Krooninen sairaus

tiivistelmä

Novel strategioita, jotka kohdistuvat kasvutekijän reseptorin (EGFR) ovat johtaneet kliinisen kehittämisen monoklonaalisia vasta-aineita, jotka hoitoon metastasoitunut kolorektaalisyöpä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää), mutta vain potilailla, joiden lisääntynyt villityypin KRAS ja EGFR-geenin kopion, vastaamaan näitä aineita. Lisäksi kestävyys EGFR saarto väistämättä tapahtunut, missä tulevaisuuden hoito vaikeaksi. Novel bio-kuvantaminen (BOI) menetelmät voivat auttaa kvantisoinnissa EGFR metastasoitunutta kolorektaalisyöpää kudoksessa täydentää siten immunohistokemiallisesti menetelmiä, ohjaamisessa tulevaisuudessa hoitoa näille potilaille. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tutkia hyödyllisyyttä lähi-infrapuna-leimatun EGF (EGF-NIR) bio-kuvantamiseen CRC käyttää

in vitro

ja

in vivo

potilaalle tehdä kasvain CRC mallia ja

ex vivo

ihmisen CRC kudoksiin. Kuvaamme valmistus ja karakterisointi EGF-NIR ja tutkia sitovia, käyttäen SAT paneelin CRC soluviljelymalleissa muistuttava heterogeenisyys ihmisen CRC kudosten. EGF-NIR nimenomaisesti ja valikoivasti sitoo EGFR ilmentävien CRC soluja, intensiteetti EGF-NIR signaali suhde taustaan ​​(SBR) heijastunut EGFR tasoilla, annos-vaste ja ajallinen kuvantaminen kokeita säädetty optimaaliset olosuhteet kvantisointitarve EGFR tasoilla BOI. EGF-NIR kuvantamisen hiirten HT-29 potilaalle tehdä CRC kasvain osoitti, että EGF-NIR on hitaammin poistuu kasvain ja korkein SBR välillä kasvain ja normaali viereinen kudos saavutettiin kaksi päivää injektion jälkeen. Lisäksi kuvia dissekoitujen kudosten osoitti kertymistä EGF-NIR kasvain ja maksan. EGF-NIR nimenomaan ja voimakkaasti merkitty EGFR positiivinen ihmisen CRC kudosten samalla viereisen CRC kudosten ja EGFR negatiivisia kudoksia ilmaisi heikkoja NIR signaaleja. Tässä tutkimuksessa korostetaan käytön EGF-NIR prekliinisissä tutkimuksissa. Yhdessä muiden menetelmien, EGF-NIR voisi tarjota ylimääräisen biologisen kuvantamisen tietyn työkalun standardisointiin mittausten EGFR CRC kudoksissa.

Citation: Cohen G, Lecht S, Arien-Zakay H, Ettinger K , Amsalem O, Oron-Herman M, et al. (2012) Bio-Imaging paksusuolisyövän mallit käyttäminen Near Infrared Merkityt kasvutekijän. PLoS ONE 7 (11): e48803. doi: 10,1371 /journal.pone.0048803

Editor: Anthony WI. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 08 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Cohen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tässä raportoidut tukivat Bio Medical Photonics (BMP) konsortio, Israelin teollisuus- ja kauppa, MAGNET ohjelma. Konsortion johto ei ollut mitään roolia suunnittelussa, tietojen keruun ja analysoinnin, tai valmisteen käsikirjoituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten länsimaisissa yhteiskunnissa. Pitkäaikainen eloonjäämisen CRC-diagnosoiduista potilaista on korreloivat sairauden vaiheessa diagnoosin. Alkuvaiheessa sekä valituilla potilailla, joilla on edennyt sairaus, leikkaus on tärkein liikennemuotojen hoidon [1]. Vähintään 40%: lla CRC kehittää joko synkroninen tai metachronous etäispesäkkeitä, useimmat niistä periksi heidän sairautensa ja kuolla [2]. Jotkut ominaisuudet pahanlaatuisen fenotyypin CRC korreloivat yli-ilmentymisen ja hyper-aktivaatio reseptorityrosiinikinaasien kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), jotka tekevät nämä reseptorit houkuttelevia kohteita syövän hoitoon [3]. Useimmilla CRC potilailla, etenemistä normaalista paksusuolen limakalvon syöpään liittyy määritelty lukuisiin molekyylimuutoksia, joka leviää yli vuoden [4]. Endoskooppinen polypectomy osoitettiin vähentävän CRC liittyvää kuolleisuutta [5]. Tämä menettely edellyttää fibro-optiikan colonoscopy visualisointi CRC kudoksen seuraa histologista arviointia varten. Lisäksi CRC kudokset ovat usein arvioidaan RT-PCR: llä [6], immunohistokemia [7] ja

in situ

-hybridisaatio [8] tekniikoita, jotka osoittivat paljon suurempi ristiriita välillä perusvärit ja niihin liittyvien CRC etäpesäkkeitä [ ,,,0],9].

