 7,4 NaOH: lla. Koe suoritettiin huoneen lämpötilassa (23-25 ​​° C).

Ca

2+ Imaging

A549-soluja ladattiin 2 uM Fura-PE3 AM 37 ° C: ssa 30 min Ca

2 + vapaa kylpy ratkaisu, jota seurasi 20 minuutin pesu vakio kylpy liuokseen huoneenlämpötilassa. Fura-PE3 fluoresenssia seurattiin käänteisen epifluoresenssimikroskoopilla (Nikon Ti-E, Japani). Ksenonkaarilamppu edellyttäen kiihtymys valoa, jonka aallonpituus oli valinnut Nikon kuvantamisjärjestelmä ohjataan NIS Elements 3.0 -ohjelmiston. Dual aallonpituus innoissaan 340 nm ja 380 nm käytettiin Fura-PE3 fluoresenssi, ja emissio kerättiin 510 nm suodatin ja valokuvannut Orca-R2 CCD-kamera (Hamamatsu, Japani). Suhde Ca

2 + väriaine fluoresenssia F

340 /F

380 aallonpituus mitattiin [30]. Kaikki kokeet suoritettiin huoneen lämpötilassa.

Reagenssit ja Chemicals

Kaikki yleiset suolat ostettiin Sigma-Aldrich (Poole, UK). Gadolinium kloridi (Gd

3+), 2-aminoethoxydiphenyl boraatti (2-APB), trypsiini, all

trans

retinoiinihappo (ATRA), ja PCR-alukkeet ostettiin Sigma-Aldrich, ja Fura -PE3 AM oli Invitrogen (Paisley, UK).

tilastot

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± sem Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin käyttäen ANOVA ja ero ryhmien kesken arvioitiin Dunnettin

t

-testissä in SPSS ohjelmiston. Opiskelijan

t

testiä sovellettiin kahden vertailuihin. Ridit analyysi käytettiin semikvantitatiivinen tietojen immunovärjäyksellä kokeen.

P

arvo 0,05 katsottiin merkitys.

Tulokset

ilmentäminen TRPCs Lung Cancer

ilmentyminen TRPCs normaaleissa ihmisen keuhkojen ja keuhkosyöpä kudoksissa tutkittiin immunovärjäyksellä (Fig. 1A). Normaalissa keuhkokudoksessa osia, alveolaarinen epiteelin solut värjättiin anti-TRPC1 ja anti-TRPC6 vasta-aineita, mutta värjäystä TRPC3 ja TRPC4 olivat negatiivisia tai erittäin heikkoa. Keuhkojen okasolusyöpä osaan, okasolujen voimakkaasti värjättiin anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 ja anti-TRPC6 vasta-aineita. Samoin positiivista värjäytymistä varten TRPC1, TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 nähtiin myös keuhkojen adenocardionoma kohdissa. Käyttäen reaaliaikaista PCR: ää määrällisesti ekspressiota TRPCs normaalissa keuhkojen ja syöpäkudoksissa. MRNA: t TRPC1, 3, 4 ja 6 havaittiin sekä normaalin keuhkokudoksen ja keuhkosyövän kudoksiin. Ilmentymisen taso TRPC1 ja TRPC6 oli paljon suurempi kuin TRPC3 ja TRPC4. MRNA: t TRPC5 ja TRPC7 voinut havaita normaalissa ja keuhkosyövän kudoksia (Fig. 1 B-C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että on olemassa TRPC1, 3, 4, 6-isoformien NSCLC.

A Esimerkkejä ihmisen normaalia keuhkojen (

n

= 20) ja keuhkosyövän kudosleikkeiden (

n

= 28), mukaan lukien adenokarsinooman (AC) ja okasolusyöpä (SCC) värjättiin anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 ja anti-TRPC6 vasta käyttämällä Vectastain ABC-järjestelmää. Positiivinen värjäytyminen näkyi ruskea väri. Tumat vasta- värjättiin hematoksyliinillä. B, mRNA havaittiin real-time PCR normaalissa keuhkojen kudoksissa käyttäen alukkeita taulukossa S1. GAPDH käytettiin sisäisenä house-pitäminen geenin ohjaus kvantifiointiin (

n

= 25 potilasta TRPC1, 4, 5 ja 6 ryhmää;

n

= 24 TRPC3, ja

n =

9 TRPC7). C, mRNA tasot keuhkosyöpää kudoksissa (AC:

n

= 9-15, SCC:

n

= 8-11).

