Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solunulkoisilla rakkulat (EV) ovat keskeisiä tukijoita syöpään missä niillä on keskeinen rooli solu-solu viestintä ja siirtää pro-onkogeenisiä molekyylien vastaanottajalle soluihin en näin syöpä fenotyyppi. Täällä puhdistettu EV käyttäen suoraviivaista biokemiallisia lähestymistapoja useilta syöpäsolulinjoista sittemmin tunnettu nämä EV kautta useiden biokemiallisten ja biofysikaalisten menetelmiä. Lisäksi käytimme fluoresenssimikroskopiaa suoraan osoittaa sisäistämisen sähköajoneuvojen vastaanottajaan soluihin muutaman minuutin lisättäessä sähköajoneuvojen vastaanottajalle soluihin. Olemme vahvistaneet, että transmembraaniproteiini EMMPRIN, oletetaan olevan merkkiaine EV, todellakin eritetty kaikissa solulinjoissa tutkittu täällä. Olemme arvioineet vaste EV stimulaation useita erilaisia ​​vastaanottajan solujen linjat ja mitataan kykyä näiden puhdistettua EV ja indusoivan useiden tekijöiden erittäin ylössäädelty ihmisen syövissä. Tuloksemme osoittavat, että puhdistettu sähköajoneuvojen valikoivasti stimuloida eritystä useiden proteiinien osallisena ajo syövän monosyyttisoluilla vaan ainoastaan ​​satama rajoitettu toiminta epiteelisoluissa. Tarkemmin, osoitamme, että sähköautot ovat voimakkaita stimulaattoreita MMP-9, IL-6, TGF-β1 ja aiheuttaa eritystä ekstrasellulaarisen EMMPRIN, jossa kaikki olla rooli ajo immuuni kiertämisen, invaasion ja tulehdus kasvaimen mikroympäristössä. Näin käyttämällä kokonaisvaltaista lähestymistapaa, joka sisältää biokemialliset, biologiset, ja spektroskooppiset menetelmät, olemme alkaneet valaista stimuloiva rooleja.

Citation: Redzic JS, Kendrick AA, Bahmed K, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et ai. (2013) Extracellular rakkulat erittää Cancer Cell Lines stimuloiminen eritys MMP-9, IL-6, TGF-β1 ja EMMPRIN. PLoS ONE 8 (8): e71225. doi: 10,1371 /journal.pone.0071225

