Krooninen sairaus

tiivistelmä

Rho GTPaasit ovat keskeisiä säätelijöitä kasvainsolun invaasiota ja näin ollen houkuttelevia kohteita suunnittelusta syöpälääkkeiden. Useat strategiat on kehitetty moduloivan niiden lisääntyneen toiminnan aikana syövän etenemisen. Mielenkiintoista, mikään näistä lähestymistavoista otettiin huomioon olemassa tunnettu antagonistisia suhde RhoA ja Rac1. Tässä tutkimuksessa ensin verrattiin invasiivisuus kokoelma paksusuolisyövän solulinjojen kanssa RhoA, Rac1 ja Cdc42 toimintaa. Huomattavaan vähenemiseen aktiivisen Cdc42 ja Rac1 korreloi korkea invasiivisia potentiaalia solulinjojen perustetaan metastaasien paksusuolen adenokarsinooma (LoVo, SKCo1, SW620 ja Colo205). Toisaalta välillä ei RhoA aktiivisuutta ja invasiivisuus havaittiin, kun taas aktiivisuus sen kinaasin efek- ROCK oli korkeampi syöpäsolulinjoissa entistä invasiivisia fenotyyppi. Lisäksi, invasiivisuus näissä koolonsyöpäsolulinjoissa korreloi tyypillinen pyöreä ja kupliminen morfologia. Sitten testataan onko hoito PDGF palauttaa Cdc42 ja Rac1 toimintaa ja /tai Y27632, kemiallisen estäjä ROCK voivat heikentää invasiivisuuden SW620-solujen. Yhdistyksen Molempien hoitojen merkittävästi vähensi invasiivisia potentiaalia SW620-solujen ja tämä vaikutus liittyy menetys kalvon kupliminen, palauttaminen entistä pitkänomainen solun muotoon ja uudelleen perustaminen E-kadheriinin riippuva vyöliitos. Tämä tutkimus avaa tien terapeuttisten strategioiden kehittämisen, jossa eri Rho GTPaasina modulaattorit yhdistetään moduloimaan cross-talk välillä Rho GTPaasit ja niiden erityiset panoksensa metastasointiin.

Citation: de Toledo M, Anguille C Roger L, Roux P, Gadea G (2012) Cooperative Anti-invasiivinen vaikutus Cdc42 /Rac1 aktivointi ja ROCK esto in SW620 peräsuolen syövän solut sisältävät Kohonnut kupliminen Activity. PLoS ONE 7 (11): e48344. doi: 10,1371 /journal.pone.0048344

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2012; Hyväksytty: 24 syyskuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 de Toledo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Ligue Nationale contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la Recherche contre le Cancer (contrat 17029), Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, ja Le Centre National de la Recherche Scientifique. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rho GTPaasit ovat välttämättömiä monille solun toimintoja, kuten kalvokuljetuksessa, transkription aktivaatio, apoptoosin, solusyklin etenemisen, solun polariteetti, tarttuvuus ja muuttoliike [1], [2], [3], [4]. Todellakin niiden purkamista on merkittäviä vaikutuksia monissa fysio-patologisten prosessien [5]. Erityisesti Rho GTPaasit ovat ratkaisevia säätelijöitä syövän etenemisen mukauttamisella solujen lisääntymisen, apoptoosin, invaasiota ja etäpesäkkeiden muodostumista [6].

Rooli kolme Rho GTPaasit in kaksiulotteisessa muuttoa on hyvin ominaista. Rac1 ajaa liikkuvuutta edistämällä lamellipodium muodostumista ja solujen ulokkeet [7]. RhoA signalointi aktivoi ROCK kinaasiperhe, edistää muodostumista Actin stressiä kuituja ja sukupolven Actomyosin supistusvoiman joka tarvitaan takaisinveto solun taakse mesenkymaalisten-tyyppinen liike [8], [9]. Cdc42 aktivoituu etureunassa lamellipodioihin ja tarvitaan Arp2 /3-riippuvaista Actin kokoonpano [10]. Lisäksi olemassaolo antagonistinen suhde Rac1 ja RhoA selittää polarisoitunut liikkeen aikana suunnattu solujen vaeltamiseen. Kiinnostavaa kyllä, nämä kaksi proteiinia tukahduttaa toisiaan toimintaa ja fenotyyppien [11], [12], [13]. Erityisesti RhoA ja Rac1 toimintaa paikallisesti ja ajallisesti ohjataan edistämään dynaamista cytoskeletal muuttuu siirron aikana. Rac1 toiminta rajoittuu etureunan laajentaa ulokkeita edessä, kun taas RhoA ajaa supistuminen takana vaeltavat solun. RhoA ja Rac1 paikallisia vaikutuksia oletettavasti ohjaa erityisiä sääntelymekanismeja. Todellakin, Wildenberg ja kollegat osoittivat, että Rac1 riippuvaisen down-regulation of RhoA toimintaa ohjataan vyöliitos eheys [14].

