Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaihtoehtoisesti saumattu variantteja useiden onkogeenien ja tuumorisuppressoreita on osoitettu olevan tärkeitä niiden kasvainten muodostumiseen. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme testanneet myös seriini-arginiini proteiinikinaasi 1 (SRPK1), tärkeä säätelijä liittämiseen tekijöistä, on mukana munasarjasyövän etenemiseen ja on rooli Chemo-herkkyyden. Western blot -analyysit, SRPK1 proteiinin havaittiin yliekspressoituvan 4 ulos 6 munasarjasyövän solulinjoissa verrattuna kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja; ja 55% munasarjojen kasvain näytteissä verrattuna ei-neoplastisten munasarjojen kudosnäytteistä. Vähentäminen SRPK1 ilmaisun käyttäen pieniä häiritseviä RNA (siRNA), joka koodaa pientä hiusneula RNA munasarjasyöpäsoluja johti (i) alennetaan soluproliferaatioon korko, hitaampi solusykliä ja vaarantaa ankkurista riippumaton kasvu ja muuttoliike kyky

in vitro

, (ii) vähentynyt taso fosforylaation useita seriini-arginiini-proteiineja, ja P44 /42MAPK ja AKT-proteiineja, ja (iii) suurempi herkkyys sisplatiinia. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kohonnut SRPK1 ilmentyminen voi olla rooli munasarjojen kasvainten synnyssä ja SRPK1 voi olla potentiaalinen kohde munasarjasyövän hoidossa.

Citation: Odunsi K, Mhawech-Fauceglia P, Andrews C, Beck, Amuwo O, Lele S, et ai. (2012) Kohonnut ilmentyminen Serine-arginiini proteiinikinaasi 1 Gene munasarjasyövässä ja sen rooli Sisplatiini Sytotoksisuus

In vitro

. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10,1371 /journal.pone.0051030

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 syyskuu 2012; Hyväksytty: 23 lokakuu 2012; Julkaistu: 7. joulukuuta 2012

Copyright: © 2012 Odunsi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health Avustukset CA 107303 (RH), naistentautien Cancer Foundation (RH), DK60632 (JDB), ja CA16056 (RPCI Core Grant); Cancer Research Institute /Ludwig Institute for Cancer Research syövän rokotteen Collaborative Grant (KO); ja Hilton-Ludwig Cancer etäpesäke Grant Ludwig Institute for Cancer Research (KO). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on arvioitu, että 35-59% ihmisen geenejä vaihtoehtoisesti liitettyjä, joka edistää merkittävästi monimutkaisuutta ihmisen solutoiminnoille [1], [2]. Siksi ei ole yllättävää, että toiminta eräiden onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille moduloidaan vaihtoehtoisen silmukoinnin [3], [4]. Esimerkiksi poikkeava vaihtoehtoisen silmukoinnin tiettyjen tuumorisuppressorien, kuten rintasyövän 1 ja 2 (BRCA1 /2) [5], Wilmsin kasvain 1 (WT1) [6], ja adenomatoottisen polypoosin coli (APC) [3], tulokset mutaatiot, jotka muodostavat perinnöllinen ja satunnaista alttiutta syöpään. Lisäksi, tietyt silmukoinnin tekijöiden on havaittu olevan yli-ilmentynyt kasvaimia ja ne on liitetty, kuten onkopsykologista proteiinit [7], [8].

SRPK1 (seriini-arginiini proteiinikinaasi 1) kuuluu SR kinaasi perheen proteiinien ja säätelee SR perheen liitos tekijöistä. SR silmukoinnin tekijät ovat joitakin ylimääräisiä proteiineja, joita tarvitaan ennalta mRNA nisäkässoluissa. SR-proteiinit on tunnusomaista yksi tai kaksi RNA tunnustamista motiivia N-päässä ja SR-rikas domeeni C-pää [9], [10], [11]. SR verkkotunnuksen arvellaan edistää proteiini-proteiini vuorovaikutusten kokoonpanon aikana [12]. SR proteiinit säätelevät palautuva fosforylaatio välittämän SRPK1. Vaikka fosforyloitu SR proteiineja tarvitaan aloittamista silmukointiyksikkövälitteiseen kokoonpanoa varhaisessa vaiheessa, defosforyloinnilla on välttämätöntä liittämiseen jotta tapahtua silmukointiyksikkövälitteiseen [13], [14]. Näyttö on osoittanut, että sekä hypo- ja hyper-fosforylaatiota SR proteiinit ovat haitallisia liittämiseen [14], [15]. Siten taso SRPK1 on ratkaisevan tärkeää säilyttää oikea tasapaino fosforyloituu ja defosforyloitiin SR proteiineja. Yli-ilmentyminen SRPK1 proteiini on dokumentoitu akuutin tyypin Adult T-solu-leukemia [16], krooninen myelooinen leukemia [17] haima-, rinta-, ja paksusuolen syövissä [18], [19], [20]. Mielenkiintoista, SRPK1 ilmentyy aikuisen sukusolut, mutta yleensä ei useimmissa muissa normaaleissa aikuisen kudoksissa, mikä viittaa syöpään /kiveksiin kaltainen jakauma [16], [21]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että SRPK1 on todennäköisesti tärkeä rooli syövän kehittymisessä.