Editor: Jialin Charles Zheng, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 elokuu 2012; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Redzic et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoitetaan NIH hakemuksen numeron 1R01GM096019-01A1 Eze Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cellular irtoaminen on prosessi, joka esiintyy kaikissa soluissa keinona poistaa tarpeettomat solukomponenttien, mutta kriittinen rooli erittyy rakkulat solu-solu-viestintä alkaa nousta [1], [2]. Kalvon proteiinit irtoa kautta useita erilaisia ​​mekanismeja, jotka sisältävät ektodomeeni leviämistä ja erittymisen täyspitkä kalvoproteiinien kautta erittää rakkulat [3]. Vesicular irtoaminen tapahtuu ulospäin orastava solukalvon vapauttaa eräänlainen rakkula tunnetaan Mikrovesikkeliin tai sisäänpäin orastava kalvon kanssa lopulta vapauttamaan rakkulat tunnetaan eksosomeiksi [4]. Täällä me kollektiivisesti viitataan sekä mikrovesikkeleille ja eksosomeiksi kuten solunulkoista rakkulat (EV). Tämä ilmiö vesicular irtoaminen, eli EV irtoaminen, on myös havaittu useita erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien neurologiset häiriöt, virusinfektio ja syöpä [5] – [7]. Itse asiassa, EV irtoaminen tapahtuu suuremmassa määrin syöpäsoluissa verrattuna terveisiin soluihin ja tulokset vapautumisen pro-onkogeenisten molekyylien, kuten proteiinien, RNA: n ja DNA: n [8], [9]. Viime aikoina useita rooleja sähköajoneuvojen on syntynyt, joiden avulla nämä hiukkaset ajaa prosesseja välttämättömiä syövän kehittymisen ja etenemisen kuten angiogeneesin, tulehdus ja lääkeresistenssin [10]. On olemassa useita mekanismeja, joilla sähköajoneuvojen voi toimia vastaanottajalle soluissa. Esimerkiksi nämä voivat sisältää joko suoraa stimulointi solun reseptoreihin proteiineja EV pinnalla tai sisäistämisen sähköajoneuvojen vastaanottajan solussa, jotka molemmat johtavat myöhemmin stimulaation signalointipolkujen [1], [11]. Syöpäsolut näyttävät käyttää EV keinona solu-solu-viestintä siirtämällä niiden sisällön (DNA, RNA ja proteiini) vastaanottajalle solun, mikä johtaa muutoksen ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen fenotyyppi vastaanottajan solujen [12 ] – [14]. Proteiinipitoisuus EVS näyttelee olennainen osa sisäistämisen ja toimintaa EV. Esimerkiksi EV proteiinit kytkeytyvät vastaanottajan solujen tuloksena oton sähköajoneuvojen [15], ja EV osoitettiin siirtää onkopsykologista proteiineja johtaen fenotyypin muutos vastaanottajan solun [12] – [14]. Kuitenkin yksi jäljellä olevista kysymyksistä suhteen EV aktiivisuus onko olemassa eroja havaittu EV aktiivisuuden kesken eri vastaanottaja solutyyppien sekä mitkä proteiinit voidaan erittää mukaan EV. Tätä varten olemme arvioineet erot EV stimuloivaa aktiivisuutta useissa eri vastaanottajan solutyyppejä tutkimalla EV-stimuloimaa eritystä useista eri tekijöistä, jotka on osoitettu merkittävää osuutta ihmisen syövissä.

Meillä on puhdistettu sähköajoneuvojen terveistä yksilöistä, syöpäpotilailla ja useista eri nisäkkäiden syöpäsolujen linjat. Meidän puhdistusmenetelmä tuotti heterogeeninen populaatio sähköajoneuvojen joiden koko 20-300 nm osoittaa seosta eksosomeiksi ja mikrovesikkelien [4]. Havaitsimme täyspitkä transmembraanisen proteiinin soluväliaineen Metalloproteinase induktori (EMMPRIN), ehdotettu merkki sähköajoneuvojen [16] ja EV puhdistettu useista eri biologisista nesteen näytteitä ja kaikista eri solut linjat arvioimme täällä. Olemme näin ollen käyttää EMMPRIN markkerina myös puhdistetun EV. Fluoresenssimikroskopia osoitti, että meidän puhdistettua sähköajoneuvojen hoidettaviksi vastaanottajan solun suhteellisen lyhyessä ajassa, (5-15 minuuttia), ja paikantaa tuman ympärillä, mikä vahvistaa, että puhdistusmenetelmä johti aktiivisesti sähköajoneuvojen pystyy siirtämään niiden sisältö vastaanottaviin soluihin . Laaja perustuu arviointiin useista eri vastaanottajan solulinjoissa on osoittanut, että sähköajoneuvojen puhdistettiin näiden erityyppisten syöpien soluilla suosivista stimuloiva vaikutus erittyvien proteiinien kohti monosyyttejä mutta ei epiteelisoluihin. Itse asiassa, kun havaitsimme, että sähköajoneuvojen erittää kaikissa solulinjoissa tutkittiin tässä sisältävät täyspitkät EMMPRIN, EV myös edistää eritystä täyspitkä EMMPRIN itse ihmisen monosyyttisen leukemian soluja. Olemme havainneet, että sähköajoneuvojen ovat voimakkaita stimulaattoreita Transforming Growth Factor beta-1 (TGF-β1), Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) ja interleukiini-6 (IL-6). Tämä stimuloiva vaikutus sähköajoneuvojen aiheuttaa eritystä TGF-β1, MMP-9, IL-6 ja EMMPRIN, viittaa rooli sähköajoneuvojen ajo kasvainprogression stimuloimalla tekijät tärkeä immuunijärjestelmän veronkierron, invaasio ja tulehdus [17] – [19 ]. Tuloksemme tuo meidät lähemmäs ymmärtämään paremmin biologiaan eritetyn EV, etuuskohteluun solutyyppi on kannustanut sähköajoneuvojen ja molekyylejä, joita erittävät vastaanottaja stimuloitaessa niitä eritetyn EV.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka Statement for Human (potilas /luovuttaja) kokoelma biologisten nesteiden