Kuitenkin mekanismit, jotka välittävät kasvain solun liikkuvuus ovat erilaisia ​​monimutkaisempia kolmiulotteisia matriiseja . Tässä yhteydessä jotkut tuumorisolut hyväksyä amoeboid muoto liikkeen [15], [16], joka on ominaista pyöristetty, kupliminen solujen morfologia, riippumattomuus solunulkoiset proteaasit ja vaatimus korkeita Actomyosin kontraktiliteettia alavirtaan RhoA-ROCK väylän muotoaan soluväliaineen ja ajaa solun liikkumista [17], [18], [19], [20]. Tutkimukset käyttäen Elintensisäistä mikroskopia ovat osoittaneet, että amoeboid liikkeen tuumorisolujen voi olla hyvin nopeaa in vivo (-5 um /min [21]). Toisaalta mesenkymaaliset-tyyppinen liike on ominaista pitkänomainen morfologia, jotka johtuvat Rac1 riippuva Actin kokoonpanon kärjessä. Nämä kaksi tilaa liikkua ovat keskenään muutettavia ja kasvaimen solut voivat läpikäydä amoeboid-mesenkymaalisten ja mesenkymaalisten-amoeboid siirtymät [15], [18], [20], jotka näyttävät ohjaa vihamielisyys välillä Rac1 ja RhoA signalointireitteihin. Löytö ROCK-säänneltyjen Rac1 GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP) auttoi ymmärtämään, miten RhoA /ROCK-reitin voi estää Rac1 välittämää Actin polymerointi [14], [22], [23]. Joka tapauksessa, tämä plastisuus voi sallia solujen mukauttaa tila siirtymisen aikana eri ympäristöissä, ja siksi se voi olla hyödyllistä kasvainsoluihin.

Lisäksi tiukka ajallisesti ja sääntelyn eri Rho GTPaasit, myös toimintaa niiden tuotantoketjun kumppaneiden on tarkasti valvottua. Todellakin, Rho GTPaasi vaikutukset solujen käyttäytymistä voidaan moduloida myös kautta erityistä vuorovaikutusta sääntelyviranomaisten (esim guaniininukleotidiä vaihto tekijät, GEFs) säännellä ilmeisesti ristiriidassa prosesseja. Esimerkiksi DOCK10, joka on Cdc42 GEF, on keskeinen toimija amoeboid maahanmuuton kautta DOCK10-Cdc42-PAK2 signalointireitin. Vastaavasti ilmaus aktivoitua Cdc42 indusoi mesenkymaalisten-amoeboid siirtyminen. Kuitenkin esto Cdc42 johtaa menetys mesenkymaalisten morfologia, mikä viittaa siihen, että Cdc42 on rooli myös mesenkymaalisten-tyyppinen morfologia läpi erilaisia ​​reittejä, jotka voisivat sotkea muut GEFs [24]. Lisäksi kaksiulotteisen kulttuuri malleja, RhoA aktivoituu ei ainoastaan ​​supistuvien häntä, mutta myös kärjessä. Todellakin, RhoA aktiivisuus on edelleen korkea, kalvo röyhelöt orastavan lamellipodioihin [25]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että RhoA on sekaantunut säätelyyn Rac1 riippuvaisten kalvo ruffling. Todellakin, RhoA yhteistyötä Rac1 aiheuttamaan kalvoon röyhelöt kautta rekrytointi erityisten efek- mDia. Yhdessä nämä tiedot osoittavat selvästi, että ylikuuluminen näiden Rho GTPaasit sulkee pois oletusta, että kukin niistä on vastuussa vain yksi tila muuttoliikettä.

