PLoS ONE: n yli-ilmentyminen Pirna Pathway geenien munasarjan epiteelin Cancer
tiivistelmä
tärkeys Piwi-vuorovaikutuksessa RNA (Pirna) koulutusjakson sukusolujen huoltoa, genomin eheys, DNA: n metylaation ja retrotransposonien ohjaus nostaa mahdollisia rooleja tämän reitin syövässä. Itse poikkeava ekspressio ihmisen PIWI ortologit ja
Maelstrom
on havaittu eri syövissä. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmentymistä ja toimintaa Pirna reitin geenien ihmisen munasarjasyövän, perustuvat viime työtä, mikä osoitti laajaa ilmentymistä Pirna reitin geenien nisäkkäiden. Työmme osoittaa, että
PIWIL1
ja
MAEL
ilmentyminen lisääntyy merkittävästi pahanlaatuisten EOC (n = 25) verrattuna hyvänlaatuinen kasvain kudosten (n = 19) ja normaalin munasarjakudoksen (n = 8) . Ilmaisu on
PIWIL3
on pienempi pahanlaatuinen ja hyvänlaatuisia kudoksissa verrattuna normaaliin munasarja. Sekvenssointi
PIWIL1
transkriptio paljasti, että monissa kasvaimien poisto eksonin 17 johtaa käyttöönoton ennenaikaisen lopetuskodonin PIWI domain, johtui todennäköisesti liittämiseen virhe.
In situ
-hybridisaatio kasvaimen ilmeni, että
L1
,
PIWIL1
,
2
ja
MAEL
nimenomaisesti ilmaistaan epiteelin solut (syöpäsolut) ja EOC. Lisäksi
PIWIL2
ja
MAEL
ovat yhteistyössä ilmaistaan stroomasoluissa vieressä kasvainsoluihin. Koska
PIWIL1
ja
MAEL
ovat jopa säännellään pahanlaatuinen EOC ja ilmaistaan epiteelisolujen, tutkimme jos nämä kaksi geenit vaikuttavat invasiivisuus munasarjasyövän solulinjoissa, jotka eivät yleensä ilmaista näitä geenejä.
PIWIL1
ja
MAEL
oli ohimenevästi yli ilmaistu munasarjasyövän solulinja SKOV3, jota seuraa reaaliaikaisesti mittaukset solun invasiivisuus. Yllättäen sekä
PIWIL1
ja
MAEL
yli ilmaisun vähensi invasiivisuuden SKOV3- soluja. Meidän havainnot tukevat yhä enemmän todisteita, jotka osoittavat, että geenit tämän reitin on yläreguloituja syöpä. Munasarjasyövän osoitamme ensimmäistä kertaa, että
Piwil1
transkriptio saattaa usein olla epänormaali tulos ei ole toiminnallinen tuote. Toisin kuin mitä on havaittu muissa solutyypeissä, olemme huomanneet, että
PIWIL1
ja
MAEL
on tukahduttava vaikutus solujen invasiivisuus.
Citation: Lim SL, Ricciardelli C, Oehler MK, De Arao Tan IMD, Russell D, Grützner F (2014) yli-ilmentyminen Pirna Pathway geenien epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10,1371 /journal.pone.0099687
Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat
vastaanotettu: 16 tammikuu 2014; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2014; Julkaistu: 16 kesäkuu 2014
Copyright: © 2014 Lim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat University of Adelaide. F. G. tukee ARC (Australian Research Council) yhteyteen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä, ja viides johtava syy syövän liittyvät kuolemat naisten länsimaissa [1]. Viiden vuoden suhteellinen eloonjäämisaste naisten munasarjasyövän on vain noin 40% [1]. Munasarjasyöpiä ovat heterogeenisiä kasvaimia, joilla on erilliset morfologisiin ominaisuuksiin, geneettisiä muutoksia ja alkuperää. On olemassa kolme päätyyppiä munasarjasyövän – epiteelin, sukusolujen ja sukupuoli johto stroomakasvaimet. Munasarjojen itusolukasvaimet ja sukupuoli johto stroomakasvaimet muodostavat 10% munasarjojen syöpiä, ja on johdettu primitiivinen munasarjojen sukusoluista tai mesenkymaalisten solujen sukupuoleen johto johdettu kudoksen munasarja-, vastaavasti [2]. EOCs osuus on yli 90% munasarjojen syöpäsairauksia. Perustuen histologia EOCs jaetaan neljään alatyyppeihin (vakavien, mucinous, endometroid ja kirkas solu karsinoomat), jossa yli 70% tapauksista diagnosoitu vakavien karsinoomat (SCS) [3].
korjauksilla epigeneettiset maiseman kuten maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio ja geenin tietty DNA hypermetylaation usein raportoitu syöpäsoluissa [4]. Global DNA hypometylaatio pitkälti vaikuttaa intergeenisessä ja introni genomin alueita, erityisesti toista sekvenssit ja siirrettävistä elementeistä (TES), joiden osuus on noin 55% ihmisen genomin [5], mukaan lukien 17%
L1
toistaa [ ,,,0],6]. Somaattisissa soluissa, DNA: n metylaatio on TEt on tärkeää estää niiden ilmentymisen, joka voi vaarantaa genomin eheyttä. Aikana sukusolujen kehitystä, on ohimenevää maailmanlaajuisen DNA hypometylaatio, joka aiheuttaa väliaikaisen aktivoitumisen TEt [7].
