Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

MikroRNA (miRNA) ilmentyminen on muuttunut syöpäsoluissa, ja miRNA voisivat toimia ja ennustavia biomarkkereiden syöpäpotilaille. Tutkimuksen tavoitteena oli analysoida kiertävän miRNA ilmaisun pahanlaatuinen pleuraeffuusio (MPE) ja niiden yhteydessä potilaiden eloonjäämisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Methods

Pleuraeffuusio alkaen 184 potilasta NSCLC ja MPE kerättiin. MiRNA microarray ja bioinformatiikan tulkinta käytettiin arvioimaan miRNA ilmentymisen profiilit 10 pienisoluista keuhkosyöpää eri eloonjäämisennuste. Yhdistykset olivat validoitu 184 potilasta (satunnaisesti luokiteltu koulutus ja validointi asettaa yhtä monta kussakin ryhmässä) käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Riski tulokset muotoiltiin perustuu ilmaus allekirjoitus miRNA. Kliiniset tiedot, kuten potilaiden eloonjäämisen, kerättiin korrelaatioanalyysiä.

Tulokset

Kolmekymmentäkolme miRNA havaittiin muuttaa yli kaksinkertaisesti microarray pahanlaatuiset effusions välillä pidemmän selviytymisen ja lyhyempi-selviytymisen ryhmiä, ja tasot viisi miRNA (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 ja miRNA-345) olivat merkitsevästi yhteydessä kokonaiselossaolo. Korkea ilmentyminen miR-100 ja alhainen ilmentyminen miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 ja miRNA-345 oli yhteydessä huonoon säilymiseen sekä koulutus ja validointi kohortti. Potilaat, joilla on korkea riski tulokset olivat yleisesti huonon eloonjäämisen verrattuna potilailla, joilla on alhainen riski tulokset. Riskiluku oli itsenäinen ennustaja elossaololuku.

Johtopäätökset

Expression malleja miRNA systemaattisesti muutettu MPE potilaan kanssa NSCLC. Viisi miRNA allekirjoituksensa effuusio voi toimia ennustaja eloonjäämisaste potilaiden kanssa keuhkosyövässä.

Citation: Wang T, Lv M, Shen S, Zhou S, Wang P, Chen Y, et al . (2012) Cell-Free MicroRNA Expression Profiles in Pahanlaatuinen Effuusiomenetelmä Associated kanssa Patient Survival in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (8): e43268. doi: 10,1371 /journal.pone.0043268

Editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 18, 2012; Hyväksytty: 18 heinäkuu 2012; Julkaistu: 24 elokuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81101552), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (BK2011571), Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education (20100091120002), ja perustutkimus rahastojen Central yliopistot (1118021418 ja 1118021406). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yksi merkittävimmistä syövän syiden kuoleman maailmanlaajuisesti. Viisitoista prosenttia keuhkosyöpään potilailla voi olla pahanlaatuinen pleuraeffuusio (MPE) aikaan alustavan diagnoosin ja puoli kehittää pleuraeffuusiota myöhemmässä vaiheessa tauti [1]. MPE on huono ennustetekijöitä merkki potilaille NSCLC. Kasvain leviävät selviytymistä ja kasvainsolujen lisääntymistä in pleuraeffuusio on tärkeä reitti etäpesäke ja usein syynä sairastuvuuteen NSCLC. Edistysaskelista huolimatta hoitomuotoja, mediaanielossaolosta on hyvin lyhyt. Esillä tavallinen hoito näyttää olevan maksimaalinen turvallinen evakuointi pleuranesteeseen seurasi suonensisäinen kemoterapiaa tai intrapleural kemoterapiaa [2] .Kuitenkin todettiin, että kaikki potilaat olivat hyötyneet lisäämällä kemoterapiaa, erityisesti potilaiden kanssa lyhyessä yleistä elinaika . Näin ollen, prognostisia arviointi potilaan on välttämätöntä valita paremmin hoitostrategioita. Hsu et al. osoitti, että ekspressiotasot angiogeneettisiä biomarkkereiden merkittävästi korreloivat potilaan selviytymistä ja pleuraalieffuusio ohjaus [3]. Lisäksi viimeaikaiset molekyyli- ja geneettistä kartoitusta tutkimukset voitaisiin tunnistaa useita markkereita ja ainutlaatuisia allekirjoituksin ja ennustavia tekijöitä NSCLC. Nämä havainnot avannut mahdollisuuksia non-invasiivisen syövän diagnoosi ja ennuste. Osa tuloksista on partaalla käännetään kliiniseen käyttöön.