Rho GTPaasit säädellä myös aktiinisytoskeletonver- organisaatio ja soluadheesion. E-kadheriinin, yksiaukkoiseksi transmembraaninen glykoproteiini, vahvistetaan homofiilisiä vuorovaikutuksia viereisen E-kadheriinimolekyylien joka ilmaistaan ​​naapurisolujen, jolloin muodostuu ydin epiteelin vyöliitos [26], [27]. Kautta sytoplasminen domeeni, E-kadheriinin assosioi useita proteiineja, mukaan lukien kolme Catenins (alfa-, beeta-, ja p120), joka yhdistää E-kadheriinin, että Aktiinisytoskeletonin. E-kadheriinin-kateniinin monimutkainen ja taustalla Aktiinisytoskeletonin tehdään useita uudelleenjärjestelyjä, jotka ohjataan Rho GTPaasit Rac1 ja RhoA ja että tulos laajentamiseen ja loppuun solu- soluadheesiota. Kun otetaan huomioon sen rooli ylläpitää vyöliitos ja sen kapea yhteys Rho GTPaasit, E-kadheriinin menetys saattaa edistää etäpesäke mahdollistamalla ensimmäisessä vaiheessa metastaattinen cascade: menetys solu-solu kontakteja. Todellakin, väheni E-kadheriinin ilmentymisen on liittynyt kasvain invasiivisuus, metastaattisen levittäminen ja huono kliininen ennuste [28], [29], [30].

Siksi Rho GTPaasit näyttävät houkutteleva tavoitteet syöpähoitoa . Useat strategiat on kehitetty torjumaan Rho GTPaasina signalointi vapauttamisen aikana tuumorigeneesiprosessin kuten suora kohdentaminen Rho GTPaasi toimintaa [31], [32], tai esto alavirran -efektiboksejamme kuten ROCK, lupaavia tuloksia ehkäisyssä invaasiokyvyn

in vivo

[33]. Vaihtoehtoinen strategia koostuu kohdistaminen säätelijöitä Rho GTPaasi aktiivisessa tilassa, kuten GEFs, aukkoja ja guaniininukleotidiä dissosiaation estäjät (GDIs) [32] [34]. Vaikka Rho GTPaasina estäjiä ei ole vielä laajalti hyväksytty kliiniseen käyttöön, niiden mahdollisesti arvoa syöpälääkkeiden ajaa edelleen huomattavia lääketutkimusta ja [35]. Kuitenkin ylikuuluminen välillä Rho GTPaasit ja niiden toiminnan kaksijakoisuus, joka on keskeinen piirre niiden sääntelyä, ei ole koskaan pidetty näiden kohdistusstrategioihin.

Tässä tutkimuksessa ensin verrattiin invasiivisuus kokoelma kolorektaalisyövän solulinjojen kanssa RhoA, Rac1 ja Cdc42 toimintaa. Me raportoimme että korkea invasiivisia potentiaali paksusuolisyövän solujen kohonnut kupliminen aktiivisuus korreloi sekä lisääntynyt ROCK aktivointi- ja laski Cdc42 ja Rac1 toimintaa. Yhdistetty hoito PDGF palauttaa Cdc42 ja Rac1 toiminta ja Y27632 estävän ROCK synergistisesti vähensi invasiivisia potentiaalia tällaisten kolorektaalisyövän soluissa. Tämä tarjoaa uusia oivalluksia kehittämistä syöpälääkkeiden jotka voivat yhdistää samanaikaisesti estämällä ROCK ja uudelleen aktivointi Cdc42 ja Rac1 toimia sekä erityisiä ja yhteisiä polkuja.

Tulokset

taso aktiivinen Cdc42 ja Rac1, mutta eivät RhoA, on vähentynyt erittäin invasiivisia peräsuolen solulinjoissa

Siirtyminen erittäin liikkuvia fenotyyppi on ominaista kohdunkaulan syöpä solujen ja osoitus siitä, että kasvain voi etäispesäkkeitä. Luokittelemaan invasiivisia potentiaali, vertasimme kykyä kokoelma paksusuolisyövän solulinjojen hyökätä Matrigel, tri-ulotteinen matriisi, joka muistuttaa tyvikalvon ja jäljittelee monimutkainen solun ulkopuolelle monissa kudoksissa. Meillä on siis arvioinut invasiivisuus kahden normaalin paksusuolen solulinjojen (FHC ja CoN), ja HCT-116 koolonkarsinoomasolulinja, ja Caco2, LS174T, SW480, HT29 ja WiDr solulinjat, jotka olivat peräisin peräsuolen adenokarsinoomia ja neljän solun linjat (LoVo, SKCo1, SW620 ja Colo205) perustetaan metastaasien paksusuolen adenokarsinooma. Neljä solulinjat myönnetty metastaasien, osoitti suurinta kykyä hyökätä Matrigel, mikä osoittaa, että nämä solut ovat säilyttäneet kykynsä hyökätä, vaikka he saavuttivat toiseen paikkaan (kuva 1a).

