Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on 5 vuoden pysyvyys on alle 4%. Edistysaskelista huolimatta diagnostinen tekniikka, haimasyövän edelleen diagnosoidaan vasta myöhäisessä ja parantumaton vaiheessa. Tarkka biomarkkereita varhaisen diagnoosin ja ennustaa hoitovastetta tarvitaan kiireellisesti. Koska muuttaminen glukoosiaineenvaihdunnan on yksi tunnusmerkkejä syöpäsolujen, ehdotimme, että pyruvaattikinaasia tyyppi M2 (M2PK) ja laktaattidehydrogenaasin A (LDHA) entsyymit voivat edustaa uusia diagnostisia markkereita ja mahdollisia terapeuttisia kohteita haimasyöpä. Vuonna 266 kudosleikkeiden normaalista haima, haiman kystistä kasvaimet, haiman intraepiteliaalisten neoplasia (Panin) ja syöpä, arvioimme ilmaus PKM2, LDHA, Ki-67 ja CD8 + immunohistokemiallisesti ja korreloivat näiden merkintöjen kanssa kliinis ominaisuudet ja potilaan selviytymistä. PKM2 ja LDHA ilmentyminen arvioitiin myös Western blot 10 ihmisen haimasyövän solulinjoissa. PKM2 ilme nousi vähitellen kysta kautta Panin syöpään, kun taas LDHA yliekspressoitui koko karsinogeeninen prosessi. Kaikki paitsi yksi solulinja osoitti korkean ilmentymisen molemmat proteiinit. Potilaat, joilla on vahva PKM2 ja LDHA ilme oli merkittävästi huonompi selviytyminen kuin ne, joilla on heikko PKM2 ja /tai LDHA lauseke (7,0 kk vs. 27,9 kuukautta vastaavasti p = 0,003, log rank -testi). Ilmaisu Sekä PKM2 ja LDHA korreloivat suoraan Ki-67 ilmentyminen, ja kääntäen kasvaimensisäisenä CD8 + solujen määrä. PKM2 oli merkittävästi yli-ilmentyy heikosti eriytetty kasvaimia ja molemmat PKM2 ja LDHA oli yli-ilmentynyt suurempia kasvaimia. Monimuuttujalähettimet analyysi osoitti, että yhdistetty ilmentyminen PKM2 ja LDHA oli itsenäinen huono ennustetekijöitä markkeri hengissä. Lopuksi tuloksemme osoittavat suurta ekspressiokuviota kaksi suurta glykolyyttisten entsyymien aikana haiman syövän synnyn, lisääntynyt ilmentyminen aggressiivinen kasvaimia ja huomattavan haitallinen vaikutus eloonjäämiseen.

Citation: Mohammad GH, Olde Damink SWM, Malago M , Dhar DK, Pereira SP (2016) pyruvaattikinaasia M2 ja laktaattidehydrogenaasi A yli-ilmennetään Haimasyöpä ja korreloivat Huono tulos. PLoS ONE 11 (3): e0151635. doi: 10,1371 /journal.pone.0151635

Editor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Saksa

vastaanotettu: 05 elokuu 2015; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2016; Julkaistu 18 maaliskuuta 2016

Copyright: © 2016 Mohammad et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Haimasyöpä Research Fund, Jason Boas Foundation, NIH avustus P01 CA084203 ja UCLH /UCL Kattava Biomedical Centre, joka vastaanottaa osa rahoituksesta osastolta Healthin National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centres rahoitusjärjestelyä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi yleisimmistä ruoansulatuskanavan syövät ja neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Kirurginen resektio on tehokkain hoitoon, mutta potilaat ovat yleensä diagnosoidaan on edennyt pitkälle, kun kirurginen resektio ei ole mahdollista, jolloin viiden vuoden pysyvyys on alle 4% [2]. On olemassa muutamia muita tehokkaita hoitoja, joissa lievittävä yhden aineen tai yhdistelmä kemoterapiaa pääasiallisena hoitovaihtoehto potilaille, joilla on edennyt sairaus [3,4].

Aerobinen Glykolyysivaiheen on tunnusmerkki syöpäsolujen, tuotannon kanssa laktaatti jopa, kun läsnä on runsaasti määriä happea, ilmiö joka tunnetaan nimellä Warburg vaikutus [5-7]. Tärkeä etu kasvoi glykolyysin kasvainsoluissa on energian tuottamiseen ilman hapen kulutus ja glykolyyttisen välituotteita, kuten aminohappoja, nukleotidejä, fosfolipidejä ja triglyseridejä, joita käytetään makromolekyylien synteesiä varten rakenneosien uusia soluja [5, 6,8,9].

