Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska alhainen hoitovasteen 10-47% kohdennettujen syöpähoitojen, on kasvava tarve ennakoivaa biomarkkereita. Meidän tavoitteena oli tunnistaa geenien ennustamisessa vastauksena viisi jo hyväksytyn tyrosiinikinaasiestäjiksi. Testasimme 45 syöpäsolun linjat herkkyys sunitinibille, erlotinibi, lapatinibi sorafenibi ja gefitinibi kliinisesti annoksista. Vastus matriisi määritettiin, ja geeniekspressioprofiilien n osajoukkojen resistenttien vs. herkkiä solulinjoja vertailtiin. Kolmena kappaleena geenien ilmentyminen allekirjoitukset saatiin caArray projektin. Merkitys analyysi mikrosiruja ja sijoitus tuotteita sovellettiin ominaisuuksien hallintaan. Yhdeksänkymmentäviisi geenien mitattiin myös RT-PCR: llä. Mikäli neljän sunitinibin vastus liittyvät geenit, tulokset validoitu kliinisissä näytteissä immunohistokemiallisesti. Luettelo 63 top liittyvien geenien vastustusta viiden tyrosiinikinaasiestäjiksi tunnistettiin. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi vahvisti 45 63 geenien tunnistaa mikrosiruanalyysillä. Vain kaksi geeniä (

ANXA3

ja

RAB25

) liittyi herkkyyden vastaan ​​yli kolme estäjiä. Immuunihistokemialliset analyysi sunitinibin saaneista metastasoitunut munuaiskarsinoomia vahvisti korrelaatio RAB17, LGALS8 ja EPCAM ja kokonaiselossaolo. Yhteenvetona määritetty ennustavan biomarkkereita viisi tyrosiinikinaasin estäjät, ja validoitu sunitinibille vastus biomarkkereita immunohistokemiallisesti itsenäisessä potilaan kohortin.

Citation: Pénzváltó Z, Tegze B, Szász AM, Sztupinszki Z, Liko I, Szendrői A, et al. (2013) tunnistaminen resistenssimekanismeja vastaan ​​Viisi tyrosiinikinaasiestäjiksi kohdistaminen ErB /RAS Pathway 45 Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e59503. doi: 10,1371 /journal.pone.0059503

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Saksa

vastaanotettu: 21 elokuu 2012; Hyväksytty: 15 helmikuu 2013; Julkaistu: 29 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Pénzváltó et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat OTKA PD 83154, jonka Veikkaa hanke (myönnä. 259303 on Health.2010.2.4.1.-8 call), jonka TAMOP-4.2.1.B-09/1 /KMR-2010-0001 ja jonka Alexander von Humboldt Stiftung. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kuuluminen tohtori István LIKO kanssa Richter Gedeon ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kohdennettu terapian syövän hoitoon viittaa soveltamiseen erityisen toimivat edustajat molekyylimerkkejä ominaisuuksista signaalitransduktioreaktioteiden mukana kehittämässä syöpä fenotyyppi. Erlotinibin, gefitinibi, sorafenibia sunitinibi ja lapatinibi kaikki kliinisesti käytetään tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) kohdistaminen reseptoreihin ja loppupään jäsenten erbB /RAS-reitin [1]. Erlotinibin: n ja gefitinibin ovat palautuvia epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) tyrosiini- kinaasi-inhibiittorit, joita käytetään hoidettaessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Noin 10% potilaista reagoi hoitoon Euroopan ja Pohjois-Amerikan väestöstä [2]. Lapatinib estää tyrosiinikinaasidomeeniin epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptoria 2 (HER2). Se on hyväksytty rintasyövän, jossa kokonaisvasteeseen tähän hoitoon on 24% [3]. Sorafenibi estää RAF, VEGFR, PDGFR, Flt-3, c-Kit-reseptoreihin. Osittainen vaste on 10%, kun sitä annetaan potilaille, joiden munuaisten-karsinooma [4]. Sunitinibi on pienimolekyylinen multi-kohdistetun Reseptorityrosiinikinaasin (RTK) estäjä, joka hyväksyttiin FDA hoitoon munuaissolukarsinooma (RCC) ja imatinibiresistenttejä ruuansulatuskanavan tukikudosten (GIST). Objektiivinen vaste on 31% ensimmäisellä hoitona munuaissolukarsinooman [5]. Koska alhainen hoitovasteen 10-47% [6] – [10], on kasvava tarve biomarkkerit ennustamisessa vaste täsmähoitoihin hoitoon.