Oheislaitteet verinäytteet kerättiin Coloradon yliopiston sairaalan Iholle Oncology Clinic. Vacutainers putket (punainen toppi, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) käytettiin seerumin keräys. Näytteet otettiin heti kuljetettiin laboratorioon, sentrifugoitiin 1200 x g 10 minuuttia, sitten pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Litiumhepariinia sisältäviä vacutainers (vihreä alkuun, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) käytettiin plasman kerääminen, heti kuljetetaan laboratorioon, sentrifugoitiin 800 x g 10 minuuttia 4 ° C: ssa. Plasma näytteet pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Askitesneste kerättiin pleuraeffuusiota hanat toimenpideradiologiassa yliopistossa Colorado sairaalan käyttämällä Vacutainer (punainen toppi, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Näytteet otettiin heti kuljetettiin laboratorioon jäissä, sentrifugoitiin 800 x g 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa poistetaan solujätteen. Näytteet pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Kokoelma biologisen nesteen näytettä hyväksyttiin Colorado Multi-Institutional Review Board (COMIRB # 05-0309), ja näytteet kerättiin seuraavista tietoisen kirjallisen suostumuksen.

Detection of Täyspitkä EMMPRIN biologisissa nesteissä

Ihmisen seerumi, plasma ja askitesneste näytteet suodatettiin käyttäen 0,22 pm suodattimen poistamiseksi soluihin ja solujen roskia. 10 ug ihmisen EMMPRIN biotinyloitua polyklonaalista vasta-ainetta (R 0,05 pidettiin merkittävänä.

nanohiukkasten Tracking Analysis Measurement

nanohiukkasten seuranta-analyysi (NTA) on yksi havaitsemisessa käytetyt eritetyn sähköajoneuvoja tietyssä näytteessä. Superose 6 kokoekskluusiokromatografia korkean molekyylipainon fraktioiden käyttäen NTA Versio 2.2 Build 0375 instrumentti (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Yhdistynyt kuningaskunta). Näytteet analysoitiin 1:10,000 laimennus ja 1 ml laimennettua näytettä käytettiin analyysiin.

fluoresenssimikroskopialla

1 x 10

6 solua /ml soluja sentrifugoitiin 1100 rpm: 5 minuuttia solujen pelletoimiseksi. Solut kiinnitettiin 200 ul: lla 1% Formaliini (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut sentrifugoitiin kuten edellä, supernatantti poistettiin ja solut pestiin 1 X PBS: llä kaksi kertaa. Soluja inkuboitiin 20 ul: aan EMMPRIN-FITC konjugoitu vasta-aine (Ancell, Bayport, MN, USA) valmistettiin 1:50 laimennus ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Solut pestiin 1 X PBS: llä kaksi kertaa seuraavan inkubointijakson aikana. Nuclear värjäys suoritettiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan käyttäen 1 ul /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) tahra (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Solut pestiin kaksi kertaa 1 X PBS: llä ja kiinnitettiin objektilaseille.