[22] ja muut [23] ovat aikaisemmin havainneet, että inaktivointi

SKY1

, hiivan homologi liitoksen suorittavan tekijä SRPK1, parantaa vastustuskykyä hiivan solujen sisplatiini (CDDP). Kuitenkin myös SRPK1 ilme on rooli määritettäessä herkkyyttä tai resistenssiä ihmisen kasvainten kemoterapiaan epäselvää seuraavista syistä. Ensimmäinen, alempi taso SRPK1 ilmentyminen on osoitettu korreloivan vastus munasarjojen [23], kivesten [20] ja HT29 [24] kasvainten solulinjat, platinaa sisältäviä hoito-ohjelmia. Toiseksi, se on viime aikoina osoittanut, että häiriöt SRPK1 ilmentymisen siRNA kasvattaa apoptoosin aiheuttaman CDDP haiman, paksusuolen ja rintasyövän solulinjoissa [18], [19].

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan onko SRPK1 ilmentyminen liittyy munasarjasyöpä etenemisen, onko ekspressiokuviota SRPK1 korreloi kliinisten hoitovaste, johon CDDP: n ja onko inhibitio SRPK1 muuttaa herkkyys munasarjasyöpä solujen CDDP. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että kohonnut SRPK1 proteiinin taso oli läsnä noin 55% munasarjojen tuumorinäytteet verrattuna ei-neoplastisten munasarjojen kudosnäytteistä. Toiseksi siRNA estoa SRPK1 vähentänyt OVCa soluproliferaation nopeus,

in vitro

solujen vaeltamiseen, Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja hitaammin solusyklin etenemisen. Nämä fenotyypit liittyivät SRPK1 välittämää korjauksilla MAPK /AKT signalointireittien, koska tasot fosforyloidun (aktivoitu) MAPK /AKT proteiinia pelkistetään SRPK1 pudotus soluja. Lopuksi, toisin kuin hiivan järjestelmä, teimme yllättävä havainto, että inhibitio SRPK1 suurempi herkkyys CDDP hoitoon, viittaa siihen, että SRPK1 voi olla kohde hoitoon munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus ihmiseen kohdistuvan suoritettiin käyttäen protokollaa hyväksymä RPCI Institutional Review Board (CIC0215). Kaikki kudosnäytteet kerättiin potilailta, jotka kunhan kirjallinen lupa.

Potilaille ja munasarjakasvain näytteet

Flash jäädytetyn kudosnäytteiden (n = 47) saatiin potilailta, joille suoritetaan rajaamisvai- kirurgia epiteelin munasarjasyöpä klo Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY vuodesta 1995 2006 Normaali munasarjanäytteiden (n = 9) saatiin potilailta, joille suoritetaan hysterectomies varten lieviä sairauksia kuten sileälihaskasvain. Ennusteeseen viittaavia tietoja koko kohortin myös vastaus kemoterapiaa, säilytetään tietokannassa laitoksella Gynecologic Oncology.

Cell Culture

Munasarjasyöpä solulinjoissa SKOV3 ja OVCAR3 saatiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). A2780 ja A2008-soluissa ja niiden CDDP-resistenttejä vastaavien A2780 /CP [25] ja A2008 /C13 [26]-solut saatiin Dr. Steven Howell (University of California, San Diego). Nämä solut pidettiin RPMI1640 väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Ei-transformoitujen munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja (IOSE-385, jäljempänä nimetty menettää tavallisesti) tehtiin kuolematon SV40 varhainen geeni [27] ja saatiin tohtori Nelly Auersperg (University of British Columbia, Kanada). Menettää tavallisesti soluja ylläpidettiin M199 /MCDB 105 keskipitkän (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) täydennettynä 5% FBS ja gentamysiini (Invitrogen, Carlsbad, CA).

