Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Angiogeneesi pidetään tunnusmerkki syövän kehittymisessä, ja antiangiogeenisestä hoito on tällä hetkellä käytetään ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla. MikroRNA (Mirs) ovat pienet ei-koodausta, endogeeninen, yksijuosteinen RNA: t, jotka säätelevät geenin ilmentymistä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan muuttunut merkittävästi MIRS liittyvät angiogeneesin NSCLC.

Methods

Suuresta kohortin 335 NSCLC potilaiden, parafinoidut näytteet 10 potilasta, joilla on lyhyt sairausspesifistä selviytyminen (DSS), 10 jolla on pitkä DSS ja 10 normaalit kontrollit analysoitiin. Mirs kvantitoitiin mikrosirujen hybridisaatio ja valitut MIRS todensi reaaliaikaista qPCR. Vaikutukset erilaisia ​​reittejä, mukaan lukien angiogeneesi, arvioitiin Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) johdettu proteiini analyysiin Evolutionary Relationship (PANTHER). Yksi mielenkiintoisimmista ehdokas markkereita, miR-155, oli validoitu

in situ

-hybridisaatio (ISH) kokonaismäärän kohortin (n = 335) ja korrelaatio analyysit useiden tunnettujen angiogeenisten markkereita tehtiin.

tulokset

128 Mirs olivat huomattavasti ylä- tai alassäädetty; normaali verrattuna pitkä DSS (n = 68) ja /tai normaali verrattuna lyhyt DSS (n = 63) ja /tai pitkät versus lyhyt DSS (n = 37). Reitti-analyysi osoittaa angiogeneesiin liittyviä MIRS olla mukana NSCLC. Oli vahva merkittäviä korrelaatioita array hybridisaatio- ja qPCR validointitiedot. Merkittävästi muuttunut angiogeneesiin liittyvien MIRS suuresti kiinnostavista olivat miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 ja miR-424. miR-155 korreloi merkitsevästi fibroblastikasvutekijää 2 (FGF2) kokonaismäärän kohortin (r = 0,17, P = 0,002), mutta merkittävintä alaryhmällä kanssa solmukohtien etäpesäkkeitä (r = 0,34, P 0,001).

Johtopäätökset

Useat angiogeneesiin liittyviä MIRS merkittävästi muuttunut NSCLC. Lisätutkimukset ymmärtää niiden biologiset toiminnot ja tutkia niiden kliinistä merkitystä perusteltua.

Citation: Donnem T, Fenton CG, Lonvik K, Berg T, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) MicroRNA allekirjoituksista kasvainkudoksessa liittyvät Angiogeneesi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10,1371 /journal.pone.0029671

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 02 joulukuu 2011; Julkaistu: 25 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Donnem et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus oli rahoitusta yksinomaan Pohjois-Norjan Regional Health Authority (Helse Nord RHF), joka on vastuussa julkisten sairaaloiden Pohjois-Norjassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on numero yksi syy syöpään liittyvät kuolleisuus sekä miehillä että naisilla, ja noin 80% on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1]. Huolimatta kehittyvien parannuksista varhaisen diagnoosin ja hoitomuotoja, yleinen 5 vuoden pysyvyys on niukka 15%. TNM (Kasvain, Node, etäpesäke) vaihe on pidetty tärkeimpänä ennustetekijöiden muuttujan alkuvaiheessa tauti on edellytys täydellinen kirurginen resektio tarpeen mahdollisten parannuskeinoa. Hoito vastauksia ja sivuvaikutukset uusia hoitovaihtoehtoja on läheistä sukua eri histologisia yksiköt NSCLC [2] – [4]. Kuitenkin kohdennettuja hoitoja suunnattu erityisiä cellular muutoksia edellyttävät tarkkaa alaluokkiin NSCLC joka on suurelta osin laudalta nykyisen lavastus ja rutiinidiagnoosimenetelmää histopatologisten tekniikat [5].

MikroRNA (Mirs) ovat pienet ei-koodausta, endogeeninen, yksijuosteinen RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä [6] – [9]. Säätelemällä geenin ilmentymistä klo posttranskriptionaalisella tasolla, Mirs on suuri vaikutus monenlaisia ​​reittejä, mukaan lukien erilaisia ​​reittejä, jotka liittyvät syövän kehittymisen. Useat tutkimukset ovat tutkineet vapauttaminen eri Mirs NSCLC ja niiden mahdolliset onkogeeniset ja tuumorisuppressoriproteiinia toiminnot sekä niiden ennustetekijöiden vaikutus [10] – [20].