EGFR on usein yli-ilmentynyt useissa eri kiinteän kasvaimen, aivot, rinta-, keuhko-, munasarja- ja haiman, sekä liittyy lisääntynyt metastaattista potentiaalia ja huonon ennusteen CRC [10]. Biologiset aineet, jotka estävät EGFR ovat osoittaneet kliinistä yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä kemoterapian lupaavimmat näiden aineiden ollessa setuksimabi ja Panitumumabilla. Valitettavasti nämä vasta-aineet ovat kliinisesti tehokkaita vain vähemmistö potilaista CRC [11]. Kliininen onnistuminen on monoklonaalinen vasta-aine hoitojen tasaisesti rajoittaa kehittämällä kehittynyt resistenssi EGFR saarto [12]. Yksi mekanismi, jolla vastus on äskettäin selvitetty: setuksimabi resistentit solut sisältävät EGFR-mutaation solunulkoisen domeenin (S492R), joka heikentää setuksimabi, mutta ei epidermaalinen kasvutekijä (EGF) sitoutumisen [12]. Näin ollen, koska hoitovaste vaatia EGFR tavoite olla läsnä, kehittäminen BOI menetelmien havaitsemiseksi kvantitatiivisesti EGFR-proteiinin tasot CRC ensisijainen ja toissijainen tuumorikudoksia on tarpeen, jotta voidaan ohjata hoitoon yksittäisten valittu EGFR kohdennettua vasta- käsittely ja erityisesti ne, jotka relapsi ollessaan EGFR kohdistaminen hoitojen [13]. Kynnyksellä EGFR-kohdistettuja vasta-aineita, setuksimabi ja panitumumabi on pohjustettiin yksilöllisiä lääketieteen metastasoituneen kolorektaalisyövän. Nykyiset tiedot viittaavat siihen, että arviointi KRAS ja BRAF-mutaatio ja PI3K /PTEN muutoksesta voinut olla hyödyllinen valittaessa potilaille, jotka eivät todennäköisesti reagoi anti-EGFR-kohdistettuja vasta-aineita. Todettiin, että reagoiva CRC kasvaimia kuljettaa villityypin KRAS /BRAF ja on yleensä vaatimaton, lisätä kopioluku EGFR-geenin, joka on käännetty vaatimaton kasvu EGFR tasolla. Siksi EGFR geenikopiomäärä havaitseminen ja määrällinen arviointi EGFR-proteiinin taso todennäköisesti parantaa räätälöintiä setuksimabin ja panitumumabi terapioita metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille [12]. Kuitenkin tekniset vaikeudet Immunohistokemian tekniikka, jota käytetään arvioitaessa ilmentymistä EGFR kiinteissä kudoksissa, saattanut rajoittaa havaita pieniä EGFR-proteiinin tason nousu toistaiseksi [11]. Siksi uudet herkkä SAT menetelmiä EGFR-proteiinin tason metastasoitunutta kolorektaalisyöpää tarvitaan. EGFR skintigrafiaa, edustaa sellaista menetelmää, joka perustuu sitoutumisen, internalisaation ja säilyttäminen radioleimatun EGFR-kohdennettuja aineita solunsisäisiin osastoihin, ja on osoitettu radioleimatun EGF: n ja radioaktiivisesti monoklonaalinen vasta-aine on suunnattu EGFR [14]. Kuitenkin näiden menetelmien haitta on radioaktiivisten aineiden käyttöön.

Lähellä infrapuna (NIR) optinen SAT tarjoaa ainutlaatuisia etuja diagnostiikka metastasoitunutta kolorektaalisyöpää: se tarjoaa korkea herkkyys, sitä voidaan käyttää eri NIR tunnisteita ja se voi tarjota dynaaminen, reaaliaikainen

in vitro

ja

in vivo

kuvien kuin radioaktiivisen avulla [15]. NIR kevyt (700-1000 nm) voi tunkeutua kudokseen, ja tarjoaa mahdollisesti turvallinen, noninvasive menetelmä luonteenomaiset kasvainten [16]. Useimmissa sovelluksissa NIR SAT käytetään avustamaan kohdennettujen loisteputki varjoaine, joka ei ainoastaan ​​tarjota parannettu kontrasti, mutta myös ennen kaikkea, paljastaa erityisiä molekyyli liittyvät tapahtumat CRC kasvain taudin alkamisen ja etenemisen [17]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet käytön Affibody välittämää kohdentamista NIR hermostunut loisteputki varjoaineita havaitsemiseksi pahanlaatuisia soluja ja kasvaimia [18].