shRNA ja pelastus-SRPK1 Constructs

shSRPK1-1 ja shSRPK1-2, koodaus shRNA kohdistaminen nukleotidit 288-308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) ja 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA), vastaavasti, SRPK1 mRNA ostettiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Transfektioon, SKOV3- ja A2780 /CP-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 80% konfluenssiin ja transfektoitiin 3-4 ug plasmidi-DNA: lla käyttäen lipofektamiinia, 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA: n ja proteiinien ohjaus- tai shSRPK1-transfektoiduissa soluissa analysoitiin 3 päivää transfektion jälkeen. Vakaa shSRPK1 kloonit valittiin käyttäen 2 ug /ml puromycine varten 3 viikkoa. Sillä SRPK1-pelastus plasmidi, aluketta, joka sisälsi 3 silenct mutaatioita (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, korostavat nukleotidejä vaihdettiin G, G, C, vastaavasti) sisällä shSRPK1-1 kohdesekvenssien otettiin p-CMV-flag-SRPK1 plasmidi (lahja Dr. Xiang-Dong Fu, University of California, San Diego) käyttäen epäsymmetrinen PCR [28]. Transfektio suoritettiin edellä kuvatulla tavalla ja vakaa kartiot valittiin käyttämällä G418: aa (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Chemicals

Sisplatiini (CDDP,

cis

-diammine-dikloori- platina II) ja MTT {3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi} ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Stock CDDP valmistettiin DMSO: ssa (330 mM), tallennetaan näyte-erinä -20 ° C: ssa, ja sitä käytettiin 2 viikon kuluessa. CDDP laimennettiin edelleen väliaineessa ennen lisäämistä soluihin.

Western blot -analyysi

Kaksikymmentä kolmekymmentä milligrammaa jäädytetyn kasvainkudoksen homogenoitiin huhmareella ja survimella kudoksessa näytepuskurissa (10% SDS , 5% β-merkaptoetanolia, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10% glyserolia), proteiinin uuttamista. Solulysaatit uutettiin käyttäen RIPA-puskuria (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksikoolihappoa, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-membraanille (Millipore, Billerica, MA) ja blokattiin TBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween-20 ja 5% kuivamaitoa yön yli 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen ja 1-2 tunnin ajan, ja sitten peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin toistuvasti ja proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (tehostettu chemiluminescense) (Pierce, Rockford, IL). Signaali oli digitaalinen valokuvattu ja kvantifioidaan tiheysmittaus alfa imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Vasta-aineita käytetään havaitsemaan SRPK1 oli peräisin BD Biosciences (San Jose, CA), fosforyloitu SR proteiinit olivat mAB104 [29] on eristetty hybridoomasta (ATCC, Manassas, Virginia), yhteensä p44 /42 MAPK: n ja AKT (AKT1 /2/3 , sc-8312) olivat Cell Signaling (Danvers, MA) ja Santa Cruz, vastaavasti, fosforyloitu MAPKp42 /44 (Thr

202 /Tyr

204) ja AKT (Ser

473 /Thr

308) olivat Cell Signaling (Danvers, MA), vasta-aine vastaan ​​Upf1 oli lahja tri Harry Dietz (Johns Hopkins University). Anti-aktiini oli Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Data ilmaistiin suhteessa kertainen ilmentymistä aktiini.

immunohistokemiallinen värjäys

pääluokat (4 pm paksu) peräisin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut normaali munasarja ja kasvainkudoksen käsiteltiin IHC kuten aiemmin on kuvattu [30]. Endogeeninen peroksidaasi salvattiin 0,3% vetyperoksidaasin 30 min. Antigeeni haku suoritettiin korkean pH: n puskuri on Höyrylaiva SRPK1 vasta-ainetta (BD Biosciences). Negatiivinen kontrolli, hiiri-IgG käytettiin.

Reverse-transkription polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi

Kokonais-RNA uutettiin kymmenen miljoonaa solua käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: ta 20 ul: ssa reaktiopuskuria, käyttämällä M-MuLV käänteistranskriptaasia, Ribolock ribonukleaasi-inhibiittori (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita jälkeen DNaseI ruoansulatusta. CDNA tuotteet käytettiin osittain kvantitatiivinen PCR käyttäen Taq DNA -polymeraasia (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) Alukkeet SRPK1 (SRPK1-R, 5′-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, ja SRPK1-exon10, 5’CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) suunniteltiin mukaan NCBI viitesekvenssin. GAPDH (glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi) käytettiin viitteenä kohdesekvenssin (alukkeet: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC ja 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC).

klonogeeninen eloonläämismääritys

Solut (3 x 10

2) ympättiin 6-kuoppaisille levyille yön yli ja käsiteltiin CDDP 24 tunnin ajan. Poistamisen jälkeen lääkkeen, solut pestiin PBS: llä ja uudelleen syötetään huumeiden väliaineella ja inkuboitiin 10-14 päivä. Pesäkkeet värjättiin 0,1% kristalliviolettia ja laskettiin. Prosentuaalinen solujen eloonjääminen on ilmaistu suhteessa käsittelemättömään kontrolliin.