MikroRNA (miRNA) ovat 18- 25-nukleotidin, ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka säätelevät ilmentymistä monien geenien. Niiden keksimisestä lähtien, miRNA on havaittu säätelemään erilaisia ​​soluprosesseja, mukaan lukien apoptoosin, erilaistumista ja soluproliferaatiota [4], [5]. Epänormaali ilmauksia erityisiä miRNA ovat patogeneesiin erilaisten ihmisen syöpien, ja miRNA ilmentymisen profilointi ihmisen kasvaimista on tunnistettu allekirjoitukset liittyy diagnoosi, lavastus, eteneminen, ennusteen ja hoitovasteen mukaan. Prognostisia potentiaali miRNA on osoitettu kroonisen lymfaattisen leukemian [6], keuhkosyöpä [7], [8], rintasyövän [9], ja neuroblastoomat [10]. Vuonna keuhkosyöpä, korkea pre-miR-155 ja alhainen let-7 oli raportoitu korreloivan huonon ennusteen [11], kun taas miR-34a voitaisiin käyttää ennustetyövälineenä merkki uusiutumisen kirurgisesti resektoitiin NSCLC [12 ]. Viime aikoina useat raportit viittaavat siihen, että solutonta kiertävän miRNA ovat havaittavissa seerumin /plasman ja tasot kasvainperäinen miRNA kohonnut potilailla, joilla keuhkosyövässä [13], [14], mikä viittaa siihen, että veri-pohjainen miRNA voisi syntyä niin vallankumouksellinen lähteitä biomarkkeri keuhkosyövän diagnoosin ja ennusteen. Kuitenkin miRNA allekirjoitus MPE, joka voi ennustaa kliinistä tulosta NSCLC potilaat eivät olleet tähän mennessä löydetty.

Aiemmissa tutkimuksissa olemme menestyksekkäästi eristetty solutonta nukleiinihapon pahanlaatuinen effusions ja osoittivat, että solun vapaa BIRC5 mRNA voitaisiin käyttää voimakas diagnostinen biomarkkeri MPE [15]. Olemme myös havainneet, että miR-24 ja miR-30d ovat eri ilmaistaan ​​hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset effusions, kun taas solu-free miR-152 voidaan käyttää ennustamaan kemosensitiivisyys dosetakselin [16], [17]. Koska ennustetekijöiden mahdollisuuksia miRNA syövän, tavoitteena oli selvittää, onko solutonta miRNA in pleuraeffuusio voitaisiin käyttää ennustamaan elinaika potilailla, joilla on pahanlaatuinen pleuraeffuusio toissijainen NSCLC.

Tulokset

havaitseminen effuusio miRNA ja bioinformatiikan tulkinnan toiminnallisia miRNA

Kaikki potilaat seurattiin vasta 16 syyskuu 2011 tai kuolinpäivä. Kaikki 184 eloonjäämistä mediaani 6 kuukautta (vaihteluväli: 1-33 kuukautta). Yleinen kumulatiivinen potilaiden osuus elossa 3 kuukauden kohdalla oli 0,70, oli 6 kuukauden 0,45, ja 12 kuukauden kohdalla oli 0,11.

havaitsemiseksi eri miRNA välillä pidemmän selviytymisen ryhmä ja lyhyemmän selviytymisen ryhmä, microarray kehitettiin 10 potilaalla. Kuten taulukosta 1, 5 potilaalla pidemmällä selviytymisen ryhmässä ja 5 potilasta lyhyemmän selviytymisen ryhmässä oli täsmälleen vastinetta taajuudet histologisen tyypin ja vaiheen, vaikka ikä, tupakointi, ja sukupuoli eivät eronneet merkittävästi näiden kahden ryhmiä. 113 miRNA havaittiin näillä 10 potilaalla mukaan miRNA mikrosirulla (File S1). Käyttämällä luokka vertailu analyysi, 33 riippumatonta miRNA tunnistettiin sen ekspressoitua eri kahteen ryhmään, joissa kertamuutoksia 2 (taulukko S1). Tulivuori tontti tarjotaan lisätietoja merkittävyys ja suuruusluokka ilmeikäs muuttamisen näiden valittujen miRNA (kuva S1), joka on ollut hyödyllinen arvioitaessa merkittävin ehdokkaita seurantatutkimuksissa.