arvioimiseksi vuorovaikutusta ja lokalisointi sähköajoneuvojen THP-1-soluja, EV inkuboitiin Texas Red tahra 30 minuuttia huoneen lämpötilassa tumma. EV sentrifugoitiin 90 minuuttia 100000 x g: in TLA-55 roottori. Supernatantti imettiin pois, ja pelletti pestiin 1 X PBS: ssä jälkeen kehrätty taas yli 2 kertaa. Supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan 1 x PBS: ää. Mosaiikki EV lisättiin sitten soluihin ja inkuboitiin eri aikoina välillä 5 minuutista 24 tuntia 37 ° C: ssa. Solut visualisoidaan Nikon Ti Eclipse (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA) -käänteismikroskoopissa Nikon 100X PlanApo NA 1.4 tavoite. Kuvat otettiin kanssa Andor iXon EMCCD 888E kamera (Andor Technologies, South Windsor, CT, USA). Kuva-analyysi ja kvantifiointi suoritettiin käyttäen NIS Elements kuvankäsittelyohjelma (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA). Kaikki kuvat on otettu hankittiin huoneenlämmössä. Paikannusajat kuville oli 80 ms, 500 ms ja 300 ms sininen, vihreä ja punainen kanavia, vastaavasti. Kuvat prosessoitiin lukuja käyttäen ImageJ ja sitten valmistettu käyttäen Corel Draw.

mittaaminen muutos EMMPRIN Expression Upon Vesirakkuloiden Stimulation

Virtaussytometrianalyysi THP-1-soluissa värjätty EMMPRIN-FITC konjugoitua vasta-ainetta suoritettiin sen määrittämiseksi, onko muutoksia tason solun pinnalla EMMPRIN ilmaisu käsittelemällä EV. EMMPRIN tarkoittaa fluoresenssin voimakkuus (MFI) mitattiin käyttämällä Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC -virtaussytometrillä on käsittelemättömät solut, solut, joita käsiteltiin 1 X PBS: llä (puskuri käsiteltyjen solujen) ja EV käsiteltyjen solujen. Kaikki mittaukset tehtiin 24 tuntia stimulaation jälkeen ja suoritettiin käyttäen koko solupopulaation, eli 1 x 10

6 solua /ml stimuloidaan 24 tuntia.

mittaaminen muutos EMMPRIN eritys Upon Vesirakkuloiden Stimulation

supernatantti ohjaus, puskuri käsitelty ja EV käsiteltyjen näytteiden kerättiin onko olemassa mitään muutoksia määrän erittyvän EMMPRIN stimuloitaessa. 100 ui supernatanttia deglykosyloitiin, kuten on kuvattu aikaisemmin, ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla. EMMPRIN eritystä mitattiin käyttäen Western blot -analyysiä, kuten on kuvattu aikaisemmin.

Activity määritykset

eritys MMP-9: n ja IL-6 mitattiin useita solulinjoja käyttämällä Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) havaitseminen sarjat (ELISA Tech, Aurora, CO, USA). Soluille suspensiossa, 5 x 10

5 solua /ml kohden käytettiin 0,5 ml median 12-kuoppalevylle. Sillä kiinnittyneet solut, ärsykkeet tehtiin 12-kuoppalevyillä solujen 70-80% konfluenssiin. Kaikki toiminta määritykset suoritettiin seerumivapaassa. Supernatantti stimuloidut solut kerättiin 24 tuntia stimulaation ja tallennetaan -20 ° C: ssa, kunnes niitä tarvittiin. 100 ui supernatanttia käytettiin ELISA-levylle. TGF-β1 erittyy piilevä muodossa, siis näytteet tehtiin happamiksi pH-arvoon 2 käyttäen 1 M suolahappoa (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) ja inkuboitiin tunnin ajan huoneenlämpötilassa tuottaa immunoreaktiivisia muodossa TGF-β1 . Sitten näytteet neutraloitiin 1 M natriumhydroksidilla (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 100 ui aktivoitua näytettä levitettiin ELISA-levylle. Mittaukset toteutettiin kohti valmistajan protokollaa (ELISA Tech, Aurora, CO, USA).