MTT-määritys

Solut (5 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena yön yli ja käsiteltiin CDDP 72 hr, MTT lisättiin 4 h, ja formatsaanipitoisuus väriaine liuotettiin DMSO ja luettiin 540 nm: ssä FL6000 mikrolevylukijalla (BIO-TEK Instruments, Winooski, VT). Prosentuaalinen solujen eloonjääminen on ilmaistu suhteessa käsittelemättömään kontrolliin.

riippumattomaan kasvuun määritys

Solut (5 x 10

3) ympättiin kolmena rinnakkaisena 6-kuoppaisille maljoille, jotka sisältävät pintakerros 0,3% pehmeää agaria ja 0,5% agar perusta. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, keskimäärin solujen kylvetään per kenttä määritettiin laskemalla solut 5 eri alojen valomikroskoopilla. Muodostuneiden pesäkkeiden ( 0,1 mm halkaisijaltaan) 3 viikon kasvun pehmeässä agarissa laskettiin; 10 eri alojen kvantitoitiin kohti ja keskimäärin pesäkettä alalla on laskettu. AIG (ankkurista riippumaton kasvu) indeksi ilmaistiin suhteessa solujen lukumäärä kylvetään.

Wound Healing (Scratch) Pitoisuus

Solut siirrostettiin 60 mm: n levyt yhtymäkohdassa ja solun yksikerroksista raaputettiin kolmessa suoria viivoja on 200 ui pipetin kärki luoda ”naarmuja”. Roskat poistettiin PBS: llä, ja sitten viljelmä uudelleen syötettiin tuoretta alustaa. Photohgraphs haava-alueen otettiin 0 ja 28 tuntia sen jälkeen, kun naarmuja laskea solujen vaeltamiseen määrä. Kaksikymmentä satunnainen mittaukset tehtiin kunakin ajankohtana. Suhteellinen siirtyvät etäisyydet haavan alueet mitattiin kuvia.

Cell Cycle Analysis

Solut synkronoidaan G2 /M-vaiheessa käsittelemällä nokodatsoli (600 ng /ml) 12 tunnin ajan , pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja sitten vapautetaan alustaa ilman lääkettä. Solut on myös synkronoitu G0 /G1 asettamalla seerumittomassa väliaineessa 48 tunnin ajan. Lepotilassa soluja stimuloitiin uudelleen solusykliin lisäämällä 10% FBS. Kussakin ilmoitettu ajankohtana, solut kerättiin ja pestiin kylmällä PBS: llä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos ja kiinnitetään 70% etanolissa yli 15 min). Sitten soluja käsiteltiin RNaasi (50 ug /ml), 1,0%: lla natriumsitraattia 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten värjättiin propidiumjodi- jodia (50 ug /ml) 15 minuuttia. DNA-pitoisuus mitattiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen analysaattorin (FACScan-virtaussytometrillä, Becton Dickson, San Jose, CA). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin käyttäen WinList ja ModFit ohjelmien (Verity Software House, Topsham, ME).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism V4.03 ohjelmisto ja R V2.7.0 tilastollinen Computing Environment.

p

-arvo vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Opiskelijan

t

-testi käytettiin useimpien vertailuja SRPK1 RNA ja proteiini ilmaisun vs kliinis parametreja. Menetelmät Kaplan ja Meier ja Cox käytettiin arvioimaan mediaani elinaika ja hazard ratio.

Tulokset

SRPK1 Expression on koholla Tietyt munasarjasyöpäsolulinjoihin ja munasarjakasvainten