Lisäksi farmakokineettiset parametrit, kasvain voi sijoittaa eri molekyyli- saavuttamismenetelmät vastustusta täsmähoitoihin aineet: kohdemolekyyli voidaan kohdistaa muutokseen, alavirtaan korjauksilla reitti voi johtaa vastustuskyvyn agentti kohdistaminen ylävirran molekyyli tai muu polut voidaan aktivoida mikä vaihtoehtoisesti välittävän syöpäsolun selviytymistä ja proliferaatiota. Esimerkiksi T790M mutaatio

EGFR

geeni säilyy kyky reseptorin aktivoimiseksi alavirran polku mutta samalla vähenee sitoutumisen gefitinibin ja erlotinibin reseptoriin ja siten johtaa lääkeresistenssi [11].

MET

vahvistus aiheuttaa vastustusta erlotinibin ja gefitinibin aktivoitumisen kautta vaihtoehtoisia väyliä [12]. Interleukiini-8 voi aktivoida vaihtoehtoisen reitin johtavan sunitinibille vastus [13]. Mutaatiot geeneistä loppupään jäsenten reitin voi myös edistää vastustusta täsmähoitoihin aineita, kuten aikaisemmin on kuvattu tapauksessa

KRAS

[14],

PTEN

[15],

BRAF

[16], ja

PIK3CA

[17]. Kun alavirran komponentti opastejärjestelmän aktivoi reitin, esto saarto ylävirran jäsenen osoitettiin olevan tehoton. Nämä loppupään muutokset voidaan käyttää negatiivisena ennustavat toimihenkilöiden ylävirtaan tämän riippuvuutta osa reitin, kuten on kuvattu aiemmin varten

KRAS

[18]. Jos

KRAS

satamat aktivoiva mutaatio, jotka toimivat EGFR ei ole mitään vaikutusta kasvaimen kasvuun [19].

Aikaisemmat tutkimukset ovat jo kuvattu, että käyttö geenien ilmentyminen tietojen yhdistettynä

in vitro

huumeiden herkkyys määrityksiä, voidaan käyttää kehittämään allekirjoituksia, jotka voisivat luokitella vaste tavanomaisille syöpälääkkeiden [20], [21]. Toisessa tutkimuksessa, paneeli syöpäsolulinjojen käsiteltiin dasatinibihoidon, joka on multitarget estäjä, ja herkkyys lääke mitattiin. Samanaikaisesti ilmaisu tuotetut tiedot samasta paneelista solulinjojen käytettiin kehittämään allekirjoituksen ennustaa herkkyys huumetta [22]. Toisessa tutkimuksessa, paneeli keuhkosyöpään solulinjojen avulla kehitettiin geeniekspressiota allekirjoitukset ennustaa herkkyyttä EGFR: n estäjien gefitnib [23] ja erlotinibin [24]. Lopuksi yhteinen merkittävää geenit olevan

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksessa pystyivät ennustamaan vastauksena rapamysiinin [25]. Vaikka pääasiallisesti yhtä terapeuttisia aineita yhdessä syöpätyyppi, näistä tutkimuksista jo osoittanut valtaa geeniekspressioprofiilien ennustaa vastauksena lääkeaineeseen.

Tässä olevassa tutkimuksessa, otimme laajempaa lähestymistapaa, jonka tarkoituksena on tunnistaa geeni allekirjoitukset liittyy luontainen vastustuskyky 5 jo hyväksytty tyrosiinikinaasiestäjiksi kohdistaminen erbB /RAS-reitin. Saada uusia ennustavan biomarkkereita, me korreloivat herkkyys 45 solulinjojen edustavat 15 eri syövän yhteisöjä ekspressiokuvioita. Parhaan suoritustason kandidaattigeenit sitten validoitu käyttäen qRT-PCR. Lopuksi, kliininen validointi suoritettiin käyttäen immunohistokemia perustuu kudossiruina joukkoon munuaiskarsinoomia hoidetuista potilaista sunitinibilla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Hyväksyntä numero näytekokoelmatodistuksen kansallinen tieteen ja tutkimus eettisen komitean (ETT-TUKEB) (Unkari) on # 185/2007. Yleinen tietoinen suostumus saatiin ennen leikkausta. Kansallinen tieteen ja tutkimus eettinen toimikunta ei vaatinut erityistä kirjallista lupaa, koska se oli retrospektiivinen tutkimus, ja potilaat hoidettiin anonyymisti.