(a) tulokset Matrigel invaasiomääritys eri koolonsyöpäsolulinjoissa. Solut, jotka olivat tunkeutuneet kautta Matrigel havaittiin alapuolelle suodattimen fluoresenssin ja laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (B) Solut hajotettiin ja taso GTP: hen sitoutuneen Cdc42 mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Cdc42-GTP saostetaan GST-PAK1 ja koko Cdc42 lysaateissa havaittiin immunoblottauksella anti-Cdc42 vasta-aine. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (C) Solut hajotettiin ja taso GTP: hen sitoutuneen Rac1 mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Rac1-GTP saostettiin GST-PAK1 ja yhteensä Rac1 lysaateissa havaittiin immunoblottauksella anti-Rac1 vasta-aine. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (D) Solut hajotettiin ja taso GTP: hen sitoutuneen RhoA mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. RhoA-GTP saostetaan GST-RBD ja koko RhoA in lysaatit määritettiin immunoblottauksella anti-RhoA vasta-aine. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkkeja) vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

sitten arvioi invasiivisuus ja vaikuttavien aineiden pitoisuus Rho GTPaasit, jotka ovat keskeisiä komponentteja invasiivisia koneen, korreloivat vertaamalla tasoa GTP-sitoutuneen Cdc42, Rac1 ja RhoA eri paksusuolen syövän solulinjoista. Huomattava lasku aktiivista Cdc42 ja Rac1 havaittiin kaikkein invasiivisia peräsuolen syöpä solulinjoja (kuva 1b ja 1c). Toisaalta taso GTP-sitoutuneen RhoA ei korreloi solujen invasiivisuus. Erityisesti voimakas RhoA aktiivisuus havaittiin HCT-116-solut, jotka oli ominaista alhainen kyky hyökätä Matrigel (kuvio 1 d). Vaihtelut tason aktiivisen GTPaaseja eri solulinjoissa eivät johtuneet eroa niiden proteiinien ilmentyminen kuin tämä oli lähes sama kaikissa solulinjoissa (ei kuvassa). Olemme päätellä, että testattu peräsuolen syövän solulinjat, vaikuttavien aineiden pitoisuus Cdc42 ja Rac1, mutta eivät RhoA, korreloi käänteisesti invasiivisuus tällaisten solujen (vastaavista

p-arvot

: 0,0008, 0,0003 ja 0,134 ).

Cofilin fosforylaatio lisääntyy invasiivisuus eri peräsuolen syövän solulinjoissa

havainto, että RhoA aktiivisuutta ei liittyvät invasiivisuus eri koolonsyöpäsolulinjaa ei ole samaa mieltä usein osallistuminen RhoA väylän kasvainsolun invaasiota, erityisesti aktivointi sen efek- kinaasin ROCK. Meillä on siis testanneet hypoteesia, että näissä solulinjoissa, taso ROCK aktivointi ei ehkä peili tasoa GTP-sidottu RhoA. Tätä varten arvioimme ROCK aktivaatio tutkittu peräsuolen syövän solulinjoissa mittaamalla fosforylaation tilan ROCK alustan Cofilin, joka ohjaa muodostumista suuntautunut Actomyosin II nippujen solussa kehon [36]. Fosforyloitua Cofilin havaittiin immunoblottauksella spesifisen anti-fosforyloitu Cofilin vasta-aineita ja sen ekspressio oli normalisoitu koko Cofilin (kuvio 2a). Cofilin oli heikosti fosforyloitu normaalissa koolonsolulinjassa CoN sekä huonosti invasiivisia HCT-116 ja SW480 solulinjoja verrattuna pisimmälle invasiivisia solulinjat LoVo, SW620, Colo205 ja SKCo-1, jossa fosforyloitiin Cofilin oli hyvin runsas. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikuttavien aineiden pitoisuus ROCK, mutta ei aktiivista RhoA, liittyy paksusuolen syöpäsolu invasiivisuus.

Solut hajotettiin ja määrää fosforyloidun Cofilin ja koko Cofilin läsnä lysaatit analysoitiin immunoblottauksella. (A) edustaja immunoblot. (B) kvantifiointi Cofilin fosforylaation. Histogrammit edustavat suhteet fosfo-Cofilin signaalin koko Cofilin signaalia. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkkeja) kolmen itsenäisen kokeen.