Olemme aikaisemmin havainneet, että inaktivointi hiivan SR proteiinikinaasi Sky1p antaa vastustuskyvyn sisplatiinin [22]. Kuitenkin taso ihmisen SRPK1 geeni on sekä positiivisesti että negatiivisesti korreloivat vastus tuumorisolujen hoito-ohjelmat, jotka sisältävät platinaa [18], [19], [20], [23]. Ryhdyimme tutkia edelleen suhdetta ilmentymistason SRPK1 geenin ja CDDP resistenssin ihmisen munasarjasyöpä (OVCa). Ensin käytetään semikvantitiivinen RT-PCR (käänteiskopioijaentsyymin polymeraasiketjureaktio) analyysi SRPK1 RNA ilmentymistä 6 OVCa solulinjoissa ero CDDP herkkyys (kuvio 1A, alapaneeli). Jotkut, jotka olivat vähintään 6 kertaa enemmän vastustuskykyä CDDP kuin ei-transformoitujen munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja (menettää tavallisesti), joka oli kuolemattomiksi SV40: n aikainen geeni [27]. Tiedot osoittavat, että ei ollut selkeää korrelaatiota CDDP resistenssifenotyyppi ja RNA-tasot näiden geenien näistä solulinjoista. Kuitenkin SRPK1 mRNA taso kohosi 4 ulos 6 solulinjoista, verrattuna kuin menettää tavallisesti solujen (kuvio 1A). Me seuraavaksi arvioitiin SRPK1 proteiinin ekspressio edellä mainituissa solulinjoissa käyttäen Western blot-analyysi. Suhteellinen taso SRPK1 proteiinin määritettiin normalisoinnin kuin taloudenhoito geenin aktiini. Kuvio 1B osoittaa, että SRPK1 proteiinin kohonneet myös 4 ulos 6 munasarjasyövän solulinjoissa (määritelty 2-kertaisesti yli keskiarvo menettää tavallisesti näytettä), vaikkakin hieman eri mallia kuin RNA. Huomasimme, että kuolemattomaksi menettää tavallisesti solut ilmentävät myös tietyn tason SRPK1. Tämä ei ole yllättävää, koska muut ovat myös osoittaneet, että kuolemattomaksi munasarjaepiteelisoluilla, verrattuna ei-kuolemattomaksi normaalin ihmisen OSE solut, lisää ilmaus liitos tekijä, polypyrimidiinijuosteen sitova proteiini [8]. Samanlainen mRNA: n ekspression, ei havaittu olevan selvää korrelaatiota CDDP fenotyyppi ja SRPK1 proteiinin taso näistä solulinjoista. Koska geeni tasoa pitkällä aikavälillä viljellyissä solulinjoja voidaan muuttaa, tutkimme seuraavaksi SRPK1 ilmaisun arkistoituja OVCa kasvain näytteet OVCa potilaista, joita hoidettiin platina-hoito leikkauksen jälkeen. Arvioimaan erityinen ilmaisu SRPK1 proteiinin kasvain epiteelin solutasolla, suoritimme immunohistokemiallisella värjäyksellä (IHC) on parafinoidut kudosleikkeiden. Kuvio 2A osoittaa, että SRPK1 värjäytyminen oli lähes olematon normaalissa munasarjan epiteelin. Sen sijaan, SRPK1 värjäytyminen oli helposti havaittu munasarjojen kasvaimia, jossa värjäys voimakkuus vaihtelee heikosta voimakkaaseen, ja esittää pääasiassa sytoplasmassa epiteelisolujen. Sytoplasmisen lokalisointi SRPK1 OVC kasvain näytteissä on samanlainen havaintoja kudosviljelysoluissa [15]. Koska munasarjojen kasvaimia koostuu pääasiassa epiteelisolujen, taso SRPK1 proteiinin homogenaateissa 47 jäädytettyä kasvain ja 9 ei-kasvainkudoksessa näytteitä tutkittiin käyttäen Western blot-analyysi. Kuvio 2B esittää immunoblotting tulokset 21 kasvaimen ja 9 ei-neoplastisen kudosnäytteistä. Densitomet- analyysi SRPK1 ja aktiini tasot tehtiin ja suhteellinen ilmentymistason SRPK1 normalisoitui tason kanssa aktiini. Huomasimme, että 26 ulos 47 (55%) tapauksista yli-ilmentyy SRPK1 (määritelty yli kaksinkertaiseksi yli keskiarvo yhdeksästä normaalin näytettä).

(A) Quantitative reaaliaikainen käänteistranskriptiotuotteiden polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi SRPK1 RNA taso 6 OVCa soluissa ja menettää tavallisesti soluja. GAPDH käytettiin lastaus valvontaa ja normalisointi. Viisikymmentä prosenttia kasvun esto pitoisuus (IC

50, uM) CDDP varten OVCa soluista osoitti alempi paneeli). (B) Western blot-analyysi SRPK1 proteiinin 6 OVCa soluissa ja menettää tavallisesti soluja. Alempi bändi blot tutkittiin anti-SRPK1 vasta-aine on todennäköisesti proteolyyttinen fragmentti SRPK1. Blotteja uudelleen tutkittiin aktiini, jota käytettiin latauskontrollina ja normalisointia varten. Kaavio edustaa suhteellinen ekspressio määritettiin densitometrisellä mittaus bändejä ja on ilmaistu suhteessa aktiini. Bar-kuvaaja esitetään on keskimäärin 4 kokeiluja. Yliekspressio SRPK1 in OVCa määriteltiin suurempi kuin 2-kertaiseksi yli keskiarvo menettää tavallisesti näytteiden ja se on merkitty tähdellä.