David geeni huomautus käytettiin tulkita biologista vaikutusta miRNA suodattaa tulivuori juoni. Tulosten mukaan tiedonlouhinta, 31 alkuperätakuita luokiteltiin pohjalta näiden miRNA tavoitteet (kuvio S2A). Toinen funktionaalinen analyysi miRNA mukaan Kegg osoitti, että 9 signaalintransduktioreitteihin osoitettiin osallistua eri elinaika potilailla, joilla on keuhkosyöpä (kuvio S2B). Nämä tulokset ovat uusia todisteita sääntelyn vaikutusta miRNA keuhkosyöpään kautta kohdegeenien ja signalointireitille. Lisäksi miRNA-mRNA verkko analyysi integroitu miRNA ja mRNA hahmotellaan vuorovaikutukset miRNA ja kohdennettujen geenien (kuvio S3). Ottanut nämä bioinformatics tulkintoja toiminnallisten miRNA yhdessä, 5 miRNA (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 ja miRNA-345) valittiin lisäanalyysiä.

välisestä assosiaatiosta ilmaus miRNA in effuusio ja potilaiden eloonjäämisen

testataan ennakoivan vaikutuksia näiden viiden miRNA keuhkosyöpään eloonjäämisennustetta 184 potilasta, satunnaisesti ryhmitelty koulutus kohortti (n = 92) ja validointi kohortti (n = 92). Ominaisuudet näistä potilaista NSCLC on esitetty taulukossa 1. koulutus kohortin korkea effuusio ekspressiotasot miR-100 (mediaani, 0,02) ja alhainen ekspressiotasot miR-134 (mediaani, 0,50), miR-345 (mediaani , 0,09) miR-151 (mediaani, 0,05), ja miR-93 (mediaani 0,03) olivat kaikki yksitellen liittyy pienempi MSTs (7,1 kuukautta vs. 4,3 kuukautta mir-134, 7,1 kuukautta vs. 3,9 kuukautta mir-151, 8,2 kuukautta vs. 2,9 kuukautta mir-345, 9,2 kuukautta vs. 5,5 kuukautta mir-93, ja 8,0 kuukautta vs. 5,2 kuukautta mir-100, taulukko 2 ja kuvio 1A). Kun nämä kynnysarvot sovellettu validointi asettaa, vertailukelpoinen log-rank

P

arvot ja HRS havaittiin (taulukko 2 ja kuvio 1 B).

A) 92 potilasta koulutuksessa tietojoukon . B) 92 potilaasta datajoukolla. C) Riskin pisteet ja eloonjäämiseen koulutukseen tietokokonaisuus D) Risk pisteet ja yleisen eloonjäämisen datajoukolla.

Coxin suhteellista vaara regressioanalyysi kaikkien 184 näytteet osoittivat, että ekspressiotasot viiden miRNA liittyivät merkittävästi syöpään kuolema (

P

= 0,004 mir-134,

P

= 0,01 miR-151,

P

= 0,008 mir -345,

P

= 0.03 mir-93, ja

P

= 0.02 mir-100, taulukko 3). Oli neljä miRNA jotka olivat suojaavia ja yksi miRNA joka oli riskialtis perustuu korrelaation niiden ilmaisuja ja yhdessä potilaan selviytymisen.

luonne 5 miRNA ilmaisun allekirjoitus

Nämä 5 miRNA olivat käytetään sitten luoda allekirjoituksen laskemalla riskiluvun kullekin potilaalle. Riskin mukaisesti tulokset, potilaat koulutuksessa kohortin jaettiin korkean ja matalan riskin ryhmiin käyttämällä mediaani diabetesriskitestiin sulku. Potilaat kuuluvat korkean riskin ryhmään oli lyhyempi elinajan mediaani kuin potilailla, joilla on alhainen riski pisteet (9,4 kuukautta vs. 4,0 kuukautta,

P

= 0,003). Sama riski-pisteet kaava ja cutoff pisteen saatu koulutus kohortti sovellettaisiin 92 potilasta validointi kohortissa. Samanlainen havainnot training set eloonjääminen oli suurempi matalan riskin ryhmässä kuin korkean riskiryhmän koko seurannan (taulukko 4, kuvio 1C).

