Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

K-RAS mutaatio aiheuttaa erityisen vaikea ongelma syövän hoidossa. Aktivoivat mutaatiot K-RAS ovat yleisiä keuhko-, haima-, ja paksusuolen ja niihin liittyy huono hoitovaste. Sellaisena kohdennetut hoidot kumota K-RAS aiheuttama onkogeenisuustutkimuksessa olisi valtava arvo.

Methods

etsitään pienimolekyylisiä kinaasiestäjät että ensisijaisesti vaikuttaa kasvuun peräsuolen syövän solut, jotka ilmentävät mutantti K-RAS. Vaikutusmekanismi yhden estäjän tutkittiin käyttäen kemiallisia ja geneettisiä lähestymistapoja.

Tulokset

Havaitsimme BAY61-3606 estäjänä leviämisen kolorektaalisyövässä soluissa, jotka ilmentävät mutantti muotoja K-RAS, mutta ei isogeenisiin soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä K-RAS. Sen lisäksi, että anti-proliferatiiviset vaikutukset mutantti-soluissa, BAY61-3606 esillä selvä biologinen ominaisuus villityypin soluja, jotka on siirrettävä herkkyys inhibitioon RAF. Tässä yhteydessä BAY61-3606 toimi estämällä MAP4K2 (GCK), joka normaalisti aktivoi NFκβ signalointia villin tyypin solujen vasteena inhibitioon RAF. Seurauksena MAP4K2 eston, villityypin solut tulivat herkkiä AZ-628, joka on RAF-inhibiittori, kun käsitelty myös BAY61-3606.

Päätelmät

Nämä tutkimukset osoittavat, että BAY61-3606 kohdistaa erillisiä biologisia vaikutuksia eri geneettisen yhteyksissä.

Citation: Lau KS, Zhang T, Kendall KR, Lauffenburger D, Gray NS, Haigis KM (2012) BAY61-3606 Vaikuttaa elinkelpoisuus koolonkarsinoomasoluissa in genotyypin -johdetussa Manner. PLoS ONE 7 (7): e41343. doi: 10,1371 /journal.pone.0041343

Toimittaja: David J. Reiner, University of North Carolina, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2012 Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 18 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Lau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Institute (K01-CA118425 ja P30-CA006516) ja American Cancer Society (MGO-114877) ja lahjoituksena Merlino Family Endowment Fund. KSL on Robert Black Fellow Damon Runyon Cancer Research Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

RAS perheen GTPaaseja toimivat binaarikytkintä jotka käyvät läpi konformaation muutoksen, sitoutuessaan GTP, joiden avulla ne voivat harjoittaa monia alavirran signalointia efektoreja kuten RAF, PI3K, ja RALGDS [1]. Luontainen GTPaasi aktiivisuus RAS hydrolysoi GTP bruttokansantuotteeseen avulla GTPaasia aktivoiva proteiini (GAP) kofaktoreita inaktivoimiseksi sen signalointi valmiudet. Missensemutaatioita kodoneissa 12, 13, 61 tai 146 ovat yleisiä syöpään ja liittyvät vastustuskyvyn GAP toimintaa, jonka avulla RAS sinnikkäästi aktivoitu, GTP sitoutuneena. Aktivointi K-RAS mutaatioita esiintyy noin 15% kaikista syövistä (joten se on yksi yleisimmin mutatoitunut onkogeenien), mutta ovat erityisen yleisiä kaikkein vaarallisin syöpäsairauksien, kuten syntyneiden sappiteiden, paksusuoli-, keuhko-, ja haiman [2]. Kolorektaalisyövässä, esimerkiksi K-RAS on mutatoitunut lähes 40%: ssa tapauksista [2]. Tärkeää on, kasvaimista K-RAS mutaatiot ovat erityisen tulenkestävä perinteisiin ja kohdennettuja hoitomuotojen ja liittyvät yleensä huonoon ennusteeseen [3] – [5].

Suurin haaste estäisi kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle aktivoitujen K-RAS on kyvyttömyys estää suoraan mutantti proteiini. Koska signalointi ominaisuudet K-RAS on parannettu kautta inaktivointi sen GTPaasi-aktiivisuus, suora farmakologinen esto RAS ei ole kestävä terapeuttinen strategia. Vaihtoehtoista strategiaa torjua mutantti K-RAS on estää sen loppupään -efektiboksejamme esimerkiksi RAF-MEK-ERK (MAPK) kautta. MEK estäjät ovat saaneet huomiota, koska niiden allosteerinen vaikutusmekanismi, joka antaa äärimmäisen spesifisyys, ja niiden osoitti vaikutuksensa ihosyövän ja paksusuolen syövät ilmentävät aktivoitua B-RAF [6], [7]. MEK estäjät suorittaa huonosti ilmentävien syöpien mutantti K-RAS kuitenkin ehkä johtuu toissijaiseen mutaatioita, jotka vaikuttavat vasteen tai olemassaoloon MEK-riippumaton signalointi alavirtaan RAF [8], [9]. Koska presumptiveness näistä skenaarioista, on selvää, että parempi käsitys siitä, miten K-RAS signalointi verkosto toimii syövän kehittämiseen tarvitaan uusia hoitomuotoja.