Cell Culture

Saimme 45 ATCC solulinjoissa . Ennen valinnan puuttuminen

KRAS

mutaatio solulinjoissa vahvistettiin käyttäen Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (search tehty 25

th kesäkuuta 2010). Soluja viljeltiin mukaisesti ATCC-protokollia (https://www.lgcstandards-atcc.org/). Lisäksi antibiootit (penisilliini-streptomysiiniä, Invitrogen, kissa. No .: 15070-063, amfoterisiini B, Invitrogen, kissa. No .: 15290-026) lisättiin. Solulinjat on esitetty taulukossa 1. Yhteenveto tutkimuksen on esitetty kuviossa 1.

Laatikot harmaalla edustavat koulutusta vaiheet, kun taas valkoinen tausta edustaa validointivaiheet.

DNA eristäminen ja laadunvalvonta

DNA eristettiin käyttäen Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa, kissa. no .: 69506) mukaan tuotteen käyttäjän opas. Määrä ja laatu DNA testattiin käyttämällä Nanodrop 1000-järjestelmä (BCM, Houston, TX, USA). DNA (A260) ja proteiini (A280) pitoisuudet ja näytteen puhtaus (260/280 suhde) mitattiin ja vain laadukkaita DNA: ta käytettiin lisäanalyysiä. DNA säilytettiin -80 ° C: ssa.

autentikointi solulinjojen

Authentication suoritettiin solulinjojen saatu yli 4 vuotta sitten ATCC käyttämällä lyhyitä tandem-toisto (STR) analyysi 10 erityisiä loci ihmisen perimän ja hiiri markkeri. Authentication suoritettiin StemElite ID System klo fragmenttianalyysi Facility, Johns Hopkins University (Baltimore, USA). STR profiilit soveltaa solulinjojen verrattiin STR profiilin tietokantaan Leibniz Institute DSMZ – German Collection of Microorganisms ja Cell Cultures (https://www.dsmz.de). Kaikki solulinjat sisältyvät tässä tutkimuksessa olivat: kontaminaation.

Resistance Testit

Drugs käytettiin niiden kaupallisesti saatavissa muodossa, ja levitettiin soluihin 3 pitoisuuksina (C1, C2, C3 ). C1 = 0,1 * C2 ja C3 = 10 * C2. Pitoisuus C2 pääteltiin kliinisesti käytettyjen annosten (katso taulukko 2).

MTT-määrityksellä (Roche, Cat. No .: 11465007001), käytettiin testaamaan anti-proliferatiivista vaikutusta reagenssit ja solujen elinkykyä. Jokaisessa kokeessa, 2000 solua /kuoppa siirrostettiin 100 ui väliaineessa 96-kuoppaisille levyille. Yhden päivän jälkeen inkuboinnin precontrol solut värjättiin. Samaan aikaan viljelmiä käsiteltiin kaikki 5 tutkittu huumeiden C1, C2 ja C3 pitoisuuksia. Viidentenä päivänä koe lopetettiin ja solut värjättiin. Absorbanssi luettiin Thermo Scientific Multiskan® FC. Absorbanssi mitattiin 595 nm: korjattiin taustan mitattiin 690 nm: ssä. Kaikki mittaukset tehtiin kolme kertaa ja laskentaa varten vastuksen indeksin (RI) arvot, keskiarvot 3 mittauksia käytettiin. Vastus indeksi (RI) laskettiin kaavalla [26]: jossa N

pre on väliaineen absorbanssin arvo ennakointi (eli solujen lukumäärä alussa hoidon), N

viesti on keskipitkän absorbanssin arvo ohjaus (eli solujen lukumäärä lopussa hoidon ajoneuvon käsittely vain), ja N

2 on väliaineen absorbanssin arvo käsiteltyjen solujen käsitelty C2 pitoisuus tutkittiin lääkkeen. C1 ja C3 pitoisuuksia käytettiin sisäisen valvonnan valvoa dynaamisen alueen aineita. Vain solulinjoja, jotka täyttivät laatuvaatimukset N

post N

pre ja poikkeama solujen kasvua toistoja 15% oli mukana arvioinnissa.