Yhdistetty palauttaminen Cdc42 ja Rac1 toiminnan estymisestä ROCK lasku solun kupliminen ja aiheuttaa soluelongaatiota

ROCK riippuva Actomyosin contractility on kriittinen solujen morfologia. Korkea ROCK toiminta voi myös aiheuttaa dynaamisia kalvo kupliminen. Voit tarkistaa, onko ROCK aktivointi eri peräsuolen solulinjoissa korreloi solujen morfologia, me seurataan solujen avulla ero häiriöitä kontrasti nopeutus mikroskoopilla. Kun taas HCT-116 ja SW480-solut säilytetään joitakin epiteelin ominaisuuksia (pitkänomainen muoto, solu-solu koskettimet), SW620 solut pallomaisia ​​ja näytteillä voimakas oheislaitteiden kupliminen aktiivisuutta (kuvio 3a, ylempi paneeli: stillkuvia videoista S1, S2, S3, S4, S5, ja S6), kanssa koholla Actomyosin contractility johtuen niiden paljon suurempi ROCK aktiivisuus verrattuna kahteen muuhun solulinjoista (katso kuva 2b). Sen testaamiseksi, havaittu lasku Cdc42 ja Rac1 ja kasvu ROCK aktiivisuuden molemmat mukana kasvaimen etenemisessä edenneessä vaiheessa, käsittelimme nämä kolme koolonsyöpäsolulinjaa PDGF aktivoida uudelleen Cdc42 ja Rac1 ja /tai Y27632 to block ROCK. Yhdistetty PDGF ja Y27632 hoito johti hankinnan entistä epiteelin ilmiasuun pitkänomainen soluja, etenkin SW620 solulinjassa (kuvio 3a, alempi paneeli). Todellakin, nämä solut, jotka olivat pyöreä ja kohonnut kalvo kupliminen alussa yhdistetyn hoidon lopetti kupliminen ja litistetty ulos (kuva 3b ja video S7). Kvantifiointi määrä pitkänomaisia ​​solujen jälkeen erilaisia ​​hoitoja selvästi osoittanut, että yhdistetty palauttaminen Cdc42 ja Rac1 toimintaa ja estämällä ROCK oli additiivinen vaikutus (kuvio 3c). Seurata PDGF-riippuvaisen aktivaation Cdc42 ja Rac1 kolmen solulinjoissa, mittasimme taso GTP: hen sitoutuneen Cdc42 ja Rac1 (kuvio 3d ja e). PDGF ei suurta vaikutusta määrään GTP-sitoutuneen Cdc42 ja Rac1 HCT-116 ja SW480-soluissa, kun taas se on selvästi lisääntynyt sitä SW620-soluissa. Lisäksi meillä on myös tarkastettava Y27632 vaikutusta myosiinikevytketjua 2 (MLC2) fosforylaatio, koska lukeman ROCK riippuvaisten supistumiskykyä ja totesi, että fosforyloitu MLC2 aleni Y27632 käsiteltyjen SW620-soluissa (kuvio 3f). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmähoito PDGF ja Y27632 palauttaa Cdc42 ja Rac1 toimintaa ja estävät ROCK voi muuntaa invasiivisia, kupliminen SW620 solut entistä epiteelin fenotyypin.

(a) Still DIC nopeutus kuvia solut, joita käsiteltiin tai ei (kontrolli) ja PDGF ja Y27632 (videoita S1, S2, S3, S4, S5, ja S6). Kehykset osoittavat muutoksen morfologiassa (pyöreästä hieman pitkänomainen muoto) solujen alussa elokuvia. Mittaviivat 10 pm. (B) DIC nopeutus kuvia SW620-solujen ennen ja jälkeen hoidon PDGF + Y27632 (videosta S7). Kehykset osoittavat muutoksen solun morfologiassa ilmoitettuina aikoina. Mittaviivat 10 pm. (B) kvantifiointi soluelongaatiota. Solu pidettiin pitkänomainen, kun sen suurin mitta oli kaksinkertainen lyhin ja kun se näytti ainakin yksi uloke [23]. Histogrammit edustavat prosenttiosuutta pitkänomainen SW620-solujen käsittelyn jälkeen vai ei (kontrolli) ja PDGF ja /tai Y27632 24 tuntia. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) kolmen itsenäisen kokeen ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (D) Cdc42 aktiivisuus määritettiin seuraavien hoitoon tai ei (kontrolli) ja PDGF: ssa 24 tuntia, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkkeja) neljän itsenäisen kokeen ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta t-testiä. * P 0,05. (E) Rac1 aktiivisuus määritettiin seuraavien hoitoon tai ei (kontrolli) ja PDGF: ssa 24 tuntia, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkkeja) neljän itsenäisen kokeen ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta t-testiä. * P 0,05. (F) SW620-soluja hajotettiin ja määrä fosforyloitu myosiinin kevytketju 2 (MLC2) ja koko MLC2 läsnä lysaateissa määritettiin immunoblottauksella eri ajankohtina (0-30 minuuttia), hoidon jälkeen 10 uM Y27632. Näkyy on edustava immunoblottaus.