Viime vuosina suuren mittakaavan toiminnallisia genomiikan lähestymistavat ovat olleet palveluksessa löytää kinaasi tavoitteita, kun pudotti ovat ”synteettisiä tappava” kanssa mutantti RAS. Mahdolliset hoitotavoitteet, joita todettu kuuluvan TBK1 [10], STK33 [11], CDK4 [12], ja PLK1 [13], vaikka se jää nähtäväksi, onko jokin näistä ovat

bona fide

terapeuttisten kohteiden K-RAS mutantti syöpiä. Kun taas ymmärtämään mekanismeja, joilla K-RAS-signaalit nämä tavoitteet on keskeinen suunnitteluun tehokkaita lääkkeitä, vähemmän tutkittu, ja usein unohdetaan, kysymys on, miksi villityypin soluissa, mikä myös ilmaista näitä tavoitteita, sietää lakkaa toimimasta näiden entsyymejä. Tämä kysymys on yhtä tärkeä lääkkeiden kehittämisen, koska etu kohdennettuja hoitoja (tavanomaisiin chemotherapies) on niiden potentiaali selektiivisyys pahanlaatuisia soluja.

Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu aktiivisuutta BAY61-3606 yhteydessä peräsuolen syövän, perehdyttäisi (1) mahdollisia terapeuttisia kohteita ilmentävien syöpien mutantti K-RAS ja (2) väyliä, jotka säätelevät vastetta ei-mutanttien solujen kohdennettuun estäjiä. BAY61-3606 tunnistettiin alun perin oraalisesti käytettävissä, ATP-kompetitiivinen inhibiittori Pernan tyrosiinikinaasi (SYK) [14]. Koska SYK on aktiivinen rooli tulehdusreaktio, BAY61-3606 on pääosin tutkimuksiin käytettyjen immuunijärjestelmän solujen toimintaa. Esimerkiksi BAY61-3606 estää antigeenin aiheuttama hengitysteiden tulehdus rotilla ja B-solujen muuttoliike hiirissä [14], [15]. Vaikka kaikki vaikutukset BAY61-3606 immuunisoluissa liittyy sen kykyyn inhiboida SYK, ei tiedetä, onko BAY61-3606 on vaihtoehtoinen tavoitteet biologista merkitystä muissa solun yhteyksissä. Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu kaksi SYK riippumaton toiminta liittyy BAY61-3606 peräsuolen syöpäsoluja.

Methods

Solulinjat, knockdowns, ja lääkehoitoja

Kaikki koolonsyöpäsolulinjoissa pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty penisilliinillä (100 yksikköä /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Peräsuolen syöpä solulinja (CAR1) pidettiin DMEM /F12, johon oli lisätty penisilliiniä (100 yksikköä /ml) /streptomysiiniä (50 ug /ml), ja 5% FBS: ää. Knockdowns saavutettiin pSICOR tai pLKO lentivirusvektoreita [16]. Kohdesekvenssejä varten knockdowns löytyvät taulukosta S2. Huumehoidon kokeissa solut maljattiin 24 tuntia ennen altistusta lääkeaineen. AZ-628 saatiin AstraZeneca. CI-1040 saatiin Pfizer. R406 syntetisoitiin Gray laboratoriossa. BAY61-3606 ja IKK VII ostettiin EMD Biosciences. BAY johdannaiset syntetisoitiin tässä tutkimuksessa.

Solusyklianalyysiä ja solujen elinkelpoisuuden määritykset

Solusyklianalyysiä suoritettiin FACS: n välityksellä, joka perustuu propidiumjodidilla ilmaista, käyttäen standardimenetelmiä. Mitata solujen elinkykyä, soluja kasvatettiin 96-kuoppaisilla levyillä, kun läsnä tai poissa lääkkeen 72 tunnin ajan, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin sitten Syto60 (Invitrogen). Levyt oli kuvattu ja mittaamaan Licor Odyssey järjestelmä (Licor).

Bio-Plex signalointi määrityksissä

Bio-Plex määritysjärjestelmä käytettiin mittaamaan signalointia lääkkeellä käsiteltyihin soluihin. Lyhyesti, soluja inkuboitiin, kun läsnä on lääkettä eri aikaa ja sitten lyysattiin Bio-Rad soluhajotuspuskurin (Bio-Rad). Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttäen BCA-määrityksellä (Pierce) ja 5 ug proteiinia kustakin näytteestä käytettiin Bio-Plex-analyysi. Fosfo-signalointi analyysit suoritettiin käyttäen saatavilla fosfo-signalointia määritys sarjat ja määrälliset Bio-Plex 200 järjestelmä (Bio-Rad): p-Iκβα (Ser32 /Ser36), p-JNK (Thr183 /Tyr185), p-MEK1 ( Ser217 /Ser221), p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), p-p90RSK (Thr359 /Ser363), p-p38 (Thr180 /Tyr182), pc-Jun (Ser63), p-ATF2: n (Thr71 ), p-AKT (Ser473), p-S6 (Ser235 /Ser236), p-STAT3 (Ser727), p-STAT3 (Tyr705) ja p-GSK3α /β (Ser21 /Ser9). Bio-Plex määritys yhteensä MEK1 analysoitiin myös latauskontrollina. Kaikki signaalit normalisoitiin yhteiseen ohjaus solulinja lysaattia, jotta määrityksissä levyjen välillä on oltava vertailukelpoisia.