Feature Selection

Raaka microarray tiedot solulinjat tuotettiin GSK caArray hanke (ftp://caftpd.nci.nih.gov/pub/caARRAY/transcript_profiling). caArray kehitettiin käyttäen caBIG yhteensopivuus suuntaviivojen, sekä Microarray Gene Expression Data (MGED) yhteiskunta standardit microarray data. Latauksen jälkeen raw.CEL tiedostot olivat MAS5 normalisoitu R tilastojärjestelmään (www.r-project.org) käyttäen affy Bioconductor kirjaston [27]. MAS5 rankattu paras normalisoinnin menetelmiä verrattuna tuloksiin qRT-PCR mittaukset tuoreessa tutkimuksessa [28]. Kukin solulinja mitattu mikrosiruja, jonka kolmena rinnakkaisena – viimeisessä vaiheessa ennen käsittelyn keskiarvo näistä laskettiin. Kuten koetin, joissa on hyvin vähäistä ovat paitsi tuskin pitää biologista merkitystä, mutta myös virhealtista, teimme suodatus pitää vain koetin, joissa on keskimäärin ilme yli 100 ja maksimaalinen ilmaisun yli 1000. Täydellinen normalisoitu tietokanta on esitetty Taulukko S1.

täydellinen aineisto koostuu ilmentymisen profiilien on järjestetty 2 luokkaan, mukaan kesto-ominaisuudet solulinjoista. Intermediate solulinjat ulkopuolelle. Tämä valintamenettely johti 5 aineistoja, joita käsiteltiin itsenäisinä luokitustehtävissä. Saadakseen luettelo geenien parhaiten verrannollinen vastus, käytimme merkitys analyysi mikrosirujen (SAM) [29] ja sijoitus tuotteita [30], [31]. Vaikka SAM on yleisimmin käytetty menetelmä, sijoitus Tuotteita ei löytynyt tarjota parasta suorituskykyä asettamalla samanlainen projektimme alhainen otoskoko aiemmassa yhteenveto saatavilla ominaisuus valintamenetelmien [32]. Tehokkuus geenin asettaa syrjiä resistenttien ja herkkien solulinjoissa laskettiin käyttäen Prediction Analysis mikrosirujen [33]. R tiedot käytetty tilastollinen analyysi on saatavilla täydentäviä materiaalia Script S1.

arvioimiseksi kykyä geenin-setit ennustaa selviytymisen, me etsitään PubMed GEO varten mittausmuistien saatavilla kliinistä seurantaa jossa syöpä potilaita hoidettiin yksi viidestä tutkitusta tekijöille. Lopuksi, etsiä geeni luettelot samanlainen kuin meidän geenejä ja geenien tunnistamiseen korreloi tunnistettu geenejä, käytimme CCancer hakukone [34].

RNA: n eristäminen ja laadunvalvonta

Kun homogenointi käyttäen QIAshredder, RNA eristettiin käyttäen Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan tuotteen käyttäjän opas. Määrä ja laatu eristetyn RNA testattiin käyttämällä Nanodrop 1000-järjestelmä (BCM, Houston, TX, USA) ja geelielektroforeesilla käyttäen Agilent Bioanalyzer järjestelmä (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). RNA (A260) ja proteiini (A280) pitoisuudet ja näytteen puhtaus (260/280 suhde) mitattiin. Vain korkealaatuisia, ehjä kokonais-RNA hyväksyttiin näytteille, joita osoittivat myös säännöllinen 18S ja 28S ribosomaalinen RNA mutka kuvio Bioanalyzer analyysiin. RNA pidettiin -80 ° C: ssa, kunnes RT-PCR-määrityksen.

TaqMan-määritys

TaqMan reaaliaikaista PCR: ää käytettiin mittaamaan ilmentymisen 95 valitun geenin (plus yksi siivous geeni) käyttäen Micro Fluidic kortin järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 40 solulinjoissa. Mittaukset tehtiin käyttäen ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System kuvatulla tuotteiden käyttöopas. Geenien valittu sisältämään alkuun geenit korreloivat resistenssin eri aineita. Lisäksi perustuu kirjallisuudesta, joukko geenejä korreloi täsmähoitoihin kestävyys ja jäsenet EGFR /RAS-reitin lisättiin myös ylimääräisiä analyysejä. Luettelo mukana geenien on esitetty taulukossa S2.

Data Analysis RT-PCR mittaukset

Tietojen primaarianalyysi SDS 2.2 ohjelmistoa käytettiin. Delta Ct-arvot (jotka edustavat ilmaus normalisoitu ribosomaalinen 18S lauseke) on ryhmitelty resistenssiominaisuuksien vastaan ​​eri toimijoiden ryhmiin. Sitten, Studentin t-testi suoritettiin vertaamaan geenin ekspressiota eri ryhmällä, jotka riippumattomasti. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05.