pyruvaattikinaasin (PK) on tiukasti säänneltyä glykolyyttistä entsyymiä, joka katalysoi viimeinen vaihe Glykolyysivaiheen ja välittää siirto fosfaatin fosfoenolipyruvaattia (PEP) ja adenosiinidifosfaatin (ADP) tuottamiseksi pyruvaattia ja energia (ATP) [10-12]. PK on neljä eri isoentsyymien PKM1, PKM2, PKL ja PKR, jonka ekspressio riippuu metabolisen solujen vaste. Sekä L ja M-geenit koodaavat PK-isoentsyymejä. L-geeni koodaa sekä L ja R-PK isoentsyymejä, kun taas M-geeni koodaa sekä M1 ja M2 isoentsyymien (PKM2) [13-17]. Aikana tuumorigeneesiprosessin ilmaus erityisiä PK isoentsyymien, esimerkiksi PK-M1 aivoissa ja PK-L maksassa, katoaa ja PKM2 ilmaisun hallitseva [18]. PKM2 ilme voi värähdellä välillä erittäin aktiivinen tetrameerinen isoformia ja lähes aktiivinen dimeerinen isoformia, riippuen solujen energian kysynnän tai tuotannon anabolisten välituotteita solujen lisääntymisen. Tetrameerisen isoformi PKM2 on pääasiassa ilmentyy normaaleissa soluissa, kun taas sen dimeerinen isoformi on yleensä löytyy kasvainsoluissa, joten nimi kasvaimen PKM2 [11,14,19].

Toinen alavirtaan komponentti glykolyyttisen reitin on laktaattidehydrogenaasi A (LDHA) entsyymi, joka on osa LDH perheen 2-hydroksihappoa oksidoreduktaaseja. LDH ovat homo- ja hetero- tetrameerisiä entsyymejä koostuu kahdesta suuresta alayksiköstä, A ja B, jolloin viisi isoentsyymejä, jotka katalysoivat palautuva pyruvaatin ja laktaatti. LDHA (tunnetaan myös LDH-5, LDH-M tai A4) koodataan

LDH-a

geenin ja vallitseva luurankolihaksessa ja maksassa, kun taas LDHB (tunnetaan myös LDH-1, LDH-H tai B4) koodaa

LDH-b

geeni ja sitä esiintyy pääasiassa sydämessä ja aivoissa [20-24]. LDH-C koostuu pääasiassa X-alayksiköt ja löytyy ihmisen siittiösolujen [22,25]. LDHA katalysoi pyruvaatin osaksi laktaatin kanssa NAD

+ jatkaa energiantuotantoa glykolyysilla [26-29]. Lactate tuottama LDHA käytetään vaihtoehtoisena polttoaineena solut, jotka ovat lähellä verisuonia ja glukoosi on säästynyt kauempana soluja, jotka ovat hypoksinen.

yli-ilmentyminen PKM2 tai LDHA on raportoitu kudosten useita syöpiä, kuten kolangiokarsinooma, peräsuolen syöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja haimasyöpä. Yliekspressio liittyy kasvaimen aloittamista eteneminen ja kestävyys kemoterapiaa [27,30-32]. Teoriassa ilmentymisprofiilin näiden entsyymien voi myös edustaa käyttökelpoinen diagnostinen tai prognostinen markkereita haimasyövän [15,23,33].

CD8 + T-solujen (sytotoksiset T-lymfosyytit) ovat tärkeä osajoukko kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä joilla on tärkeä rooli kasvaimen vastaisen immuunivasteen. Immunohistokemia tutkimukset ovat osoittaneet anti-kasvain vaikutus infiltroivien CD8 + lymfosyytit, joilla on parantunut eloonjäämisaste potilaiden haiman, keuhkon, munasarjojen, kolorektaalisen, munuaisten ja ruokatorven tuumorit [34-39], ja suora korrelaatio kasvava määrä CD8 + ja tuumoria infiltroivien lymfosyyttien (TIL) ja tuumorisolujen apoptoosin [40,41].

tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ilmaus PKM2 ja LDHA haiman pre-neoplastisia vaurioita (kystat ja haiman intraepiteliaalisten neoplasia, Panin) ja syöpien ja korreloivan sen potilaiden hoitotuloksiin. Ottaen huomioon, että PKM2 ja LDHA ovat mukana useissa solujen lisääntymisen signalointireittien [42], tutkimme myös, onko ilmentymistä näiden glykolyyttisten entsyymien korreloi määrä CD8 + TIL ja merkit kasvaimen leviämisen (Ki-67).