Effuusiomenetelmä miRNA ilme allekirjoitus on riippumaton tupakoinnista

jotta onko 5 miRNA ilmaus allekirjoitus perustuva riskiluku on itsenäinen ennustaja keuhkosyöpään potilaan selviytymistä, suoritimme Coxin regressioanalyysiä. Kuten taulukossa 5, tupakointi, ikä ja riskien pisteet olivat tilastollisesti merkitseviä eloonjäämistekijöiden käyttäen Coxin muuttujan regressiomallin. Kuitenkin, kun Coxin monimuuttuja regressio mallia sovellettiin, riskiluku (

P

= 0,01) ja tupakointi (

P

= 0,04) olivat molemmat riippumattomia ennustajia elossaololuku (taulukko 5).

keskustelu

Käyttämällä näyte-halkaisu lähestymistapa, 5 miRNA ilmaus allekirjoitus, joka voi ennustaa selviytymistä sekä koulutukseen ja validointi sarjaa tunnistettiin tässä tutkimuksessa. Vielä tärkeämpää on, 5 miRNA ilmaus allekirjoitus oli itsenäinen prognostinen merkkiaine huono selviytymisen aikaa monimuuttujamenetelmin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti on miRNA ilmaisun allekirjoituksen pahanlaatuinen Pleuraeffuusiot joka voisi ennustaa NSCLC elossaololuku.

käyttää miRNA microarray havaita eri tavalla ilmaistuna miRNA. Verrattuna lyhyemmät-selviytymisen ryhmä, 21 miRNA oli säädelty ja 12 miRNA olivat alassäädetty pitemmän selviytymisen ryhmässä. Useimmat aiemmat tutkimukset valitaan miRNA perustuu

P

arvot ja taitto muutoksia. Täällä käytetään lisäksi bioinformatiikan tulkinnan toiminnallisia miRNA valita miRNA. GO aikavälillä ja Kegg polku merkintä levitettiin tavoitteensa geenipooli. Tämän seurauksena Kegg merkintä paljastui merkittäviä proliferatiivisia (MAPK ja Wnt), selviytyminen (TGF-β ja mTOR), liima, onkogeeninen ja aineenvaihdunnan signalointireitteihin oli runsaasti joukossa merkittävästi rikastettu niistä. Useimmat niistä on jo raportoitu osallistua keuhkosyöpä edistäminen. GOS liittyvät signaalitransduktion, solujen kasvuun, apoptoosin ja aineenvaihduntaa edusti suurinta merkittävästi rikastettu GO termejä, jotka oli mukaisesti Kegg analyysiin. Tämä toiminnallinen identiteetti vahvistettiin systemaattista muutosta miRNA ja niiden kohdegeenien aikana kasvaimen muodostumisen ja edistäminen. Mirna-mRNA vuorovaikutusverkosto analyysin lisäksi integroitu bioinformatiikan havainto, ja sitten esitteli keskeiset tavoitteet miRNA. Keskellä verkko oli edustaa tutkinnoittain, mikä tarkoittaa panos yksi miRNA geeneihin ympärillä. miRNA korkeammilla valittiin lisäanalyysiä varten. Siksi bioinformatiikka tulkinta voi auttaa meitä poimia miRNA tärkeitä tehtäviä aikana keuhkosyöpää etenemisen.

Viisi miRNA allekirjoitus tunnistettu tässä tutkimuksessa olivat yksi miRNA (miRNA-100), joka oli riskialtis ja neljä miRNA (miRNA-93 miRNA-134, miRNA-151 ja miRNA-345), jotka olivat suojaavia suhteessa niiden yhteydestä niiden ilmaisun ja potilaan selviytymistä. Suojaava ja riskialtis luonne miRNA on viittaavia niiden toiminnot ovat joko estävää tai edistämällä erilaisten ominaisuuksien syöpäsolujen kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lisääntynyt miR-100 on löydetty munasarjasyövän [18], maksasyövän ja ruokatorven okasolusyöpä [19], [20]. Hyvässä korrelaatio tietomme, miR-100 ilmentyminen liittyi etenemiseen ja ennusteeseen mahasyövän [21]. Zheng et al. osoittivat, että miR-100 säätelee solujen erilaistumisen ja eloonjäämisen kohdistamalla RBSP3, fosfataasi kaltainen tuumorisuppressoriproteiinia akuutti myelooinen leukemia [22]. Niistä neljä suojaava miRNA, vain miR-134 ilmoitettiin kohonneen solun selviytymisen indusoimalla G1 pidätys keuhkosyövän soluihin [23]. Tuloksemme osoittavat, että kaikki nämä neljä miRNA oli säädelty potilailla, joilla on pidempi elinaika. Ilmaisut Näiden miRNA korreloivat positiivisesti potilaan selviytymistä. Soluttautuminen effuusio mukaan lumophcytes voi johtaa kasvaimen immuunivasteen. Siksi me spekuloida, että miRNA liittyy parantunut eloonjääminen voi osoittaa tulehdusvastetta, joka on osoittautunut.