munuaissolukarsinooma (RCC) Näytteenotto

Potilaita hoidettiin osastolla urologian, Semmelweis University, Budapest, Unkari vuosina 2005 ja 2010. Näytteitä kerättiin mukaan state-of-the-art patologian protokollan kaikilta potilailta toiminut munuaissyövän syöpä. Kuitenkin vain potilaille, joilla on myöhemmin etäpesäkkeitä oli mukana olevassa tutkimuksessa, sillä vain nämä potilaat saivat kohdennetun hoidon hoito. Kaksi aineet kliinisessä käytössä metastaattisen RCC ovat sunitinibia ja sorafenibin. Näiden, sunitinibille annetaan ensimmäisellä rivillä asetus, mikä näitä potilaita valittiin immunohistokemiallisissa määrityksissä. Kudossiruina (TMA) kaikista FFPE näytteet rakennettava Tissue Micro-Array Builder väline (histopatologian Ltd., Pécs, Unkari). Vuonna TMA, kaksoiskappaleet 2 mm leveä ytimiä käytettiin kunkin kasvaimen edustaa niiden tärkeimmät alueet mukaan histopatologian.

immunohistokemia

Immuunihistokemialliset (IHC) reaktiot suoritettiin 4 mikrometriä paksu kohdat saadut TMA lohkoja. Sen jälkeen deparaffinization, diat kuumennettiin mikroaaltouunissa Target Retrieval Solution (DAKO, Carpenteria, CA, USA) 30 minuutin ajan. Automatisoitu Ventana Benchmark immunostainer järjestelmää käytettiin protokollan mukaan ”880” (ja ”870” for LGALS8) valmistajan toimittamat (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, USA). RAB17 (laimennus, 1:200), LGALS8 (1:50), EpCAM (1:100) ja CD9 (1:300) vasta-aineita käytettiin värjäystä. Kudokset vastavärjättiin Mayerin hemalaun (00-8011, Zymed Laboratories Inc.). Positiiviset kontrollit ja negatiiviset kontrollisilkkipaperia sovelletaan kaikissa IHC ajoja. Mikäli CD9, LGALS8, RAB17 sytoplasman reaktio, sillä EpCAM kalvo värjäystä hyväksyttiin oikea lokalisointi.

värjätään diat olivat digitalisoitu dia skanneri (Mirax MIDI Scan, 3DHistech Ltd., Budapest, Unkari), ja intensiteetti reaktio (0: negatiivinen reaktio, +1: heikko positiivisuus, +2: kohtalainen positiivisuus, +3: voimakas reaktio) ja tiheys positiivisesti värjättyjen solujen (0:0-1%, 1:1-5%, 2:5-10%, 3:10-20%, 4:20-33%, 5:33-50%, 6:50-66%, 7:66-80%, 8:80-100%) oli arvioidaan erikseen. Lopuksi korrelaatio 25-prosenttipiste eloonjäämisen ryhmille sekä Kaplan-Meier selviytymisen tontteja perustuu ryhmittelyä käyttämällä mediaani laskettiin vuonna WinStat Excel (R. Fitch Software, Bad Krozingen, Saksa).

Tulokset

Resistance Testit

vastus kustakin solulinjasta mitattiin kolmena rinnakkaisena kustakin kolmesta pitoisuudet viidestä aineita. Sitten solulinjoja paremmuusjärjestykseen perustuen niiden RI arvoihin. Väli- RI arvo nimettiin olemisen mediaani RI arvo +/- 10% RI alue. Solulinjat näytteille korkeampi RIS nimettiin resistenttejä, ja solulinjat, joilla on alhaisempi RIS yhtä herkkä. Kokonaiskuva erottaminen solulinjojen ryhmiin on esitetty taulukossa 1.

tunnistaminen Discriminatory Genes

luokittelusta geenit suodatettiin sisältämään vain ne, jotka saavuttivat vähintään 2-kertainen ero keskimääräisessä ilmaisua verrataan solulinjojen nimetty herkkiä tai resistenttejä. Sitten ominaisuus valinta SAM ja sijoitus tuotteita suoritettiin. Vain ne geenit hyväksyttiin merkittäviksi, joka saavutti väärä löytö korko alle 20%. Täydellinen luettelo merkittävistä geenien on esitetty taulukossa S3.

tarkkuus luokituksen jätettävissä one-out ristivalidointi ympäristössä käyttäen kaikkia geenejä solulinjoissa johti hyötysuhde 92,8% vuonna PAM (solulinjoissa, joiden välissä on vastukset suljettiin pois). Käyttö top 100 geenit tunnistetaan sijoitus tuotteita johti 79% oikein ennusteita. Oikea luokituksia käyttäen top 100 listalla tuotteita tunnistettu geenejä esitetään sinisellä ja virheellisiä luokituksia punaisella taulukossa S4.