Biochemical -aktiivisuusmäärityksiä

biokemiallinen aktiivisuus BAY61-3606 ja johdannaisten mitattiin kahdella tavalla . Ensinnäkin, käytimme Soveltamisala n KINOMEscan ™ -tekniikka tunnistaa ne kinaasit, jotka estivät varten substraatin sitoutumisen yhdisteillä, kaikki analysoitiin 1 uM. Toiseksi, käytimme Invitrogen n SelectScreen® Biochemical Kinase Profilointi Service määrittää

in vitro

IC50 yhdisteiden määrätyiltä kinaasien.

Chemical johtaminen BAY61-3603

Tietoja synteesiä BAY johdannaisia ​​ja rakenteet näiden johdannaisia, löytyy kuvassa S5.

tulokset

AZ-628 ja BAY61-3606 tukahduttaa kasvua soluissa, jotka ilmentävät K-RAS

G13D

Kun pyritään tunnistamaan uusia terapeuttisia kohteita kolorektaalisyövissä ilmentävät mutantti K-RAS, teimme näyttö pienimolekyylisiä estäjät, jotka vaikuttavat elinkelpoisuuden genotyyppispesifinen tavalla. Näissä tutkimuksissa käytimme joukko isogeenisen koolonsyöpäsolulinjaa jotka eroavat ainoastaan ​​niiden K-RAS mutaatiostatus. Kantasolulinjoista, HCT-116 ja DLD-1, kuljettaa heterotsygoottinen aktivoiva mutaatio K-RAS (G13D /+). Johdannainen solulinjat, HKE-3 ja DKS-8, säilyttävät villityypin alleelin, mutta ovat menettäneet mutantti alleeli K-RAS nojalla geenikohdennuksen [17]. Yhdenmukainen edellisessä työssä [9], huomasimme, että K-RAS mutantti solut olivat yliherkkiä AZ-628, yleiseurooppalaisen RAF estäjä [18], [19], verrattuna villityypin soluissa, mutta herkkä CI-1040 , joka on MEK-inhibiittori [6] (Fig. 1a). Huomasimme myös, että BAY61-3606, perna tyrosiinikinaasi (SYK) estäjä, joka kaiken elinkelpoisuuden HCT-116 ja DLD-1-soluissa verrattuna HKE-3 ja DKS-8-soluista (Fig. 1a, kuvio. S1a).

(a) Solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 kuluttua 72 tunnin AZ-628, CI-1040 tai BAY61-3606 hoidon HCT-116 (K-RAS

G13D /+, punainen) tai HKE-3 (K-RAS

– /+, sininen) solulinjat. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin DMSO ajoneuvon käsitellään käyttölukituksen solulinjaa. Virhe pylväät edustavat SEM 3 itsenäisestä kokeesta. Solut, jotka ilmentävät mutantti K-RAS olivat suhteellisen herkkiä AZ-628 ja BAY61-3606, mutta ei CI-1040. (B) Cell cycle profiilit, määritettynä propidiumjodidivärjäys, kolorektaalisyövän solujen mutantti B-RAF (HT-29) käsiteltiin CI-1040 tai mutantti K-RAS (DLD-1) käsiteltiin BAY61-3606. Vaikka esto MEK indusoi G1 pysähtymisen HT-29-solujen, mistä on osoituksena menetys 4N huippu, BAY61-3606 ei näytä muuttavan profiilia DLD-1-soluja. (C) Solujen elinkelpoisuus ja peräsuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti B-RAF (V600E) 72 tunnin kuluttua hoidon BAY61-3606 ja /tai CI-1040. Solut, jotka ilmentävät mutantti B-RAF (HT-29 – kiinteät ääriviivat ja RKO – pisteviivalla) olivat herkkiä sekä BAY61-3606 ja CI-1040 ja nämä kaksi inhibiittorit yhteistyössä tuottaa tehostetun vastausta. (D) Phospho-MEK1 (Ser217 /Ser221) ja fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) tasoilla K-RAS villityypin ja mutanttien solujen jälkeen 45 minuutin altistuksen 1 uM AZ-628, 1 uM BAY61-3606, tai ajoneuvon ohjaus. Signaalit mitattiin käyttäen Bio-Plex määrityksissä. Suhteellinen signaali normalisoidaan Master Control lysaattia. AZ-628 vähensi taso fosfo-MEK ja fosfo-ERK, mutta BAY61-3606 ei.