Jotkut Mirs näyttävät olevan mukana angiogeneesiin [21] – [24]. Angiogeneesi on prosessi uusien verisuonten muodostumista ennestään olevia, ja sillä on keskeinen rooli kasvainten kehittymiseen [25]. Angiogeenisten estäjiä käytetään NSCLC hoidossa. Monoklonaalinen vasta-aine bevasitsumabi yhdessä kemoterapian on FDA hyväksytty hoitovaihtoehto metastasoivaa ei-levyepiteelikarsinooma pienisoluista keuhkosyöpää, ja monet tyrosiinikinaasiestäjiksi kohdistaminen angiogeenisen reitit ovat lupaavia [3], [26].

Ensimmäinen todisteet osoittavat Mirs sääntelyssä angiogeneesin tuli Dicer hiirten. Dicer on kriittinen entsyymi miR synteesissä. Dicer-vaje hiiret kuolivat varhain kehityksen aikana johtuen ohenemista verisuonten seinämien ja vakava epäjärjestyksestä verkoston verisuonten [27]. Lisäksi toinen hiiren tutkimus osoitti, että alijoukon Mirs muuttunut angiogeenisen siirtymän aikana tuli vastakkain säänneltyjen vastauksena antiangiogeenisestä hoito [23].

suuri valitsematta NSCLC kohortti olemme aiemmin tutkineet ennustetekijöiden vaikutus useita keskeisiä angiogeenisten kasvutekijöiden ja reseptorit sekä ennustetekijöiden roolia miR-155 ja miR-126

in situ

-hybridisaatio [28] – [38]. Tässä arvioimme miR ekspressioprofiileja NSCLC käyttäen kudosta valikoiduista potilaista Kohortin. Meidän tavoitteena oli tunnistaa mielenkiintoisia angiogeneesiin liittyviä miR ehdokkaita edelleen mahdollisia laajamittaista ja perusteellisia tutkimuksia.

Tulokset

Potilaat

Väestörakenteen, kliininen ja histopatologisia muuttujat potilaan ryhmät (pitkä DSS, lyhyt DSS ja kontrollit) on esitetty taulukossa 1. mediaani DSS olivat 8,0 (vaihteluväli 6,5-9,9) kuukautta ja 160,5 (vaihteluväli 60,5-184,3) kuukautta matalan ja korkean DSS ryhmä, vastaavasti. Oli neljä adenokarsinomia ja kuusi okasolusyöpää kussakin ryhmässä.

Micro RNA ilmentymisanalyysiä

Out of 281 Mirs, Kuviossa 1 esitetään määrä ja jakauma 128 differentiaalisesti ilmaisi Mirs merkittäviä eri vertailut tutkimuksessa (P 0,1 oikaistu väärien löytö korko, FDR). Vastaavat up ja alassäädetty (-1,1) MIRS esitetään taulukossa S1. miR-182 oli ainoa miR muuttaa kaikissa kolmessa yhdistelmiä; normaali versus lyhyt DSS, normaali vs. pitkä DSS ja lyhyt verrattuna pitkä DSS. Pääkomponenttianalyysiin (PCA) (kuvio 2A) koko näytteen joukko ilmaisun arvoista paljasti, että pääperiaate komponentti vaihtelun erottaa normaali näytteitä NSCLC näytteistä. Korostaa ero ryhmien NSCLC kasvainnäytteestä sillan osittainen pienimmän neliösumman (PLS) mallia käytettiin poimia aliavaruuden jossa ryhmä erot ovat selvempiä kuin PCA (kuvio 2B). Taulukossa 2 esitetään kymmenen Mirs korkeimmalla kertainen muutos kerrostuu ryhmiin pitkä selviytymisen ja normaalissa ohjaus ja lyhyt eloonjäämisen verrattuna normaaliin säätelyyn. Taulukossa 3 esitetään Mirs korkeimmalla kertainen muutos lyhyellä vs. pitkä selviytymisen ryhmiä.

Venn-kaavio näyttää, kuinka monta kaikkien differentiaalisesti ilmaisi miRNA eri vertailuissa: Kudos pienisoluista keuhkosyöpää lyhyet selviytymisen vastaan ​​kudosta NSCLC sairastavien potilaiden pitkä selviytymisen, kudos normaalista keuhkojen verrattuna kudosta pienisoluista keuhkosyöpää pitkä selviytymisen ja kudosten normaalista keuhkojen verrattuna kudosta pienisoluista keuhkosyöpää lyhyet selviytymistä. Out of 281 Mirs arvioitu määrä ero ilmaistaan ​​Mirs kanssa FDR säätää P 0,1 (yhteensä n = 128) kunkin vertailun osoitetaan.