Vaikka tutkittu aineet ovat kliinisessä käytössä jo yli 7 vuotta, olemme löytäneet julkaistu tietokokonaisuuksien sopii meta-analyysi tunnistettu geeni-set. Näin ollen meidän ei suorita

in silico

validointi ennustamiseen sekä kliinisen vasteen tai selviytymistä. Käyttäen CCancer, kaikki yhdessä 27 julkaisut, joissa limittäin geenin sarjat on tunnistettu. Nämä on esitetty taulukossa S5.

TaqMan validointi Cell Line-johdettu Gene Profiilit

TaqManq RT-PCR-tulokset on esitetty taulukossa 3. 45 63 liittyvien geenien vastus ominaisuus valinta käyttäen microarray tiedot vahvistettiin alla p 0,05 ja 23 näistä alle p 0,01. Korkeimman merkitys saavutettiin

ITGB4

(p = 0,005) ja erlotinibin-vastus liittyy, jonka

IADA

(p = 0,003) ja gefitinibin liittyvien geenien, jonka

FAT4

(p = 0,011) ja sorafenibin liittyvien geenien ja

furiinin

ja

ME1

(p = 0,011) ja lapatinib liittyvien geenien. Useita geenejä merkittävästi vahvisti, että sunitinibin-resistenssigeenin allekirjoitus mukaan lukien

KRT18

(p = 0,001),

LGALS8

(p = 0,019),

RAB17

(p = 0,002 ),

CD9

(p = 0,002) ja

PPL

(p = 0,001). Samaan aikaan, vain 7 32 geenien aikaisemmin kuvattu kirjallisuudessa, kuten resistenssiin liittyvät vastaan ​​suunnattu hoito aineita vahvistettiin. Täydellinen normalisoitu tulos TaqMan määrityksiä on saatavana Taulukko S6.

Osa geeneistä liittyi vastustuskyky useita aineita. Korkeimmat merkitys näiden saavutettiin

COL3A1

(p 0,001 tapauksessa sorafenibin-vastus),

GJA1

(p 0,001 tapauksessa sunitinibin-vastus) ja

KRT19

(p 0,001 tapauksessa sunitinibin-resistenssi). Olemme myös kuvattu geenit liittyvät vastustuskyvyn useita aineita käyttäen sirkus-plot (katso kuva 2). Tätä lähestymistapaa käyttämällä voidaan tunnistaa suuri määrä geenejä, jotka liittyvät sunitinibia vastus ja läsnäolo vain yhden geenin korreloi lapatinibille vastarintaa. Vain kaksi geeniä (

ANXA3

ja

RAB25

) korreloivat luontaisten vastustuskyvyn vähintään neljä tekijää.

Circos käyrä RT-PCR validoitu korrelaatiot geenejä, jotka liittyvät vastustuskyvyn vastaan ​​useita aineita kuten tunnistaa mikrosiruanalyysillä. Paksuus nauhat korreloivat

log (p) B korrelaation (katso taulukko 2). Huomaa suuri määrä geenejä, jotka liittyvät sunitinibia vastus ja yhden liittyvän geenin lapatinib vastarintaa. Kaksi eniten informatiivinen geenit ovat ANXA3 ja RAB25, kukin liittyy vastustuskyky neljä tekijää.

IHC-pohjainen Validation munuaiskarsinoomia

Kaikkiaan 39 sunitinibia saaneilla potilailla, joilla oli metastasoitunut munuaisten karsinooma olivat mukana tutkimuksessa. Potilas näytteet kerättiin ennen antamisen ensilinjan TKI ja ovat siten samankaltaisia ​​kuin geenien ilmentäminen solulinjoissa ilman hoitoa. Keski-ikä potilailla oli 59 vuotta, 63% potilaista oli naisia. Keskimääräinen eloonjäämisaika on 14 kuukautta ja 12/39 kuolemia. Keskimääräinen elinaika on 20 kuukautta. Osittainen metastasectomy suoritettiin tapauksessa seitsemäntoista potilailla. Edustavia kuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä kolme koodaamien proteiinien tunnistetut geenit näytetään kuviossa 3. yksityiskohtaiset tulokset kaikissa näytteissä kaikki geenit on esitetty taulukossa S7.