Siksi tavoitteet tässä tutkimuksessa oli kehittää ja karakterisoida uusia

in vitro

CRC malleja, jotka muistuttivat CRC heterogeenisyys ja arvioida, onko mahdollista määrittää tason EGFR

ex vivo

tuore CRC kudosnäytteitä, potilaalle tehdä kasvain hiirillä ja äskettäin kehitetty solulinjoja mallit käyttämällä EGF konjugoitu IRDye 800CW (EGF-NIR) koetin. Olemme löytäneet optimaaliset olosuhteet SAT EGFR käyttämällä EGF-NIR anturi näissä malleissa, joita sovelletaan endoskooppiset ja Odyssey Lämpökamerat analyysejä. Lisäksi käyttämällä kuvankäsittelyn analyysiä ja Western blotting varmistimme, että intensiteetti EGF-NIR signaali tausta suhde heijastaa EGFR-proteiinin taso

in vitro

CRC mallia ja

in situ

ihmisen CRC kudokset tutkitaan.

(A) Reaktiokaavio synteesin EGF-NIR-konjugaattia, ensimmäinen aminohappo on asparagiini aminopäästä on merkitty Asn1. (B) erottaminen synteesin reaktioseos geelikromatografialla ja EGF-NIR näyte geelikromatografialla on (C) anioninvaihtokromatografialla; EGF-NIR-täyden valikoiman (800 nm); kaltevuus NaCl-katkoviiva; konjugoimattoman EGF-pisteviiva. (D) HPLC erottaminen EGF-NIR puhdistettu anioninvaihtajan avulla. Täysi viiva edustaa absorbanssin 226 nm: ssä ja katkoviiva kuvaa kaltevuus. Aseta-12% SDS-PAGE-analyysi 10 ug EGF-NIR skannattu Odyssey ja modifioimattoman EGF värjättiin Coomassie-sinisellä. (E) NIR spektri EGF-NIR [heräte (harmaa viiva) ja päästöjen (musta viiva)]; Aseta-IRDye 800CW NHS-esteriä; (F) EGF-NIR indusoima Erk-fosforylaation.

HT-29-soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa (A) ja 4 ° C: ssa (B) 7 nM EGF-NIR että läsnä ollessa tai puuttuessa 100 nM EGF. Kilpailu kokeiluja 500 nM setuksimabin, TGF-α tai NRG1 tehtiin myös. Verrokkikokeissa viljelmiä inkuboitiin 7 nM NIR-Dye arvioida epäspesifisen merkintöjä soluille. NIR intensiteetti 800 nm arvioitiin samoissa olosuhteissa kaikkien kulttuurien ja keskimääräinen ± SD (n = 9) on esitetty. Ylempi insertit: NIR skannaa; alempi insertit: vaihe-kontrastin pikuvat viljelmiä, * p 0,05 vs. NIR-Dye; ** P 0,05 vs. EGF-NIR.

HT-29-soluja transfektoitiin 2 päivää 5 nM anti-EGFR Äänenvaimennin valita siRNA tai salattu RNA tai jätetään käsittelemättä (kontrolli). Arviointi EGFR suoritettiin In Cell NIR kuvantamisen avulla 7 nM EGF-NIR (mustat palkit) ja western-blottauksella (harmaat palkit). Arvot ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * P 0,05 vs. salattu tai valvontaa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja HT-29, SW620, Colo205, A431 ihmisen epiteelisolujen squamous masoluja ja rotan ohutsuolen epiteelisolujen klooni IEC 6 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja säädettiin kasvun Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L -glutamine ja 10000 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 6% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Kaikki kokeet suoritettiin GLP olosuhteissa käyttäen clean room mukaan ISO7 vaatimusten (10,000 hiukkasia /m

3).