(A) Kaksiulotteinen PCA Mirs, johdettujen 20 potilasta NSCLC ja 10 kudosnäytteitä normaalista keuhkokudoksesta, joka osoittaa erottaminen kaksi näytettä ryhmää. (B) Juoni kuvaa osat 1 ja 2 PLS malli, jota käytetään elinaika kuin pisteytys kriteerit. Analyysi selvästi erottaa kudosnäytteen ryhmien lyhyen ja pitkän selviytymisen NSCLC potilaat. Kaikki näytteet ovat värikoodattu ryhmään: Musta: Normaali potilaan näytteitä; vihreä: Näytteet potilailta lyhyet selviytymisen; punainen: Näytteet, joilla on pitkään hengissä.

Pathway analyysi

Taulukko 4 tulokset GSEA. Geeni kytkettyyn 31 angiogeneesiin liittyvien Mirs paljasti korkein geeni asetettu nimellinen rikastus pisteet (NES = -1,17, nimellinen p-arvo 0,28, FDR 0). Kuvio 3 esittää lämpökartassa edustavat 31miRs liitetty angiogeenisten geeniperimä.

Ero miR ilmaisun välillä kasvain näytteet NSCLC potilaalla on pitkä (L) ja lyhyt (S) eloonjääminen on esitetty. miR ilme arvot on esitetty spektri jossa alassäädetty on sininen ja säädelty on punainen.

PCR validointi

sirontakaavioissa vertailemalla microarray hybridisaatio- ja qPCR tietoja 28 on valittu MIRS on esitetty kuviossa 4. mukana Mirs, ja tiedot kaikista kolmesta yhdistelmästä (sekä hybridisaatio- ja qPCR) on lueteltu taulukossa S2. Oli vahva ja merkittävä korrelaatio hybridisaatio- ja qPCR tiedot: Lyhyt ja normaalissa r = 0,81, P 0,001; pitkä ja normaalissa r = 0,85, P 0,001; Lyhyen versus pitkä r = 0,85, P 0,001.

Vertailu mikrosiru hybridisaatio (dLMR, ero on keskimäärin ekspressiotasot välillä näytteen ryhmien log2 asteikko) ja qPCR (ddCP, ero on keskimäärin ekspressiotasot välillä näytteen ryhmien log2 asteikko) tietojen korrelaatiokerroin = r (Pearson): (A) alhainen verrattuna normaaliin r = 0,81, P 0,001; (B) huipulla normaali r = 0,85, P 0,001; (C) huipulla pieni r = 0,85, P 0,001. Punaisella; miR-150.

Korrelaatioanalyysiä välillä angiogeenisten markkereita ja miR-155

Olemme aiemmin julkaistu ennustetekijöiden vaikutuksista miR-155 suuresta (335 potilasta) NSCLC väestöstä [ ,,,0],37]. Tässä tutkimuksessa selvitimme korrelaatio miR-155 ja useita tunnettuja angiogeenisten markkereita. Sama raja-arvot kuten aiemmin julkaistu käytettiin FGF2 ja miR-155 [33], [37]. Kuva S1 osoittaa

in situ

-hybridisaatio (ISH) analyysi NSCLC edustavat vahvat ja heikot intensiteetit kasvainsolun miR-155 ilmaisu sekä negatiiviset ja positiiviset kontrollit. Taulukossa 5 on esitetty korrelaatio angiogeenisten markkereita [vaskulaarinen endoteelikasvutekijä – A (VEGF-A), verihiutaleperäisen tekijä – B (PDGF-B), HIF-1α ja fibroblastikasvutekijää 2 (FGF2)] ja miR-155. miR-155 korreloi merkittävästi FGF2 kokonaismäärän kohortin (r = 0,17, P = 0,002), mutta merkittävintä alaryhmällä kanssa solmukohtien etäpesäkkeitä (r = 0,34, P 0,001). Crosstabs taulukossa 6 ja taulukossa 7 osoittavat korrelaation ja jakelun korkean ja matalan ilmaus FGF2 ja miR-155.

Keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen NSCLC miR ilmaisun profilointi tutkimus osoittaa geeniperimä liitetty angiogeneesiin liittyviä Mirs korkein vaikutusta koulutusjakson analyysi. Yhdenmukainen aiemmin julkaistu tutkimuksia vietämme merkittäviä eroja miR profiilien välillä normaalin ja kasvainkudoksen välillä näytteitä potilaista, joilla on huono versus suotuisa DSS. Useat näistä merkittävistä muuttuneen MIRS liittyy angiogeneesiä ja ovat mielenkiintoisia ehdokas merkkiaineita lisäarviointia. Tarkistamalla jonkin näistä merkeistä, miR-155, kohortin 335 NSCLC potilaiden, löydämme tämän miR ensimmäistä kertaa voidaan merkittävästi liittyvän tunnetun angiogeenisen merkki FGF2.