Tulokset

Täyspitkä EMMPRIN palvelee kuin yleinen Marker sähköajoneuvojen Eritettyä biologisissa nesteissä sekä viljellyistä soluista

läsnäolo solunulkoisen EMMPRIN muodossa (s) arvioitiin aluksi useita erilaisia ​​biologisia nesteitä, kuten seerumia, plasmaa, ja askitesneste onko EMMPRIN voidaan käyttää yleisenä esiintymisen merkkiaine sähköajoneuvojen kuten on hiljattain ehdotettu [16]. Näytteet suodatettiin käyttäen 0,22 pm suodatin poistaa solujen ja solujen roskia ja immunosaostettiin (IPed) käyttäen EMMPRIN vasta-ainetta. Kun Deglykosylaatiota, täyspitkän proteiinin muodon (28 kDa) havaittiin ihmisen seerumista ja plasmasta sekä terveiden luovuttajien ja syöpäpotilaiden sekä askitesnesteestä kerätty syöpäpotilaita, joilla ei ole havaittavissa tasoilla tahansa pilkotun muodoista näissä biologisissa nesteet (ks. S1A ja Fig. S1B ihmisen seerumeissa ja askitesneste, vastaavasti). Massaspektrometria analyysi tryptisten pilkontatuotteet käytettiin yksiselitteisesti vahvistaa, että EMMPRIN on IPed seeruminäytteessä, Fig. S1C. Useita peptidejä kartoitus on ektodomeenia EMMPRIN havaittiin ja käytetään vahvistamaan läsnäolo solunulkoisen EMMPRIN sisällä seeruminäytteet, Fig. S1C. Kun läsnä on täyspitkä transmembraaninen proteiini, kuten EMMPRIN tunnistettu tässä sopusoinnussa yleisen eritys läpäisevien proteiinien kautta sähköajoneuvojen kaikissa biologisissa nesteissä, mutta tämä on edelleen esitetty seuraavassa.

Jotta johdonmukainen ja luotettava sähköajoneuvojen myöhemmin määrityksiä suoraan koetin niiden stimuloiva roolit, EV puhdistettiin useista eri nisäkkäiden syöpäsolujen linjat. EMMPRIN koettimena sen määrittämiseksi, onko tämä transmembraaniproteiini voidaan käyttää yleisenä markkeri sähköajoneuvojen kaikkien näiden solulinjojen analoginen EV puhdistettiin biologisista nesteistä, kuten edellä. Kahden rintasyövän solulinjoissa, MCF-7 ja MDA-MB-231, on käytetty ja EV puhdistettiin nämä solulinjat merkitään EV

MCF-7 ja EV

MDA, vastaavasti. Lisäksi, sekä monosyyttileukemiasolulinja, U937, ja haimasyöpä solulinja, L3.6pL, kanssa käytettiin EV johdettu näistä solulinjoista merkitään EV

U937 ja EV

L3.6pL, vastaavasti. Supernatantit soluista viljellään sopiva alusta täydennettynä antibiooteilla ja 3% EV vapaa FBS kerättiin 48 tunnin välein.

aiemmin käytössä menetelmät puhdistamiseksi erittyvä EV, päätimme käyttää kokoeksluusiokromatografiaa [27] . Erityisesti, Superose 6 kokoekskluusiokromatografia käytettiin valita suurten molekyylipainon fraktiot, Fig. 1A (punainen laatikko). EMMPRIN havaittiin EV fraktio kerätään kaikista testatuissa solulinjoissa tässä, kuvion. 1B, mikä osoittaa, että EMMPRIN eritys on laajasti esiintyvä prosessi.