valmistelu, puhdistus ja karakterisointi EGF-NIR

EGF- NIR syntetisoitiin LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, USA) ohjeiden avulla IRDye 800CW NHS esterin (2-(3-{5-[7-(5-amino-1-carboxy-pentylcarbamoyl)-heptanoylamino]-1-carboxy-pentyl}ureido)-pentanedioic happo) konjugoitavaksi ihmisen rekombinanttia EGF (Peprotech, Aasiassa, Rehovot, Israel). Lyhyesti, EGF: n (32 nmol) inkuboitiin 5 ekvivalentin IRDye 800CW NHS-esteriä 1 M K2HPO4, pH 9,0, 2 tuntia pimeässä 20 ° C: ssa, samalla sekoittaen. Sen jälkeen konjugaatio, kytkimen sekoitus vapaa reagenssien ja EGF-NIR sovellettiin Hiprep 26/10 (Fine Sephadex G-25, hiukkasten koko 90 pm) suolanpoistopylväässä (GE Healthcare, biotieteet, Buckinghamshire, UK), jonka tilavuus on 55 ml (Vo = 15 ml). Tämä pylväs tasapainotettiin ja eluoitiin nopeudella 10 ml /min tislattua vettä käyttäen FPLC AKTA P900 väline (GE-Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK). Tämän jälkeen keräämällä Pitoisuushuippu ja säätämällä se pH-arvoon 8,0 lisäämällä 1 ml 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 8,0). Liuosta haettu anioninvaihtokromatografialla HiTrap DEAE FF (DEAE Sepharose High Flow, GE Healthcare, Life Sciences, Buckinghamshire, UK), joka oli tasapainotettu 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 8,0), virtausnopeudella 1 ml /min ja EGF -NIR eluoitiin pylväästä käyttäen gradienttia 1-100% NaCl tasapainotuspuskurissa. Puhdistettu EGF-NIR dialysoitiin 3000 katkaista dialyysipusseihin (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA) 14 tuntia pimeässä 4 ° C: ssa tislattua vettä vastaan. Tislattu liuos lyofilisoitiin, ja 0,1 mg kuivaa näytettä EGF-NIR liuotettuna 1% trifluorietikkahappoa (TFA) lopulta erotettiin HPLC: llä käyttäen Sperisorb DDS2 sarake (LKB välineitä, Gaithersburg MD) käyttäen kahta lineaarinen kaltevuudet: ensimmäisen gradientin 10-35%, jota seuraa toinen gradientilla 35-85% asetonitriiliä 1% TFA. Puhdistus suoritettiin virtausnopeudella 4,7 ml /min (100 bar paine). Täydellinen run jatkettiin 45 minuutin ajan ja EGF-NIR huippu arvioitiin optisen absorbanssin 226 ja 700 nm. Moolipitoisuuksien väriaineita ja EGF laskettiin molaarinen ekstinktiokerroin 270.000 M

-1cm

-1 IRDye 800CW 780 nm: n ja 18000 M

-1cm

-1 EGR. Absorbanssi 280 nm: ssa, joita käytetään laskettaessa EGF-proteiinin pitoisuus, joka perustuu sen molaarinen ekstinktiokerroin. Dual aallonpituus absorbanssi käytettiin määrittämään väriaine: proteiinisuhde. EGF-NIR emissio mitattiin PBS: ään käyttämällä fluori-Max 4 spektrofluorometriä (JY Horiba, Edison, NJ, USA), jossa on Xenon-kaarilamppu kuin heräte lähteenä 774 nm 1 cm kyvetissä, ja pyyhkäisynopeus on 80 nm /sek. Validointia varten, EGF-NIR LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, USA) käytettiin myös. EGF-NIR toimitettiin analysoitavaksi 12% SDS-PAGE verrattuna natiivi, leimaamattoman EGF. Näytteet 10 ug proteiineja erotettiin ja visualisoitiin Coomassie sininen värjäys ja NIR emissio mitattiin paikannus ja skannaamalla geelin Odyssey® lämpökamera (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).

Western-blottaus EGFR ja Erk-fosforylaation

tasot EGFR solulinjoissa ja CRC kudosten ja Erk-fosforylaation, arvioitiin heti uuttamalla soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA). Kyky EGF-NIR stimuloida ERK-fosforylaation A431-soluissa verrattiin leimaamatonta EGF. 2 x 10

6 solua 90% konfluenssiin 6 kuoppalevyllä olivat ilman seerumia 2 tuntia. Nälkiinnyttämisalustassa korvattiin säännöllisin alustalla, joka sisälsi 7 nM EGF-NIR. Soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja otettiin talteen. 50 ug proteiinia lysaatit erotettiin 10% polyakryyliamidi-SDS-PAGE ja siirrettiin jäissä nitroselluloosakalvoille (90 V 1,5 tuntia, Whatman, Dassel, Saksa). Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla kalvoja 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) 5% rasvatonta maitojauhetta (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20. Immunodetektio suoritettiin monoklonaalisella anti-EGFR-vasta-aine (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA) tai ensisijainen vasta-aineita (1:1,000) vastaan ​​fosfo-tai pan-Erk1 /2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA), jota seurasi piparjuuriperoksidaasiin (Jackson Immuno-, West Grove, PA, USA) ja kehitettiin ECL (Pierce, Rockford, IL, USA).