Suurimmat heikkoudet tutkimuksen etsittäessä uusia ehdokas markkereita ovat suhteellisen heterogeeninen tutkimusväestöstä ja pieni määrä potilaita mukaan analyysiin. Monet tässä esitetyt tulokset ovat siksi vain rajatapaus merkittävä (tai jotkut vain osoittaa suuntaus) ja lisävalidointia suuremmassa NSCLC joukko, kuten tehnyt miR-155, on edellytys kiinteämpi johtopäätöksiä. Tämä pätee erityisesti silloin, kun verrataan merkittäviä eroja kasvaimen kudokset (pitkä versus lyhyt eloonjääminen) kuin on yleisesti suurempia eroja kasvaimen kudosten ja normaalit kontrollit. Taitteen muutokset ovat keskimääräistä suurempi ja p-arvot vahvempia taulukossa 2 (kasvainkudoksen vs. normaali valvonta) verrattuna taulukossa 3 (pitkä versus lyhyt selviytymisen). Eräästä kliinisestä näkökulmasta, ainakin mitä tulee MIRS mahdollisina ennustetekijöitä tai ennakoivaa markkereita, Mirs muuttuneeseen ilme välissä lyhyt verrattuna pitkä selviytymisen ryhmässä ovat erityisen kiinnostavia. Siksi olemme tutkineet kirjallisuudessa neljä angiogeneesiin liittyviä MIRS taulukosta 3 (miR-106a, miR-155, miR-182 ja miR-424) ja validoitu miR-155 suuri joukko NSCLC potilaiden. Lisäksi halusimme korostaa mahdollisia vaikutuksia miR-21, miR-126 ja miR-210 taulukosta 2, kun on olemassa vakuuttavia kertomuksia näillä MIRS olla mahdollista vaikutusta angiogeneesiin. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet miR-126 on prognostista vaikutusta meidän NSCLC kohortissa [38].

vahvistaminen tuloksemme ovat vahvat ja merkittävät korrelaatiot microarray hybridisaatio datan ja saman Mirs vahvistanut qPCR. Lisäksi muuttunut miR ilmaisuja kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen ovat suuressa määrin yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu NSCLC miR tutkimuksia [15] – [17], [20] ja kuten käsitellään seuraavassa on jatkuvasti uutta kirjallisuutta lisätty, tukevat meidän ehdokas Mirs olla mukana angiogeneesiin.

Harvat tutkimukset ovat tutkineet vaikutusta polkuja liittyvien miR geenikohteet NSCLC. Tulkinta tällaisten analyysien ei ole suoraviivaista, koska tulokset ovat erittäin riippuvaisia ​​jotka kohdistuvat geenit liittyvät MIRS ja jotka MIRS on kytketty eri reittejä. Lisäksi Mirs ovat usein monimuotoinen ja sama miR voi kohdistaa erilaisia ​​geenejä eri reittejä, ja geeni voidaan osana useisiin Mirs. Vaikka ei tilastollisesti merkittävä, GSEA vaihteli angiogeneesi tärkeimpänä polku meidän NSCLC näytteitä. On olemassa useita uusia raportteja yhdistää erityinen MIRS angiogeneesiin tukemiseen havaintomme [23], [24], [39] – [42]. Lisäksi Raponi et ai. ovat osoittaneet, että angiogeneesin liittyvät fibroblastikasvutekijä (FGF), reitti oli merkittävä geenin rikastamisen levyepiteelikarsinooma NSCLC [17].

kattavan hiiren tutkimuksen, Olson et ai. tunnistettu erityisiä miR ilmaisu allekirjoituksia liittyvät vaiheet kasvainten synnyssä ja eri tunnusmerkkejä syövän, mukaan lukien angiogeneesi [23]. Angiogeneesiä estävä allekirjoitus MIRS arvioitiin qPCR tekniikalla ja määritellään ne MIRS merkittävästi muuttunut normaaleissa verrattuna sunitinibin saaneista ensisijainen kasvaimia 1,3 kertainen muutos [23]. Sunitinibin on tyrosiinikinaasi-inhibiittorin suunnattu verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin (VEGFR), verihiutaleista peräisin oleva kasvutekijä (PDGFR) ja c-Kit. Mukaisesti meidän qPCR vahvistustulokset PCR data yleensä on usein lisääntynyt kertainen muutos verrattuna hybridisaation tietoihin. Monet angiogeneesiin liittyvien MIRS havaita Olson ja työtoverit ovat myös muuttaneet huomattavasti meidän materiaali [23]. Niistä mielenkiintoisin angiogeneesiin liittyvien MIRS merkittävästi muuttunut molemmissa tutkimuksissa löydämme miR-126, miR-155, ja miR-21 ja miR-424.