Tyypillisiä esimerkkejä immunhistochemical validointi CD9, EpCAM ja LGALS8. Vasen sarake: normaali munuainen, oikea sarake: valittu kasvainkudoksessa.

lisääntynyt värjäytymisen intensiteetti LGALS8 (p = 0,026) ja RAB17 (p = 0,018) ja taajuus positiivisten solujen EpCAM (p = 0,01) ja LGALS8 (p = 0,01) oli korreloi parantunut selviytymistä. Samaan aikaan, CD9 – joskin osoittaa suuntausta pienentää eloonjäämisen potilailla on lisääntynyt värjäyksen intensiteettiä (p = 0,14) – ei ollut merkittävä. Kaplan-Meier selviytymisen kuvaaja EPCAM on esitetty kuviossa 4.

Kaplan-Meier selviytymisen tontteja Sunitinibin saaneista etäpesäkkeinen RCC näytteet jaetaan kahteen ryhminä perustuen mediaani EpCAM positiivisten solujen (p = 0,01).

keskustelu

täsmähoitoihin asiamiesten kautta erbB /RAS-reitin tullut valtavirtaa syöpähoidon ohjeita. Koska kuitenkin vain 10-47%: lla potilaista reagoi näiden hoitojen, se on erittäin tärkeää tunnistaa ohjaimet ja mahdolliset markkereita resistenssin. Tutkimuksessamme käytimme 45 syöpäsolun linjat ja genominlaajuisten geeniekspression allekirjoituksia tunnistaa mahdollisia uusia luontainen biomarkkereiden geenejä. Mahdollisena kliininen käyttö Strategiamme validoitu tuotteiden resistenssiin liittyviä geenien IHC analyysi sunitinibin saaneilla munuaiskarsinoomia.

Käytimme heterogeeninen paneeli syöpäsolulinjojen peräisin keuhkojen (käytetty TKI sisältävät erlotinibin ja gefitinibin), rinta (lapatinibi), munuaisten (sorafenibi ja sunitinibin), ja maksan (sorafenibi). Solulinjoja, joiden tiedetään olevan RAS mutaatio ei oteta huomioon, koska aktivoivat ras-mutaatioiden tekemiseksi inhibition ylävirran tyrosiinikinaasien täysin tehoton, kuten on aiemmin osoitettu paksusuolen syövän [35]. Valinta solulinjojen mahdollistaa tunnistamisen vankka geenien liittyvät aiemmin tunnistamattomia riippumattomia polkuja.

Tuoreessa tutkimuksessa Barretina et ai, suuri paneeli solulinjoja tutkittiin tunnistaa merkkiaineiden herkkyys vastaan ​​joukko sytotoksisen ja kohdennetut aineet, mukaan lukien kolme tyrosiinikinaasiestäjiksi käytetty tässä tutkimuksessa (erlotinibin, lapatinibi ja sorafenibi) mittaamalla herkkyydestä IC 50 ja EC 50-arvot [36]. Lisätä kliinistä merkitystä syöpäsolun testausta, käytimme lääkeainepitoisuudet sovelletaan kliinisissä yhteyksissä, kuten odotimme löytää luotettavin ehdokas markkereita pitoisuuksina myös saavutettavissa potilailla [37], [38]. Kestävyydestä lähestymistapaa käyttämällä tällaisia ​​ennalta määriteltyjä kliinisiä pitoisuuksia tukee onnistunut validointi kliinisessä kohortin sunitinibia saaneista potilaista.

Olemme havainneet eniten ristiresistenssiä liittyvät geenit liittyvät sunitinibille-vastus. Kiinnostavaa kyllä, toistaiseksi vain muutamia geenejä ovat korreloineet sunitinibilla-resistenssi kirjallisuudessa kun taas määrä ehdokkaan geenien vastustusta muiden lääkeaineiden on paljon suurempi. Siksi olemme erityisesti keskittyneet sunitinibia kestävyys ja suoritettiin immunohistokemiallinen kokeiluja tuumorinäytteissä validoimiseksi syrjivä potentiaalia neljä uutta ehdokasta biomarkkereita,

LGALS8

,

RAB17

,

EpCAM

, ja

CD9

.

ensimmäinen kandidaattigeenifragmenttikloonien

LGALS8

koodaa jäsen galektiini perheen. Galectins on liitetty monia toimintoja, kuten kehitystä, erilaistumista, solu-solu-adheesio, solu-matriisi vuorovaikutus, kasvun säätelyssä, apoptoosin, ja RNA: n silmukoinnin. Galektiini-8 voi myös olla mukana angiogeneesiin [39], ja ilmaisu on muuttunut hypolaryngeal ja kurkunpään syövän etenemiseen [40]. Toinen geeni,

RAB17

on epiteelin soluspesifisestä GTPaasina merkittävä rooli säätelyssä kalvokuljetuksessa [41]. Kolmas geeni, epiteelisolujen adheesiomolekyyli (