(a) Vasen: järjestelmä CRC polyyppi korkea täplät transformoituneiden CRC soluja (polttoväli alue) ja heterogeeninen lukien sekä normaali ja muuttuu CRC soluja; Keskellä: sukupolvi heterogeenisen seoksen erilaisilla suhteilla (%) välillä HT-29 ja SW 620; 0 – ei soluja; + /++ -presence Erilaisten solupitoisuuksilla; Oikea: polttoväli pinnoitus (joka rengas) HT-29 ja A431 yksikerroksista ympäröi SW620 yksikerroksista; aseta-taso EGFR (170 kD) ja ei-kypsiä EGFR (150 kD) soluissa; (B) välinen suhde NIR intensiteetti 15 min sitoutumisen 7 nM EGF-NIR (keskiarvo ± SD, n = 9), ja prosenttiosuus SW620 solun seos joko HT-29 (umpinaiset ympyrät) tai HCT116 (open ympyrät) * p 0,05 vs. 100% SW620; (C) välinen suhde SBR (keskiarvo ± SD, n = 9) ja EGF-NIR pitoisuus; A431 (avoimet ympyrät); HT-29 (umpinaiset ympyrät); sitoutuminen suoritettiin 15 minuutin ajan. Aseta: NIR skannaa; * P 0,05 vs. 0,01 nM; (D) kinetiikka 7 nM EGF-NIR sitoutuminen (keskiarvo ± SD, n = 9) ja polttovälin viljelmät A431 (avoimet ympyrät) tai HT-29 (umpinaiset ympyrät); Aseta: NIR skannaa; * P 0,05 vs. 0 min.

valmistaminen

in vitro

CRC mallit ja Cell NIR Imaging (IC-NIR) B

homogeeninen yksikerroksista sellaisen yksittäisen solun line.

CRC-solut maljattiin tiheydellä 150,000 solua /kuoppa 12-kuoppaisiin kudos- viljelymaljoilta (Nunc, Rochester, NY, USA) kaksi päivää ennen kokeita tuottaa homogeeninen yksisolukerrokselle. Sen jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 7 nM EGF-NIR, 15 min 4 ° C: ssa ja 37 ° C: ssa, voidaan mitata kokonaissitoutumisesta. Lopussa kokeen viljelmät pestiin kolme kertaa 1 ml: lla PBS: ää ja soluun liittyvän NIR-intensiteetti arvioitiin. Arvioida epäspesifistä sitoutumista, sisko viljelmiä inkuboitiin saman pitoisuuden EGF-NIR, samoissa olosuhteissa, kun läsnä on yli 100 nM EGF. Spesifinen sitoutuminen EGF-NIR kuvantamisen määritellään erotus NIR intensiteetti yhteensä sitova ja NIR intensiteetti epäspesifistä sitoutumista. Kilpailu kokeiluja 500 nM joko setuksimabi, transformoivan kasvutekijän α (TGF-α) tai neureguliini 1 (NRG1) suoritettiin samanaikaisesti inkuboimalla kilpailija EGF-NIR. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen (n = 9). NIR kuvantamisen arvioitiin käyttäen Odyssey lämpökamera seuraavissa olosuhteissa vaihtelevat: resoluutio: 170-340 mikronia; pikselien: 0,03 mm

2 (noin 15-20-solut); laatu: keskimatalan; keskitytään offset: 1-3; kanavat: 800 nm; intensiteetti: 1-3.

heterogeeninen polttoväli yksikerroksisiin CRC soluja.

Voit jäljitellä kohokohtia transformoitujen CRC solujen polyyppi [19] ja mahdollistaa suorien mittausten signaali tausta suhde sama koe, polttoväli soluviljelmää oli menetelty. Eri kolorektaalisyöpä solulinjoissa (eri tasoilla EGFR) tai 15 x 10

3 A431 (korkeita EGFR) maljattiin konfluenssiin sisällä 4 mm sisähalkaisija kloonaus rengas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) on sijoitettu keskelle hyvin. Solut jätettiin kiinnittyä 2 tunnin ajan inkubaattorissa. Sen jälkeen 15 x 10

3 SW620-solujen (puuttuu EGFR) maljattiin soluvapaaseen ympäröivä alue kloonausrengasmenetelmää ja jätetään kiinni 2 tuntia samoissa olosuhteissa. Kahdenlaisia ​​tällaisia ​​kokeita suoritettiin: a. yksi painopiste. b. kaksi pesäkkeitä. Lopussa solun sitoutuminen vaiheen, kloonaus rengas poistettiin ja solut pestiin elatusaineessa. Kaksi päivää sen jälkeen mallin luomiseksi, viljelmät altistettiin sitovia ja kuvantaminen kokeissa kuten aikaisemmin on kuvattu. Signaali /Tausta-suhde (SBR) arvot tarkoittavat suhde NIR fluoresoivan signaalin Keski ympyrän (painopistealalla CRC tai A431-solut) ja NIR fluoresoiva signaali ulkoalueella (SW620).