Korrelaatio TRPC Expression Cancer erilaistuminen Grade

ero mRNA tasojen syövän erilaistumisen laadut, solutyyppejä, tupakoitsija ja ei-tupakoitsija havaittiin reaaliaikainen PCR. Ilmentyminen TRPC1, 3, 4 ja 6 kanavaa oli merkitsevästi pienempi huonosti eriytetty keuhkosyöpään kuin hyvin kohtuullisesti erilaistunut ryhmä (Fig. 2A, katso myös taulukko S2). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa tupakoitsija ja ei-tupakoitsija ryhmien (Fig. 2B). Lineaarinen multivariance regressioanalyysi osoitti myös negatiivista korrelaatiota mRNA ilmentymisen TRPC1, TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 keuhkosyöpään erilaistumista laatu standardoituja β kerroin sekvenssi TRPC1 (-0,563) TRPC4 (-0,360) TRPC6 (0,271 ) ja TRPC3 (-0,057), vastaavasti. Vaiheittainen regressio osoitti TRPC1 oli merkittävä muuttuja (P 0,01), mutta korrelaatio syövän eriyttäminen grade sukupuolen, iän, tupakointi, ja syöpäsolujen tyyppi ei ollut merkittävä.

, mRNA ilmaus TRPCs keuhkosyövän kudoksiin hyvin kohtalainen (grade II (

n

= 17) ja luokan III (

n

= 6)) tai huono (luokka IV,

n

= 5) erilaistuminen laatu havaittiin reaaliaikainen PCR. GAPDH käytettiin taloudenhoito geeni ohjaus. B, mRNA ilmentyminen TRPCs että keuhkosyöpä kudoksia saatu tupakoitsija (20 savuketta päivässä yli 10 vuotta,

n

= 11) ja ei-tupakoitsija (

n

= 17 ). C, Esimerkki kaksi kudossiruina normaali keuhko (N) ja keuhkosyöpää (C) etiketit värjättiin anti-TRPC1 vasta-aine. Solutyypin ja erilaistumista luokan kunkin osan leimasi HE-värjäys. Kaksi esimerkkiä (11C ja 9C) ja hyvin erilaistunut adenokarsinooma oli esitetty sisäkkeet. Korrelaatio värjäytymisen intensiteettiä muiden tekijöiden taulukossa ja merkityksen arvioitiin Ridit analyysi. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

Myös tutki korrelaatio keuhkosyöpään eriyttäminen luokalta tRPC proteiinin ilmentymisen tasot käyttäen puoli- kvantitatiivista immunovärjäystä. Kaksi kudossiruina 20 normaalin keuhkojen kudoksia ja 28 NSCLC näytteitä muun 15 tapauksessa adenokarsinooma, 11 tapauksia okasolusyöpä, ja 2 tapausta sekavin solutyyppejä adenosquamous syöpä rakennettiin (Fig. 2C). Keuhkosyöpä solutyypin varmistettiin HE-värjäys. TRPC1, TRPC3, ja TRPC6 viereisen microarray kudosleikkeet voimakkaasti värjättiin anti-TRPC1, 3, ja 6-vasta-aineiden kanssa, prosentteina positiivisesti värjättyä syövän osien 71,4%, 75,0% ja 71,4%, vastaavasti, kun taas lievää värjäytymistä nähnyt TRPC4 positiivisen värjäytymisen osuus 32,1%. Normaali keuhko osiot mikrosiruja, positiivinen värjäytyminen prosenttiosuus TRPC1, 3, 4 ja 6 olivat 70%, 70%, 45%, ja 85%, vastaavasti. Ridit analyysi osoitti, että värjäytymisen intensiteetti TRPC1 liittyi erilaistumiseen luokka (Fig. 2C). Kuitenkin lineaarinen multivariance regressioanalyysi ei osoittanut merkittävää korrelaatiota proteiinin värjäys tulokset TRPC että keuhkosyöpä erilaistumista luokalla, solutyyppi, tupakointi, ikä ja sukupuoli.

lisääntymisen merkkejä TRPC Expression by Krooninen hoito ATRA

TRPC1, 3, 4 ja 6 havaittiin A549-soluja, mutta TRPC5 ja TRPC7 olivat havaittavissa, vaikka alukesarjat varten TRPC5 ja TRPC7 voi vahvistaa mRNA eristettiin aivo- tai HepG2-solut (Fig. 3A). Kaksi TRPC1 geelissä olivat α ja β isoformit, ja taajuusalueiden TRPC4 olivat α, β, γ ja δ isoformit, vastaavasti, kuten on kuvattu munasarjasyöpäsoluja [9]. MRNA ja proteiini tasot TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 kasvatti merkittävästi pitkäaikaisen hoidon 1 uM ATRA 96 tuntia (Kuva. 3B-C), kuitenkin asetuksen TRPC1 ilmaisu ei ollut merkittävä. Nämä tiedot viittaavat lisäksi siihen, että ilmaus joidenkin TRPC isoformien liittyy solujen erilaistumisen.