(A) immunohistokemiallinen värjäys SRPK1 proteiinin ilmentyminen normaalissa ja kasvaimen munasarja kudosleikkeiden . Solut värjäystä positiivisesti SRPK1 vasta-ruskeita. Negatiivinen kontrolli, isäntä-IgG käyttää (ei esitetty). E, epiteelin; S, strooman. (B) Western blot-analyysi SRPK1 proteiinin 21 munasarjakasvain näytettä (T), ja 9 ei-neoplastisten munasarjojen kudosnäytteistä (N). Normaalin ja kasvaimen näytteiden alimman paneelin oli rajattu kahdesta eri blotit varten esityksen. Alempi bändejä blot tutkittiin anti-SRPK1 vasta-lienevät proteolyyttisiä fragmentteja SRPK1. (C) Box-Whisker tontti SRPK1 /aktiinin kertainen ilmaisun johdettu densitometristä analyysi bändejä Western blot analyysissä. Whiskers kattavat kaikki kasvain (n = 47) tai normaalia näytettä (n = 9), laatikot sisältävät 50% tietojen ja keskiviivat laatikoihin osoittavat mediaanit. Mean ilmentymistä verrattiin Studentin

t

-testi (p = 0,03).

Suurin osa 47 testatusta potilaasta esittelyyn 3. asteen kasvaimet (91%), vaiheessa IIIC (76%), ja vakavien histologia (85%). Keskimääräinen elinaika kaikille potilaille oli 39,7 kuukautta {luottamusväli (CI), 26,5-∞ kuukautta}, kun taas mediaani taudista vapaan eloonjäämisen ilman potilailla, joilla on jatkuva /etenevä sairaus jälkeen ensimmäisestä hoidosta, oli 17,5 kuukautta (CI, 14,4-35,9 kuukaudet). Käyttämällä Coxin regressiomallin emme noudata selkeää korrelaatiota SRPK1 taso ja yleinen (p = 0,26) tai taudista vapaa (p = 0,62) selviytyminen munasarjasyöpä potilaille. SRPK1 tasot eivät korreloi histologia, grade tai hoitovastetta CDDP sisältäviä kemoterapiahoidon. Kuitenkin keskimääräinen suhteellinen kertaiseksi ilmentymisen SRPK1 proteiini oli merkitsevää eroa kasvainnäytteestä ja normaali näytteet (kuvio 2C; riippumaton näytteitä t-testi, p-arvo = 0,03). Siten meidän tiedot osoittavat, että kohonnut SRPK1 proteiinin ilmentymisen on yleinen tapahtuma munasarjojen epiteelin syöpää sairastavilla.

vähentäminen taso SRPK1 Short Hairpin RNA Parantaa CDDP Sytotoksisuus

On osoitettu, että keskeytyminen SRPK1 ilmentymisen Sirna kasvaa apoptoosin aiheuttaman CDDP haiman, paksusuolen ja rintasyövän solulinjoissa [18], [19]. Sen testaamiseksi, onko pudotus on SRPK1 geenin OVCa soluissa vaikuttaa niiden herkkyyttä CDDP, suunnattiin tämän geenin kaksi asentoa kinaasidomeenissa kahdella eri konstruktien lyhyen hiusneula-RNA (sh-SRPK1-1 ja sh-SRPK1-2) in SKOV3 ja A2780 /CP-soluja, jotka molemmat ovat suhteellisen vastustuskykyisiä CDDP kuin menettää tavallisesti solujen ja joidenkin muiden OVCa solulinjoissa (kuvio 1A). Verrokkeina vektori pSM2-EV myös transfektoitu molemmissa solulinjoissa. Ohimenevä transfektio (48 h) joko rakentaa erityisesti vähentää SRPK1 mRNA: ta (tuloksia ei ole esitetty), ja proteiinin tasolla vahvistettiin reprobing Western blotteja vasta-ainetta ei-liittyviä proteiinia, Upf1, ja aktiini käytettiin lastaus ohjaus (kuvio 3A). Inhiboiva vaikutus shSRPK1-2 konstrukti on merkittävämpi kuin shSRPK1-1. Käyttämällä formatsaanipitoisuus väri (MTT), Kuvio 3B esittää, että vähentämällä SRPK1 proteiinin SKOV3- soluissa johti suurempi herkkyys CDDP hoitoon (pariksi t-testi ja * tarkoittaa P 0,05). Lisätutkimuksia kemiallis-herkistävä estävä vaikutus SRPK1, me syntyy stabiilien kloonien eri shRNA potencies in SKOV3- soluissa. Saimme useita klooneja, joissa vähennetään SRPK1 mRNA: ta ja proteiinia arvioituna RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä, vastaavasti. Kaksi niistä on esitetty kuviossa 3C, jossa SRPK1 proteiinin taso aleni noin 60% (pshSRPK1-c4, kohteena sh-SRPK1-2) tai 20% (pshSRPK1-c5, kohteena sh-SRPK1-1) ohjausyksikön pSM2-EV soluissa. SRPK1 tasot näiden kloonien korreloivat käänteisesti niiden CDDP herkkyys määritettynä pesäkemuodostusta (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittavat, että SRPK1 on rooli moduloivan CDDP sytotoksisuuden

in vitro

ja että kohdistaminen nukleotidit 288-308 ja SRPK1 mRNA johti voimakkaamman äänenvaimennusvaikutus.