miR-126 on hiljattain tarkistettava tärkeä toimija angiogeneesi [43] ja Wang et al. osoittivat hiirimallissa, että se parantaa proangiogeeninen toimia VEGF: n ja FGF jonka tukahduttaa ilmentymistä spred-1, solunsisäinen estäjä angiogeenisten signaloinnin [44]. miR-126 on myös sijoitettu epidermaalisen kasvutekijän kaltaisen domeenin 7 (EGFL7) geenin. EGFL7 voi olla merkittävä rooli angiogeneesissä edistämällä VEGF signaloinnin ja verisuonten eheyden [45]. Lisäksi olemme aiemmin raportoitu, että miR-126 ilmentyminen merkitsevästi liittyy VEGF-A NSCLC [38]. Lisäksi havaitsimme, että ennustetekijöiden vaikutus miR-126 liittyy histologisia alatyyppejä ja imusolmukestatuksesta. Lisäksi ilmaisu ja roolit miR-126 voi olla erilainen eri pahanlaatuisia kasvaimia [23].

miR-155 on yksi Mirs kaikkein jatkuvasti mukana kasvainsairaus [46], mutta meidän tietomme mukaan ei ollut yhteydessä angiogeneesiin ennen tutkimuksen Olson ja työtoverit [23]. Sen on raportoitu olevan säädelty useissa ihmisen NSCLC tutkimuksia [15], [17], [20], ja alassäädetty hiirimallissa käytettäessä angiogeeninen inhibiittori sunitinibia [23]. Meidän array data, miR-155 oli taipumus muuttua merkittävästi välillä sekä lyhyellä että pitkällä selviytymisen ryhmiä (taulukko 3) ja oli merkitsevästi yliekspressoitu kasvain verrattuna normaalissa kudoksessa qPCR validointi asetettu. Olemme raportoineet ennustetekijöiden vaikutus miR-155 liittyvän histologisia alatyyppejä ja imusolmukestatuksesta mutta ei linkkiä näiden tulosten angiogeenisten merkkiaineita [37]. Näiden pohjalta uutta tietoa meillä on nyt tutkittava, onko miR-155 korreloi tunnettu angiogeeninen /hypoksinen parametrit VEGF-A, PDGF-B, HIF-1α ja FGF2. Mielenkiintoista, havaitsimme, ensimmäistä kertaa, miR-155 voidaan merkittävästi liittyvän FGF2 korkein vaikutusta N + NSCLC alaryhmä. Vaikka FGF2 on useita toimintoja, se on tärkeä toimija angiogeneesiä. Itse asiassa, miR-155 taipumus myös korreloivan VEGF-A N + alaryhmä. miR-155 oli yksi ensimmäisistä Mirs liittyvän NSCLC kehittämiseen ja lisätutkimukset ovat tärkeitä, jotta sen mahdollisuuksia angiogeeninen toiminta.

Tässä tutkimuksessa miR-21 on merkittävästi säädellään ylöspäin kasvain ja normaalissa kudoksessa (taulukko 2), joka tukee edellinen NSCLC raporteissa [15], [17], [20] ja havaitun alassäätö jälkeen antiangiogeenisen hoito [23]. miR-21 on myös havaittu olevan erittäin ilmaistaan ​​endoteelisoluissa [24]. Tuoreessa tutkimuksessa Liu et al., MiR-21 yliekspressoitui transfektoimalla ennalta miR-21 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja tuumoriangiogeneesissa analysoinnissa käytettiin kanan korioallantoiskalvoon [47]. He havaitsivat, että yli-ilmentyminen miR-21 DU145 soluissa lisäsi ilmentymistä HIF-1α ja VEGF, ja indusoi kasvaimen angiogeneesiä. He päättelevät, että miR-21 indusoi kasvaimen angiogeneesi kohdistamalla PTEN, mikä aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointireittejä, ja siten parantaa HIF-1α: n ja VEGF ilmaisun. Samoja reittejä kuvataan tärkeitä NSCLC kehittämiseen sekä [48], ja lisätutkimusten käsittelemään tätä suhdetta miR-21 keuhkosyöpä olisi kiinnostava.