Pirna polku on evoluutiossa hyvin säilynyt Metazoa ja koostuu 21-26 nt piRNAs, jotka sitoutuvat PIWI proteiineja välittävän posttranslational valvontaan TE ilmaisun ja rooli epigeneettisellä muutoksia (kuten DNA: n metylaatio) kautta vuorovaikutuksessa muiden proteiinien (kuten MAEL tai HP1) [8], [9]. Nisäkkäillä on useita
Piwi kuten
(
Piwil
) geenejä (kolme hiirillä, neljä ihmisillä). Expression of
Piwil
geenejä ja Pirna polku liittyvät geenit on osoitettu eri vaiheissa sukusolujen kehitystä erityisesti kiveksissä.
Piwil1
(
Miwi
) on aiemmin tunnistettu geeni yksinomaan ilmaistaan hiiren kiveksissä ja välttämätön siittiöiden [10]. Viime aikoina ilmaus
Piwil1
on myös osoitettu hiiren ja ihmisen munasarjan [11]. Mutaatio
Piwil2
,
Piwil4
ja
Mael
hiiren johtaa samanlaisiin fenotyypit mukaan lukien poistaminen TE DNA: n metylaation ja hedesteriliteetti [8]. Nyt on yhä enemmän näyttöä Pirna toiminnan myös nisäkkään munasarjoissa kuitenkin tyrmätä kokeita Pirna reitin geenin hiirillä on toistaiseksi johtanut vain hedesteriliteetti [12] – [14].
On yhä enemmän todisteita Pirna signalointia erilaisissa syövissä. Expression of
PIWIL1
ja
PIWIL2
on löydetty erilaisten ihmisten syöpien, kuten mahan, rinta-, maha-suolikanavan ja kohdun limakalvon [15] – [18] ja viime aikoina myös munasarjasyövän [19]. Lisääntynyt ilmentyminen
PIWIL1
liittyy parannettu kasvaimen kasvua [20] lisäsivät kasvainten laadut [21], köyhä diagnostiset tulokset [22] ja kuolleisuutta [23].
PIWIL2
ilmentyy laajalti alkuvaiheen rinta- ja kohdunkaulan syöpiä ja syövän esiasteiden kantasolujen kasvaimien syntyyn liittyvien [18]. Ekspressiokuviota
PIWIL3
ja
4
on tutkittu ainoastaan paksusuolen syövissä [24].
Maelstrom
(
MAEL
) on tunnettu kives syövän geeni [25].
toteaminen ilmentymisen munasarjojen somaattisten solujen [11] yhdessä vähentynyt DNA: n metylaatio klo
L1
promoottori alueella liittyy etenemistä kohdunkaulan ja kohdun syöpiä [26] ja huonon ennusteen munasarjakarsinoomissa [27] johti meidät tutkimaan, Pirna reitin geenit voivat olla rooli EOCs. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus
PIWIL1
–
4
ja
MAEL
25 EOC, 19 hyvänlaatuinen kasvain näytteet, ja 8 normaali munasarjojen kudoksiin. Löysimme merkittävästi kohonnut ilmentyminen
PIWIL1
ja
MAEL
sisään EOC verrattuna hyvänlaatuinen ja normaaliin munasarjojen kudoksiin. Kuitenkin
PIWIL1
transkriptien EOC eivät ehkä toimi johtuen poistot tunnistettu PIWI domain tämän transkriptin. Lisäksi yliekspressio
PIWIL1
ja
MAEL
viittaa rooli näiden geenien vähentää munasarjasyöpäsoluja invasiivisuus
in vitro
.
Materiaalit ja menetelmät
kudokset
Yhteensä RNA: ita ihmisen kiveksen ja pre-vaihdevuodet munasarjakudoksessa hankittiin Stratagene (USA). Pahanlaatuinen, hyvänlaatuinen ja normaali munasarjojen kudoksissa (taulukko 1 ja taulukko S3) kerättiin tietoisen kirjallisen suostumuksensa potilaan ja hyväksyntää eettisen komitean Royal Adelaide Hospital, Adelaide, South Australia.
