Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin) raportoidaan tukemaan kasvaimien syntyyn stimuloimalla angiogeneesiä, syöpäsolujen lisääntymistä, ja invaasio useimmissa kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin roolit valuuttalisiin maksassa syöpä microenvironment ei ole tutkittu perusteellisesti. Aiemmissa tutkimuksessa olemme menestyksellisesti eristetty valuuttalisiin alkaen maksasolusyövän (HCC) (H-valuuttalisiin) ja osoittivat, että H-valuuttalisiin tukahdutti aktivoitumisen NK-solujen ja siten luonut suotuisat olosuhteet HCC etenemistä. Meidän Tässä tutkimuksessa havaittiin, että leviämisen MHCC97L ja Hep3B solujen edistänyt merkittävästi käsittelemällä kasvualusta alkaen H-valuuttalisien. Patologinen analyysi paljasti myös, että H-valuuttalisiin kasvattanut Ki-67 (+) pahanlaatuisia soluja ja estää niiden käynnissä kuolion. Lisäksi pitoisuus hepatosyyttien kasvutekijän (HGF), sytokiini väliaine H-valuuttalisiin oli korkeampi kuin kunnostettua alustaa kuin normaali iho, fibroblasteissa (NSFs). Anti-HGF vähensi lisääntymistä edistävää kykyä H-valuuttalisien. Lisäksi olemme havainneet, että runsaasti H-valuuttalisiin korreloi positiivisesti kasvaimen kokoa. Nämä tulokset osoittavat, että H-valuuttalisiin ovat tärkeä tekijä kasvun edistämistä HCC

in vitro

ja

in vivo

, ja että HGF on keskeinen rooli HCC leviämisen aiheuttama H-valuuttalisien .

Citation: Jia CC, Wang TT, Liu W, Fu BS, Hua X, Wang GY, et al. (2013) Cancer-Associated Sidekudosmuodostussolujen päässä maksasyövän edistää syöpäsolujen lisääntymistä HGF eritys. PLoS ONE 8 (5): e63243. doi: 10,1371 /journal.pone.0063243

Editor: Song Guo Zheng, University of Southern California, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 marraskuu 2012; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2013; Julkaistu: 7. 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat: State 973 National Basic Research Program of China (2009CB522404), National Natural Science Foundation of China (NSFC-30972914, 81000936, 81172036, 81170451, 81170452), 985 Project (82000-3281901), perustutkimus rahastoja Central yliopistot (10ykpy05), valtion Key Projects on Infection Diseases of China (2012ZX10002016-023, 2012ZX10002010-001-007), National Natural Science Foundation of Guangdong (+10151008901000208) sekä keskeiset hankkeen Lääketieteen Sun Yat-sen University ( 10YKJC03). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jälkensä kasvaimen strooman kasvuun pahanlaatuisten syöpäsolujen on osoitettu ja tutkittu innokkaasti tämän aikakauden täsmähoitoihin [1], [2]. Koska merkittävä osa kasvain strooman, kasvava näyttö on osoittanut, että syöpään liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin) ovat merkittävä muokkaaja syövän kehittyminen [3], ja ne edistävät kasvaimen kehittymisen [4], eteneminen [5], invaasio [6] ja chemoresistance [7] syöpäsolujen erilaisilla mekanismeilla. Tämä pätee erityisesti maksasolusyövän (HCC) [8], [9], koska useimmat HCC tapauksissa voi johtua maksakirroosi [10]. Valuuttalisiin ensisijaisesti resistenttejä kemoterapiaa ja sädehoitoa johtuen pienen osan lisääntyvien solujen toisin pahanlaatuisten solujen [11], mikä tekee valuuttalisiin potentiaalinen syövän etenemisen ja uusiutumisen [12]. Täsmähoitoihin kohti valuuttalisiin on osoittanut lupaavia syöpälääkkeen tehoa [6], joka on entisestään lisännyt tarvetta tutkimiseen suhdetta valuuttalisiin ja niiden isännät [13].