A) Kokoekskluusiokromatografia eluutioprofiilin puhdistus vakioidun alustan eristämiseksi EV. Punainen ruutu vastaa eluutiopiikki puhdistetusta EV. B) EMMPRIN erittyy kautta sähköajoneuvojen kaikissa testatuissa solulinjoissa, kuten on esitetty Western blot koestettiin EMMPRIN vesikkelin jakeet puhdistettiin käyttäen kokoekskluusiokromatografiaa. C) nanohiukkasten seuranta analyysi osoittaa sähköajoneuvojen puhdistetussa näytteessä ja vahvistaa meidän koko poissulkemistavan puhdistamiseksi sähköajoneuvoja elatusaineesta. D) Elektronimikroskopia käytettiin visualisoimaan eritettyä EV. Näytetyt tiedot koskevat EV

MDA.

Näin tutkimuksemme tässä osoittavat, että solunulkoinen, täyspitkät EMMPRIN erityksestä EV on laajalti esiintyvä ilmiö sijaan solutyypin tietyn prosessin ja EMMPRIN saattaa olla käytetään yleisenä esiintymisen merkkiaine sähköajoneuvojen.

Vahvistus ja validointi Puhdistettu sähköajoneuvojen käyttää nanohiukkasten Tracking Analysis, elektronimikroskoopilla ja massaspekrometria

Käytimme useita menetelmiä yleisesti käytetään EV havaitseminen ja visualisointi edelleen vahvistaa meidän EV puhdistusmenetelmä ole meidän todistettu esiintyminen EMMPRIN yleisenä EV merkki (Fig. 1A, B). Erityisesti nanohiukkasten seuranta analyysi (NTA) käytettiin määritettäessä kokojakauma sähköajoneuvojen näytteissä. Perustuu kokojakauma sähköajoneuvojen havaittiin käyttäen NTA (Fig. 1 C), voidaan päätellä, että solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt erittää heterogeeninen populaatio sähköajoneuvojen kooltaan 20-300 nm. Kokovalikoima osoittaa, että nämä vesikkelit käsittävät pienempiä EV, joka tunnetaan eksosomeiksi (10-100 nm), ja suurempien EV tunnetaan mikrovesikkeleille (100-1000 nm). Huomaa, että edelleen sakkaroosigradientilla fraktiointi ja sitä seuraava Western blot -analyysillä tunnistettiin EMMPRIN sekä EV populaatioissa (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että EMMPRIN on yleinen markkeri molempien EV. Elektronimikroskopialla (EM) käytettiin havainnollistamaan sähköajoneuvoja erittyy eri solulinjoista kuten on esitetty puhdistetun EV

MDA (Fig. 1 D). EM-data osoitti myös heterogeenisyys vesikkelin koon määritettiin NTA. Massaspektrometria-analyysi tuotti myös esille useita muita EV markkereita, kuten CD63, CD81 ja anneksiini V, kuten on esitetty taulukossa 1, mikä edelleen validoida puhdistusmenetelmä käytetään tässä. Koska osapuolet kokojakauma havaita NTA ja EM ja tunnistaminen EV tiettyjen proteiinien, voimme päätellä, että puhdistusmenetelmä tuottaa sekoitus eksosomeiksi ja Mikrovesikkelien.