Olson Tutkimus osoittaa miR-424 on osallisena angiogeneesissä koska tämä miR oli alassäädetty jälkeen sunitinibihoito [23]. Lisäksi, Ghosh et ai. ovat tutkineet tätä miR ja kuvattu, että hypoksian indusoima miR-424 ilmentymistä ihmisen endoteelisoluissa säätelee HIF-α isoformit ja edistää angiogeneesiä [49]. Ne viittaavat lisäksi siihen miR-424 tärkeä fysiologinen rooli postiskeemisesti angiogeneesiä. Sen sijaan, Nakshima et ai. raportoitu alas-säätely miR-424 edistää epänormaalin angiogeneesin kautta MEK1 ja sykliini E1 seniili hemangioma, osoittaa mahdollisia kudosten ja vaihe konkreettinen vaikutus saman miR [50]. Tutkimuksessamme miR-424 ei muuttunut, kun verrataan kasvaimen normaaliin kudokseen, mutta oli merkittävästi säädelty kudoksessa potilailla, joilla on huono ennuste kuin kudoksen potilaille, joilla on suotuisa ennusteeseen (taulukko 3). On meidän tietääksemme ole julkaistu tutkimus, joka on tutkinut ennustetekijöiden vaikutus miR-424 syövässä. Koska on olemassa merkittävä miR-424 ylössäätö köyhissä ennustetekijöiden ryhmä olisi kiinnostava arvioida enempää markkeri suuressa mittakaavassa NSCLC tutkimus.

Toinen merkittävä up-säänneltyjen markkeri meidän materiaali on miR-210 (taulukko 2), joka on aiemmin liittyvät angiogeneesiin [41], [51], [52]. miR-210 ylössäätöä uskotaan olevan ratkaiseva tekijä endoteelisolujen vastaus hypoksia ja siksi potentiaalisesti tärkeää kasvaimen angiogeneesiä. Tämä miR on hiljattain tarkastelleet Devlin et al. [51], päätteli, että miR-210 on vankka tavoite hypoksia-indusoituva tekijä ja että sen yliekspressio on havaittu erilaisissa sydän- ja verisuonitautien ja kiinteitä kasvaimia. NSCLC solulinjoissa, miR-210 on raportoitu välittävän mitokondrioiden muutoksiin liittyy modulaatio HIF-1 toimintaa [52]. Kuitenkin suuri osa toiminnalliset ja ennustetekijöiden vaikutus miR-210 NSCLC vielä ratkaisematta.

miR-182 sisältyy angiogeneesiä väylän GSEA, osittain siksi fibroblastikasvutekijäreseptori alustan 2 (FRS2) on yksi sen kohdegeenien. FRS2 on tärkeä säätelijä fibroblastikasvutekijän polku että me ja muut ovat osoittaneet olevan tärkeitä NSCLC etenemisen, mahdollisesti stimuloimalla angiogeneesiä [33], [53]. Mielenkiintoista, miR-182 oli ainoa miR merkittävästi muuttunut kaikissa kolmessa yhdistelmät, kuten on esitetty Venn-kaavio (kuvio 1). Sen ylössäätöä kasvaimen (sekä köyhiä ja suotuisa ennustetekijöiden ryhmä, taulukko 2) verrattuna normaaliin kudokseen, on yhdenmukainen aiempien tutkimuksen Raponi et al. [17]. Lisäksi miR-182 on huomattavasti säädellään ylöspäin lyhyt DSS vs. pitkä DSS potilailla (taulukko 3). Kuitenkin Barchack et ai. havaittu korkeampi miR-182 ilmentymisen primaarikasvaimille kuin metastaattisen keuhkotuumoreita, mikä osoittaa, että miR-182 ilmentyminen voi saavuttaa huippunsa alkuvaiheen NSCLC.

Huomaamme sama suuntaus miR-106a, joka on ollut osoitettu olevan säädelty aikana hypoksiaa rintasyövän ja paksusuolen syövän solulinjoissa [40]. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, miR-106a oli säädellään ylöspäin NSCLC [16], [17], [20]. Olemme myös tarkkailla sen lauseke merkittävästi vahvistunut kasvaimissa versus terveillä (taulukko 2). Kuten miR-182, miR-106a edelleen lisääntynyt kudoksen sairastavien potilaiden lyhyen selviytymisen sijaan pitkä selviytymisen (taulukko 3).

Kuten odotettua, monet Mirs tiedetään liittyvän angiogeneesiin eivät muuttuneet merkittävästi tutkimuksessamme. Cluster miR-17-92 (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a ja miR92-1), let-7, let-7f, asennuspalveli- 27b, miR-15b, miR-16, miR-92a, miR-99a, miR-130a, miR-214, miR-221, miR-222 ja miR-296 sekä joitakin Mirs esitetty lämpö kartta ( kuvio 3), ei ole merkittävästi muuttunut, tai ne osoittivat vain vähäisiä kertainen muutokset [24], [39], [41], [42]. Tämä puute merkittäviä muutoksia voi johtua vääriä negatiivisia tuloksia, koska on olemassa muutamia kunkin ryhmän potilaista. Lisäksi, kuten monet Mirs näyttävät olevan kudoksen ja vaihespesifisellä, jotkut näistä Mirs voi vaihtoehtoisesti käyttää vaikutusta rajoitu alaryhmiä resektoitiin NSCLC tai voi olla tärkeä muiden pahanlaatuisten kasvainten.