munasarjasyöpäsoluja olivat lyhytaikaisesti ( A) tai pysyvästi (C) transfektoitiin joko siRNA koodaavaa shSRPK1 plasmidin tai tyhjän vektorin (pSM2-EV). Proteiini tasot SRPK1, UPF1 ja aktiini määritettiin Western blot -analyysillä. Edustavia blots kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. (B) ja (D) SRPK1 Knockdown lisää sisplatiinin sytotoksisuutta. (B) Soluja (5 x 10

4) oli siirrostettiin 24 h transfektion jälkeen, käsiteltiin erilaisilla sisplatiinin 48 tunnin ajan ja määrän eloonjääneiden solujen analysoitiin MTT-määrityksellä. Survival (%) on ilmaistu suhteessa ei-käsiteltyjen pSM2-EV-soluja. (D) Stable transfektantteja (3 x 10

2) ympättiin kolmena kappaleena, sisplatiinia 24 tunnin ja pesäkkeiden muodostus arvioitiin jälkeen 10-14 päivää. Tiedot analysoitiin yksisuuntainen ANOVA ja * tarkoittaa P 0,05; baareja, SD.

knockdovvn SRPK1 Expression Vähentynyt Cell Proliferation ja

in vitro

Tuumorigeenisuustutkimuksissa SKOV3 Cells

Data kuvassa 3D osoittavat myös, että solut vähennetään SRPK1 ilmentyminen shRNA kasvoi hitaammin kuin kontrolli pSM2-EV soluissa. Ne muodostivat vähemmän pesäkkeitä kuin ei-käsitellyn kontrolliryhmän ilman CDDP hoitoa. Edelleen testaamiseksi vähentää SRPK1 ilmaisun estää munasarjasyövän solujen lisääntymistä, tuplautumisai- aika pSM2-EV ja pshSRPK1-c5 soluja verrattiin. Solujen lisääntyminen korko määritettiin eksponentiaalisesti kasvavissa soluissa trypsinaatiolla ja trypaanisinivärin syrjäytymistä 24, 48, 72, ja 96 tuntia post pinnoitus. Kuvio 4A osoittaa, että kaksinkertaistamalla aika pshSRPK1-c5 on noin 1,4-kertainen valvonnan pSM2-EV-solut (31 h vs. 22 tuntia). Tämä vahvistettiin MTT-määrityksellä (tuloksia ei ole esitetty). Me seuraavaksi tutkittiin Tuumorigeenisuustutkimuksissa SRPK1 käyttäen kiinnittämisestä riippumaton kasvua (AIG) määritys. SRPK1 pudotus ja valvonta-soluja siirrostettiin pehmeä agar ja annettiin kasvaa 3 viikkoa. Kuvio 4B osoittaa, että sekä shSRPK1 kloonit tuottivat vähemmän ja pienempiä pesäkkeitä pehmeässä agarissa, mikä viittaa vähenemiseen

in vitro

kasvainten muodostumiseen. Soluliikkuvuus on yksi niistä tekijöistä, jotka edistävät kasvainsolun invaasiota. Sen testaamiseksi solujen vaeltamiseen kyky on vaarantunut SRPK1 pudotus soluja, joka on

in vitro

solujen vaeltamiseen (haavan paranemiseen) analyysi suoritettiin. Kuvio 4C osoittaa, että keskimääräinen muuttoliike korko shSRPK1-c5 soluja (5,8 ± 0,81 yksikköä) oli noin 60%, että valvontaa varten pSM2-EV-solut (9,9 ± 1,5 yksikköä). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että SRPK1 edistää solujen lisääntymistä,

in vitro

solujen vaeltamiseen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa SKOV soluja.