Kuitenkin tiedetään vähän koskevat valuuttalisien HCC (H-valuuttalisien). H-valuuttalisiin eristettiin ja tunnettu edellisessä tutkimuksessa [8], joka oli verrattavissa tutkimuksessa Antonio Mazzocca [9]. Huomasimme, että H-valuuttalisiin koulutettuja NK-solujen hankkia deaktivoitu fenotyyppi ja luo välinpitämättömiä ehto kasvaimissa [8]. Lisäksi tutkimus Antonio Mazzocca [9] osoitti, että lysofosfatidihappo (LPA) kiihdyttää HCC eteneminen rekrytoimalla peri-kasvain fibroblasteja (PTF) ja edistämällä niiden transdifferentiation osaksi myofibroblasteja. Kuitenkin, että tutkimus ei vaikutusten arvioimiseksi valuuttalisiin maksan syöpäsoluja vitro. Rooli H-valuuttalisiin HCC ei tunneta. Lisää tutkimuksia tarvitaan saamiseksi kattavan kuvan cross-talk välillä H-valuuttalisiin ja HCC isännässä.

valuuttalisiin arvellaan aktivoitua, jolle on ominaista ilmaus α-sileän lihaksen aktiini (α SMA), fibroblastien aktivoitumista proteiini (FAP), fibroblastien pinnan proteiini (FSP), ja vimentiinin [1] – [3]. Tämä aktivointi avustukset valuuttalisiin useita toimintoja edistämisessä syövän kehitykseen, kuten helpottaa angiogeneesiin, epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [14], chemoresistance [5], [7], toimintahäiriöstä paikalliseen immuunijärjestelmään [6], [8], ja vielä tärkeämpää, pahanlaatuisten solujen lisääntymistä [1] – [3]. Kuitenkin avain molekyylimekanismin ja toiminnallinen signaalireitin mukana näissä biologisissa prosesseissa ovat huonosti tunnettuja ja kaukana täysin tutkittu.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään roolin H-valuuttalisiin edistämisessä HCC solujen lisääntymisen ja taustalla olevaa mekanismia.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja kelpoisuus

Tutkimme peräkkäinen 43 histologisesti vahvistettu maksasyövän, joka otettiin kolmannen Affiliated Hospital Sun Yat-sen University (Guangzhou, Kiina) marraskuusta 2008 elokuussa 2011. Potilaat olivat mukana seuraavat mukaanottokriteerinä: (a) patologisesti vahvistettu HCC, (b) age≥18, (c) käsitelty radikaali leikkaaminen HCC, (d) saatavuus CT tietojen kasvain morfologia, (e) puute syöpähoidon, kuten transkatetri- valtimon chemoembolization (TACE), sorafenibia, kemoterapiaa ja sädehoitoa ennen leikkausta. Tutkimuksen hyväksyi Clinical Research eettisen komitean kolmannen Affiliated sairaala Sun Yat-sen University, Guangzhou, Kiina. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ajankohdan. Parafiini-sulautettujen näytteet ja kliiniset tiedot haettiin kullekin potilaalle.

eristäminen ensisijaisen fibroblasteista HCC yksilöt

Tuumorinäytteet saatu HCC potilailla, normaali maksa näytteitä saatiin maksan hemangioma potilaiden ja esinahka näytteet saatiin terveiltä luovuttajilta kolmannesta Affiliated sairaala Sun Yat-sen University. Diagnoosi HCC kaikilla potilailla, joille tehtiin hepatolobectomy vahvistivat patologiset ja kliiniset kokeet. Näytteet anonyymisti mukaisesti koodattuna paikallisten eettisten ohjeiden (josta määrätään Helsingin julistuksen), ja kirjallinen suostumus saatiin potilailta ja terveillä vapaaehtoisilla. Työ tehtiin tiukka mukaisesti tutkimusasetelma hyväksymä Clinical Research eettisen komitean kolmannen Affiliated sairaala Sun Yat-sen University Kiinan Guangzhoussa.

H-valuuttalisiin eristettiin syöpä alueelta ja noncancerous fibroblasteissa (NFS) sisältyy kolme fibroblastien: peritumoraalista fibroblasteissa (PTF) otetaan kudoksesta vähintään 2 cm distaalisesti ulkoreuna syöpä massa, fibroblasteja, jotka ovat peräisin maksan hyvänlaatuinen hemangioma kuin normaali maksan fibroblasteissa (NLFs) ja fibroblasteissa saatu esinahka kuin normaalin ihon fibroblasteja (NSFs). Kudokset jauhettiin ja hajotettiin Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY), 1 mg /ml kollagenaasia (tyyppi I Sigma, St. Louis, MO) ja 100 U /ml hyaluronidaasia (Sigma, St. Louis, MO) 37 ° C: ssa 6-8 tunnin ajan, pestiin kahdesti PBS: llä (Sigma, St. Louis, MO) ja sentrifugoitiin 450 g 8 minuuttia kerrallaan. Ne suspendoitiin lopuksi RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja sitten viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ympäristössä. Differential trypsinaation aikana suorasta Saharan viljelyn valitsemaan kasvun fibroblasteissa. Prosenttiosuus puhdistettiin fibroblastien oli 95%, kun 2-3 kohtia, jotka määritettiin immunofluoresenssilla, Western-blottauksella ja virtaussytometrialla käyttämällä vasta-aineita vastaan, vimentiinin, sytokeratiini, FAP, ja α-SMA. Myöhemmät kokeet suoritettiin käyttäen näitä soluja 3-10 kohtia.