Eri CRC soluja fokaalisesti pinnoitettu taustalla IEC6 suoliston yksikerroksisen. Viljelmiä inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa 7 nM EGF-NIR: n läsnä (ei-spesifinen sitoutuminen – valkoiset pylväät) tai puuttuessa (kokonaissitoutuminen – harmaat pylväät) ja 100 nM modifioimattoman EGF. Signaali (CRC solulinja) /tausta (IEC6) suhde oli arviolta sama edellytykset kaikissa kulttuureissa ja esitetään keskiarvona ± SD (n = 9). Merkitys: * p 0,05 verrattuna IEC6 arvoihin; ** P 0,05 verrattuna yhteensä sitovia kunkin ryhmän p 0,05 verrattuna A431 ja p 0,05 verrattuna COLO 205; Alempi insertit: NIR skannaa; Ylempi insertit: vasen-EGFR-proteiinin ilmentyminen western blottauksella; nuoli osoittaa aseman kypsän EGFR 170 kD proteiinia ja ei-glykosyloitu 150 kD proteiiniin; oikea-mRNA ilmentymä CEA ja β-aktiini soluviljelmissä.

heterogeeninen suspensioita CRC soluja.

Voit jäljitellä heterogeeninen jakautuminen transformoitujen CRC solujen polyyppi [20] ja pystytään arvioimaan havaitsemisen herkkyyttä minimaalinen määrä EGFR ilmentävien solujen joukossa ohjaus normaali enterosyyttien, heterogeenisesti sekaviljelmiä HT-29 ja SW620-soluja valmistettiin. Suspension viljelmät HT-29 sekoitettiin suspension viljelmät SW620 tuottaa eri prosenttiosuus yksittäisten soluviljelmän samaan tilavuuteen. SW620-soluja voitaisiin erottaa HT-29-solut niiden pitkänomainen morfologia. Olosuhteissa nimetty ”0%” suspensio sisältää 0% HT29 ja 100% SW620 soluja, ja ”100%”, suspensio sisältää 100% HT-29-solujen ja 0% SW620-soluissa. Muissa tapauksissa prosenttiosuudet osoittavat suhde prosentteina HT-29-solujen ja prosenttiosuus SW620-soluja. Sitova koeolosuhteissa ja mittaukset NIR fluoresenssin voimakkuus (mielivaltaisina yksikköinä /mm

2) eri heterogeeninen viljelmistä suoritettiin kuten edellä.

(A) Valokuva ortotrooppinen kasvain ja EGFR-proteiinin ilmentymistä kasvaimet; (B) ajan kuluessa EGF-NIR kertymistä kudoksiin kasvaimen kantavien hiirten. Hiiriin injektoitiin i.v. 1 nmol EGF-NIR käsittelemättömissä hiirissä (ylärivi, n = 6) tai hiirillä pre-injektoitiin 1 ug /ml setuksimabi (alarivi, n = 4); korkean resoluution SAT hiiren injektoitu EGF-NIR ja ympyrät ilmaisevat ROI mittaukset (C) Aika tietysti kudoksen kertymistä EGF-NIR 48 tunnin hiiriltä esitetty B; Signaalin voimakkuus 800 nm normalisoituivat taustafluoresenssitasoja käyttäen mielivaltaista kasvain ympyrä (10-20 ROI /hiiri) verrattuna samanlaisen alue kylkeen (viereinen lihas); * P 0,05 verrattuna EGF-NIR 4 tuntia; ** P 0,05 verrattuna hiiriin ruiskutettiin EGF-NIR; (D) EGF-NIR signaali /tausta-suhde eristetyssä kudosta kasvaimen kantavien hiirten 48 tuntia injektion jälkeen. * P 0,05 verrattuna lihaksen, ** p 0,05 verrattuna maksan; Aseta: Ylä-valokuvat kudosten lautasen; Lähi-NIR kuvia; Ala-intensiteettiä kartat; Intensiteetti mittakaavasta punaruskea (5) korkea ilmentyminen; sininen (3) hyvin heikkoa ilmentymistä.

RT-PCR: ää ja EGFR siRNA hiljentäminen

Kokonais-RNA eristettiin ja genomista DNA: ta pilkottiin RNA-valmisteet, käytetään SV kokonais-RNA: eristäminen järjestelmä (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). 1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin (Promega, Madison, WI, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR suoritettiin lopputilavuudessa 50 ui, joka sisälsi 5 ug cDNA: ta, 50 pmol kutakin ylävirran sense- ja alavirran sense-alukkeet CEA tai EGFR [21], [22], ja 25 ui GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison , WI). PCR suoritettiin kokeita varten 35 sykliä. Luoda erilaisia ​​cDNA-fragmentteja, joka on Mastercycler gradientilla (Eppendorf, Hampuri, Saksa) oli ohjelmoitu seuraavasti: denaturaatio 95 ° C: ssa 1 min, pariutuminen 61 ° C: ssa ja pidennys 72 ° C: ssa 1 min. Kaataa EGFR tavallinen amiini transfektion agentti protokolla Ambion (Applied Biosystem, Austin, TX, USA) seurattiin. Lyhyesti, 5 nM 21 mer EGFR Äänenvaimennin valita pieni häiriöitä RNA (siRNA) ja salattu RNA oli käänteinen transfektoitiin A431 soluviljelmiin käyttäen siPORTNeoFX transfektion agentti mukaan valmistajan protokollaa. Solut tiheydellä 80000 solua /ml levitettiin 12-kuoppalevyille ja 2 päivää sen jälkeen, kun transfektiot analysoitiin. Kaataa EGFR mRNA vahvistettiin Western-blottauksella. Seuraavat karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) ja EGFR-alukkeita, jotka on valmistettu SyntezzaBioScience Ltd., Jerusalem, Israel, käytettiin:

Human CEA CAM5: Sense: 5′-CGCATACAGTGGTCGAGAGA-3 ’; Antisense: 5’-ATTGCTGGAAAGTCCCATTG-3 ’

Rat CEA1: Sense: 5′-CTACAGGCTGAGGGATGCTC-3′ antisense: 5′-GGTCCCGTCACAGTTACGTT-3 ’

Human EGFR: Sense: 5′- CGAGGGCAAATACAGCTT-3 ’Antisense: AAATTCACCAATACCTATT-3’

Human EGFR siRNA: Sense: 5′-CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt-3 ’Antisense: 5′-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag-3’

salatut siRNA: Sense: 5 ’-UAACGACGCGACGACGUAATT-3′ Antisense: 5’-UUACGUCGUCGCGUCGUUATT-3 ’

valmistelu ja NIR Imaging CRC Orthotopic hiirissä

tutkimus käyttäen Mies Balb /c nude (Harlan , Israel) hiiret hyväksyttiin, suoritettiin ja valvoo ohjeiden The Chaim Sheba Medical Center Animal Care ja käyttö komitea. HT-29-solut trypsinoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen pitoisuudella 1 x 10

7 solua /ml PBS: ssä. Kasvaimen implantaation jälkeen hiiret nukutettiin intraperitoneaalisena injektiona seoksen ketamiinin (100 mg /kg) ja ksylatsiinia (20 mg /kg). Trans-anaali injektio 1 x 10

6 HT-29-solujen tehtiin mikroskoopilla suurennuksella (X40) käyttämällä 27 g neulaa. Injektio suunnattiin limakalvonalaisesti kaukaisimpaan, posterior peräsuoli, noin 2-3 mm yli peräaukkokanavaan ja osaksi peräsuolen limakalvoon [23]. Hiiriä seurattiin kaksi kertaa viikossa kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Kasvaimet olivat saavuttaneet ~ 0,75 cm kokoisista 3-4 viikkoa.

In vivo

kuvantamiseen EGF-NIR fluoresenssi hiirillä suoritettiin LI-COR biotieteiden pienen eläimen Imager Odyssey MousePOD®. Visualisoida kasvaimia, 1 nmol EGF-NIR 100 ui suolaliuosta injektoitiin häntälaskimon kasvain-positiivisia hiirissä läsnä (n = 4) tai ilman sitä (n = 6), setuksimabin (1 ug /ml), ja arvioitu systeemistä puhdistumaa NIR kuvantamisen välein 1-8 tunnin ajan kolmen päivän ajan, minkä jälkeen 95% signaali oli selvitetty. Hiiret kuvattiin enintään kaksi päivää injektion ja lopetettiin. Tilastollinen analyysi kuvia kunkin hiiren normalisoitiin käyttäen samaa intensiteettiä asteikot, olosuhteissa aiemmin kuvattu. SBR laskettiin seuraavat: tarkoittaa NIR intensiteetti kasvaimen jaettuna keskimääräinen NIR intensiteetti taustan viereisen lihas. Kiinnostavat alueet (ROI) kanssa identtisiä alueita käytettiin sekä kasvaimen ja tausta. Keskihajonnan keskiarvon taustat laskettiin 10-20 ROI. Johtuen tuumorin koon eroista eläimet, jotka saivat EGF-NIR, kasvaimen signaali jaetaan tausta signaali samankokoisia ROI korjattu alue (pikseliä), edellyttäen, että kasvaimen kaksiulotteinen (2D) yhteensä merkintöjä. Kasvaimet, luurankolihasten ja maksakudosta of lopetetaan hiirten leikeltiin ja niiden virtsa kerättiin. Kudokset punnittiin ja syötettiin muoviputkiin ruokia. Astiat skannattiin Odyssey Lämpökamerat. NIR intensiteetti ROI kasvaimen verrattiin viereiseen lihas tuottaa SBR. Eristetty kudos analyysit tehtiin skannaamalla 800 nm kanava, kudosten kertyneen EGF-NIR fluoresenssisignaalisuhteet ja SBR laskettiin. NIR kuvantaminen arvioitiin seuraavissa olosuhteissa: resoluutio: 170-340 mikronia; pikselien: 0,03 mm

2; laatu: keskimatalan; keskitytään offset: 1-3; kanavat: 800 nm; intensiteetti: 1-3.