Voit selvittää miten BAY61-3606 vaikuttaa elinkelpoisuuden ilmentävien solujen mutantti K-RAS, analysoimme solusyklin käsiteltyjen solujen lääkeaineen kanssa. Olemme havainneet, että BAY61-3606 ei muuttanut solusyklin profiilia DLD-1-soluja, eikä se indusoi apoptoosia (Fig. 1b). Toisin kuin peräsuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti K-RAS, solulinjat, jotka ilmentävät mutantti B-RAF olivat herkkiä eston MEK ja hoidon CI-1040 aiheuttama G1 pidätys [6] (Fig. 1b, c). Mielenkiintoista on, olemme havainneet, että B-RAF mutantti solulinjat olivat myös herkkiä BAY61-3606 ja että CI-1040 ja BAY61-3606 yhteistyössä tuottamaan tehostetun negatiivinen vaikutus elinkelpoisuuden ilmentävien solujen aktivoitujen B-RAF (Fig. 1 c). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, (1) että BAY61-3606 estää proteiini, joka tarvitaan yleinen elinkelpoisuus soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS tai B-RAF ja (2) että BAY61-3606 kohdistettu polku, joka on riippumaton kanoninen MAPK /ERK signalointi.

Voit testata toinen osa tämän hypoteesin suoraan, mittasimme aktivaatiotilaa MEK ja ERK soluissa, joita oli käsitelty BAY61-3606. Huomasimme, että esto RAF AZ-628 tukahdutetaan MEK ja ERK-fosforylaation, mutta BAY61-3606 ei voinut tehdä niin (Fig. 1 d). Siten vaikka AZ-628 ja BAY61-3606 molemmat vaikuttavat selektiivisesti elinkelpoisuuden K-RAS mutanttisoluja, ne näyttävät tehdä niin läpi erillisiä polkuja, jossa BAY61-3606 kohdistaminen polku, joka on riippumaton MEK ja ERK.

SYK ei ole tavoite BAY61-3606 soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS

koska BAY61-3606 kehitettiin alun perin ATP-kompetitiivinen inhibiittori SYK [14], ei ollut yllättävää, että se näytti kohdistaa MEK /ERK-riippumaton polku. Kuitenkin, HCT-116-solut, jotka ovat herkkiä BAY61-3606, eivät ilmennä havaittavia määriä SYK, viittaa siihen, että se ei voi olla kohde BAY61-3606 tässä yhteydessä. Tutustua tarkemmin, käytimme lentivirus- shRNA kaataa SYK DLD-1-solut (Fig. 2a). Knockdovvn SYK ei vaikuttanut kokonaiskasvusta eikä se vaikuta merkittävästi vaste DLD-1 solut BAY61-3606 (Fig. 2b). Lisäksi solujen käsittely R406, rakenteellisesti erillisen estäjä SYK, ei johtanut edullisella vaikutus soluihin, jotka ilmentävät mutantti K-RAS (Fig. 2b). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Syk ole merkitystä kohde BAY61-3606 peräsuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti K-RAS.

(a) pudotus Syk-proteiinin DLD-1-solujen kautta shRNA, kuten on esitetty Western blotting -tekniikalla. Ramos (R) solulinja, hematopoieettisen solulinjan, joilla on korkea ilmentymisen SYK, käytettiin positiivisena kontrollina. (B) Cell elinkelpoisuus DLD-1-solut (punainen), ja sen K-RAS villityypin (DKS-8 – sininen) ja SYK taintumisen (punainen tummennetut) johdannaiset 72 tunnin jälkeen hoidon 1 uM BAY61-3606 tai R406, erillinen SYK estäjä. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin DMSO ajoneuvon käsitellään käyttölukituksen solulinjaa. Virhe pylväät edustavat SEM 3 itsenäisestä kokeesta. DLD-1-soluissa ja sen K-RAS villin tyypin johdannainen ei esiintynyt herkkyyttä R406, kun kaatamalla SYK DLD-1-soluissa vain vähäisiä muutoksia sen herkkyys BAY61-3606.

BAY61- 3606 tavoitteena on pieni määrä kinaasien

arveltu, että aktiivisuus BAY61-3606 paksusuolen syöpäsoluissa johtui ”off-tavoite” vaikutus estäjän, mutta vähän tiedettiin promiscuity tämän nimenomaisen yhdiste. Tunnistaa muita mahdollisia kohteita BAY61-3606, ensin analysoidaan kykyä BAY61-3606 estää kompetitiivisesti aktiiviseen kohtaan sitova paneelia 402 kinaasien. Olemme havainneet, että 1 uM BAY61-3606 inhiboivat mukaan yli 90%, vain 15 kinaasien (Fig. 3a, taulukko 1, taulukko S1), joka osoittaa, että se on erittäin selektiivinen, samanlainen selektiivisyys kahdessa kliinisessä estäjät, Imatinib ja Gefitinibi [20]. Koska inhibitio aktiivisen sitovan voi, tai ei voi, olla suoraan korreloi inhibitio kinaasiaktiivisuuden, teimme toissijainen analyysi, jossa määritimme

in vitro

IC50-arvot BAY61-3606 vastaan ​​monet näistä hakijan tavoitteita. Tämä tutkimus osoitti, MAP4K2, joka on STE-20-ryhmän kinaasia, koska kinaasi herkin BAY61-3606, jossa on

in vitro

IC50 oli 11,3 nM (taulukko 1).