Solut ja soluviljelmä

HCC-solulinja Hep3B (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) viljeltiin Minimum Essential Medium (MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY), jota oli täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja 10% FBS: ää. MHCC-97L soluja (97L; Maksa Cancer Institute, Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston Shanghai, Kiina) ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY) täydennettynä penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), L-glutamiinia (300 ug /ml) ja 10% FBS: ää. LO2-solut (saatu meidän lab varastointi) viljeltiin RPMI 1640: ssä (Gibco-BRL, Grand Island, NY), jota oli täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja 10% FBS: ää. Kaikki solut siirrostettiin suhteessa 1:04 joka 4-5 päivä.

kokoelma kunnostettua alustaa ja entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

kokoelma kunnostettua alustaa näistä fibroblastit, fibroblastit maljattiin 75 cm

2 pulloissa, pestiin kahdesti PBS: lla 4 päivää myöhemmin, ja inkuboitiin 48 tuntia seerumittomalla DMEM. Sitten supernatantti kerättiin, sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 5 min, läpi steriilin Millipore 50 ml suodatus 0,45 um: polyvinylidenedifluoride kalvon ja varastoidaan -80 ° C: ssa jääkaapissa myöhempää käyttöä varten.

mitataan liukoinen sytokiinien väliainetta, 2 x 10

5 fibroblastit maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 24 tuntia, ja elatusaine kerättiin ELISA. Samaa menetelmää käytetään, jotta saataisiin vahvistettua elatusainetta päässä LO2 soluja. Tasot ihmisen strooman-soluista peräisin tekijä 1 (SDF-1), hepatosyyttikasvutekijä (HGF), transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-β) ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF), määritettiin käyttämällä ihmisen ELISA-kittejä (R D Systems, Minneapolis, MN) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

immunoblottauksella

Yhteensä proteiini uutettiin käyttäen RIPA-puskuria jälkeen kuopat pestiin vähintään 3 kertaa PBS-puskurilla. Proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE, immunoblotattiin vastaisella vasta-aineella α-SMA (Abcam, Cambridge, MA), FAP (Abcam, Cambridge, MA), vimentiinin (Abcam, Cambridge, MA) ja β-aktiini (Santa Cruz Biotekniikka, Santa Cruz, CA) ja sitten näkyviksi tehostetun kemiluminesenssin järjestelmä (GE, Buckinghamshire, UK).

Immunofluoresenssitesti (IF) B

solut kiinnitettiin jääkylmässä metanoli (at 4 ° C: ssa 15 min), pestiin PBS: llä, blokattiin 3% BSA: ta, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 1 tunti huoneen lämpötilassa. Solut immunovärjättiin α-SMA, FAP, vimentiinistä, FSP (Sigma, St. Louis, MO) ja sytokeratiinia (Dako, Carpinteria, CA). Toissijainen vasta-aineet olivat Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L), ja Alexa Fluor 546 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) (Molecular Probes, Grand Island, NY). Tumat värjättiin Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO). Kuvat koettiin fluoresenssimikroskoopilla (LEICA DMI 4000B, Solms, Saksa) ja analysoitiin Leican ohjelmistopaketti (versio 4.0).

immunohistokemia

Kudokset fiksattiin 4% paraformaldehydillä (PFA, Sigma, St. Louis, MO), upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 pm paksu osissa. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin, antigeeni haku suoritettiin, ja levyt värjättiin ensisijainen vasta-aineita Ki-67 (Abcam, Cambridge, MA), α-SMA ja CD31 (Abcam, Cambridge, MA), joka käytettiin laimennosten valmistajan ilmoittama. Immunoreaktioita havaittiin, että Dako-Cytomation Envision HRP System (Dako, Glostrup, Tanska), ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä (Sigma, St. Louis, MO). Negatiiviset kontrollit olivat vain värjättiin sekundaarisen vasta-aineen.

H-valuuttalisiin tunnistettiin α-SMA immunoreaktiivisuus. Väestöstä H-valuuttalisiin on luokiteltu korkean intensiteetin tai matalan intensiteetin värjäyskuviot mukaisesti aiemmin kuvattu kriteerien [14].