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Tähän tutkimukseen osallistui haiman koepala tai kirurginen resektio näytteitä 266 potilasta; 136 University College London Hospital NHS Foundation Trust (UCLH) ja toinen 130 kaupallisesti saatavissa kudos microarray (TMA) (AccuMaxArray, ISU ABXIS CO., LTD, USA, ja Insight Biotechnology Limited, UK). UCLH kohortti koostui 136 potilasta, joilla on varmistettu haiman adenokarsinooma (PDAC) (n = 61), ampullary adenokarsinooma (n = 11), haiman kystistä leesioita (n = 49), krooninen haimatulehdus (n = 11) ja normaalin haimakudoksesta ( n = 4). Näitä potilaita oli käsitelty UCLH tammikuun 2005 ja tammikuussa 2010. kliininen tietokanta UCLH potilaiden luotiin kautta CoPath histologia tietokanta, joka sisälsi seuraavat kliinis parametrit: sukupuoli, ikä diagnoosin, näytetyyppi (biopsia tai resektio), kasvaimen tyyppi (ampullary tai ductal), tulos (elävät tai kuolleet), kuolinsyy, pituus seurannan jos elossa, läsnäolo tai puuttuminen etäpesäkkeitä aikaan histologisen diagnoosi, onko resektio suoritettiin, jäljellä tauti ( R) tila, post-resektio toistuminen, aika jälkeisiin resektio toistuminen (jos on), syöpä vaiheessa imusolmuke osallistuminen, läsnäolo hermoa tai lymphovascular invaasio, aste kasvaimen erilaistumiseen, ja onko potilasta sai kemoterapiaa (taulukko 1). Kaikki tiedot kerättiin alkaen histologisten diagnoosi kuolinpäivästä tai lopussa tiedonkeruun 1. helmikuuta 2015. eettisen komitean hyväksyntä saatiin Central London REC 3 Tutkimus eettisen komitean suorittamaan immunohistokemia varastoidaan koepala ja resektion näytteet liittyvät joiden kliininen tietokanta tarvetta suostumusta luopua (REC viite 06 /Q0512 /106, muutos päivämäärä 30 heinäkuu 2010). Kaikki potilaan näytteet anonymisoitava de-tunnistettu ennen analyysiä.

Tissue mikrosirujen

Toinen validointi sarja 130 kudosnäytteitä oli johdettu kaupallisesti saatavilla haiman TMA. Kaikkiaan 206 kudoksen sydämiä 130 potilasta (83 uros, 47 naispuolinen, mediaani-ikä 59, vaihteluväli 32-80 vuotta) olivat läsnä TMA, johon kuului 63 tapausta PDAC kahtena, 19 Panin (10 Panin-1, 7 PANIN-2 ja 2 PANIN-3), 10 krooninen haimatulehdus ja 38 normaalin haiman kudoksen ytimet. Histologinen diagnoosi kaikissa tapauksissa todennettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. Kliiniset tiedot mukana TMA mukana kasvaimen koon ja vaiheen verran kasvaimen erilaistumiseen, imusolmuke osallistuminen, metastasoitunut tila ja kasvain sivustoja.

immunohistokemia

Standard immunohistokemiaa menetelmiä käytettiin havaitsemaan ilmaus PKM2, LDHA, CD8 ja Ki-67. Lyhyesti, parafiiniin leikkeet ennalta kuumennettiin uunissa 30 minuuttia 60 ° C: ssa, ja sitten deparaffinised ksyleeniin ja sammutettua läpi sarjan porrastettu etanolia (70% -95%). Leikkeet altistettiin lämpöä välittämä antigeenin haku sitraattipuskurilla (pH 4,0) autoklaavissa. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estyi 3% vetyperoksidia 20 minuuttia, jonka jälkeen inkuboitiin 2,5% normaalia hevosen estää seerumia 20 minuuttia. Sitten leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa CD8 (CD8a Kanin polyklonaalista vasta-ainetta, Abnova, UK, Cat # PAB11235, 1: 200) ja Ki-67 (Kanin polyklonaalista Ki-67, Abcam, UK, Cat # ab15580, 1: 300), ja yli yön 4 ° C: ssa PKM2 (hiiren monoklonaalinen anti-ihmisen ja rotan PKM2, ScheBo®Biotech, Giessen, Saksa, Cat # S-1, 1: 100) ja LDHA (LDHA /LDHC (C28H7) Rabbit Monoklonaalinen vasta-aine, Cell Signaling, UK, Cat # 3558, 1: 250) PBS: ssä. Kolmen pesun jälkeen PBS: llä, joka sisälsi 0,5% Tween 20, leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta 30 minuutin ajan. Primaarinen vasta-aine havaittiin käyttämällä 3, 3′-diaminobentsidiini (DAB) tai 3-amino-9-etyyli-karbatsoli (AEC) havaitsemisjärjestelmä kit. Leikkeet sijoitettiin hematoksyliinillä 3 minuuttia, sitten varovasti pesty ja asennettu.