(a) TREEspot kuva edustaa estoaktiivisuus BAY61-3606. Kinaasit, jotka estivät ATP sitoutumisen BAY61-3606 osoitetaan punaisia ​​pisteitä fylogeneettiseen puun kinaasien. Koko punainen piste vastaa eston määrällä 1 uM BAY61-3606. Identiteetti Yksittäisten kinaasien löytyy taulukosta S1. (B) Solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 jälkeen shRNA välittämää Knockdown mahdollisista BAY61-3606 tavoitteiden DLD-1 (punainen) tai DKS-8 (siniset) solulinjat. Suhteellinen solujen elävyys normalisoidaan kantasolulinjoista infektoitu vektorilla. Virhe pylväät edustavat SEM 2 riippumatonta koetta.

geneettinen analyysi mahdollisten BAY61-3606 tavoitteiden

seuranta meidän biokemiallinen analyysi BAY61-3606 toimintaa, me käytetyt lentiviruksen shRNA onko pudotus minkä tahansa mahdollisia kohteita pystyi phenocopy Lääkehoito (eli vaikuttavat selektiivisesti elinkelpoisuuteen K-RAS-mutantti-solut) (Fig. S1c, taulukko S2). Näitä tutkimuksia varten käytimme DLD 1 /DKS-8 isogeenisiin solulinjoja, koska meillä oli käytetty tätä paria geneettistä analyysiä SYK (Fig. 2). Pudotus on vain yksi mahdollisista tavoitteet, jotka me määritettiin, HIPK2, pystyi vaikuttavat selektiivisesti elinkelpoisuuteen K-RAS mutanttisoluista (Fig. 3b). Kuitenkin voimme vain tunnistaa yhden shRNA sekvenssi, joka tuotti riittävän knockdown tämän tavoitteen. Tämän seurauksena tämä tutkimus oli viittaavia, mutta ei ole ratkaiseva, on rooli HIPK2 kuin tavoitteeksi BAY61-3606 soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS. Haimme riippumaton tapa tunnistaa kohde BAY61-3606.

tunnistaminen biologisesti aktiivisia BAY61-3606 johdannaiset

Toissijainen meidän geneettinen analyysi, otimme kemiallinen lähestymistapa opiskeluun BAY61-3606 . Tässä tutkimuksessa olemme syntyy 30 rakenteellisesti liittyviä johdannaisia ​​BAY61-3606 ja analysoitiin niiden kyky selektiivisesti vaikuttaa elinkelpoisuuden ilmentävien solujen mutantti K-RAS (Fig. S2). Näistä 30 johdannaiset, vain yksi (johdannainen 6) säilytti selektiivinen teho samanlainen kantayhdisteen (Fig. 4a, b, Fig. S1B). Muut (esim. Johdannainen 8) säilytetään valikoivuus mutta hävisi teho. Vastatakseen valikoivuus BAY johdannaisen 6 laajemmin, arvioimme sen aktiivisuuden paneelissa paksusuolen syövän solulinjoja, jotka olivat joko mutantti villityypin K-RAS. Yhdenmukainen analyysiimme isogeeninen paria, 4/5, jotka ilmentävät mutagenisaation aktivoitu K-RAS vastasivat BAY johdannainen 6, kun taas 0/3 solulinjat ilmentävät villin tyypin K-RAS vastasivat (Fig. S3).

(a) GI50 arvot BAY61-3606 johdannaisten suoritetaan HCT-116 (punainen) tai HKE-3 (sininen) soluja. Johdannainen 6 valittiin lisätutkimuksia sen lisääntynyt teho ja spesifisyys K-RAS mutanttisoluista. (B) Solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 72 tunnin kuluttua altistumisesta BAY johdannaisen 6 HCT-116 (punainen) tai HKE-3 (sininen) soluja. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin DMSO ajoneuvon käsitellään käyttölukituksen solulinjaa. Virhe pylväät edustavat SEM 3 itsenäisestä kokeesta. HCT-116-solut olivat suhteellisen herkkiä BAY johdannainen 6.

verrata BAY61-3606, me testattiin kyky useiden johdannaisten estää kompetitiivisesti aktiiviseen kohtaan sitova suuressa paneelissa kinaasien. Huomattavasti, kukin johdannaiset testattiin oleellisesti menettäneet kyvyn inhiboida kompetitiivisesti aktiivisen sitoutumisen 402 kinaaseja, jotka analysoitiin, kuten HIPK2 (Fig. S4). Tämän mukaisesti havainnon,

in vitro

-aktiivisuusmäärityksiä paljasti menetykseen kinaasin estovaikutuksen kahden johdannaisten testattu (Fig. S5).