Soluproliferaatiomääritys

HCC-solut (97L soluja) maljattiin tiheys on 2 × 10

3-solujen kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevylle (Corning Life Sciences, Lowell, MA). Vakioitu alusta, joka sisälsi 10% FBS: n päässä fibroblasti näytteistä tai Lo2 soluja lisättiin ja vaihdettiin 4-5 päivää, ja DMEM 10% FBS: ää käytettiin kontrollina. Solujen proliferaatio mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Rockville, MD) mukaan valmistajan protokollan.

In vivo

vaikutus H-valuuttalisiin kasvaimen kasvua

maksasyövän ksenograftimalli onnistuneesti perustettu vaikutuksen arvioimiseksi H-valuuttalisiin kasvaimen kasvua esillä olevassa tutkimuksessa. On neljästä kuuteen viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriä ostettiin Wei Tong Li Hua Company (Peking, Kiina) ja ylläpidetään paineistetaan ilmanvaihto häkeissä Vaccine Research Institute of Sun Yat-sen University. 97L solut (5 x 10

6) yksinään kontrollina tai sekoitettuna joko valuuttalisiin (5 x 10

6) tai NFS (5 x 10

6) suspendoitiin 0,5 ml: n putkeen ja ruiskutetaan ihon alle (sc) nude-hiiriin. Kasvainten koot rutiininomaisesti mitattiin Vernier jarrusatulat joka 3 päivä, ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: π /6 x suurempi halkaisija x pienempi halkaisija)

2. Tiedot on esitetty kuvaaja keskimääräisen kasvainten versus aika päivinä. Kaikki eläinkokeet suoritettiin suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of the Sun Yat-sen yliopiston ja hyväksyi ne eläinten eettisen komitean Kolmannen Affiliated Hospital (Luvan numero: 0021942).

tilastollinen analyysi

tiedot esitettiin keskiarvona ± SEM, ja Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan ero kahden ryhmän välillä.

P

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Merkittäviä eroja jatkuvaan tietojen kliinisiä piirteitä kahden ryhmän välillä (H-valuuttalisiin korkean intensiteetin vs. H-valuuttalisiin matalan intensiteetin) verrattiin käyttäen Mann-Whitneyn testi.

Tulokset

Isolation, kulttuuri ja karakterisointi H-valuuttalisiin

H-valuuttalisiin eristettiin primaarikasvaimen kudosten ja viljeltiin menetelmien mukaisesti kuvattu aikaisemmassa tutkimuksessa [8]. H-valuuttalisiin osoitti korkean tason ilmentymisen α-SMA, FAP, FSP, vimentiinistä ja fibronektiinin mukaan immunofluoresenssianalyysillä (Fig. 1A), joka vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio. 1 B). Lisäksi, kuten keskeinen piirre H-valuuttalisiin ja aktivoituneiden fibroblastien, α-SMA ekspressiota havaittiin primaarikasvaimen kudoksissa käyttäen immunohistokemia vahvistaa läsnäoloa H-valuuttalisiin kasvaimen yksilöitä. CD31 ilmentyminen arvioitiin sulkea pois verisuonten endoteelisolujen, joka co-express α-SMA ja CD31. Tulokset osoittivat, että H-valuuttalisiin oli runsaampaa tuumorikudoksissa verrattuna peri-kasvain ja normaali maksan kudoksen (Fig. 1 C).

(A) ilmentyminen α-SMA, FAP, FSP, vimentiinistä, fibronektiiniä ja sytokeratiinia neljän tyyppisiä puhdistettua fibroblasteissa 3-10 kohtia määritettiin immunofluoresenssivärjäyksellä. Kaikki neljä fibroblasti tyypit osoitti korkea ilmentyminen mesenkymaalisten merkkiaineiden FSP, vimentiinistä ja fibronektiiniä. NLFs, H-valuuttalisiin, PTF ja NLFs näytetään korkean ilmentymisen α-SMA, mikä viittaa siihen, että nämä fibroblastit olemassa aktivoidussa tilassa mukaisesti soluviljelmässä olosuhteissa. Kuitenkin toinen aktivointi tunnusmerkki FAP oli hyvin ilmaistu H-valuuttalisiin ja PTF muttei NSFs ja NLFs. (B) Western blotting osoitti eroja α-SMA ja FAP ilmaisun joukossa neljä fibroblasteissa. Yhdenmukainen tulokset immunofluoresenssivärjäyksellä, H-valuuttalisiin, PTF ja NLFs näytetään korkean ilmentymisen α-SMA. FAP oli hyvin ilmaistu H-valuuttalisiin ja PTF muttei NSFs ja NLFs. (C) jakautuminen H-valuuttalisiin tunnistetaan α-SMA (+) CD31 (-) ilmentyminen kukin näyte pahanlaatuinen, peri-kasvain ja normaali maksan alueilla havaittiin läpi immunohistokemia sarja patologinen osissa. α-SMA ekspressiota havaittiin vahvistaa läsnäoloa H-valuuttalisien. Lisäksi CD31 ilmentyminen arvioitiin sulkea pois verisuonten endoteelisolujen, joka co-express α-SMA ja CD31. H-valuuttalisiin oli runsaampaa kasvainkudoksessa verrattuna peri-kasvain ja normaali maksakudosta.