A, mRNA: t TRPC1, 3, 4 ja 6 havaittiin A549-soluja RT-PCR: llä käyttäen aluketta asetettu taulukon S1. PCR bändejä TRPC5 ja TRPC7 olivat negatiivisia A549-soluja, mutta positiivisia ihmisen aivoissa tai HepG2. B, mRNA havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä A549 käsitelty all

trans

retinoiinihappo (ATRA, 1 uM) 96 tunnin ajan. Β-aktiini käytettiin housekeeping-geenin suhteellisen kvantifioinnin. 2

(- ΔΔCt) menetelmää käytettiin laskennassa. C, trpC proteiinit kvantitoitiin Western-blottauksella käyttäen anti-TRPC1 (T1E3), anti-TRPC3, anti-TRPC4 (T45E3) ja anti-TRPC6 vasta-aineita. Anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin suhteellisen proteiinin määrästä (

n

= 3 itsenäisestä kokeesta ja kukin kokeilla triplikaattinäytteet).

Effects of ATRA Cartr

2 + Release ja Tulva A549 Cells and TRPC Channel Activity

A549-soluja hoidettiin jatkuvasti ATRA (1 uM) 4 päivää jokaisen 24 tunnin virvokkeita soluviljelyelatusaineen. Dynamiikka solunsisäisen Ca

2+ seurattiin Fura-PE3 /AM. Trypsiini 0.2 nM aiheuttama vankka Ca

2 + vapautumista Ca

2+ ilmaisen ratkaisun, jota seurasi toinen Ca

2 + huippu A549-soluja. Perfuusion 1,5 mM Ca

2+ jälkeen store-ehtyminen trypsiinillä lisäsi Ca

2+ tulva että ATRA käsiteltyjä soluja (Kuva. 4A-B), mikä viittaa kroonisen hoidon ATRA tehosti Ca

2+ tulva, mutta ei vaikuttanut Ca

2 + julkaisu signaali. Käyttämällä koko solun patch tallennuksen, nykyinen A549-solujen ei ole muuttanut akuutti perfuusiota ATRA (Fig. 4C-E). Tutkia mahdollisuuksia välitön vaikutus ATRA on TRPC kanavilla, HEK-293-solujen indusoitavasti ilmentävät TRPCs käytettiin koko solun patch tallennus. Virtauksia TRPC3, 6 ja TRPC4 virrat aktivoitiin trypsiinillä tai Gd

3 + (100 uM) vastaavasti. Nykyinen-jännite suhde (

IV

) käyrät nämä virrat olivat samankaltaisia ​​edellisessä raportissa [29]. ATRA 1 uM ja 10 uM ei ollut stimuloivaa tai esto vaikutus näillä kanavilla, mutta kaikki nämä virtaukset olivat estänyt TRPC salpaaja 2-APB, mikä viittaa siihen, että ATRA ei ollut akuuttia suoraa vaikutusta Ca

2+ nykyinen tai Ca

2+ tulva kautta TRPC kanavien (Fig. 4F-I). Krooninen augmentation Ca

2+ tulva että ATRA käsitellylle A549 voitaisiin yksinomaan myötävaikuttanut TRPC geenin säätelyä.

A549-soluja ladattiin 2 uM Fura-PE3 /AM ja Ca

2+ mitattiin suhde (F

340 /F

380) Ca

2 + väriaine fluoresenssi. Ca

2+ vapautuminen herättämän trypsiinin (0,2 nM) ja Ca

2+ tulva otettiin käyttöön 1,5 mM Ca

2+ perfuusioliuokseen. Soluja inkuboitiin 1 uM ATRA 96 tuntia ja ohjaus soluja inkuboitiin saman tilavuuden ajoneuvon. B, keskiarvona ± s.e.m. tiedot Ca

2 + merkintä jälkeen varastoon ehtymisestä trypsiinillä kuvan (A).

n

= 21-32 kullekin ryhmälle, ***

P

0,001. C, Kokosolun virtaukset näytteitä käskystä jännitteellä ± 80 mV A549-soluja ennen ja jälkeen perfuusiota ATRA (1 uM), trypsiiniä (0,2 nM) ja 2-APB (100 uM). D,

IV

käyrät (C). E, Mean tiedot vaikutuksen ATRA. F-H, vaikutus ATRA on koko solun virtaukset TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 että HEK293-soluissa yli-ilmentävät yksittäisiä TRPC isoformeja. I, keskiarvo ± s.e.m. data mitattiin -80 mV, ja

n =

4-6 kullekin ryhmälle.