Yhdistetty palauttaminen Cdc42 ja Rac1 aktiivisuus ja esto ROCK uudelleen lokalisoida E-kadheriinin solun liittymissä

Kun yhdistettynä hoidon PDGF ja Y27632, SW620-soluissa näytti olevan palauttaa vyöliitos (kuva 3a). Sen selventämiseksi Tässä vaiheessa meidän arvioi ilmaus E-kadheriinin immuno-värjäyksellä ohjaus ja käsiteltyjen solujen (kuvio 4a). Kun taas lähes muutoksia E-kadheriinin ilmentymisen havaittiin HCT-116 ja SW480-solujen, voimakas E-kadheriinin värjäytyminen SW620-soluissa selvästi, että solu-solu kontakteja solmittiin uudelleen käsittelyn jälkeen PDGF ja Y27632. Kvantifiointi vyöliitos in SW620-soluissa vahvisti synergistinen vaikutus PDGF ja Y27632.

(a) edustaja E-kadheriinin värjäytyminen paksusuolen syövän soluissa, joita käsiteltiin tai ei (kontrolli) ja PDGF ja Y27632 24 tuntia. Mittaviivat 10 pm. (B) kvantifiointi E-kadheriinin liittymissä. Me sijoitettiin positiivisia jokainen solu osoittaa ainakin yhden E-kadheriinin risteykseen yhden tai useamman naapurisolujen. Histogrammit edustavat prosenttiosuutta SW620 paksusuolen syövän soluja E-kadheriinin liittymissä käsittelyn jälkeen on tai ei ole PDGF ja /tai Y27632 24 tuntia. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) kolmen itsenäisen kokeen ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

yhdistettyyn palauttaminen Cdc42 ja Rac1 aktiivisuus ja esto ROCK heikentää SW620 invasiivisia ominaisuuksia

Koska yhdistettynä PDGF ja Y27632 hoito johti uudelleen perustamista vyöliitos invasiivisessa SW620-solulinja, me sitten testataan suoraan vaikutus PDGF ja Y27632 käsittely invasiivisuus näiden solujen matrigeeliin hyökkäystä määrityksissä. Jälleen kerran, yhdistys PDGF ja Y27632 oli tehokkaampi kuin yksittäinen hoidot estävät invasiivisia ominaisuuksia SW620-solujen (kuvio 5). PDGF ja Y27632 ollut lähes mitään vaikutusta HCT-116 ja SW480 invasiivisuus (tuloksia ei ole esitetty). Kaikkiaan meidän tietojen mukaan invasiivisia käyttäytyminen metastaattisen koolonisyöpäsolulinja SW620 voidaan dramaattisesti heikentynyt jonka käyttö yhdessä PDGF ja Y27632 joka johtaa amoeboid epiteeli- siirtyminen ja uudelleen perustaminen E-kadheriinin riippuva vyöliitos.

invasiivisuuden SW620 paksusuolen syövän soluja hoidon vai ei (kontrolli) ja PDGF ja /tai Y27632 kvantitoitiin käyttäen Matrigel invaasion määrityksiä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja +/- SD (virhepalkit) vähintään kolmen itsenäisen kokeen ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, ns ei-merkitsevä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollinen suhde invasiivisuus ja aktiivisuuden taso tärkeimmistä Rho GTPaasit kokoelmaan paksusuolisyövän solulinjoja. Osoitamme, että kyky hyökätä näiden peräsuolen syöpä solulinjoja korreloi vähentyneen merkittävästi Cdc42 ja Rac1 toimintaa ja lisätä ROCK, mutta ei RhoA, aktiivisuutta. Koska tämä molekyyli fenotyyppi liittyi pyöreä, kupliminen solumorfologiaan me sitten kysytään normaalin epiteelin morfologia voidaan palauttaa estämällä ROCK kanssa Y27632 ja aktivoiminen Cdc42 ja Rac1 PDGF. Itse asiassa invasiivisia SW620-solulinja, yhdistetty hoito PDGF ja Y27632 pidätetty kupliminen ja solujen hankki litistetty ja levitä morfologia. Näissä olosuhteissa vyöliitos myös palautettu osoitetaan uudelleen ulkonäkö E-kadheriinin ilmentymisen solu-solu kontakteja. Tämä morfologiset muuntaminen liittyi voimakas väheneminen niiden kyky tunkeutua läpi Matrigel. On erittäin mahdollista, että nämä ominaisuudet (solu-solu kontaktit /morfologia ja hyökkäys) liittyvät suoraan.