Double immunohistokemia

Kaksinkertainen immuunivärjäysmenetelmällä Kit (kuva double -värjäyspakkausta, Invitrogen, UK) käytettiin kolokalisaation of PKM2 ja CD8 tai Ki-67. Lyhyesti, kahta eri entsyymiä havaitsemisjärjestelmät käytettiin peräkkäisiä Kaksoisvärjäys ensimmäistä käyttöä piparjuuriperoksidaasi järjestelmä seuraa emäksinen fosfaatti järjestelmään. Leikkeitä inkuboitiin anti-PKM2 primäärinen vasta-aine ja HRP-sekundäärisen vasta-aineen, ja visualisointi kehitettiin DAB tunnistusjärjestelmä. Tämän vaiheen jälkeen, leikkeet pestiin PBS: llä, inkuboitiin estää seerumia, minkä jälkeen primaarinen vasta-aine (anti-CD8 tai Ki-67) ja vuohen anti-kani-IgG-alkalinen fosfataasi sekundäärinen vasta-aine. Väri kehitettiin nopea punainen counter värjäyksen hematoksyliinillä.

Arviointi Immunohistokemian värjäystä

immunohistokemia arvioitiin käyttämällä konferenssissa valomikroskoopilla (AXIO laajuus, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Saksa). Arviointi immuno- dioja suoritettiin itsenäisesti kaksi tarkkailijaa, sokaisi potilaan taustatietoja, ja eroavuudet tarkkailijat ratkaistiin käyttämällä konferenssi mikroskooppia. Kattava pisteytys kaava käytettiin semi-kvantitatiivinen arviointi PKM2 ilmaisun kuten aiemmin on kuvattu [43], kanssa värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin: 1, heikko ilmentyminen; 2, kohtalainen ilmaisu; tai 3, voimakas ilmaus; laajuus värjäytyminen pisteytettiin 1, 33% syöpäsoluja positiivisia; 2, 33-67% syöpäsolujen positiivinen tai; 3, 67% syöpäsoluja positiivisia. Intensiteetti ja laajuus tulokset olivat sitten kerrotaan saamiseksi yhden asteikolla tulokset 1, 2, 3, 4, 6, ja 9. tulokset 1-3 määriteltiin heikko (tai negatiivinen) värjäys, kun taas tulokset 4, 6 ja 9 pidettiin vahvana (tai positiivinen) värjäys.

numerot CD8 + TIL ja Ki-67-positiivisia kasvainsoluja myös laskettiin itsenäisesti kaksi tarkkailijaa. Aluksi koko dia tutkittiin aallonpituudella pienellä suurennoksella (x40) tunnistaa alueen tihein intratumoraalisesti CD8 tai Ki-67-positiivisia kasvainsoluja ja sitten viisi satunnaisia ​​alueita, jotka alueella laskettiin suurella suurennuksella (X400). Keskimäärin CD8 + TIL laskettiin ja ilmaistiin laskennalle per suuri teho kenttä (HPF). Soluproliferaatioon-indeksi (PI) ilmaistiin prosentteina ytimien lukumäärä värjättiin positiivisia Ki-67 joukossa 1000 tuumorisoluja käyttäen standardoitua verkkoon.

Soluviljelmät

yhdeksän ihmisen haimasyövän solulinjat ostettiin RIKEN Bioresource Centre (RIKEN BRC, Tsukuba, Japani) ja BxPc-3 solulinja hankittiin PerknElmer (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA, USA). PANC-1, PK-1, PK-59, PK-45H, PK45P, KLM-1, NOR-P1 ja BxPc-3 ylläpidettiin RPMI-1640, MiaPaca-2 DMED ja KP-4 DMEM /F12 -alustassa . Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 2 mM glutamiinia (Gibco, Life technologies, Iso-Britannia). Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 21% O

2, 5% CO

2 37 ° C: ssa ja otettiin talteen trypsiinillä-EDTA.

Western Blot

PKM2 ja LDHA ilmentyminen arvioitiin haimasyövän solulinjoissa Western blotting -tekniikalla. Lyhyesti, seuraavat proteiini uuttamalla, proteiinipitoisuus mitattiin Bicinchoninic Acid (BCA) -määrityksellä, ja 15 jig proteiinia ajettiin pre-cast geeli (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 1,0 mm, 10 kaivot geeli, Invitrogen, USA) ja siirrettiin 0,45 um huokoskoko polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo (Invitrogen, USA). Membraani blokattiin 5% naudan seerumialbumiinia (BSA) liuokseen, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa joko hiiren anti-PKM2 (DF-4, ScheBo®Biotech, Giessen, Saksa, 1: 1000) tai kaniinin anti-LDHA-vasta-ainetta (Cell Signaling, UK, 1: 1000), ja inkuboitiin sitten sopiva piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundaarinen vasta-aineita (Cell Signaling, UK, 1: 2000). Antigeeni-vasta-aine Reaktio havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla substraatti (Thermo Scientific, USA). Anti-β aktiini vasta-ainetta (Cell Signaling, UK) käytettiin proteiinin latauskontrollina.