Cell linjat
Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 ja OVCAR3 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, USA), kun taas OVCAR5 saatiin tri Thomas Hamilton (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA) Johnson et ai Cancer Res 57: 850-856 1997 solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa, jota oli täydennetty L-glutamiinilla (2 mM), penisilliini-streptomysiinillä (100 U /ml, 100 ug /ml) (Sigma). SKOV3- ja OVCAR3 solut oli täydennetty 5% FBS: ää (Invitrogen), kun taas OVCAR5 soluja oli täydennetty 10% FBS: ää ja 7,5 ug /ml insuliinia. Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kosteassa kammiossa 5% CO
2.
RNA: n eristys ja cDNA-synteesi
RNA eristettiin kudoksista ja solulinjoissa käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. RNA suspendoitiin uudelleen nukleaasilla vapaata vettä, ja säilytettiin -80 ° C: ssa. RNA käsiteltiin DNaasi I: llä (New England Biolabs), ennen kuin käänteinen transkriptio. 1 ug RNA: ta käytettiin cDNA: n saamiseksi käyttäen Super Script III Ensimmäisen juosteen synteesi System (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, RNA: ta inkuboitiin 1 ui 50 uM oligo (dT)
20 ja 1 ui 10 mM dNTP: itä ja 10 min 65 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen, 4 ui 5x RT-puskuria, 2 ui ditiotreitolia (DTT: tä, 0,1 M), 1 ui RNaseOUT (40 U /ul) ja 1 ui Super Script III RT-entsyymiä (200 U /ul) lisättiin ja inkuboitiin 50 minuutin ajan 50 ° C: ssa. Reaktio lopetettiin 85 ° C: ssa 5 min. cDNA: t säilytettiin -20 ° C: ssa.
geeniekspressio analysoidaan
RT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, mRNA: n tasoon viiden Pirna reitin geenien (taulukko S1) ja beeta-aktiini (
ACTB
) 52 potilaan näytteitä ja 3 munasarjasyövän solulinjoissa. Kukin 25 ui reaktio sisälsi 200 ng cDNA: ta, 5 ui 5x Go Taq Green Master Mix (Promega), 1 ui 5 mM dNTP-liuosta (Roche), 0,5 pl kutakin aluketta (20 pmol /ul) ja 0,5 pl Taq DNA-polymeraasia. PCR-olosuhteet olivat samat kaikkien geenien, paitsi pariutumislämpötila (taulukko S1), ja ne olivat seuraavat: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 2 min, 95 ° C: ssa 30 sekuntia, pariutuminen geenispesifistä lämpötilassa 30 sekuntia ( Taulukko S1), pidennys 72 ° C: ssa 1 minuutin ajan, 32 sykliä. PCR
ACTB
ohjaus suoritettiin 27 sykliä, jota seurasi 5 min lopullista pidentämistä 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 1,5% agaroosigeelillä värjättiin etidiumbromidilla. Band-intensiteetti mitattiin (Määrä Yksi ohjelma, versio 4, Bio-Rad), ja suhteellinen intensiteetti kunkin geenin normalisoitiin että
ACTB
. PCR-tuotteet varmistettiin sekvensoimalla (Big Dye Terminator v3.1 syklisekvensointireagenssipakkausta, Applied Biosystems). RT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin alukeparia.
tilastollisia analyysejä geenin ilmentymisen
Data esitetään mediaanin suhteellinen ilmentyminen (ensimmäinen neljänneksessä kolmannen kvartiiliin). Otteen taso kunkin geenin normalisoitui vastaan
ACTB
. Kolmogorov-Smirnov ja Shapiro-Wilk testit ehdotti, että ilmentymisen taso kunkin geenin kaikki 52 näytettä ei normaalisti jakautunut. Siten Kruskal-Wallisin testiä, joka käyttää ei-parametrinen menetelmä, käytettiin vertaamaan geeniekspression pahanlaatuisia, hyvänlaatuisia ja normaali ryhmiä. Spearman n korrelaatio suoritettiin tutkimaan korrelaatio potilaan ikä ja siitä geeniekspression. R-arvo lähempänä 1 osoittaa olevan vahva positiivinen korrelaatio, kun taas R-arvon lähemmäksi -1 osoittaa vahvempi negatiivinen korrelaatio. Vuonna Kruskal-Wallisin ja Spearmanin testit, P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
RNA
in situ
-hybridisaatio
Koettimet leimattiin digoxigenin- 11-UTP (Roche Diagnostics) mukaan valmistajan protokollaa. Formaliinifiksoidusta parafinoidut kudosleikkeet deparaffinised ksyleeniin ja sen jälkeen pestiin arvostellaan etanolia. Kaikki liuokset valmistettiin dietyylipyrokarbonaattia (DEPC) hoidetun H
2O inaktivoimiseksi RNaasi-aktiivisuus. mRNA-sidottu nukleoproteiiniantigeenit poistettiin proteinaasi K inkuboimalla (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics), 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Objektilasit pestiin 1 x PBS: llä ja asetyloidut (1 M TRIETANOLIAMIINI /0,178% HCl /0,25% etikkahappoanhydridiä). Leikkeitä esihybridisoitiin 65 ° C: ssa 2 tuntia, kun esihybridisaatiopuskurissa (50% deionisoitua formamidia /2 x SSC /1x Denhardtin liuos /0,005 M fosfaattipuskuri /10% dekstraanisulfaattia /1 mg /ml hiivan kokonais-RNA: ta /1 mg /ml lohen maidin DNA) ja hybridisoitiin noin 200 ng cRNA koetin esihybridisaatiopuskurissa yön yli 50 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Objektilasit pestiin 2 x SSC: ssä, 1 x SSC, 0,5 x SSC: ssä ja 0,1 x SSC 15 minuuttia kukin 50 ° C: ssa. Poistamaan sitoutumaton cRNA-koettimia, kudos saatettiin RNaasi A (150 ug /ml) digestio 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Spesifisesti sitoutuneet cRNA-koettimet todettiin käyttäen anti-DIG-vasta-ainetta, joka on kytketty alkaliseen fosfataasiin kanssa nitrobluetetrazolium kloridi /X-fosfaatti-5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti (NBT /BCIP) (Roche Diagnostics), kuten kromogeenista substraattia.