tiedot osoittavat, että vahva lasku Cdc42 ja Rac1 aktiivisuus selvästi liittyy lisääntynyt paksusuolen syövän invasiivisuus. Nämä havainnot vahvistavat, jotka saatiin muissa epiteelisolujen linjat. Madin Darby koiran munuaissolut (MDCK) epiteelisolujen aktivoitumisen Cdc42 ja Rac1 on liitetty muodostumiseen vyöliitos [37]. Lisäksi konstitutiivisesti aktivoitua muodot Cdc42 ja Rac1 voi estää hepatosyyttikasvutekijä (HGF) aiheuttaman solu- hajonta lisäämällä E-kadheriinin välittämiä solun-soluadheesiota [37]. Tuloksemme ulottaa nämä havainnot ihmisen koolonkarsinoomasoluja. Erityisesti kun palauttaminen tasojen GTP-sitoutuneen Cdc42 ja Rac1 PDGF hoito, SW620 solujen kupliminen aktiivisuus voimakkaasti poistetaan ja solut hajotetaan muodostumista filopodia ja lamelleja. Lisäksi voimme vahvistaa, että ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen Cdc42 tai Rac1 estää SW620 invasiivisia ominaisuuksia (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi PDGF myös suosivat E-cadherin- riippuvainen uudelleen perustamiseksi vyöliitos. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivaatio Rac1 tuloksia E-kadheriinin välittämiä solun-soluadheesiota ja myöhemmin estämällä muuttoliike ja invaasion epiteelisolujen [38] [39] [40] [41]. Päinvastoin, maksan kasvaimet, PDGF on mukana ylläpitoon EMT [42]. Lisäksi Cdc42 ja Rac1 voi olla keskeinen rooli solujen maahanmuuton ja invaasion muodostamalla filopodia ja lamellipodioihin. Tällöin valvonta solu-solu kosketuksiin ylläpitää solujen yhtenäisenä epiteelin ja säätelyyn solujen siirtymisen suosii hyökkäystä voidaan pitää kaksi antagonistiset vaikutukset Cdc42 ja Rac1 kasvaimen etenemiseen. Tutkimuksessamme PDGF käsittely palauttaa E-kadheriinin riippuvainen solu-solu-kontaktien, mutta se ei riitä estämään hyökkäyksen kun niitä käytetään yksin. Todellakin, PDGF tarpeen yhdistää ROCK esto näyttää vahva, additiivinen vaikutus invasiivisuus. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että jokainen polku näyttää riippumattomat toiminnot ja että esto invaasio voisi harkita tehokkaan manipuloinnin molempien reittien. Nämä havainnot liittyvät amoeboid tila kulkeutumista SW620 solulinjan käytettiin tässä tutkimuksessa. Koska syöpäsolut voivat hyökätä eri liikennemuotojen muuttoliikkeen, emme tiedä, onko tämä modu strategiaa voitaisiin soveltaa muunlaisiin syöpäsoluinvaasiota.

ROCK lisäksi keskeisessä asemassa RhoA riippuvaisen eston Rac1 [22], [23], [43], [44], [45]. Viimeaikaiset edistysaskeleet ovat tunnistaneet FilGAP, joka on filamiini sitovan proteiinin jolla kanssa Rac1-pyrkien Rho GTPaasi aktivoivaa toimintoa, jota pidetään ratkaisevana välittäjänä ROCK inhiboivan vaikutuksen Rac1. Seuraavat fosforylaatiota Rock, The RacGAP aktiivisuus FilGAP stimuloidaan, ja sen seurauksena, FilGAP indusoi rakkulan muodostumista ja estää solujen leviämisen ja johtavien muodostumiseen, jotka ovat ominaisuuksia Rac1 aktiivisuuden inhibition [22]. Lisäksi ROCK signalointi aktivoi myös ARHGAP22 (toinen RacGAP), joka puolestaan ​​estää Rac1 aktivointi välttää suppressio kupliminen riippuvan (amoeboid?) Liikkeen [23]. Kuitenkin, RhoA voi myös välittää Rac1 aktivaatio ja myöhempi lamellipodioihin muodostuminen rekrytointi mDia, joka liittyy kalvon ruffles [43], [46]. Koska tämä kaksoisrooli, puuttuminen korrelaatio RhoA aktivaation ja solun invaasiota me raportoimme tässä ei ole yllättävää. ROCK aktiivisuus on todennäköisesti liittyä invasiivisuus, kun taas vaikutus RhoA värähtelee välillä mDia ja ROCK aktivointi, riippuen solutyypistä. Näin ollen, vaikutukset C3 -eksoentsyymi, joka on Rho-inhibiittori, ja Y27632, ROCK-inhibiittori, ovat hyvin erilaisia. In LPA stimuloimaa Swiss 3T3-soluja, Y27632, mutta ei C3, hoito lisäsi Rac1 toimintaa ja indusoi kalvon ruffle muodostumisen [43].