Kuitenkin PTF ilmaisi samantasoista α-SMA, FAP, FSP, vimentiinistä ja fibronektiiniä H -CAFs

in vitro

(Fig. 1A), mikä vahvistettiin edelleen Western blottauksella (kuvio. 1 B). NLFs näkyy huomattavasti pienempi ilmentyminen FAP verrattuna H-valuuttalisiin

in vitro

, ja ei ollut merkittävää eroa muiden biomarkkerit (Fig. 1A ja kuvio. 1 B). Ilmaisu on α-SMA ja FAP oli erittäin alhainen NSFs toisin H-valuuttalisiin, joka osoitettiin immunofluoresenssilla ja Western-blottauksella (kuvio. 1A ja Fig. 1 B).

H-valuuttalisiin edistänyt leviämisen HCC-solujen sekä

in vivo

ja

in vitro

CCK-8 kokeet osoittivat, että leviämisen 97L ja Hep3B solujen lisääntyi merkittävästi käsittelemällä kunnostetun alustan alkaen NLFs , PTF ja H-valuuttalisiin verrattuna kasvualusta peräisin NSFs tai kontrolliryhmän

in vitro

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että H-valuuttalisiin hallussaan pro-proliferatiivinen vaikutus HCC-solut (Fig. 2A ja Fig. 2B).

(A ja B) 97L-solujen (A) ja Hep3B-soluja (B) viljeltiin kunnostetussa alustassa eri fibroblastien, ja pahanlaatuisten solujen uudiskasvun määritettiin CCK-8-analyysi. NLFs, PTF ja H-valuuttalisiin huomattavasti HCC-solujen lisääntymisen suhteen NSFs ja kontrolliryhmään. (C ja D) BALB /c-nude-hiiri ksenograftimallissa perustuu yhteistyöhön injektion HCC-solujen kanssa tai ilman kaksi fibroblasti tyyppiä (NSFs tai H-valuuttalisiin) käytettiin tutkimaan

in vivo

vuorovaikutuksen H-valuuttalisiin ja HCC-soluissa. Tuumoritilavuudet kasvaimen solmujen syntyy yhteistyössä injektio HCC-solujen ja H-valuuttalisiin olivat jatkuvasti merkittävästi suurempia kuin muodostetaan HCC soluja ilman co-injektion H-valuuttalisien. NSFs ei lisännyt merkittävästi kasvaimen kasvua suhteessa kontrolliin. Lisäksi fibroblastit eivät tuottaneet kasvaimia, kun injektoidaan yksinään. (C) Gross Tuumorinäytteet lopussa kokeen esitetty. Suuremmat HCC kasvaimet muodostuvat, kun HCC-solut ovat yhteistyössä injektoitu H-valuuttalisiin (n = 5 per ryhmä) (D). (*

P

0,05; **

P

0,01).

arvioimiseksi osuus H-valuuttalisiin ja NSFs kannalta kasvaimen kasvu

in vivo

, joka on maksasyöpä ksenografti järjestelmä perustettiin kuvatulla menetelmät jaksossa. Nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisti HCC-solut, fibroblastit, tai HCC-solut ja fibroblastisolujen. Kasvaimen kasvua kirjattiin enintään 28 vuorokauden kuluttua solujen injektion. Tuumorin koko mittaus osoitti, että implantaation puhdasta H-valuuttalisiin tai NSFs ei johtanut kasvaimen muodostumiseen. Lisäksi co-injektio H-valuuttalisiin osaltaan sukupolven suurempien kasvaimia (HCC + H-valuuttalisiin

vs

. HCC,

P

0,05, n = 5) vastakohtana co-injektion NSFs, joita ei tehostanut syöpäkasvain muodostumisen tai kasvun (HCC + NSFs

vs

. HCC,

P

0,05, n = 5) (Fig. 2C ja kuva 2D).