EpCAM

) on kalvon proteiini, proto-onkogeenisen ominaisuuksia, jotka on ilmaistu lukuisissa syövissä ja on lupaava syöpälääke tavoite. Se toimii homotyyppisessä kalsiumista riippumaton solun adheesiomolekyyli. Vapauttamista solunsisäisen domeenin molekyylin johtaa aktivoinnin WNT reitin [42]. Korkea ilmaus

EpCAM

liittyy huonoon ennusteeseen sappirakon syöpä [43]. Lopuksi

CD9

on rooli monissa solun prosesseissa kuten erilaistuminen, adheesio, signaalitransduktion, kasvua ja tukahduttaminen syövän solun liikkuvuus ja etäpesäke. Miyake

et al

osoitti, että potilailla, joilla on invasiivisia ductal karsinoomia vähentynyt ilmentyminen

CD9

proteiini liittyy huonoon ennusteeseen [44]. IHC värjäys Tulokset vahvistivat korrelaatiot

LGALS8, RAB17

ja

EpCAM

ja eloonjäämisen munuaissyöpäpotilailla sunitinibilla hoidetuilla, kun taas CD9 ei päässyt merkittäviä syrjivä potentiaali.

mukaan Tutkimuksemme tuloksia näiden geenien voisi edustaa uutta ehdokkaita tunnistamaan potilaat, jotka voivat hyötyä sunitinibin hoitoa. Vaikka immunohistokemiallista analyysiä validoitu 3 4 biomerkkiaineen ehdokkaita, suurempi kliininen tutkimus tarvitaan tiukasti arvioida voima ja vahvistavat kliinistä merkitystä.

Viime vuosikymmenellä, onkogeenin riippuvuus on tunnustettu yhdeksi avaintekijöitä syövän kehittyminen, joka voi myös merkitä reittejä ja geenit kohdennettujen hoitomuotojen [45]. Kuitenkin johtuen mukauttaminen syöpäsolujen, huumeriippuvuus johtuvat intensiivinen hoito voi voittaa onkogeeni riippuvuus kuten on äskettäin osoitettu keuhkosyövän solulinjoissa [46]. Ymmärtää näitä prosesseja, tunnistaminen geenit, joilla on yhteinen funktionaalinen rooli vastustusta useita täsmähoitoihin aineita, on korkea prioriteetti.

Huolimatta samanlainen vaikutusmekanismi, ei geeni tunnistettiin korreloivan herkkyys vastaan ​​kaikki viisi agentit tutkimuksessamme. Kaksi geeniä,

ANXA3

ja

RAB25

liittyivät neljään huumeita.

anneksiini 3

(ANXA3) on rooli solun kasvuun ja signaalitransduktion [47], ja on aiemmin liitetty platinaa vastus munasarjasyöpä [48]. Tuote on

ANXA3

geeni tunnistettiin myös yhtenä tyrosiini- fosforylaatiota tavoitteita EGFR immunosaostuksella ja western blotting [49].

ANXA3

määriteltiin yhdeksi neljästä alas geenien mukana eturauhassyövän etenemisen tuoreessa tutkimuksessa, jossa verrattiin EGFR mutatoitunut ja mutatoimattomaan kasvaimia [50]. Tuloksemme merkitse mahdollisuutta osallistumisen

ANXA3

vakuustoimissa väyliä mahdollistaa syöpäsolujen kiertää TKI-terapialle.

RAB25

kuuluu RAS onkogeeni perhe. Menetys

RAB25

liittyi paksu- adenokarsinoomia [51] ja kolminkertainen negatiivinen rintasyöpä [52], mutta geeni ei ole vielä tutkittu suhteessa tyrosiinikinaasin vastarintaa. Jatkotutkimuksissa osallistuneilla potilailla samanaikaisesti sekvensoitiin tyrosiinikinaaseja ja RAS-signalointireitin jäsentä tarvitaan arvioida sen merkitystä täsmähoitoihin.

Yhteenvetona esittää kattava analyysi putki tulevia tutkimuksia tutkittujen tyrosiinikinaasiestäjiksi. Osoituksena periaate valitsimme joukon geenejä, jotka liittyvät sunitinibilla vastus (agentin kanssa vähiten julkaistun ennustavan biomarkkereita) testaukseen kliinisessä kohortin.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Normalized microarray tiedot kaikista geenien kaikissa solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0059503.s001

(XLSX) B Taulukko S2.

Luettelo geenien valittu qRT-PCR validointi.