Potilaille ja CRC Tissue Näytteenotto

18 potilasta yli 18-vuotiaiden, joilla on histologisesti vahvistettu ensisijainen adenokarsinooma tarjottiin tutkimukseen osallistumisesta. 5 potilailla, jotka saivat ennen säteilyä tai kemoterapiaa olivat tukikelvottomia tutkimukseen. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Institutional Review Board (IRB, Helsinki-komitea) on Hadassah-Hebrew University Medical Center. Kaikki näytteet on saatu suostumuksensa oppiaineista joille kirurginen kasvaimen resektion jotka allekirjoittivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Kaikki näytteet tehtiin rutiini makroskooppiset ja mikroskooppiset analyysi hallituksen sertifioitu patologi mukaan College of American patologi (CAP) suuntaviivojen histopatologiasta raportointi (www.cap.org). Kudokset tunnistetaan tutkimus patologi kuten paksusuolen adenokarsinooma ja viereisten kudosten [24] käytettiin sitten IC-NIR kuvantamisen.

36 viipaletta CRC kudosten ja 19 viipaletta vierekkäisten paksusuolikudos (n = 10-15 ROI kukin viipale) toimitettiin

ex vivo

sitoutumismääritys 45 minuuttia 37 ° C: ssa 70 nM EGF-NIR läsnä (ei erityisiä) tai poissa (yhteensä sitovia) 1 uM leimaamatonta EGF. NIR-intensiteetti oli arviolta samat olosuhteet kaikille viipaleet (n = 12). Merkitys: * p 0,01 verrattuna vastaaviin ryhmään viereisissä paksusuolen EGFR-, ** p 0,05 verrattuna vastaaviin ryhmään CRC kudoksessa EGFR-; Aseta: tyypilliset western blotting EGFR viipaleiden tutkittu.

Kuvia viisi tyypillistä viipaletta, nimenomaan merkitty EGF-NIR, kuten on kuvattu legenda kuvassa. 7. 800 nm Odyssey lämpökamera haetut kuvat prosessoitiin käyttäen soveltavan spektrin kuvankäsittelyohjelma, Spectral View. Intensiteetti mittakaavasta punaruskea (5) korkea ilmentyminen EGF-NIR sitova; vihreä (4) väli- ilmaisu; sininen (3) erittäin alhainen ilme.

NIR SAT CRC Kudokset

tuore kasvainkudoksen tai viereisten paksusuolen kudokset jaettiin vaaka viipaleina, 230 um, joka valmistettiin käyttämällä vibratomilla VT1000S (Leica, Nussloch, Saksa) ja inkuboitiin jääkylmässä DMEM sitova ratkaisu. Viipaleet siirrettiin 24 kuopan kudosviljelmälevyille täynnä DMEM kyllästetty 95% O

2 ja 5% CO

2 samanlainen olosuhteet mahdollistavat peräsuolen organ kulttuureissa [25]. Levyjä pidettiin jäiden päällä 45 min ajan DMEM ja sitoutumisen koe suoritettiin lisäämällä 70 nM EGF-NIR: n läsnä (ei-spesifisen sitoutumisen) tai poissa (yhteensä sitovia) 1 uM modifioimattoman EGF. Kustakin kudoksesta, kolmena viipaleita inkuboitiin 70 nM NIR-Dye (IRDye800CW) arvioida epäspesifistä sitoutumista väriaineen. Sitova koe lopetettiin pesemällä kudoksen kolme kertaa kylmällä PBS: llä. Märät viipaleet siirrettiin uusiin 24-kuoppalevyille 1 ml /kuoppa PBS ja skannataan NIR kuvantamisen intensiteetti käyttäen Odyssey Lämpökamerat, kuvatuissa olosuhteissa edellä. Sarjatuotantona, yli kahden vuoden ajan, 43 CRC ja 23 viereisten paksusuolen kudosnäytteet arvioitiin. ROI identtisillä alueita käytettiin siivuja eri koeryhmään. Välineet ja keskihajonnat NIR intensiteetti (mielivaltainen loisteputki yksikköä /mm

2 alue) laskettiin 10-15 ROI kussakin siivu. Jokainen viipale toimitettu EGR-NIR sitoutumisen koe arvioitiin myös sen jälkeen, kun kuvantamiseen EGFR western blottauksella. Tiedot saavutettiin luokiteltiin mukaan EGFR positiivinen CRC kudoksia, EGFR negatiivinen CRC kudosten ja viereisen paksusuolikudos joka on osa oli EGFR negatiivisia. Puute EGFR todistettiin Western-blottauksella. 85% viipaleita sisällytettiin tilastollisten analyysien mukaan seuraavien farmakologisen kriteerit: a. yhteensä sitova; b. Kuva.