Lisäksi tämä edistäminen kyky vahvistettiin prosenttiosuus Ki-67-positiivisia kasvainsoluja kasvaimen solmuissa. Ki-67 (+) runsaus suoraan heijastaa kasvavaa osa kasvain kudosten. Kuten odotettua, kasvainten muodostettu HCC ja H-valuuttalisiin näytetään vahva ja tiheä Ki-67 ilmentyminen, kun taas kaksi muuta ryhmää osoitti kohtalaista ja hajallaan Ki-67-värjäys (Fig. 3A). Mielenkiintoista, yleisyydestä Ki-67-positiivisia soluja havaittiin noin fibroblasteissa sisällä leikesarjojen, erityisesti alueilla, joilla on massiivinen kuolion, mikä edelleen ehdotti edistävää roolia fibroblasteissa selviytymisen kasvainsolujen (Fig. 3B).

(A) Ki-67 ilmentyminen HCC-soluissa oli huomattavasti suurempi kasvaimen solmujen muodostama yhteistyössä injektio 97L solujen ja H-valuuttalisiin, joka oli toisin kuin tulokset kasvainten muodostaman yhteistyössä injektio 97L ja NSFs tai 97L soluja yksinään. (B) Ki-67-positiivisia soluja oli runsaasti lähellä α-SMA (+) CD31 (-) fibroblasteissa sisällä sarja tuumorisektioiden. Näytteissä, jotka oli kaksinkertainen immunovärjättiin α-SMA (punainen väri, musta rivi) ja CD31 (ruskea väri, punainen rivi), CD31 ei ilmaistu α-SMA-positiivisia soluja (ylempi paneeli). Kun kaksinkertainen immunovärjättiin α-SMA (punainen väri) ja Ki-67 (ruskea väri), esiintyy paljon kasvainsolujen Ki-67 lauseke (ruskea väri, punainen rivi) havaittiin löytyy läheisyydessä H-valuuttalisien kanssa α SMA-positiivista värjäytymistä (punainen väri, musta rivi) (alempi paneeli). (C) nekroosin massiivisesti vähennetty kasvain solmuissa tuottamat yhteistyössä injektio fibroblastien (+ NSFs tai + H-valuuttalisiin), verrattuna kasvaimia muodostettu 97L solu injektiona yksinään (kontrolli). (D) α-SMA ilmentymistä havaittiin kaikissa tuumoriksenografteja, mukaan lukien kasvain solmut muodostaa ilman fibroblasti co-injektio (kontrolliryhmä).

Tämä parantaa kasvaimen solmu kasvua voidaan paitsi vahvistaa leviämisen edistäminen vaan tukee myös välttämällä kuolion. Kuolio tapahtui kasvaimen solmut kolmeen ryhmään, kun solmu halkaisija kasvoi tietylle tasolle. Mielenkiintoista, nekroottinen sisällä alueiden leikesarjojen olivat paljon pienempiä kasvain massat kehitetty fibroblasteja (Fig. 3C). Lisäksi jäännöksen kasvain solujen nekroottista alueilla jaettiin noin fibroblastit ekspressoivat α-SMA, joka voimakkaasti osoitti selviytyminen roolia fibroblastien pahanlaatuisten solujen (Fig. 3B).

Lisäksi mielenkiintoinen ilmiö havaittiin meidän kokeilu. H-valuuttalisiin havaittiin myös kasvaimen solmut on muodostettu vain HCC-solut, jotka ehdottivat, että kasvainsolut voivat aiheuttaa tiettyjen solujen alkuperä on tuntematon muuntua valuuttalisiin (Fig. 3d).

HGF on mukana parantaa proliferaatiota HCC-solujen

Sen erittäin osoitti, että H-valuuttalisiin voisi kommunikoida HCC-solujen kautta paracrine tilat koska H-CAF kunnostettu alusta edistänyt leviämisen HCC soluja. Siksi kasvutekijät ja kemokiinit voivat olla tärkein välittäjiä, joiden kautta fibroblastien kommunikoida syöpäsoluja. Mittasimme tasoja neljän aikaisemmin raportoitu sytokiinien, SDF-1 [15], HGF [16], TGF-β [1], [3] ja EGF, että väliaine H-valuuttalisien. ELISA osoitti, että HGF pitoisuus väliaine H-valuuttalisiin oli korkein joukossa neljän tyyppisiä fibroblasteissa. PTF myös osoittaneet korkeaa eritystä HGF, joilla ei ole merkittävää eroa verrattuna H-valuuttalisien. HGF erittämä NLFs väheni huomattavasti verrattuna H-valuuttalisiin ja esitteli laskeva suuntaus verrattuna PTF. Lisäksi, NSFs ei eritä HGF. Nämä tulokset osoittivat, että HGF eritys korreloi fibroblastien tyyppiä. Kuitenkin tämä samanlainen suuntaus ei havaittu pitoisuuksien SDF-1, TGF-β tai EGF erittää eri fibroblasteissa (Fig. 4A).