BAY61-3606 tavoitteet MAP4K2 vaikuttaa vasteen luonnonvaraisen tyyppinen solujen AZ-628

analysoitaessa suhteellinen toiminta AZ-628 ja BAY61-3606, testasimme ovatko nämä kaksi yhdistettä olisi yhteistyössä tuottamaan tehostetun vaikutuksen soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS, joka on samanlainen osuuskunnan vaikutus nähdään CI-1040 ja BAY61-3606 soluissa, jotka ilmentävät mutantti B-RAF. AZ-628 ja BAY61-3606 eivät toimineet yhteistyössä HCT-116-solut (Fig. 5a), mutta viittaa siihen, että ne voivat kohdistaa yhteinen polku. Kiinnostavaa nämä kaksi inhibiittorit osallistui yhteistyöhön vaikuttaa kielteisesti elinkelpoisuuden ilmentävien solujen villityypin K-RAS. Pohjimmiltaan HKE-3-soluissa, jotka olivat muodollisesti resistenttejä AZ-628 tuli herkkä, kun ne käsiteltiin myös BAY61-3606 (Fig. 5a). BAY johdannainen 6, joka säilytti kyky valikoivasti tukahduttaa lisääntymistä soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS (Fig. 4b), menetti kykynsä tehdä yhteistyötä AZ-628 soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä K-RAS (Fig. 5b).

(a) solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 72 tunnin kombinatorisista hoidon vaihtelevilla BAY61-3606 ja 1 uM AZ-628 HCT-116 (punainen viiva) tai HKE-3 (siniset viivat) soluja. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin DMSO ajoneuvon käsitellään käyttölukituksen solulinjaa. Virhe pylväät edustavat SEM 3 itsenäisestä kokeesta. Kaksi inhibiittorit yhteistyötä villityypin soluissa, mutta ei soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS. (B) Solujen elävyys 72 tunnin kombinatorisista hoidon vaihtelevilla BAY johdannaisen 6 ja 1 uM AZ-628 HCT-116 ja HKE-3-soluissa. BAY johdannainen 6 ei anneta ylimääräisiä herkkyys AZ-628 upon HKE-3-soluissa. (C) Solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 kuluttua 72 tunnin AZ-628 käsittely HCT-116 tai HKE-3-solulinjojen kanssa MAP4K2 knockdown. Menetys MAP4K2 ei vaikuta AZ-628 vasteen soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS, mutta kiihdyttää vaikutusta AZ-628 soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä K-RAS. (D) Solujen elävyys 72 tunnin kombinatorisista käsittelemällä 1 uM BAY61-3606 ja 1 uM AZ-628 (tummennetut) tai 1 uM AZ-628 yksin (kirkas) in HKE-3 solujen MAP4K2 knockdown. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin 1 uM AZ-628 käsiteltyjen näytteiden. Vanhempien HKE-3-soluissa, BAY61-3606 antaa herkkyys AZ-628. Kun menetys MAP4K2, BAY61-3606 enää herkistää.

Lukuun ottamatta SYK, BAY61-3606 oli yli 10-kertaisesti tehokkaampi inhiboimaan MAP4K2 kuin mikään muu kinaasi. Lisäksi BAY johdannainen 6 menetti kykynsä estävät tehokkaasti

in vitro

kinaasiaktiivisuutta MAP4K2 (Fig. S5). Näiden havaintojen perusteella, tutkimme, MAP4K2 on merkitystä herkkyys villityypin ja K-RAS mutantti solujen BAY61-3606. HKE-3 ja Dks-8-soluista puuttuu MAP4K2 olivat yliherkkiä AZ-628, kun taas MAP4K2 knockout ei ollut vaikutusta vasteen HCT-116 tai DLD-1-solut (Fig. 5c, Fig. S6a). Päättelimme, että jos esto MAP4K2 jonka BAY61-3606 osuus muuttunut vasteen villityypin solujen AZ-628, sitten K-RAS villityypin soluissa, joista puuttuu MAP4K2 ei olisi edelleen herkistyneet AZ-628 käsittelemällä BAY61- 3606. Ennustetusti BAY61-3606 ja AZ-628 ei yhteistoiminnassa vaikuttamaan elinkelpoisuuden HKE-3-solujen puuttui MAP4K2 (Fig. 5d). Tulokset viittaavat vahvasti siihen, että BAY61-3606 muuttaa vaste ekspressoivan solun villityypin K-RAS AZ-628 estämällä kinaasiaktiivisuutta MAP4K2.