Cell Differentiation säätelemä TRPC Channel Activity

erilaistuminen A549 keuhko syöpäsolut arvioitiin Giemsa värjäys, joka voi visualisoida kromosomeja. Cell ydin- mitoosia näkyvissä tummansininen tuma tai erillistä ytimet värjäys (Kuva. 5). ATRA (1 uM) inhiboi merkittävästi solun mitoosia 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua soluviljelyn. Prosenttiosuus mitoottisten solujen tuli vähemmän 72 tuntia ja 96 tuntia soluviljelmässä ja ero kahden ryhmän välillä ei havaittu merkittäviä (kuvio. 5B). Menetys tilastotieto ero 72 tunnin kuluttua soluviljelmissä voi johtua solujen kontakti-inhibitio, joka tapahtui konfluentteja soluja jälkeen 3-4 päivää soluviljelmässä. Siksi arvioimme vaikutus TRPC salpaajien on mitoosin 48 tunnin kulttuuri. Spesifisyys ja toiminta TRPC huokosten estävien vasta-aineiden on osoitettu aiemmissa tutkimuksissa [9], [31], [32], [33]. Esto TRPC1, TRPC3 ja TRPC6 kanavat T1E3 ja T367E3 vasta-aineet estivät merkittävästi mitoosia, kun vaikutukset T1E3 ja T367E3 osoittivat vähemmän tehokkaita sen jälkeen, kun hoidon ATRA vertaamalla käsiteltyjen ryhmien keitetyn vasta-aineen tai ryhmä ilman vasta-aineen lisäystä.

A Esimerkki Giemsa värjäytymisen A549-soluja ja hoidon kanssa tai ilman ATRA varten 0-96 tuntia. Mitoosi Solut nuolella. B, prosentuaalinen mitoosi solujen valvontaa ja ATRA-käsiteltyjen ryhmien (

n

= 32-40 mikroskooppikentäs- kutakin ryhmää, joka sisältää 6 viljelymaljoihin, ***

P

0,001). C, vaikutus TRPC salpaava vasta solun mitoosia. Keskipitkällä ilman vasta-ainetta (No-Ab) ja keitetty vasta-aine (Keitetyt-Ab) kontrolleina (

n

= 18 mikroskooppikentäs- 6 viljelykuoppia kullekin ryhmälle, NS: ei-merkitsevä, *

P

0,05, ja **

P

0,01). Delta (Δ) uudelleen ATRA inhiboivan verrattiin myös joukossa keitetty-Ab (Control) ja estävän vasta-aineen käsiteltyjen ryhmien.

TRPC Channel ja A549 Cell Proliferation

Cell erilaistuminen ja proliferaatio on kaksi läheistä sukua soluprosessien, siksi myös havaittu vaikutusta TRPC kanavan aktiivisuus A549-solujen lisääntymisen. Solujen lukumäärä lisääntyi ~ 8-taittuu jälkeen 96 tunnin soluviljelmässä. ATRA (1 uM) esti merkitsevästi solujen lisääntymistä jälkeen 72 tunnin ja 96 tunnin soluviljelmässä (Fig. 6A), mikä viittaa vaikutus ATRA soluproliferaatioon on hitaasti puhkeamista prosessi. Kuitenkin, anti-proliferatiivisen vaikutuksen salpaamalla TRPC kanava-aktiivisuus oli paljon nopeammin, ja merkittävä ero saavutettiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 2-APB, ei-selektiivinen TRPC salpaaja. N

50 ° C 2-APB oli 87,9 uM (Fig. 6B). Käyttämällä estävien vasta-aineiden T1E3 ja T367E3 spesifisesti estää TRPC1 ja TRPC3 /6 A549-soluja esti myös solujen proliferaation ilman ATRA hoitoa, mutta inhibitorinen vaikutus oli selvempi silloin, kun soluja käsiteltiin 1 uM ATRA: ssa 48 tuntia (kuvio . 6C), mikä viittaa aktiivisuuden TRPC kanava saattaa lisätä ATRA. Edelleen osoittaa osallistumista TRPC kanavien keuhkosyövän solujen lisääntymisen, A549-solut transfektoitiin TRPC1, 3, 4, ja 6 plasmidi cDNA. Solulisäkasvumäärityk- nostettiin vuonna A549-soluja yli-ilmentävät TRPC1 ja TRPC6, mutta ei merkittäviä soluille yliekspressoivien TRPC3 ja TRPC4 (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittavat, että keuhkosyövän solujen lisääntymistä säädellään toiminnan TRPC kanavia.