Lopuksi yksi tärkeimmistä havainnoista tutkimuksessamme on että ROCK, mutta ei RhoA , toiminta liittyy invasiivisuus meidän kokoelma koolonsyöpäsolulinjaa. Tämä herättää kysymyksen signalointireitin (t), joka selektiivisesti aktivoi ROCK on enemmän invasiivisia solulinjat. Voimme spekuloida, että muut ROCK aktivaattoreita saattaa lievittää RhoA toimintaa sen puuttuessa. Esimerkiksi RhoC, joka pääasiassa edistää invasiivisuus [47], [48], [49], [50], [51], stimuloi ja on vuorovaikutuksessa ROCK voimakkaammin kuin RhoA [52]. Tästä samaa mieltä, RhoC ilmaisun ja aktivointi samaan aikaan EMT paksusuolen syövän solut, jotka liittyy lisääntynyt aggressiivisuus aikana tuumorigeneesin [53]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Rho GTPaasit voivat toimia kompensoiva, mutta erillinen, tavalla [54]. Kuitenkin tietämystä osallistumisesta Rho GTPaasit syövässä invaasio on voimakkaasti riippuvainen yli-ilmentyminen konstitutiivisesti aktivoitua muotoja. Tämä saattaa häiritä luonnollisen tasapainon Rho GTPaasina sääntelyviranomaisten sekä -efektiboksejamme. Esimerkiksi solujen altistaminen korkeille aktiivisten RhoA tulisi suosia signalointi kautta ROCK, kun taas alhainen RhoA edistää signalointi mDia [52]. Näin ollen, yli-ilmentymistä konstitutiivisesti aktivoitu muoto RhoA edistää ROCK-riippuvainen invasiivisuus ja voi peittää mDia antagonistinen kautta. Lisäksi kertynyt näyttö osoittaa, että GTPaasi signalointi lopputulos riippuu paitsi -efektiboksejamme vaan myös GEFs joka ajaa GTPaaseja ja efektorien lähellä, luoda mikro-alueilla paikallisesti korkeita efektorien [55] [56] . Tämän seurauksena, RhoA aktiivisuus ei voi täysin selittää ROCK aktivointia. Lisäksi raakaöljyn RhoA aktiivisuus voi olla ei täysin ohjeellisia joista signalointireitin (ts GEFs ja niihin liittyvät effektorit) päällä.

Yhteenvetona työmme tarjoaa tärkeää tietoa siitä, miten Rho GTPaasit aktivoinnin vaikutuksia peräsuolen kasvain etenemisen ja täsmällisemmin invasiivisuus on kupliminen peräsuolen solujen. Keskeinen havainto on vuorovaikutus ROCK ja Cdc42 ja Rac1 toimintaa. Nämä signalointipolkujen on päinvastainen vaikutus hyökkäystä ja niiden vaihtelut ovat osittain keskenään toisiinsa, vaikka tietomme viittaavat myös siihen, että on olemassa itsenäinen luontainen maksuja. Tämä olisi tärkeää seuraukset strategioita uusien syöpälääkkeiden. Keskitytään vain yleistä koholla ekspressiotasot Rho GTPaasit syövän saattaa johtaa hoidon haittoja, jos niiden vastakkaisia ​​vaikutuksia ei ole otettu huomioon. Todellakin, suunnittelu erittäin selektiivinen Rho GTPaasina signalointi modulaattorit ja yhdistämällä niiden vaikutukset saattavat tarjota parempia terapeuttisia mahdollisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

normaali paksusuoli solulinjat FHC Con ja peräsuolen syövän solulinjoissa HCT116, Caco2, LS174T, SW480, HT29, WiDr, LoVo, SKCo1, SW620 ja Colo205 ostettiin ATCC ja viljeltiin suositellaan. Soluja käsiteltiin 40 ng /ml PDGF-BB: tä (Upstate) ja 10 uM Y27632 (Calbiochem). Proteiini lysaatit saatiin sonikoimalla käsiteltyjen solujen 2 x Laemmli-puskuria.