MAP4K2 aktivoi NFKB polku torjua AZ628 riippuvaisen kasvun inhibition

Koska MAP4K2 on tärkeää vasteen villityypin solujen AZ-628, seuraavan kerran kysyttiin MAP4K2 toimintoja säädellä vaste RAF inhibition. Tunnistaa koulutusjakson vastaavat MAP4K2 toimia, käytimme Bio-Plex fosfo-proteiinin analyysi mitata vaikutuksia MAP4K2 Knockdown eri solujen signalointireitteihin. Yhteensä, olemme profiloitu 13 fosfo-proteiinit: Iκβα (Ser32 /Ser36), JNK: n (Thr183 /Tyr185), MEK1 (Ser217 /Ser221), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), EK (Thr359 /Ser363) , p38 (Thr180 /Tyr182), c-Jun (Ser63), ATF2 (Thr71), AKT (Ser473), S6 (Ser235 /Ser236), STAT3 (Ser727), STAT3 (Tyr705) ja GSK3α /β (Ser21 /Ser9 ) (Fig. S7). Olemme löytäneet kaksi eroja HKE-3 ja HCT-116, joka meillä oletettuja saattavat liittyä toimintaan MAP4K2. Ensinnäkin, huomasimme, että pohjapinta taso Iκβα fosforylaation oli merkitsevästi pienempi HCT-116 kuin HKE-3-soluissa, mikä viittaa siihen, että NFκβ signalointi vaimennetaan soluissa, jotka ilmentävät aktivoitua K-RAS (Fig. S7). Iκβα fosforylaatio edelleen indusoitui HKE-3-solujen hoidon jälkeen AZ-628 ja tämä induktio oli riippuvainen MAP4K2 (Fig. 6a). Tämä havainto on johdonmukainen aiempien tutkimusten kanssa yhdistää MAP4K2 on NFκβ signalointi [21]. Toinen, olemme huomanneet, että JNK voimakkaasti aktivoitu HKE-3-solujen käsittelyn jälkeen AZ-628 (Fig. S7). Vaikka MAP4K2 on aikaisemmin yhdistetty JNK signalointi, tämä aktivaatio ei näytä vaativan MAP4K2 (Fig. S6b).

(a) Aika aikana fosfo-Iκβα (Ser32 /Ser36) aktivoitumisen jälkeen 1 uM AZ- 628 käsittely HCT-116 (punaiset viivat) tai HKE-3 (sininen viiva) solujen MAP4K2 kaataa mitattuna kautta Bio-Plex. Suhteellinen signaali normalisoidaan Master Control lysaattia. Virhe pylväät edustavat SEM 3 itsenäisestä kokeesta. NFκβ signalointi parannettiin HKE-3-solujen altistumisen jälkeen AZ-628 ja tämä oli riippuvainen MAP4K2. (B) Solujen elävyys kvantitoitiin Syto60 72 tunnin kombinatorisista hoidon IKK estäjän VII ja 1 uM AZ-628. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin DMSO ajoneuvon käsitellään käyttölukituksen solulinjaa. Kuten BAY61-3606, IKK-estäjä VII parannettu vaikutus AZ-628, erityisesti K-RAS villityypin soluissa. (C) Solujen elävyys 72 tunnin kombinatorisista käsittely 1 uM IKK estäjä VII ja 1 uM AZ-628 (tummennetut) tai 1 uM AZ-628 yksin (kirkas) in HKe3 solujen MAP4K2 knockdown. Suhteellinen solujen elävyys normalisoitiin 1 uM AZ-628 käsiteltyjen näytteiden. Menetys MAP4K2 kumosi kyky IKK-inhibiittorin VII herkistää HKE-3-solujen AZ-628.

Koska NFκβ oli ilmestynyt hyper-aktivoitua villityypin solujen MAP4K2 riippuvalla tavalla, olemme otaksuttiin, että inhibitio NFκβ reitin olisi sama vaikutus kuin BAY61-3606 tai MAP4K2 pudotus. Se on, odotimme, että inhibitio NFκβ lisäisi herkkyyttä K-RAS villityypin solujen AZ-628 vaikuttamatta herkkyys K-RAS mutanttisoluista. Ennustetusti esto NFκβ lisääntynyt herkkyys HKE-3 ja Dks-8 solujen AZ-628, lähinnä phenocopying MAP4K2 taintumisen (Fig. 6b, Fig. S6c). Sen sijaan, inhibitio JNK ei muuttanut herkkyyttä HKE-3-solujen AZ-628 (Fig. S6d). Edelleen, kuten BAY61-3606 hoitoon, knockdovvn MAP4K2 poistettiin kyky NFκβ inhibition herkistää villityypin solujen AZ-628 (Fig. 6c). Näiden tietojen, voimme päätellä, että MAP4K2 toimii alkupäässä NFκβ polku säädellä vaste paksusuolen syövän solujen inhibitio RAF.