(A) Soluproliferaatiomääritys. -Soluja (1 x 10

4) ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppaiselle levylle, trypsinoitiin ja laskettiin läsnä trypaanisinisellä ilmoitettuina aikoina. (B) ankkurointi riippumattoman kasvun määrityksessä. Solut (5 x 10

3) ympättiin pehmeä agar ja pesäkkeiden lukumäärä määritettiin 21 päivää myöhemmin. Edustavia aloilla pesäkkeiden pehmeässä-agarmaljoille on myös esitetty. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo kolmen erillisen kokeen ja analysoitiin pariksi t-testiä; * Tarkoittaa P 0,05, baareja, SD. SKOV3- solut ympättiin positiivisena kontrollina. (C)

In vitro

haavan paranemista määrityksessä. Maljan solut raaputettiin 200 ul-kärki tuottaa suoralla-aukkoja. Kuvia aukkojen otettiin 0 ja 28 h ja leveys aukkojen (valkoinen dashed-linjat) mitattiin valomikroskoopin laskea nopeuden solumigraation. Kuvat ovat näkyvät vasemmalla ja suhteellinen vaeltavat etäisyydet (haavansulkemiseen) näkyy oikealla laskettiin 20 alueet kultakin levyltä. Esitetyt tiedot ovat peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tähdellä

merkittäviä eroja verrattuna ohjaus (

P

0,05).

knockdovvn SRPK1 Expression Vähentynyt fosforylaatio Tietyt SR Proteiinit ja MAPK /AKT Proteiinit

SR proteiinit ovat kohdistu suoraa SRPK1 [15]. Fosforylointireaktio kuvio Näiden SR liitos tekijät odotetaan vaikuttaa SRPK1 pudotus soluissa. Testata tätä ennustus, Western blot-analyysi käyttämällä pannulla vasta-ainetta, joka tunnistaa fosfospesifisiä epitoopin yhteisiä useille SR proteiineihin [29] tehtiin. Kuten odotettua, vähentää SRPK1 ilmentyminen johti alentuneet fosforylaation tiettyjen SR proteiinien SKOV3- soluissa (kuvio 5, keskimmäinen paneeli). On mielenkiintoista huomata, että eri SR proteiinit vaikuttavat välillä shSRPK1-c4 ja shSRPK1-c5 klooneja. Esimerkiksi, taso SRp55 laskettiin paljon enemmän shSRPK1c5 kuin että shSRPK1-c4-soluja. Päinvastainen pätee SRp40 ja SRp20. Differentiaalinen knockdovvn SRPK1 havaittu tässä kaksi kloonia (kuvio 5, yläpaneeli) voi selittää erot alustaan ​​fosforylaatioon. Taso SRPK1 entsyymi voidaan määrittää substraattitunnistus ja katalyyttinen aktiivisuus. Erot on SRPK1 tason välillä shSRPK1-c4 ja shSRPK1-c5 kloonit heijastuvat myös solujen lisääntymisen ja herkkyyttä sisplatiinin (katso alla) vaikuttaa SRPK1 downregulation.

Western blot-analyysi suoritettiin lysaatit valmistettiin SKOV3 -peräisen pSM2-EV-solujen ja kaksi stabiilia SRPK1-pudotus klooneja. Vasta-aineita käytettiin havaitsemaan fosforyloitu SR proteiinit (mAB104), MAPK42 /44 (Thr

202 /Tyr

204), ja AKT (Ser

473 /Thr

308) sekä kokonaisproteiinipitoisuus tasot MAPK42 /44, ja AKT.

on hyvin tunnettua, että aktivointi, esimerkiksi kohonnut fosforylaation, MAPK (mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin) ja AKT signalointireittejä on mukana monissa maligniteettien ( 29, 30), ja että nämä reitit säätelevät pre-mRNA: n prosessointi [31], [32]. Fosforylaatio kuvio kaksi keskeistä muuntimet leviämisen signaaleja, p44 /42-MAPK (ERK1 ja ERK2) ja AKT analysoitiin SRPK1 pudotus soluja. Kuvio 5 osoittaa, että pshSRPK1-c4 ja pshSRPK1-c5 solut olivat alhaisempia fosforyloidun p44 /42-MAPK (p-MAPK) ja AKT (p-AKT) proteiineja. Sen sijaan, kokonaismäärä MAPK ja AKT-proteiineja ei vaikuttanut inhibition SRPK1 ilmaisua. Pienentynyt tasot fosforyloitua p44 /42-MAPK ja AKT korreloivat hitaampi kasvu SRPK1 pudotus soluja (kuva 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että SRPK1 on rooli säätelyssä tason aktivoituja muotoja MAPK ja /tai AKT proteiineja.

SRPK1-pudotus soluilla Hitaampi solusyklin etenemisen

Data edellä kuvattu osoittaa, että esto of SRPK1 johtaa hitaampi solujen kasvua ja vähentää fosforylaation tiettyjen MAP kinaasien, jotka ovat merkittäviä säätelijöitä solusyklin etenemisen.