Tilastollinen

IBM SPSS tilasto-ohjelmalla (versio 22, SPSS Inc., Chicago, IL, USA ) käytettiin tietojen analysointia ja grafiikkaa. Kaplan-Meier tontteja ja log-rank testejä käytettiin analysoimaan selviytymisen ja tunnistaa erot ryhmien. Yksisuuntainen ANOVA Bonferronin post-hoc testiä käytettiin yleistä vertailua useita ryhmiä, joissa Mann-Whitneyn U-testi nonparametric testejä ja Chi square testi eroja kategorisen datan. Ei-parametrinen korrelaatio analyysit kahden jatkuvia muuttujia suoritettiin Spearman testi. Kaikki testitulokset olivat kaksisuuntaisia, jonka vaikutukset tiivistää käyttäen 95%: n luottamusväli. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05.

Tulokset

ilmentäminen PKM2 ja LDHA haimasyövän

Sekä PKM2 ja LDHA olivat yli-ilmentyvät tuumorisoluissa verrattuna normaaliin haimakudoksesta . Vaihteleva ekspressiokuviota PKM2 havaittiin kasvain kudosten suhteellisesti suurempi ekspressio heikosti eriytetty alueilla, edistettäessä marginaalit kasvaimen kyhmyjä ja invasiivisia (lihasten ja verisuonten) kasvaimia (kuvio 1A, 1B, 1E ja 1F). Kaiken PKM2 ilmentyminen pääasiallisesti liittyy aggressiivinen kasvain. Etuuskohteluun ilmentyminen PKM2 havaittiin binucleated lisääntyvien solujen kasvaimen kyhmyjä (kuvio 1 D). Expression of PKM2 todettiin kaikissa solun osastoihin, kuten solukalvon, solulimassa ja /tai tumassa (kuvio 1C ja 1F). Sen sijaan, LDHA ekspressio oli yleensä korkea tuumorin sekä esineoplastiset kudosten ja haimatulehduksen ilman erityistä kuvio (kuvio 2). LDHA ekspressiota havaittiin myös solukalvon ja /tai solulimassa, ja joskus tumassa.

(A) Hyvin eriytetty kasvaimen alueella osoittaa heikkoa PKM2 ilmaisun (punainen nuoli), joilla on korkea ekspressio heikosti eriytetty alueilla ( ruskea väri, keltainen nuoli) (x100 suurennos). (B) Kasvava marginaali kasvaimen kyhmyjä voimakkaiden ilmaus PKM2 (punainen nuoli) (x100 suurennos). (C) kalvo ilmentymä PKM2 (punainen nuoli) (x200 suurennos). (D) heterogeeninen ilmentymä PKM2 kanssa hallitseva ilmaisun lisääntyvissä soluissa (punainen nuoli) (x200 suurennos). (E) Vahvasti positiivinen kasvain ilmentymistä PKM2 verisuonen invaasiota (punainen nuoli) (x100 suurennos). (F) Vahvasti positiivinen kasvain ilmaus PKM2 lihasten invaasiota (punainen nuoli) (x100 suurennos).

(A) kalvo ilmentymä LDHA (x200 suurennos). (B) Sytoplastiset ja ydin- ilmaisun (x200 suurennos). (C) Vahva ilmaisun haiman kysta lievää ilmaisua ympäröivään normaalissa haimakudos (x50 suurennos). (D) Nuclear ilmentymistä LDHA haimasyövän (x100 suurennos). (E) Vahva ilmaisua Panin leesioiden (x100 suurennos). (F) Negatiivinen värjäys normaalissa haimassa (x100 suurennos).

Samankaltaisia ​​ilmaus PKM2 ja LDHA havaittiin UCLH kohortti ja TMA näytteitä, joiden värjäys pisteet 3 64% ja 73% kasvainten osalta, että PKM2, ja 76%: kasvaimista LDHA molemmissa ikäryhmät. Ilmaisu kuviota haimasyövän solulinjoissa oli samanlainen sekä PKM2 ja LDHA, paitsi KP4 solulinjassa, jossa LDHA taso oli vahvempi kuin PKM2 tasolla (kuvio 3). Molemmissa ryhminä, haimatulehdus näytteet myös ilmentyy voimakkaasti LDHA verrattuna PKM2 ilmentymistä (kuvio 4).

immunovärjäys MiaPaca-2-solujen PKM2 (A) ja LDHA (B) on esitetty alemmassa paneelissa. Vahva sytoplasminen ja tumavärjäystä on huomattava lisääntyvien solujen.