A, aikakäyrän vaikutus ATRA A549-solujen lisääntymisen. B, A549-soluja inkuboitiin 2-APB eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan (

n

= 8 kuoppaa kutakin ryhmää), ja solujen lisääntyminen määritettiin WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä kit. C, A549-soluja käsiteltiin erityisiä E3-kohdistaminen TRPC estäviä vasta-aineita tai yhdistettynä ATRA 48 tuntia (

n

= 6-7 kullekin ryhmälle, kontrolliryhmään verrattuna (

#), * tai

#

P

0,05, ** tai

##

P

0,01). D, A549-solujen lisääntymisen arvioitiin WST-1 jälkeen transfektion TRPC1, 3, 4, ja 6 plasmidi cDNA 48 tuntia (

n

= 8 kullekin ryhmälle, **

P

0,01).

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että TRPC1, TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 olemassa ihmisen keuhkosyöpä lukien adenokarsinooma, okasolusyöpä ja adenokarsinooma-solulinjaa A549. Ilmentymisen taso TRPC kanavien korreloi erilaistumista luokan keuhkosyöpään. ATRA ylössäätelee TRPC geeniekspression A549-soluja. Esto TRPC kanavan toiminta osoittaa antiproliferatiivista vaikutusta. Nämä havainnot ovat tärkeitä ymmärtämisen roolit TRPC kanavien keuhkosyövän solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon.

TRPC kanavia on havaittu monissa kudoksissa [32], [34], [35], [36] kuten syövän kudoksia, kuten rintasyövän [37], munasarjasyöpä [9], [20], hepatooma [12], eturauhassyöpä [13], tyvisolusyöpä [21], munuaissolukarsinooma [15], pahanlaatuisten glioomien [16] , glioblastooma [8], ja mahalaukun kasvaimet [19]. Ilmaisu taso kunkin TRPC isoformin eri syöpätyypin soluja tai kudoksia ovat vaihtelevia, mikä viittaa siihen, osuuden tai biologisen merkityksen jokaisen TRPC isoformin eri syöpätyypin voisi olla erilainen. Esimerkiksi ilmaus TRPC7 on negatiivinen A549- ja SKOV-3, mutta positiivinen HepG2-soluissa tässä tutkimuksessa ja eriytetty neuroblastoomasoluilla [17]. Lisäksi vaihtoehtoinen saumattu variantteja voi myös edistää toiminnallisuutta TRPC kanavia, kuten TRPC1 ja TRPC4 saumattu isomuotojen munasarjasyövän SKOV3- soluissa [9]. Lisäksi ekspressiotason TRPC kanavat voivat riippua erilaistumista tilan syöpäsoluja, koska olemme huomanneet, mRNA: n ilmentymistä TRPC1, TRPC3, TRPC4 ja TRPC6 alhainen erilaistumista luokka keuhkosyöpä oli alhaisempi kuin hyvin eriytetty syöpä , mikä on johdonmukaista havaintomme munasarjasyövän [9] ja alhainen ilmaus TRPC4 ja TRPC6 kasvuvaiheessa kantasolujen [38]. Vaikka tiedot osoittivat, että mRNA-tasot on TRPCs normaaleissa keuhkoissa oli korkeampi kuin keuhkosyöpä, on vaikea tehdä tällainen vertailu vaihtelun vuoksi solutyypeissä, koska normaali keuhko näytteet on paljon ei-epiteelisolujen kuin, että kiinteän kasvaimen näytteiden, kuten verisuonten solujen, keuhkorakkuloiden makrofageissa, fibroblasteissa, ja verisoluja. Immunovärjäyksen on keuhkosyöpä kudossiruina osoitti vähäisempiä, mikä voisi johtua alhaisesta herkkyydestä menetelmää verrataan korkean herkkyyden tosiaikaisen PCR.