Keskustelu

K-RAS on mutaatiolla aktivoidaan noin 40% peräsuolen syöpiä [2]. Aktivoitu K-RAS ajatellaan antavan onkogeenisuustutkimuksessa kautta kanoninen loppupään signalointi polkuja, esimerkiksi RAF-MEK-ERK (MAPK) signalointiryöpyn. Tämän mukaisesti ajatuksen, aktivoivat mutaatiot B-RAF esiintyy 15% ja peräsuolen syöpien ja ne ovat toisensa poissulkevia K-ras-mutaatioiden [22]. Kuitenkin esto MAPK signaloinnin, tyypillisesti suoraan estämällä MEK, on ​​pitkälti tehoton hoidettaessa K-RAS mutantti kolorektaalisyöpä [9], [23]. Tehon puuttumisesta MEK-inhibiittoreita tässä yhteydessä voi johtua pleiotrooppisten funktion K-RAS, joka on osoitettu edistävän muutoksen kautta PI3K ja RAL efektori väyliä lisäksi MAPK [24], [25]. Silti PI3K koulutusjakso mutaatioita tapahtuu myös kolorektaalisyövissä ja ovat usein yhtenevät K-RAS mutaatioita, mikä viittaa siihen, että PI3K ei ole yleinen efektori K-RAS signalointi paksusuolen syöpä [26]. Ja kun PI3K mutaatioita on liitetty MEK-inhibiittoreita syöpäsolulinjoissa [27], [28], K-RAS mutantti paksusuolen syövät geneettisesti muokatuista hiiret ovat luonnostaan ​​resistenttejä inhibition MEK [9]. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​vaihtoehtoinen selitys puute tehoa MEK estäjien kolorektaalisyövissä ilmentävät mutantti K-RAS – että on olemassa vaihtoehtoinen /rinnakkainen reitin myötävirtaan B-RAF, joka välittää K-RAS aiheuttama onkogeenisyydelle.

tutkimuksessamme olemme tunnettu aktiivisuus pieni molekyyli, BAY61-3606, että ensisijaisesti vaikuttaa elinkelpoisuuden ja peräsuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti K-RAS verrattuna isogeenisiin soluihin, jotka ekspressoivat vain villityypin K-RAS (Fig. 1a, Kuva. S1a). Koska BAY61-3606 on ATP-kilpailukykyinen estäjä, sen kyky ensisijaisesti vaikuttaa soluihin, jotka ilmentävät mutantti K-RAS aluksi ehdotti, että se on kohdistettu säätelykinaasi myötävirtaan K-RAS edistää leviämistä. Olemme aiemmin osoittaneet, että K-RAS edistää paksusuolen syövän solujen proliferaatiota kautta RAF-riippuvainen, mutta MEK-riippumaton, signalointireitin [9]. Kolme todistetta syytetä BAY61-3606 estäjänä tämä MEK-riippumaton polun alavirtaan RAF. Ensinnäkin, BAY61-3606 ei yhteistyötä AZ-628 soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS (Fig. 5a), mikä viittaa siihen, että nämä inhibiittorit suunnattu yhteinen polku. Toiseksi BAY61-3606 vaikuttaa kasvuun KRAS mutanttisoluja, mutta toisin kuin AZ-628, ei vaikuttanut fosforyloitumisaste MEK tai ERK (Fig. 1 d). Lopuksi BAY61-3606 hidasti peräsuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti B-RAF ja yhteistyössä MEK: iä estäjän tuottamiseksi tehostetun vasteen näissä soluissa (Kuva. 1 c).

Vaikka BAY61-3606 alunperin ominaista koska ATP kilpailukykyinen estäjä, sen selektiivisyys vähentää elinkelpoisuuden K-RAS mutanttisoluista ei voi vaatia tätä toimintaa. Meidän tutkimukset BAY61-3606 johdannaisten osoittavat, että ne puuttuu kyky vaikuttaa aktiivisen sitoutuminen voi silti säilyttää niiden kyky valikoivasti vaikuttaa solujen elinkykyyn. Yksi mahdollinen selitys tälle havainnolle on, että asiaa tavoite BAY61-3606 ja sen biologisesti aktiiviset johdannaiset on ei-kinaasiproteiini. Sen lisäksi estämällä kinaasien, ATP analogit voivat vaikuttaa biologian kautta muihin prosesseihin, mukaan lukien nukleiinihapot synteesi [29], [30] ja mikrotubulusten Moottoriajoneuvojen [31]. Vaihtoehtoisesti asiaankuuluvat tavoite voi olla joukossa 402 kinaaseja, jotka kartoitettiin meidän määrityksessä tai BAY61-3606 ja johdannaiset voivat estää kinaasiaktiivisuutta vaikuttamatta aktiivisen sitovia. Tällöin ne eivät pisteet meidän näytöllä.

Sen lisäksi, että toimintaa soluissa, jotka ilmentävät mutantti K-RAS tai B-RAF, myös tunnistaneet toissijainen biologinen vaikutus BAY61-3606; se uskottu villityypin soluja, jotka ovat yleensä resistenttejä AZ-628, herkkyys RAF inhibition (Fig. 5a). Käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja, tunnistimme MAP4K2 tavoitteeksi BAY61-3606 villityypin soluissa.