PKM2 voimakkaasti ilmaisseet haimasyövän kudosnäytteet ja oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa, haimatulehdus, haiman kysta ja Panin kudoksissa (P 0,001). Expression of LDHA oli merkitsevästi korkeampi haimasyövän kuin normaalissa haimassa (P 0,001), kun taas ei ollut merkittäviä eroja LDHA ilmaisun välillä haimasyöpä, Panin haiman kystat ja haimatulehdus.

kuvion 4, asteittain parantaa PKM2 ilmentymistä havaittiin pitkin siirtymistä haimasyövän, jolla on pienin ilmaisua haiman kystat (19%), välituotteena Panin (37%) ja eniten syöpiä (68%). PKM2 ilme oli noin neljä kertaa suurempi haimatulehdus (29%) verrattuna normaaliin haiman kudosta. Vaikka LDHA ilmentyminen oli myös merkitsevästi lisääntynyt syövissä verrattuna normaaliin haimakudoksesta (p 0,0001, ANOVA), ei ollut merkittäviä eroja krooninen haimatulehdus, haiman kystat, Panin ja syöpä näytettä (67%, 59%, 73% ja 76 %, vastaavasti).

PKM2 ja LDHA ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa

Western blotting, korkean ilmentymisen PKM2 ja LDHA havaittiin 8 ja 9 ulos 10 haimasyövän solulinjoissa (kuvio 3). Ilmaisu taso PKM2 ja LDHA vastasi kaikissa solulinjoissa paitsi KP4 jossa PKM2 taso oli heikompi kuin LDHA tasolla. Immunohistokemiallisesti, sekä PKM2 ja LDHA oli vahva sytoplasmista ja ydinvoiman ilmaisu (kuvio 3).

Assosiaatio kliinis parametrien

korrelaatio PKM2 ja LDHA ilmaisutapoja kliinis ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. oli merkittävä käänteinen korrelaatio PKM2 ilmaisun ja kasvain eriyttäminen UCLH kohortin 83% of PKM2 kasvaimia ovat vähemmän eriytetty verrattuna 64% PKM2 syöpäkasvain (p = 0,047, Chi-square test) (tuloksia ei ole esitetty) .

huomattavasti suurempi määrä CD8 + TIL havaittiin kasvaimia, joilla on heikko PKM2 tai LDHA ilmentymisen verrattuna kasvaimia, jotka oli vahva ilmentyminen (p = 0,0001, p = 0,005 vastaavasti, taulukko 1). Lisäksi merkittävä assosiaatio kasvainsoluproliferaation ja ilmaisun sekä PKM2 ja LDHA havaittiin; määrä kasvaimen ytimien ilmentävien Ki-67 oli yli 2 kertaa suurempi PKM2 ja LDHA ilmentävien kasvainten verrattuna syöpäkasvain (PKM2: 27,8 ± 12,9 vs. 12,2 ± 14, p = 0,0001 ja LDHA: 25,1 ± 14 vs. 12,3 ± 15,1, p = 0,004). Kun värjäystä tulokset, CD8 + TIL määrä ja määrä Ki-67-positiivisia soluja pidettiin jatkuvia muuttujia, merkittävä käänteinen korrelaatio värjäyksen tulokset ja CD8 + solujen määrän havaittiin (PKM2: p 0,001 ja LDHA: p = 0,004, Spearman sijoitus korrelaatio). Merkittävä suora korrelaatio havaittiin välillä värjäyksen tulokset ja Ki-67 count (PKM2: p 0,001 ja LDHA: p = 0,001, Spearmanin testi) (kuviot 5 ja 6). Vuonna TMA kohortin ilmaus PKM2 ja LDHA korreloivat kasvaimen kokoa. PKM2 ilmentymistä havaittiin 54,5%, 77,8% ja 90,9% kasvaimia, jotka olivat ≤ 2,5, 2,6-3,9 ja ≥ 4 cm kokoisia, vastaavasti. Positiivinen LDHA ekspressio havaittiin 59,1%, 77,8% ja 100% kasvaimissa, jotka olivat ≤ 2,5, 2,6-3,9 ja ≥ 4 cm kokoisia, vastaavasti. Ei ollut merkittäviä eroja PKM2 tai LDHA ilmaisun ja kasvaimen sijainti, imusolmuke osallistuminen, T-vaihe ja metastasoitunut tila.

(A) Hyvin eriytetty kasvaimet negatiivisin PKM2 ilme oli vahva tunkeutuminen CD8 + positiiviset T-lymfosyyttien (x200 suurennus). (B) Huonosti eriytetty kasvaimet vahvasti positiivinen PKM2 oli harva tunkeutuminen CD8 + positiiviset T-lymfosyyttien (x200 suurennos). Oli merkittävä negatiivinen korrelaatio CD8 + positiiviset solut ja molemmat PKM2 (C) (D) ja LDHA värjäytymistä (E) (F).