Tässä tutkimuksessa soluttomasti miRNA profiilit Pleuraeffuusiot havaittiin ensimmäisen kerran, mikä on paljon etuja. Sillä NSCLC potilaiden kanssa MPE, tavoitteet hoidon ovat äänenvoimakkuutta pleuraeffuusioon ja pidentää elinaikaa. Siksi thoracoscopically evakuointi nestekertymä on rutiinia kliinisissä. Kokoelma effuusio näytettä ei lisätä taakkaa potilaille. Lisäksi potilailla, joilla on keuhkosyöpä ja pahanlaatuisia effusions voi vastaanottaa leikkaushoitoa. Effuusio näyte on helpompi saada kuin kudosnäyte. Lisäksi miRNA biomarkkereina käytetään ennusteen kliinisessä ympäristössä on merkittäviä etuja verrattuna mRNA: ita. Toisin kuin mRNA: t, miRNA vuonna effusions pysyvät pitkälti ennallaan ja vakaa. Vaatimaton määrä miRNA voi riittää ennustaa potilaan selviytymistä. On osoitettu, että luokittelu useiden syöpien perustuu miRNA lauseke allekirjoitukset on tarkempi kuin mRNA allekirjoituksia [24].

Vaikka edelleen tulevaisuudentutkimuksista joissa on paljon potilaita perusteltua vahvistaa roolia miRNA allekirjoituksella ennustetyövälineenä tekijä esillä tulokset voivat olla merkittäviä kliinisiä seurauksia, koska ei ole olemassa vakiintunutta ennustetekijöiden merkki paitsi esikäsittely suorituskyky tilan pienisoluista keuhkosyöpää kanssa MPE [25]. Viisi miRNA allekirjoitus, jonka tunnuksena tässä tutkimuksessa, luokittelee potilaita onnistuneesti matalan riskin ja korkean riskin ryhmiin sekä koulutukseen ja validointi sarjoiksi. Tämä voi auttaa lääkärit tunnistamaan kuuluvien potilaiden suuri riski tehokkaammin adjuvanttihoito lisäksi tavanomaista hoitoa protokollaa. Meidän havainto, että viisi miRNA allekirjoitus voi ennustaa potilaan selviytymisen myös todennäköisesti synnyttää potentiaalisia molekyylikohteista kehittämiseksi syövän hoitoon. Koska miRNA voi kohdistaa useita geenejä, tarkempi tutkimuksia tarvitaan ymmärtää sääntelymekanismiin näiden miRNA joka todennäköisesti johtaa parempaan ymmärrystä keuhkopussin etäpesäke NSCLC.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet viisi miRNA allekirjoitus joka voi ennustaa elossaololuku pitkälle NSCLC. Vuodatuksia korkea ilmentyminen miR-100 ja alhainen ilmentyminen miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 ja miRNA-345 oli yhteydessä huonoon säilymiseen lopputulokseen. Nämä havainnot voivat olla vaikutuksia ymmärrystä kehittyneiden NSCLC, kehittäminen täsmähoitoihin ja valinta syöpäpotilaiden adjuvanttihoito.

Methods

Kaikki tutkimukseen liittyy ihmisen osallistujat ovat hyväksyneet ”Drum Tower Hospital eettinen komitea ”ja kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

näytteiden keräys ja RNA: n eristys

Effuusiomenetelmä näytteitä 184 peräkkäisen histologisesti vahvistettu keuhkosyöpä kerättiin vuosina maaliskuu 2006 joulukuuhun 2010 rumputorni sairaalassa ja Nanjing Rinta Hospital. Kukaan potilaista sai onteloon lääkkeen toimitus ennen näytteen keräämistä. 5 ml effuusio RNA uuttamalla kerättiin RNaasi-vapaa putkeen, joka sisältää sitruunahapon kullekin potilaalle. Supernatantti saatiin sentrifugoimalla 4000 g 20 minuuttia. 800 ui supernatanttia sekoitettiin 2,4 ml TRIzol LS-reagenssia (Invitrogen, CA, USA). Toinen 30 fmol ATH-miR159a täydennettiin kuhunkin näyteputkeen. Seuraavaksi kokonais-RNA sisältävät pieniä RNA uutettiin effusions käyttämällä miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa.

Microarray ja bioinformatiikan tulkinnan toiminnallisia miRNA

Mirna microarray oli kehitettiin 10 näytettä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kun merkittävä analyysi ja FDR analyysi, valitsimme differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukaan

P

-arvo kynnys ja kertamuutoksia [26]. GO analyysi sovellettiin analysoida päätehtävä ero ilmaisun geenit mukaan Gene ontologia, joka on keskeinen toiminnallinen luokittelu NCBI [27]. Vastaavasti Pathway analyysiä käytettiin selvittää merkittävä polun tasauspyörästön geenien mukaan Kegg, BioCarta ja Reatome [28]. Suhde on miRNA ja geenit laskettiin niiden differentiaalikaavojen arvoja, ja miRNA -Gene-verkko on rakennettu mukaan vuorovaikutuksia miRNA ja geenien Sanger miRNA tietokantaan [29]. Keskellä verkko oli edustaa tutkinnoittain, mikä tarkoittaa panos yksi MicroRNA geeneihin ympärillä. 5 miRNA korkeimmalla astetta valittiin jatkotutkimuksiin.

kvantitatiivinen RT-PCR

miRNA olivat käänteistranskriboitua cDNA AMV käänteistranskriptaasi (Takara, Japani). Kokonais-RNA (1,5 ui kutakin miRNA) käytettiin malleja, ja reaktioseosta inkuboitiin 16 ° C: ssa 10 min, minkä jälkeen 42 ° C: ssa 40 min ja 70 ° C: ssa 15 min: n denaturoimiseksi käänteistranskriptaasia. Kvantitatiivinen PCR reaktiot miRNA suoritettiin käyttäen UPL koetin (Roche, Basel, Switerland) ABI Stepone Plus Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 50 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Suhteellinen miRNA ekspressiotasoja laskettiin vertailevan Ct-menetelmällä ATH-miR159a referenssinä ja seosta RNA uutettiin ihmisen keuhkosyövän A549-soluja ja mahasyövän BGC-823-soluja (01:01), kuten kalibraattori.

tilastollinen analyysi

erot kahden ryhmän välillä arvioitiin t-testin. Liitot välinen eloonjäämiseen ja effuusio miRNA ekspressiotasoja analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä, log-rank testi, ja Coxin suhteellinen vaara regressiomalleja. Riskin tulokset jaettiin kaikille potilaille mukainen lineaarinen yhdistelmä ilmentymistason miRNA painotettu regressiokerroin koulutuksesta näytteistä. Riski pisteet laskettiin seuraavasti: riskitön pisteet = (1,21 × ilmentymistaso miR-100) + (- 0,28 × ilmentymistaso miR-134) + (- 0,33 × ilmentymistaso miR-151) + (- 0,35 × ilmentymistaso miR-345) + (- 0,19 × ilmentymistaso miR-93). Coxin vaiheittain regressiomallia ja ositus analyysit myös tehtiin. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa (SPSS 18, SPSS, Chicago, IL). Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin varten

P

arvojen 0,05.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

113 miRNA havaittiin näillä 10 potilaalla välillä pidemmän selviytymisen ryhmä ja lyhyemmän selviytymisen ryhmän miRNA mikrosirulla (File S1). Kertamuutoksia, FDR arvo ja p-arvo on laskettu kaikista miRNA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s001

(XLS) B Kuva S1.

Tulivuori juoni näyttää ilmennetty eri miRNA in effusions välillä pidemmän selviytymisen ryhmä ja lyhyemmän selviytymisen ryhmässä. Vaaka-akseli edustaa kertainen muutos kahden ryhmän välillä. Pystyakseli edustaa P-arvo t-testi erot näytteissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s002

(TIF)

Kuva S2.

GO ja polku analyysi perustuu miRNA kohdennettuja geenejä. Pystyakseli on GO (A) ja reitin (B) luokka, ja vaaka-akselilla on rikastumista GO ja polkuja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s003

(TIF)

Kuva S3.

miRNA-mRNA verkkoon. Punainen laatikko solmut edustavat miRNA ja sininen cycle solmut edustavat mRNA. Reunat osoittavat inhiboivaa vaikutusta miRNA RNA: lla. Keskellä verkko oli edustaa tutkinnoittain, mikä tarkoittaa panos yksi MicroRNA geeneihin ympärillä. miRNA-93 on suurin astetta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s004

(TIF) B Taulukko S1.

miRNA että ilmentyvät differentiaalisesti effusions välillä pidemmän selviytymisen ryhmä ja lyhyemmän selviytymisen ryhmässä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s005

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Qian Qian ja Like Yu Nanjing Chest Hospital tarjoamaan osa effuusio näytteitä.