angiogeenisen estäjiä yhdessä kemoterapian vahvistetaan kuten NSCLC hoitoa, mutta vielä tietoa biologiasta, effektorit mekanismeja sekä varoituksia ja ennakoivan markkereita ovat perusteltuja. Mirs ovat vakaita ja mahdollisesti mitattavissa sekä kudosten ja seerumin. Useat Mirs liittyy angiogeneesiä ja tässä tutkimuksessa tukee oletusta, että useat angiogeneesiin liittyvien MIRS ovat mahdollisesti tärkeitä NSCLC etenemistä. Ehdotamme miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 ja miR-424 on yksi mielenkiintoinen ehdokkaita. Koska Mirs usein ovat vaiheessa ja kudosspesifisiä, suuren mittakaavan tutkimuksia perusteltua edelleen tutkia niiden prognoosi- ja ennakoiva vaikutus. Lisäksi sama miR on usein useita kohdegeenien ja eri toimintoja. Siksi toiminnalliset tutkimukset ovat erittäin tarvitaan saada paremman käsityksen niiden biologisia toimintoja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus on hyväksynyt kansallisen tietosuojaviranomaiselle, The aluekomitean tutkimuseettinen neuvottelukunta ja Biopankkiverkosto Board Collection of Tissue. Tiedotus ja myöhempää kirjallista lupaa potilailta tai lähiomaisen pidettiin, mutta koska tämä oli retrospektiivinen tutkimus, jossa yli puolet potilaista kuolleen, jotkut enemmän kuin kymmenen vuotta sitten, Aluekomitean tutkimusta Ethics nimenomaan luopuneet tarvetta suostumusta.

potilaat ja kudosnäytteiden

From aikaisemmin hyvin kuvattua suuri NSCLC kohortin [30], kaksikymmentä formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotetut (FFPE) kasvain kudosnäytteitä saatiin joilla potilailla on diagnosoitu vaiheen I -IIIA yliopistollisessa sairaalassa Pohjois-Norjan (UNN) ja Nordland keskussairaalan (NLCH). Nämä olivat kymmenelle potilaalle lyhyt tautikohtaisia ​​eloonjäämisen (DSS) (NSCLC_01 – NSCLC_10), ja kymmenelle potilaalle pitkä DSS (NSCLC_11 – NSCLC_20). Lisäksi, näytteet normaalista keuhkokudoksesta sivustoja kymmenen pienisoluista keuhkosyöpää (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 ja NSCLC_19) otettiin mukaan tutkimukseen (NORM_01 – NORM_10). Neljä näytettä sydämiä, kukin 0,6 mm halkaisijaltaan, elinkelpoisista kasvain alueita kustakin kasvain ja normaali näyte otettiin ja yhdistettiin ennen RNA: n eristämistä, jotta saadaan edustava näyte kunkin potilaan. Pitkä ja lyhyt DSS ryhmiä ositettiin saadakseen tasainen jakautuminen sukupuolen ja histologia. Kasvain näytteitä säilytettiin osastot patologian UNN ja NLCH, lavastettuja mukaan International Union Against Cancer (UICC) TNM luokittelu, ja histologisesti aliluokitusta mukaan Maailman terveysjärjestön suuntaviivat [54], [55]. Kaikki potilaan materiaali tarkasteli kaksi riippumatonta ja koulutettua patologeja (SAS ja KAS). Kukaan potilaista ei saanut kemo- tai sädehoidon ennen leikkausta. Täydellinen potilastiedot saatiin potilastiedot, mukaan lukien demografiset, kliininen, hoito ja lopputulos tiedot.

RNA: n eristys

RNA eristettiin kerätystä kairausnäytteitä käyttämällä Palauta kaikki ™ Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit FFPE kudokset (Ambion, Austin, TX), mukaan valmistajan ohjeiden, joitakin pieniä muutoksia. Ksyleeni hoito nostettiin 3 min 8 min, ja proteaasikäsittely nostettiin 3 tuntia noin 20 tuntia. RNA laatu ja määrä arvioitiin käyttämällä NanoDrop 1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) ja edelleen varmistettiin Agilent 2100 Bioanalyzer profiilin.