(A) Kasvaimet kanssa vahvasti positiivinen PKM2 ilmaus piti tuman värjättiin Ki-67 (x100 suurennos). (B) Kasvaimet heikosti positiivisia PKM2 oli niukat Ki67 värjäytymistä (x100 suurennos). (C) (D) välinen korrelaatio PKM2 värjäys ja Ki-67-positiivisia soluja. (E) (F) välinen korrelaatio LDHA värjäys ja Ki-67-positiivisia soluja. Siellä oli merkittävä korrelaatio sekä PKM2 ja LDHA.

korrelaatio PKM2 ja LDHA ilmaisun ja potilaiden eloonjäämisen

seuraava tutki ilmaisun profiilia PKM2 ja LDHA ennusti selviytymistä. Potilaat, joilla on kasvaimia pisteytys 3 PKM2 tai LDHA ilmentyminen oli huomattavasti elinajan verrattuna niihin, jotka heikosti ilmaistu PKM2 ja /tai LDHA. 72 haimasyövän näytteitä (UCLH kohortti), 46 (64%) vahvasti ilmaistu PKM2 ja näillä potilailla oli mediaanielossaolosta vain 8,9 kuukauden aikana verrattuna 28,9 kuukautta 26 (36%) potilailla, joilla on heikko (negatiivinen) PKM2 kasvain lauseke (p = 0,016, log-rank testi, kuvio 7). Vastaavasti 55 (76,4%) potilailla, joilla on positiivinen LDHA kasvain ilmaus, oli keskimääräinen eloonjäämisaika oli 10,9 kuukautta, kun 34,5 kuukautta ja 17 (23,6%) potilaista, joilla on heikko (negatiivinen) LDHA kasvain lauseke (p = 0,029, log-rank-testi, kuva 7). Lisäksi, kun ilmentymisen profiili PKM2 ja LDHA yhdistettiin, selviytymisen potilailla, joilla on negatiivinen ilmaus sekä tai positiivisia yksi oli neljä kertaa pidempi kuin ne, joilla on positiivinen tila sekä (27,9 kuukautta vs. 7,0 kuukautta, vastaavasti, p = 0,003, log rank -testi). Joukossa useita selviytymisen ennustajia jonka yhden muuttujan analyysin (T-vaihe; p = 0,006, kasvaimen erilaistumiseen; p = 0,003, metastaattisen tila; p = 0,000), Coxin regressioanalyysi vain yhdistetyn PKM2 /LDHA ilmentymistilanne ja kasvaimen erilaistumiseen tila oli itsenäinen selviytyminen ennustajia (p = 0,003, Riskisuhde (HR) = 4,96 ja p = 0,015, HR = 3,31, vastaavasti) (Taulukko S1 taulukko).

sekä PKM2 (A) ja LDHA (B) oli merkittävä prognostisia vaikutus potilaiden eloonjäämisen (p = 0,016, 0,029, log rank testi, vastaavasti) ja yhdistetty lauseke sekä markkereita edelleen kerrostunut potilaista (C) (p = 0,003, log rank -testi). Kuten odotettua, potilaat, joille tehtiin kirurginen resektio oli pidempi eloonjäämisen kuin unresected potilasta.

Lisäksi 27 72 potilasta (UCLH kohortti) tehtiin kirurginen resektio varten PDAC (n = 16) tai ampullary adenokarsinooma ( n = 11). Ne, jotka tehtiin kirurginen resektio oli merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin ne, jotka eivät leikkaukseen (26,5 vs. 7,0 kuukautta, P 0,0001; log rank -testi). Kuten odotettua, potilailla, joilla on ampullary adenokarsinooma oli parempi ennuste leikkauksen jälkeen kuin ne, joilla PDAC, 5 11 (45,5%) ampullary kohdunkaulan potilaiden elossa viime yhteyttä, verrattuna vain 1 ulos 16 (6,3%) potilailla, joilla on PDAC (P log rank -testi).