(A) taso SDF-1, HGF, TGF-β ja EGR vakioitu väliaine johdetaan H-valuuttalisiin määritettiin ELISA: lla. H-valuuttalisiin ja PTF erittyy HGF huomattavasti korkeampi kuin NLFs, kun taas NSFs erittyy lähes ei havaittavaa HGF. Kuitenkin NSFs erittää korkeampi SDF1 kuin muut kolme fibroblastien tyyppejä. TGF-β ja EGF eritys olivat samanlaiset neljän fibroblastien tyyppejä. (B) Solujen lisääntyminen kasvoi altistettaessa eri pitoisuuksia HGF, kuten on osoitettu CCK-8 testeissä. HGF edistänyt HCC soluproliferaatiota kaikilla pitoisuuksilla. (C) lisäys leviämisen HCC solujen välittämiä H-CAF elatusaine antagonisoi merkittävällä HGF-neutraloiva vasta-aine. Lisäksi, anti-HGF ei häiritse leviämisen 97L soluja. (*

P

0,05; **

P

0,01).

Oli mielenkiintoista, että taipumus HGF tuotanto oli yhteneväinen kasvaimen tilavuus kasvu, mikä johti hypoteesiin, että HGF ollut välittäjänä rooli HCC leviämisen helpottaa H-valuuttalisiin (Fig. 2D ja Fig. 4A). Niinpä HGF analysoitiin CCK-8 kokeisiin sen proliferaatiopotentiaali. Tulokset olivat positiivisia kaikkien ryhmien eri pitoisuuksilla HGF (Fig. 4B). Lisäksi anti-HGF annettiin antagonisoinut H-CAF väliaine on HCC-soluissa ja vähentää merkittävästi proliferaatiota (Fig. 4C). Lisäksi HGF ei havaittu väliaine on 97L soluja, jotka suljettiin pois HGF autokriinisen stimuloivan reaktiotien HCC-soluissa. Tämä havainto on vielä osoituksena se, että anti-HGF ei häiritse leviämisen 97L-solujen (Fig. 4C). Kuitenkin, proliferaatio ei kokonaan poistaa, mikä merkitsi sitä, että HGF ei ole ainoa sytokiini mukana molekyylimekanismi pahanlaatuisten solujen proliferaation välittämiä H-valuuttalisiin.

H-CAF-eritetyn HGF indusoiman HCC-solujen lisääntymisen

Lisäksi olemme analysoineet HGF tasolla kunnostetussa alustassa H-valuuttalisiin, normaali maksasoluissa (LO2) ja HCC-solut (97L ja Hep3B) ELISA jättää mahdollisuutta HGF autokriininen mekanismi. Tuloksemme osoittavat suuren eron HGF eritys välillä H-valuuttalisiin ja maksan peräisin olevien solujen riippumatta pahanlaatuinen luonteeltaan. Lisäksi HGF ei ole havaittu LO2 kunnostettua alustaa (Fig. S1A). Selvittämään tätä roolia H-valuuttalisiin HCC etenemisen edelleen, vertasimme lisääntymistä edistävää kykyä H-valuuttalisiin kuin LO2 soluja. Tuloksemme osoittavat, että H-valuuttalisiin oli merkitsevästi voimakkaampi vaikutus HCC proliferaatioon kuin LO2 soluja. Kaikki havainnot viittaavat siihen, että HCC-solujen lisääntymistä ei aiheuttanut autokriinisellä tavalla (Kuva. S1B). Siten meidän tiedot viittaavat siihen, että HCC lisääntymistä edistetään parakriinisesti HGF erittämän H-valuuttalisiin.

Patologiset aktivointi on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista H-valuuttalisiin

yhtäläisyydet löytyivät fenotyyppi ja leviämisen lisälaite keskuudessa NLFs, PTF ja H-valuuttalisiin (Fig. 1A, Fig. 1B, Fig. 2A ja 2B) in

in vitro

kokeiluja, kuten α-SMA ilme. Kuitenkin saaduissa fibroblasteissa alueilla kasvainkudoksen, peri-kasvainkudoksen ja normaalin maksakudoksissa ilmaisseet eri α-SMA, erityinen merkkiaine fibroblastien aktivoitumisen. Tämä epäyhtenäisyys tulokset saattavat johtua siitä, että fibroblastit muuttaisi staattisesta, pericyte kaltainen fenotyyppi aktivoituun fenotyyppi muistuttava myofibroblasteja muutaman päivän viljelyn

in vitro

. Verrattuna aikaisemmassa tutkimuksessa, normaalien fibroblastien aktivoitiin sen jälkeen 1 viikko viljelyn