Microarray menettelyjä

kokonais-RNA (700 ng ) näytteestä ja viite leimattiin Hy3 ™ ja Hy5 ™ fluoresenssileimalla käyttäen miRCURY

Tm LNA Array teho -leimauskitillä (Exiqon, Vedbaek, Tanska) esitetyn menettelyn valmistajan. Hy3 ™ -merkattua näytteitä ja Hy5 ™ -merkityllä viite RNA-näytettä (joka sisältää yhtä näyte RNA lajien mukana tässä tutkimuksessa) sekoitettiin pareittain ja hybridisoitui miCURY

Tm LNA Array versio 5

nnen sukupolven (Exiqon, Tanska), joka sisältää sieppauskoettimien suunnattu kaikille ihmisen miRNA rekisteröity miRBASE versiossa 14.0 Sanger Institute. Hybridisaatio suoritettiin mukaisesti miRCURY ™ LNA array käsikirja käyttäen Tecan HS4800 hybridisaatio station (Tecan, Itävalta). Hybridisaation jälkeen mikrosiru diat skannattiin ja varastoitava otsonia ympäristössä (otsoni tason alapuolella 2,0 ppb) estääkseen mahdollisia valkaisu fluoresoivan väriaineita. MiCURY ™ LNA Array mikrosirujen Levyt skannattu käyttäen Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies Inc., USA) ja kuva-analyysi suoritettiin käyttäen ImaGene 8.0 ohjelmisto (BioDiscovery Inc., USA). Määrälliset signaalit tausta korjataan offset-arvo 10 ja normalisoitu käyttämällä yleisiä Lowess (Paikallisesti Weighted scatterplot tasoittava) regressio algoritmi [56].

Tietokanta toimittamisen microarray tietojen

microarray data valmisteltiin mukaan vähintään tietoa microarray kokeilu (MIAME) suositukset [57] ja talletetaan GEO tietokannassa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GEO liittymistä numero alusta on GSE27705 ja tutkimus on nähtävissä: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705.

kvantifiointi kypsien miRNA reaaliaikaisella qPCR

Yksi tai useampi seuraavista perusteista käytettiin valittaessa MIRS PCR validointi; merkittävä P-arvo, korkea kertainen muutos ja /tai angiogeneesiin liittyvän Mirs. Viisi näytettä kustakin ryhmästä riittävät kasvaimen miR jälkeen jäljelle erilaisia ​​analyysi käytettiin PCR-vahvistus. Niistä 41 testattu Mirs, 28 Mirs havaittiin 7 tai useampia näytteitä ja analysoitiin. Vakautta miRNA havaittiin kaikissa näytteissä testattiin Exicon käyttämällä Normfinder ohjelmistoa. miR-423-5p oli yksi suositellun viite miRNA yhdessä miR-150, miR-423-5p ja miR-300. miR-300 jätettiin johtuen erittäin alhainen havaittu. Lisäksi Normfinder havaittu suurta vaihtelua luki- 150, mutta miR-423-5p havaittiin olevan vakain miRNA datan asetettu ja näin ollen käytetään viitteenä. Kaikki reaaliaikaiset qPCR Kokeet suoritettiin Exiqon, Vedbaek, Tanska. 10 ng RNA käänteiskopioitiin 10 ui reaktiot käyttäen miRCURY LNA ™ Universal RT miR PCR, Polyadenylaatio ja cDNA-synteesi Kit (Exiqon); kukin näyte käsiteltiin kolmena kappaleena. cDNA laimennettiin 100-kertaisesti ja 4 ul käytettiin 10 ul PCR-reaktioissa mukaan protokolla miRCURY LNA ™ Universal RT miR PCR; Kunkin miR määritettiin kerran qPCR kolmena kappaleena cDNA. Monistus suoritettiin LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) 384 kuoppalevyillä. LinRegPCR (versio 11.5) ohjelmistoa käytettiin määrittämään qPCR monistustehokkuudessa. Keskimääräinen monistustehokkuudessa käytettiin korjaamaan Raw Cp arvot.

Pathway analyysi

vaikutuksia eri reittejä arvioitiin Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) johdettu proteiini analyysiin Evolutionary Suhde (PANTTERI). Panther luokitusjärjestelmä on ainutlaatuinen resurssi, joka luokittelee geenit niiden toimintoja käyttämällä julkaistua tieteellistä kokeellista näyttöä ja evoluution suhteita ennustaa toiminto jopa ilman suoria kokeellista näyttöä. Geeni setti otettiin MirDB (https://www.mirdb.org) (https://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full) tietokanta, joka on koonnut geeni luetteloita reittejä kuratoinut vuonna Panther tietokantaan.

koko lista on saatavilla osoitteessa https://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miRNA merkintä perustuu miRBase versioon 13 (https://www.mirbase.org/). GSEA analyysi suoritettiin käyttäen R tilastokieltä (www.r-project.org) ja GSEA paketti R saatavilla https://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.

Data