keskustelu

on yhä enemmän todisteita siitä, että syöpäsolut ovat koholla glukoosin sisäänoton kanssa samanaikainen kasvu laktaatin tuotantoa peräkkäinen katalyyttinen entsyymivälitteisestä prosesseja [44,45] . PKM2 ja LDHA kaksi ratkaisevaa glykolyyttisiä entsyymejä, jotka helpottavat näiden prosessien antaa syöpäsolujen kanssa kasvua etu normaalit solut. Tähän mennessä seerumin PKM2 on tunnistettu ja ennustavia markkeri vertailukelpoisia herkkyys ja spesifisyys seerumin CA19-9 markkeri haimasyövän [46-48]. On kuitenkin olemassa rajoitetusti tietoa ekspressiokuviota sekä varoituksia vaikutus PKM2 ja LDHA haimasyövän [32,49,50]. Parhaan tietomme mukaan meidän tutkimus on ensimmäinen arvioida ennustetekijöiden vaikutusta yhdistetyn PKM2 ja LDHA ilmaisun taudin alkamisen ja etenemisen haimasyöpä. Tuore tutkimus osoitti yli-ilmentymisen ja fosforylaatiota molempien entsyymien kilpirauhassyöpä verrattuna hyvänlaatuinen struuman [51]. Tuloksemme yhtyvät havaintonsa osoittavat merkittävää yliekspressio PKM2 ja LDHA haiman syövät verrattuna normaaliin haiman kudosta.

vaiheittain aloittamisen ja kehittämisen haimasyövän usein alkaa haimatulehdus, ductal metaplasiaa, kystamuodostusta tai Panin leesioita, mikä haimasyöpä. Mielenkiintoista, tuloksemme osoittavat yliekspressio LDHA hyvin varhaisessa vaiheessa pitkin karsinogeenisia koulutusjakson haimatulehdus kautta kysta /Panin syöpään korkein ilmaus kaikkein aggressiivinen kasvaimia. Sen sijaan PKM2 ilmaisu kasvoi progressiivisesti pitkin siirtymistä haimasyövän ja oli alhaisin kystat, välituotteena Panin vaurioita ja korkein syövissä. Vaikka tarkkaa mekanismia ero ilmentymiskuvio on vielä selvittämättä, on mahdollista, että pre-neoplastisia vaurioita hankkia glykolyyttisen fenotyyppi kautta LDHA yli-ilmentymisen ja sitten LDHA itsensä tai muiden onkogeenien aiheuttaa PKM2 yliekspressio myöhemmissä vaiheissa, kun kasvainsolujen proliferaatiota hinnat ovat korkeammat . Itse asiassa, se on viime aikoina osoittanut, että epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) indusoi β-kateniinin transactivation ja c-myc ekspressiota, säätelemällä LDHA, joka puolestaan ​​indusoi ylössäätelyyn PKM2 ilmentymisen vuorottelemalla silmukoinnin geenin M1 M2 tyyppi [52]. Nämä havainnot saattavat osittain selittää johdonmukainen yli-ilmentyminen LDHA koko tuumorigeenisemmiksi prosessin ja asteittaisen yliekspressio PKM2 pitkin karsinogeenisia kautta. Ilmaisua ja entsymaattinen aktiivisuus LDHA ja PKM2 voidaan myös moduloida tyrosiinin fosforylaatiota eri tähteitä (Y10 ja Y105, vastaavasti), jonka onkogeeninen tyrosiinikinaasi fibroblastikasvutekijäreseptori-1 [53]. Ero ekspressiokuvio viittaa siihen, että PKM2 (tai niiden yhdistelmä PKM2 ja LDHA) olisi parempi valinta erotteleva syövän pre-neoplastisia vaurioita verrattuna LDHA yksin, paitsi haimatulehdus, jossa molemmat markkerit ovat erittäin ilmaistaan.

hoitoon haimasyöpä on erittäin haastavaa, koska myöhässä diagnoosi, ja puute asianmukaisten ennustetekijöitä markkereita ja tehokkaita hoitoja. Tuloksemme osoittavat, että molemmat PKM2 tai LDHA ovat merkittäviä prognostisia markkereita haimasyövän ja yhdistelmä tarjoaa parannetun kerrostuminen lopputuloksen. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien julkaisujen osoittaa merkittävää prognostisia vaikutus LDHA tai PKM2 vuonna muissa elimissä, mukaan lukien okasolusyöpä, kolangiokarsinooma ja mahasyövän [43,54,55]. Tarkka mekanismit liittyvät yliekspressio PKM2 ja LDHA joka johtaa huonoon ennusteeseen jää epäselväksi. Aivan viime aikoina, Rajeshkumar et al (2015) havaitsi, että LDHA pienmolekyylisalpaaja- FX11 voi estää kasvaimen kasvua, vähentämään kasvainsolujen proliferaatiota ja indusoivat apoptoosin potilaasta peräisin hiiren ksenograftimallissa haimasyövän mutantti TP53, kun taas kasvaimet kätkeminen villityypin TP53 olivat täysin resistenttejä FX11 [56].

Haimasyöpä on yksi tuumorien aggressiivisempaa tyyppejä, joilla on erittäin huono elinaika. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat selvästi säätely ylöspäin Sekä PKM2 ja LDHA haimasyövän ja sotkea korkea ilmentyminen näiden kahden glykolyyttisten entsyymien kehittymistä ja etenemistä haimasyövän parantamalla proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja angiogeneesi.