kloonaus ja rakentaa valmistautuminen invaasio analyysejä
MAEL
(CCDS1257) ja
PIWIL1
(CCDS9268) cDNA-sekvenssit saatiin NCBI ccds tietokantaan. Koko cDNA-sekvenssi monistettiin käyttämällä Expand High Fidelity PCR -järjestelmää (Roche) valmistajan menettelyohjeen mukaisesti protokollan ja kloonataan pcDNA3.1 nisäkkään ekspressiovektoriin. Plasmidi-DNA: t, mukaan lukien pcDNA 3.1 (Invitrogen) tai pEGFP-N1 tyhjä vektoreita (Clontech) transfektoitiin SKOV3- soluihin käyttäen Lipofectamine LTX (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. SKOV3- solut valittiin, koska niiden endogeenisen
L1
ekspressiotasot ja se, että ne eivät osoittaneet mitään Pirna reitin geenien ilmentymisen (Fig. 1 C). Kutakin transfektiota varten 8 x 10
4 SKOV3–solut ympättiin 24-kuoppalevylle 14 tunnin ajan ennen transfektiota ja viljeltiin RPMI 1640/5% FBS: ää ilman penisilliini-streptomysiiniä. Plasmidi-DNA (500 ng) laimennettiin 100 ulissa Opti-MEM-elatusainetta (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 0,5 pl Plus-reagenssia (Invitrogen) ja 2 ui Lipofectamine LTX (Invitrogen) ja 30 min ennen kuin se lisätään kuhunkin kuoppaan. 6 tunnin kuluttua, solujen elatusaine korvattiin uusilla RPMI 1640/5% FBS: ia ja soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO
2 ennen sadonkorjuuta varten
in vitro
invaasio analyysit. Transfektio pEGFP-N1 tyhjä vektoreita SKOV3- solujen annettiin transfektion tehokkuutta voidaan mitata, kuten onnistuneesti transfektoitujen solujen ilmaisi GFP-proteiinia. PEGFP-N1-vektori altistettiin samalle kasvun ja transfektio olosuhteissa kuin edellä on esitetty, sen määrittämiseksi, transfektion tehokkuus, joka oli noin 70% 24 tunnin kuluttua.
RT-PCR-analyysit
PIWIL1-4
ja
MAEL
ilmentymistä (A) pahanlaatuinen EOC, hyvänlaatuinen munasarjojen syöpien (B) normaali munasarjat ja (C) munasarjasyövän solulinjoissa. Tämä on esitys 4 ulos 25 pahanlaatuisten EOC ja 19 hyvänlaatuinen munasarjasyöpä kudoksiin. Lisääntynyt ilmentyminen
PIWIL1, 2, 4
ja
MAEL
, mutta ei
PIWIL3
, löytyy pahanlaatuisten syöpien verrattuna hyvänlaatuisia kasvaimia. Kaikki normaali munasarjojen osoittavat
PIWIL2
ja
PIWIL4
ilmaus, mutta vain jotkut ovat
PIWIL1, 3
ja
MAEL
ilme. Endogeenistä
PIWIL1, 2, 4
ja
MAEL
ilmentymistä havaitaan OVCAR3 ja SKOV3-soluja. Ova * tarkoittaa kudosta 20-vuotias premenopausaalinen munasarja taas muut munasarjat ovat yksilöitä vuotiaista 44-76 vuotta vanhoja.
In vitro
invaasio analyysit xCelligence
Solun invaasio testattiin reaaliaikaisella invaasiomääritys seurannan avulla CIM laitteita ja xCelligence DP-järjestelmän (Roche Diagnostics) [28]. Lyhyesti, 4 tuntia ennen invaasiomääritys, CIM levyn (Roche) päällystettiin 1:20 laimennettu kasvutekijä vähentää Matrigel tyvikalvon matriisin (~450μg /ml) (BD Biosciences). Sitten 40000 solut, transfektoimattomia tai transfektoitu tyhjällä vektorilla (EV) tai
MAEL
tai
PIWIL1
vektorit, ympättiin kuhunkin päällystetty hyvin. Solujen toimintaa seurasi jakson aikana 72 tunnin mittaamalla impedanssi signaalin CIM levy. Solun aktiivisuus tallennettiin jokainen minuutti ensimmäisen 12 tunnin ja joka 5 min seuraavien 12 tunnin ajan. Sitten 24 tunnin lähtien loppuun saakka kokeen, solujen toiminnan kirjattiin joka 30. min. Kussakin CIM levy, kolmena rinnakkaisena kunkin ryhmän suoritettiin saada keskiarvo ja keskihajonta. Koe toistettiin kolme kertaa.
PIWIL1
transkriptisekvenoinnin
PIWI domeeni
PIWIL1
transkripti PCR-monistettiin ja tuotteiden eri kokoa kloonattiin pGEM-T Easy -vektoriin (Promega). Yhteensä 30 positiivista pesäkettä eri PCR-vyöhykettä on valittu kustakin ligaatioreaktio ja plasmidi-DNA puhdistettiin käyttämällä standardeja alkalisen lyysin menetelmiin (Qiagen) [29]. 200 ng plasmidi-DNA sekvensoitiin (Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) käyttäen SP6 ja T7 universaali alukkeita.
Tulokset
Expression of Pirna reitin geenien lisääntynyt pahanlaatuisten EOC verrattuna hyvänlaatuisia kasvaimia tai normaalin munasarjan kudoksissa
Pirna reitin geenit ovat johdonmukaisesti ilmaistaan nisäkkään munasarjoissa [11]. Sen tutkimiseksi, mahdollista roolia tämän väylän EOC, suoritimme semikvantitatiivinen RT-PCR ilmentymisen tutkimiseksi
PIWIL1
,
PIWIL2
,
PIWIL3
,
PIWIL4
ja
MAEL
edennyt jo vakavien EOC (n = 25), hyvänlaatuiset munasarjojen kasvain (n = 19) ja normaalin munasarjakudoksen (n = 8) (taulukko 1, taulukko S3 ja Fig. 1A, B). Semi kvantitatiivinen analyysi paljasti, että suhteellinen ekspressiotasot
PIWIL1
ja
MAEL
olivat merkittävästi korkeammat pahanlaatuisten EOC verrattuna hyvänlaatuisia ja normaaleissa kudoksissa (Fig. 2A, B). Suhteellinen ekspressiotasot
PIWIL2
ja
PIWIL4
pahanlaatuiset ryhmissä eivät olleet merkittävästi erilaiset kuin hyvänlaatuisia tai normaali munasarjojen kudoksiin (Fig. 2C, D). Kuitenkin ilmaus
PIWIL2
ja
PIWIL4
ovat huomattavasti alhaisemmat hyvänlaatuisia kasvaimia verrattuna normaaliin munasarjakudoksessa, mikä viittaa muutoksiin geenien ilmentymisen etenemisen aikana EOC. Suhteellinen ilmentyminen
PIWIL3
on erilainen muihin
PIWIL
geenejä siten, että tämän geenin ilmentyminen on merkittävästi korkeampi normaalissa munasarjassa verrattuna sekä pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia kudoksissa (kuvio. 2E) . Lisäksi suhteellinen ilmentyminen
PIWIL3
normaalissa munasarjassa korreloi positiivisesti potilaan iän normaalissa munasarjassa kudoksissa (n = 8) (r = 0,750, P = 0,05) (taulukko 2). Toisin kuin
PIWIL3
,
PIWIL1
ilmentyminen korreloi negatiivisesti potilaiden iän (r = -0,737, p = 0,037).
PIWIL1
ilmaistaan kasvavia munarakkuloita premenopausaalisilla munasarjat, mutta tässä tutkimuksessa puolet munasarjat testatuissa naisilta alle 50-vuotias ja todennäköisesti premenopausal.
Semikvantitatiivisilla RT-PCR-analyysi mRNA: n ekspression (suhteessa
ACTB
) (A)
PIWIL1
, (B)
MAEL
, (C)
PIWIL2
, (D)
PIWIL4
ja (E)
PIWIL3
. (F) P-arvo kunkin vertailuryhmän. Pahanlaatuinen EOC (n = 25), hyvänlaatuinen munasarjasyöpä kudoksissa (n = 19) ja normaalin munasarjat (n = 8). Kruskal-Wallisin testi suoritettiin vertaamaan geeniekspression taso kahden ryhmän välillä. Täytetty piste osoittaa keskiarvo kussakin ryhmässä. * Tarkoittaa 0,001 P 0,05; *** Osoittaa P 0,001; NS, ei merkittävää.
L1
ja Pirna reitin geenit ovat yli ilmaistu EOC soluissa
analysoimiseksi ekspressiokuviota Pirna reitin geenien ja
L1
vuonna EOC, RNA
in situ
hybridisaatio suoritettiin pahanlaatuinen EOC (n = 5) ja hyvänlaatuiset munasarjojen kasvain (n = 2) (taulukko 3, kuvio. S1). Löysimme vahva ilmaus
L1
epiteelisoluissa mutta
L1
puuttui stroomasoluihin kaikissa näytteissä (kuvio. 3A, E). Lisäksi olemme huomanneet, että ilmaus
L1
vaihtelee eri potilailla (Fig. 3A). Vahva ilmentyminen
PIWIL1
havaittiin epiteelisoluissa kaikissa EOC kudoksissa (Fig. 3B, F), kun taas
MAEL
ja
PIWIL2
osoitti voimakasta ekspressiota epiteelisoluissa ja stromasoluja kaikkien EOC tutkittiin (Kuva. 3C, G ja D, H vastaavasti).
In situ
analyysi (A, A ’, E)
L1
, (B, B ’, F)
PIWIL1
, (C, C’, G)
MAEL
, (D, D ’, H)
PIWIL2
vuonna kaksi pahanlaatuinen EOC (AD maasta SC3 taas EH päässä SC2). (A’-D ’) monistaminen kuvat A-D vastaavasti. Vahva ilmentyminen Pirna reitin geenien ja
L1
havaittiin levyepiteelikarsinooma-to-cuboidal kuten epiteelisolujen sekä pahanlaatuisten EOC paitsi
PIWIL1
, joka ilmentyy vain SC2, mutta ei SC3.
L1
on hajanaista ilmentymistä tietyissä EOC niin, että jotkut epiteelisolujen näyttävät vahvempi
L1
ilmaus muihin verrattuna.
MAEL
ja
PIWIL2
mutta ei
PIWIL1
ilmaistaan myös stroomasoluihin molemmissa EOC. (E’-H) Negatiiviset säätimet tunne koetin
L1
,
PIWIL1
,
MAEL
ja
PIWIL2
vastaavasti. Ep = epiteelisolut; S = stroomasoluissa. Asteikko bar = 50 um.
Ei
PIWIL1
transkriptivariantissa esiintyä pahanlaatuisen EOC
monistamiseen PCR PIWI toimialue EOC cDNA tuotti kaksi erillistä bändejä verrattuna cDNA normaaleista kives tai munasarja (Fig. 4), jotka viittaavat useiden
PIWIL1
transkriptivariantissa pahanlaatuiseen EOC. PCR-tuotteiden kiveksissä ja pahanlaatuiset EOC poimittiin, kloonattiin ja sekvensoitiin. Monirinnastukset Kloonin sekvenssit osoittivat monia muutoksia sisällä PIWI verkkotunnuksen nukleotiditasolla verrattuna kiveksissä ja julkaistaan
PIWIL1
cDNA-sekvenssi. Yhden emäsparin muutoksia on havaittu
PIWIL1
selostukset pahanlaatuinen EOCs (taulukko S2). Lisäksi useimmat näistä klooneista on eksonin deleetion ja silmukoimattoman introneja, jotka otetaan käyttöön ennenaikaisen stop-kodonit. Tärkeää on 75 nt poistuman, joka käsitti koko eksoni 17 havaittiin useimmissa sekvensoitiin kloonit 5 ulos 28 EOC potilailla (Fig. 4B). Lisäksi jotkin klooneista osoitti osittaista silmukoinnin intronien 15 ja 16 (Fig. 4B) niin, että 17 bp ja 20 bp 5′-intronin 15 ja 16, vastaavasti, ovat silmukoimattoman. Sen varmistamiseksi, että mutaatiot johtuvat liittämiseen, genomista DNA: ta kasvaimen näytteet eristettiin ja sekvensoitiin vastaavalla alueella. Ei mutaatioita tunnistettiin välillä eksonien 15-18 (jos liitos tapahtunut virheitä) genomisessa
PIWIL1
järjestyksessä (Kuva. S2). Jotta ennustaa jos edellä transkription jälkeisen muutokset vaikuttavat PIWIL1 toiminto, sekvenssit käännettiin ja kontrolliin verrattuna (kives cDNA) ja julkaisi peptidisekvenssi (AAC97371.2). Menetys koko eksonin 17 (73-nt poistetaan) 11 klooneja otettiin ennenaikainen lopetuskodoni PIWI domain (Fig. S3). Samoin lopetuskodonit löydettiin klooneja, jotka ovat silmukoimattoman intronit (ei kuvassa).
(A)
PIWIL1
ilmentymisen kontrollisilkkipaperia (ihmisen kives, normaali munasarja (ov) 1, 2) ja EOC kudosten SC1 ja 2. positiivinen kontrolli, 500 bp: n vyöhyke monistettiin, mutta pahanlaatuiset SC1, kaksi nauhaa saatiin. (B) cDNA monirinnastuksen (osittainen), jotka osoittavat, että suurin osa klooneista on deleetio eksonista 17 (ΔΔ3) ja 3-kloonien osittainen silmukoinnin intronin 15 ja 16 (). PIWIL1_ccds: julkaistu cDNA
PIWIL1
(CCDS9268); Kives C1: kives transkriptio klooni 1; B1-3, B6, B9-B14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: klooneja
PIWIL1
selostukset.
Yli ilmentymistä Pirna reitin geenien vähentää invasiivisuus
in vitro
tutkiakseen mahdollisesta merkityksestä Pirna reitin geenien syövän etenemiseen, täyspitkä
PIWIL1
tai
MAEL
selostukset kloonattiin ja transfektoitiin ohimenevästi osaksi munasarjasyövän solulinja SKOV3 ja määritettiin invasiivisuus 24 tunnin kuluttua transfektion. RT-PCR suoritettiin vahvistaa lisäämällä plasmidien näihin soluihin. RT-PCR vahvisti
GFP
,
PIWIL1
tai
MAEL
yli lauseke (Fig. S4A). Expression of
MAEL
ja
PIWIL1
konstruktioita pysyi korkeana transfektoiduissa soluissa 50 tuntia transfektion jälkeen (kuvio. S4A).
MAEL
,
PIWIL1
ja tyhjän vektorin (Ev) transfektoituja soluja ja transfektoimattomia SKOV3-soluja levitettiin xCELLigence järjestelmän tutkia niiden vaikutusta solun invasiivisuus [30]. Yllättäen invasiivisuus on
MAEL
ja
PIWIL1
transfektoiduissa soluissa oli alhaisempi kuin transfektoimattomilla tai tyhjän vektorin soluihin (Fig. 5). Cell invasiivisuus kustakin ryhmästä alkoi tasaantua 30 tunnin jälkeen, mikä vain solujen toiminnan ensimmäisen 30 tunnin näkyy. Tuloksemme viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen
PIWIL1
ja
MAEL
on tukahduttava vaikutus SKOV3 solun invasiivisuus.
PIWIL1
ja
MAEL
transfektoiduissa soluissa on alhaisempi invasiivisuus verrattuna transfektoimattomiin soluihin ja
Ev
transfektoiduista soluista. Kussakin kokeessa kukin ryhmä suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja tämä koe toistettiin kolme kertaa. Tämä on yhdistetty datan kuvaaja kolmen erillisen kokeen kaikissa ryhmissä. Virhe palkit kuvaavat keskihajontaa.
WT
osoittaa transfektoimattomilla SKOV3- soluja; tyhjän vektorin (Ev),
MAEL
ja
PIWIL1
osoittaa transfektoiduissa soluissa
MAEL
tai
PIWIL1
vektoreita.
Ei mitään
osoittaa hyvin ilman soluja.
Keskustelu
Pirna reitti on tärkeä TE vaiennettu, epigeneettiset sääntelyn ja kantasolujen itseuudistumisen in monenlaisia organismit [31], [32]. Global DNA hypometylaatio ja TE derepressiota, kuten
L1,
on yhteinen piirre syöpä genomien [33], [34] ihmisillä
PIWIL1
ja
2
yliekspressio on havaittu kasvaimia eri kudoksista [15] – [18], [21] – [23]. On kuitenkin vielä epäselvää, onko Pirna reitin geenit ilmentyvät differentiaalisesti munasarjasyövän tai olla rooli munasarjojen syövän etenemiseen. Tutkimme ilmentymistä Pirna reitin geenien
PIWIL1
–
4
,
MAEL
ja
L1
pahanlaatuisissa EOC, hyvänlaatuiset kasvaimet ja normaali munasarjojen kudoksiin, ja myös tutkittu mahdollisia rooleja
PIWIL1
ja
MAEL
munasarjasyövän solulinjoissa.
Expression of
PIWIL1
–
2
on tutkittu eri syöpäkudokset [15] – [18], [21], [23], [35], mutta ei
MAEL
,
PIWIL3
ja
PIWIL4
. Vaikka ilmaus
PIWIL2
ja
4
ilmestyi korkea Tuumorinäytteissä tämä ei ollut merkittävä, mikä johtuu todennäköisesti siitä, että
PIWIL2
ja
PIWIL4
voimakkaasti ilmentyy normaaleissa munasarjakudoksessa (Fig. 1 B), ja niiden ekspressiota joukossa pahanlaatuisia kudoksia on erittäin vaihteleva. Ilmaus
PIWIL1
ja
MAEL
kuitenkin kasvaa merkittävästi pahanlaatuisten EOC verrattuna hyvänlaatuisia kasvaimia.
PIWIL1
ja
MAEL,
mutta ei
PIWIL2
ja
4,
kasvoi merkittävästi säädellään verrattuna normaaliin munasarjat. Toisin kuin
PIWIL2
ja
4
, jotka on ilmaistu kaikissa tavanomaisissa munasarjan tutkituissa kudoksissa, ilmaus
PIWIL1
ja
MAEL
on löydetty vain osajoukko normaalin munasarjan kudosten potilailta, jotka olivat alle 50-vuotiaita. Normaalissa munasarja,
PIWIL1
ja
MAEL
ilmentyvät cumulus soluissa kasvavien follikkelien ihmisen [11]. Normaali munasarjojen testatuissa kudoksissa ovat yksilöitä vuotiaista 44-76 vuotta vanha, ja puolet näistä näytteistä olivat peräisin yksilöiden alle 50 vuotias. Näin ollen vaihteleva ilmentyminen
PIWIL1
ja
MAEL
normaalin munasarjat voidaan selittää eron runsaasti kasvavien munarakkuloiden, jotka ilmentävät Pirna reitin geenien poikki näytteitä.
MAEL
tunnetaan syövän /kives-geenin, koska se ilmentyy kiveksissä ja useita syöpäsolulinjoissa [36]. Täällä tunnistettu ensimmäistä kertaa lisääntynyt ilmentyminen
MAEL
pahanlaatuisia EOC ja hyvänlaatuisia munasarjojen kasvaimia. Samanlaisia PIWI, MAEL on tärkeää varmistaa asianmukaisen ituradan kantasolujen erilaistumista
Drosophila
ja muut selkärankaiset [37]. Yliekspressio Pirna reitin geenien EOC saattaa osoittaa, että jotkut kantasolujen ominaisuudet ovat läsnä tuumorisoluissa tai että Pirna polku on aktivoitu esimerkiksi aktiivisuuden retrotransposoneja. Näiden geenien ilmentymistä voi olla myös allekirjoitus läsnäolon munasarjasyöpä kantasolujen [38].
ilmentymistä Pirna reitin geenien normaalissa munasarjassa ja tietyntyyppisten EOC voi antaa uuden näkökulman alkuperästä munasarjasyöpä. Somaattisten solujen kypsymistä follicle voi joutua kosketuksiin munasarjojen pinnan epiteeli aikana ovulaatio tai voi olla läsnä sisällyttäminen kysta jonka arvellaan rooli alkuperä epiteelin munasarjasyöpä [3], vaikka läsnä osallisuuden kystat näyttää ei sinänsä lisää riskiä sairastua munasarjasyöpään [39]. Hypometylaatio
L1
promoottorialue korreloi lisääntynyt
L1
mRNA ilmaisun pahanlaatuiset rintasyöpä kudoksiin ja solulinjoissa [40], [41]. Ilmaus
PIWIL
geenien ja
MAEL
sekä normaalissa munasarjassa ja pahanlaatuisten EOC korreloi lisääntyneen ilmentymisen toista elementtejä ja nostaa esiin mahdollisuuden, että Pirna reitti on voitu laukaista TE ilmentymistä. Huomasimme kuitenkin, että
L1
ilmentyminen oli poissa aikaisemmassa vaiheessa pahanlaatuinen kasvain (n = 6), mutta jatkuvasti läsnä kaikissa vaiheessa 3c kasvainnäytteestä. Tämä antaa jonkin verran epäilyinä aktivoitumisen Pirna reitin geenit voivat edeltää
L1
ilmaisun aikana syövän etenemiseen. Tämä on sopusoinnussa työn muissa kasvaimissa, jotka korreloivat
L1
ilmaisutapoja syövän etenemisessä [42].
Maelstrom
knock out tulokset laskivat DNA-metylaation sukurauhaset, mutta ei somaattisten kudosta. Vuonna sukuelimiin tämä johtaa dramaattiseen lisääntymiseen siirrettävissä elementti ilmaisu sukusolujen [43]. Havaintomme on
MAEL
yli-ilmentymisen puuttuessa havaittavissa
L1
ilmaisun varhaisessa vaiheessa kasvain näytteet nostaa esiin mahdollisuuden, että ei-toiminnalliset
MAEL
voi olla rooli alenevassa DNA metylaatio edistää myöhemmin
L1
ilme.
Vaikka
PIWIL1
transkripti taso oli merkittävästi lisääntynyt pahanlaatuisten EOC verrattuna hyvänlaatuisia ja normaaleissa kudoksissa, kloonaus ja sekvensointi näiden selostukset ehdotti, että nämä selostukset voivat tuottaa poikkeavaan ja toimimattomia PIWIL1 proteiinia. Useita mutaatioita löydettiin
PIWIL1
selostukset lukien silmukoimattoman intronit, menetys eksonien sekä yhden emäsparin muutokset. Yhden emäsparin muutokset ehkä tuloksena RNA muokkaus [44].