in vitro

, joka on tunnettu siitä, että α-SMA ilmentymisen (1A ja kuvio. 1 B). Siten oli loogista oletuksen, että PTF ja NLFs olivat staattisia kasvaimissa ja aktivoituvat kulttuuriin. Lisäksi H-valuuttalisiin oli suhteellisen aktivoidaan kasvaimissa. Sopusoinnussa tämän hypoteesin, esillä oleva tutkimus osoitti, että PTF ja NLFs olivat ”pericyte kuten”, kun taas H-valuuttalisiin olivat ”myofibroblastin kuten”, kun ne alun perin eristettiin Tuumorinäytteet (Fig. 5A). Edelleen testata tätä hypoteesia, immunofluoresenssilla havaitsemiseen käytettiin α-SMA ilmentymisen eri tyyppisiä fibroblastien inkuboitiin 24 tuntia eristämisen jälkeen alkuperäistä kudosta. Kuten kuviossa 5B, H-valuuttalisiin olivat aktivoidussa vaiheessa, kuten on osoitettu α-SMA ilmaisu, kun taas PTF ja NLFs esitti lepää fenotyypin, kuten on osoitettu negatiivinen α-SMA värjäys, mikä osoittaa, että patologiset aktivointi voi olla pääsyy välinen ero normaalien fibroblastien ja H-valuuttalisiin.

(A) mikroskooppi kuvia H-valuuttalisiin, PTF ja NSFs inkuboitiin 24 tuntia. Kun alunperin eristettiin kasvain näytteet, PTF ja NLFs esitetään staattinen, pericyte kaltainen fenotyyppi, kun taas H-valuuttalisiin kanna aktivoitu fenotyyppi muistuttava myofibroblasteja. (B) ekspressio α-SMA, FAP, FSP ja fibronektiinin H-valuuttalisiin, PTF ja NSFs inkuboitiin 24 tuntia määritettiin immunofluoresenssivärjäyksen. α-SMA ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi H-valuuttalisiin ja suhteellisen olematon muissa fibroblastien tyyppejä kun analysoidaan heti sadonkorjuun kasvain yksilöitä. Tämä ero osoittaa, patologisesti aktivoitu luonnetta H-valuuttalisiin ja suhteellisen staattinen luonne muiden fibroblastien sisällä alkuperäisen kudoksissa.

läsnäolo H-valuuttalisiin positiivisesti korreloi kasvaimen koon

määrittämiseksi kliinistä merkitystä H-valuuttalisiin yhteydessä kasvaimen kasvun, tutkimme läsnäolo H-valuuttalisiin kuluessa kasvaimen näytteestä saatujen 43 potilaiden α-SMA immunoreaktiivisuus. Tuloksemme osoittavat, että kaksikymmentäseitsemän potilasnäytteillä näkyy korkeatasoinen värjäyksen H-valuuttalisiin, kun taas loput kuusitoista näytteiden esittelyyn on alhainen värjäyksen H-valuuttalisiin (Fig. 6A). Huomattavaa on, että yhdistäminen H-valuuttalisiin oli merkitsevästi yhteydessä suurempi kasvaimen kokoa (Fig. 6B ja taulukko S1), mikä viittaa siihen, positiivinen korrelaatio suhteellinen runsaus H-valuuttalisiin ja kasvaimen kasvua kliinisestä tasolla.

(A) runsaus H-valuuttalisiin oli kaksijakoinen kahteen tasoon, tiheän ja alhainen tiheys. (B) Tuumoritilavuudet korkean tiheyden (n = 27) olivat merkittävästi korkeampia kuin kasvainten alhaisen tiheyden (n = 16,

P

= 0,006).

keskustelu

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien osuus 90% kaikista tapauksista ensisijainen maksasyövän. Rooli kasvaimen mikroympäris- aikana karsinogeneesissä on suurelta osin tutkittu dynaaminen järjestelmä johtamasta tulehdussolujen, kuten syöpäsoluja. Mikroympäristössä HCC koostuu fibroblastien, valtaavat tulehdussolujen, endoteelisolujen (EC), perisyyteissä vieressä hankittua, ja laaja soluväliaineen (ECM) komponentteja. Karsinooma liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisiin) on yksi tärkeimmistä komponenteista HCC mikroympäristön. Edellisessä tutkimuksessa olemme menestyksellisesti eristetty erityisiä karsinooma liittyvien fibroblasteissa HCC (H-valuuttalisiin) primaarisista HCC kudosten ja osoittivat, että H-valuuttalisiin tukahdutti NK-solujen aktivaation ja loi suotuisat immunosuppressiivista suojakilven HCC-soluissa.