EV nopeasti otetuksi Vastaanottaja Cells

EV modulaatioon vastaanottajasolu toiminto on ehdotettu olevan ainakin osittain riippuvainen niiden alkuperäisestä käyttöönottoa ja lasti- (ks tarkastelun Lopez-Verrilli [28]). Sopusoinnussa kuten ehdotettua mekanismia, olemme huomanneet, että puhdistettu sähköajoneuvojen sisäistetään muutamassa minuutissa monosyyttileukemia THP-1-soluissa (kuvio. 2) ja monosyyttileukemia U937-soluissa (kuvio. S4) mikä vahvistaa biologista aktiivisuutta meidän puhdistetun EV. Erityisesti, me visualisoitiin sisäistämisen Texas Red värjättiin EV erillisinä puncti soluihin värjättiin EMMPRIN-FITC-vasta-ainetta, joka mahdollisti visualisointi solukalvon (Fig. 2, oikealla). Näin ollen näissä kokeissa olemme hyödyntäneet sitä, että EMMPRIN aluksi ilmentyy voimakkaasti vastaanottajalle solun pinnalla merkkiaineena solukalvon. Single kuvia kautta soluvolyymiä Z-pinot kerättiin vahvistaa, että sähköajoneuvojen todellakin sisäistetään eikä vain lokalisoitu solun pinnalla. Olemme myös määrällisesti solujen prosenttiosuus, jotka sisäistänyt sähköajoneuvojen laskemalla taajuus EV positiivisia soluja. Data keskimäärin kolme riippumatonta mittausta osoittaa, että rakkula sisäistämisen esiintyy 76%: lla soluista. Siten rakkula sisäistäminen ei ole harvinaista, mutta usein. Nämä tiedot osoittavat myös lokalisointia Texas Red värjätään EV on solukalvon, mikä osoittaa, että sähköajoneuvojen todennäköisesti sisällytetty tai assosioituvat solukalvon samoin kuin on sisäistetty.

Fluoresenssimikroskopia kuvia THP-1-solujen käsiteltyjen Texas punainen petsattu EV. Vasen paneeli – THP-1 solun värjätään EMMPRIN FITC ja DAPI. Punainen signaali on auto-fluoresenssi signaali solun. Lähi-paneeli – THP-1 solujen käsiteltyjen Texas Red tahra yksin. Signaali havaittu on sama kuin vasemman kuvan ja vastaa Texas punaisella taustalla ja solujen auto-fluoresenssi signaali. Oikea paneeli – THP-1-soluissa käsitelty Texas Red värjätään sähköajoneuvojen ja visualisoida jälkeen 5 minuutin itämisaika. Solukalvon värjätään EMMPRIN-FITC-vasta, EVS näkyvät punaisina ja DAPI värjätään ydin näkyy sinisenä. Viittaus baari on 10 pm.

EV Edistää eritys Useat syöpään liittyvien tekijät

Initial aktiivisuusmäärityksillä.

Aluksi seulottiin useita vastaanottaja solulinjoja määrittää joka mahdollisesti viljellyt solut reagoivat meidän puhdistettua EV

MCF ja EV

MDA. Erityisesti, MMP-9: n ja IL-6 eritystä (Fig. S2 ja Fig. S3, vastaavasti) seurattiin stimuloitaessa EV

MCF-7 ja EV

MDA käyttäen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), koska molemmat näiden proteiinien ilmentyminen li- sääntyy useita syöpiä yhdessä EMMPRIN markkeri EV [29], [30]. Yleensä huomaamme, että on olemassa etuoikeutettu valikoivuus solutyypin herättämään vasteen EV stimulaation. Esimerkiksi U937 monosyyttistä solut reagoivat erittävien sekä IL-6: n ja MMP-9 stimuloitaessa EV verrattuna epiteelisoluihin. Teimme tarkkailla kasvu IL-6 eritystä sekä HFF ja MBA-MB-231-solujen stimuloitaessa EV

MDA kuitenkaan kumpikaan eritystä IL-6 tai MMP-9 stimuloitiin EV

MCF- 7. Siten, koska U937-solut herättivät merkittävin vasteen stimuloitaessa molempia sähköajoneuvojen käytetään näissä aluksi ELISA-määritykset, keskityimme monosyyttisoluilla, THP-1 ja U937, myöhemmissä aktiivisuuden määrityksissä.

Puhdistettu sähköajoneuvojen stimuloida eritystä EMMPRIN viittaavia positiivista palautetta silmukka.

Koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että EMMPRIN on mukana positiivista palautetta silmukka joissakin solulinjoissa [31], halusimme seuraavaksi arvioida vaikutus sähköajoneuvojen on EMMPRIN solupintailmentymi- ja eritystä monosyyteissä. THP-1-soluja stimuloitiin 10 ug kokonais-proteiinin kunkin rakkulan eli EV

MCF-7 ja EV

MDA, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa.