Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cell cycle proteiinin ilmentyminen on tärkeä rooli patofysiologiassa kohdunkaulan syövän. Kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat yrittäneet korreloivan käyttää näitä biomarkkereiden kliinisen kasvaimen edistymistä.

Tavoitteet

1) ekspression analysoimiseksi Ki-67, p53 ja p16

INK4a kohdunkaulan syövän, 2) korreloivan suhteellisen ilmentymistä näiden proteiinien sekä kliinisten parametrien kanssa taudin vaiheesta, ja 3) määrittää HPV-DNA yleisyys ja alatyyppi jakelu.

Methods

Tissue mikroriveissä (TMA) potilailta, joilla invasiivisen kohdunkaulan syövän (ICC) ja valvonta analysoitiin. HPV-DNA-tunnistus tehtiin PCR: llä ja in situ hybridisaatio. Ki-67, p53 ja p16

INK4a analysoitiin immunohistokemiallisesti; kliiniset tiedot oli peräisin kaavion tarkastelu.

Tulokset

Advanced kasvain vaiheen (III ja IV) oli voimakkaasti yhteydessä (p 0,005) ja korkea ikä ( 55-vuotias), jossa yli neljä raskaudet ja kanssa muodollisen koulutuksen puutteen. HPV-DNA: ta löytyi 94,3%: ssa tapauksista, joissa yleisimpiä tyyppejä ovat HPV16 (67,5%), jota seuraa HPV33 (12,0%) ja HPV35 (3,6%). Korkea ilmentyminen Ki-67 ja p16 oli yleisempää Advanced FIGO vaiheista (p = 0,023). Naiset HPV16 yleensä nuorempia (50,9 vuotta SE 1,9) verrattuna naisiin muunlaisiin (59,9 vuotta, SE 2,8).

Johtopäätös

Huomasimme, että Ki-67 ja p16 ilmaus olivat itsenäisesti liittyy kasvaimen vaiheessa. Totesimme myös, että noin 1/3 kohdunkaulan syöpiä tässä Brasilian kohortissa ei liittynyt HPV-tyypit suoraan kohteena nykyisen HPV-rokotteiden.

Citation: Amaro-Filho SM, Golub JE, Nuovo GJ, Cunha CB, Levi JE, Villa LL, et al. (2013) vertaileva analyysi Clinical and Molecular tekijät, joiden vuoksi vaiheen kohdunkaulasyövän Brasilian Kohortin. PLoS ONE 8 (3): e57810. doi: 10,1371 /journal.pone.0057810

Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia

vastaanotettu: 07 syyskuu 2012; Hyväksytty 26. tammikuuta 2013 Julkaistu: 07 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Amaro-Filho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant Support : AFN ja SAF olivat tutkijoiden kansainvälistä aids Research and Training Program tukemana Fogarty International Center, National Institutes of Health (NIH) Research Grant 2 D 43 TW000010-23-AITRP. Tätä työtä tukee osittain avustuksia LIPMED-IOCFiocruz, RJ, Brasilia, ja Lewis Foundation (tri Gerard J Nuovo Laboratory). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta lupaavia tuloksia saavutettiin viime vuosikymmeninä kanssa seulonta oireeton naisten papa-kokeilla ja viime aikoina kynnyksellä rokotteita HPV, kohdunkaulan syöpä on edelleen yleinen sairaus noin 530000 uutta tapausta ja 275000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Klassinen johto invasiivisen kohdunkaulan syövän (ICC) sisältää arvioidaan kasvaimen laajuutta, joka sisältää kasvaimen koko, syvyys invaasio, mikrovaskulaaristen tila kasvain invaasio, levinnyt imusolmukkeisiin, ja arvosana erilaistumista. Hoito kohdunkaulan syövän perustuu siihen arviointiin kliinisessä vaiheessa kasvain luokituksen mukainen International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Aikaisen vaiheen (FIGO I-II A) joko leikkaus tai sädehoitoa (RT) käytetään, kun taas myöhään vaiheissa (FIGO IIB-IV) kemoterapia näkyy [2]. Kuitenkin kliininen lavastus on tiettyjä rajoituksia johtuen muuttujia kuten inter-tarkkailijan vaihtelua. Eroavaisuudet on raportoitu jopa 25%: ssa tapauksista varhaisessa vaiheessa tauti ja 65-90% vuonna kehittynyt (≥IIB) tauti [3], [4].

Imaging tekniikoita, kuten tietokonetomografia ja ultraääni , on hyväksytty parantaa kliinistä lavastus tarkkuutta kohdunkaulan syöpä. Kuitenkin jotkut tutkimukset ovat alhainen herkkyys ja korkea väärien negatiivisten tulosten näillä menetelmillä [2]. Näin uudet ennustava merkkiaineita tarvitaan tunnistaa potilaat, joilla on suuri taudin uusiutumisen riski, huonompi ennuste ja optimoida tautien hallinta, etenkin alussa invasiivisen kohdunkaulan syövän (ICC).

Jatkuva infektio tiettyjen ihmisen papilloomaviruksen tyyppejä (erityisesti tyypit 16 ja 18) on hyvin dokumentoitu välttämättömänä co-tekijä kohdunkaulan syövän kehittymisen. Suuren riskin HPV-tyypit ovat voitava vaikuttaa monimutkaisia ​​polkuja, jotka lopulta johtaa kohdunkaulan syöpä, osittain johtuen kyky E6- ja E7-viruksen onkoproteiineja ajaa solujen S-vaiheen [5]. E7 assosioituu retinoblastoomaproteiinia (pRb), joka on tuumorisuppressoriproteiinia liittyviä useita merkittäviä syöpiä. pRb estää solun jäljittelevän vaurioitunut DNA estämällä sen etenemistä pitkin solusyklin läpi G1 (ensimmäinen aukko vaihe) osaksi S (synteesi vaihe) [6] – [9] ja on mukana estämään solujen liiallista kasvua estämällä solusyklin etenemisen, kunnes solu on valmis jakamaan kun pRb sitoo ja estää E2F perheen transkriptiotekijöiden [10], [11]. Sen jälkeen E7 ja pRb yhdistys, E2F proteiinit kykenevät myöhemmin transaktivoi solun sykliineistä dependet kinaasien (CDK) proteiineja, tarvitaan viruksen DNA: n replikaatiota, joka voi johtaa syöpään [6]. Futhermore, E7 pystyy myös vuorovaikutuksessa muiden proteiinien mukana solujen lisääntymisen, kuten histonideasetylaasit, komponentit AP1 transkription monimutkainen ja sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorit, mukaan lukien p21 ja p27 [12]. E6 on välittäjinä p53 ubikinaation ja hajoamista. Tämä puolestaan ​​vähentää tehokkuutta solun DNA-vaurioita vasteen ja mahdollistaa kertymistä johdetun mutaatioita, jotka puolestaan ​​lisää syöpäriskiä muodostumisen [5].

antigeeni KI-67 tunnetaan myös Ki -67 tai MKI67 on tumaproteiini, että ihmisillä on koodaa MKI67 geeni ja se on tiukasti liittyy solujen lisääntymistä. Ki-67-proteiini on läsnä kaikkien aktiivisten vaiheiden solusyklin (G1, S, G2 ja mitoosi), mutta puuttuu leposoluissa. On havaittu olevan luotettava ennustava tekijä kasvaimen kehittymiselle. Siten Ki-67 leviämisen indeksi, joka heijastaa tuumorisolujen prosenttiosuuteen, jotka ovat aktiivisesti lisääntyvät, on yleisesti käytetty markkerina diagnostisten patologian erottamiselle hyvänlaatuista pahanlaatuisia kasvaimia [13] – [15]. P16

INK4a on sykliiniriippuvaisen kinaasin estäjä, joka toimii tuumorisuppressorina sitomalla sykliiniriippuvaisiin kinaasien, kuten CDK4 ja CDK6, estää fosforylaation ja sitä seuraavan inaktivoitumisen retinoblastoomaproteiiniin (pRB), ihmisillä on koodaa CDKN2A-geenin ja on tärkeä rooli säätelyssä solusyklin. Tämä geeni tuottaa useita transkriptivariantissa, jotka eroavat ensimmäisen eksonia. Äskettäin yksi tutkimuksessa todettiin useita uusia geenejä voidaan ilmentää eri tavalla kohdunkaulan syövän ja sen yli-ilmentyy kohdunkaulan syöpiä, vahvisti immunohistokemiallisesti kuten MMP3, UBE2C ja p16-proteiini [16]. Diffuusi p16

INK4a ilme on liittynyt korkean riskin HPV (HR-HPV) infektio, erityisesti korkean asteen CIN-muutos ja syöpä [17] – [19].

Proteiini P53, tunnetut kuten proteiini 53 tai tuumoriproteiinin 53, on tuumorisuppressoriproteiinia, jossa se säätelee solusyklin ja siten toimii tuumorisuppressori, joka on osallisena syövän ehkäisemiseen. P53 on merkittävä rooli säilyttämiseksi vakautta estämällä genomin mutaatio. Ihmisillä, p53 koodaa TP53-geeni sijaitsee lyhyen varren kromosomin 17 jännittämättömässä soluissa p53 tasot on pidettävä pienenä jatkuvalla hajoamisen p53 kuitenkin Jos TP53-geeni on vaurioitunut, tuumorisuppressiogeeneksi heikkenee huomattavasti [20] . TP53-geeni voidaan myös vaurioitua soluissa perimän muutoksia lisää todennäköisyyttä, että solu alkaa decontrolled jako. Yli 50 prosenttia ihmisen kasvaimista sisältävät mutaation tai deleetion TP53-geenin. Kohdunkaulan syövän, E6 HPV onkoproteiinia sitoutuu p53 ja edistää sen hajoamista ubikitiinipromoottori proteolyysin polku [21] – [24]. Jotkut taudinaiheuttajia, kuten HPV voi vaikuttaa myös p53-proteiinien ilmentymisen. Ristiriitaisia ​​tuloksia on julkaistu koskee p53 ilmaus, joissakin tutkimuksissa on osoittaa positiivinen korrelaatio p53 kanssa korkealuokkaisesta vaurioita ja kohdunkaulan syöpää, kun taas toiset julistaa ole merkitseviä [21], [25].

Tämä tutkimus oli suoritettiin tutkimaan hypoteesia, että proteiinit, jotka osallistuvat solusyklin Ki-67, p53 ja p16

INK4a on yliekspressoituvat kohdunkaulan potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä, ja tarkemmin sanottuna, arvioida korrelaatiota näiden biomarkkereiden kanssa FIGO vaiheessa ja HPV-genotyyppi. Lisäksi sosiodemografiset, käyttäytymiseen ja kliinisiä tekijöitä Tutkimuksen populaatio analysoitiin myös, siksi meidän päätavoitteet olivat 1) ekspression analysoimiseksi Ki-67, p53 ja p16

INK4a kohdunkaulan syöpä 2) etsiä differentiaalikaavojen jotka voivat auttaa arvioinnissa kliinisen tuumorin luokitus mukaan FIGO luokituksen, ja 3) määrittää HPV-DNA genotyyppijakauman tässä potilasryhmässä.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä ja data kokoelma

tutkimuksen aineisto koostui 130 näytettä satunnaisesti valituille arkistoista Fernandes Figueira Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasilia. Näytteitä 87 potilaista saatu kohdunkaulan biopsialla tai conization vuosien 2003 ja 2008 olivat histopatologisesti varmistettiin kirurgisella patologi kuin invasiivisen kohdunkaulan syövän. Neljäkymmentä kolme potilailla, joille tehtiin kohdunpoisto hyvänlaatuisen leiomyomata taudin käytettiin verrokkeina.

Sosiodemografinen ja terveyttä koskevat tiedot saatiin potilaan kaavioita. Seuraavat tiedot kerättiin: ikä, historia ja pakkaus vuosien tupakoinnin historiaa alkoholinkäytön ehkäisyvälineiden (hormonaalista), ikä ensimmäisen yhdynnän, numerot raskauksia, koulutustaso, HIV-1 serologia ja FIGO vaiheessa. Institutionaalinen Review Board (IRB) Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), (CAE 0024.0.011.000-09-, Rio de Janeiro, Brasilia) hyväksytty käyttö kirjallisen suostumuksen tässä tutkimuksessa.

Tissue Micro-Array (TMA) lohko rakentamiseen.

Tissue Micro-Array lohkot rakennettiin kuten ovat kuvanneet Pires ym, 2006 [26]. Lyhyesti, kaikki hematoksyliini- eosiinilla (HE) liukuu tutkittiin uudelleen toisella kokenut patologi ja kaksi morfologisia edustavan aloilla invasiivisen kohdunkaulan syövän valittiin ympäröimässä tussilla. Kaksi ydintä kustakin tapauksessa stanssattiin luovuttajalta lohkoja. Vastaava H vain näytteet osoittavat alkuperäisen vaurion käytettiin. Yhteensä kaksi TMA korttelin rakennettiin, joista kohdunkaulan syövän koepaloja ja muut hallintalaitteet, joissa ilman CIN-muutos (CIN) vahvistettiin tarkastelu hematoksyliinillä ja eosiini värjätään dia.

DNA: n eristämiseksi .

Kustakin parafiiniin kohdunkaulan koepala, 4 viipaletta 5 um leikattiin. Lyhyesti, sen jälkeen, kun vahan kanssa ksyleeniin 48 ° C: ssa 2 tunnin ajan, etanoli (100%, 70% ja 50%) lisättiin poistamaan jäljellä ksyleeniä, minkä jälkeen nesteytys ja sentrifugoimalla 12000 rpm per 15 min kussakin vaiheessa. Pelletti suspendoitiin uudelleen liuokseen, jossa on 300 ui proteinaasi K: n (100 ug /ml) ja 10% SDS aikana 48 tunnin ajan 48 ° C: ssa. Viisi mikrolitraa proteinaasi K: n (200 ug /ml) lisättiin 24 tunnin kuluttua. DNA eristettiin fenoli uuttamalla, joka sisälsi 300 ui fenoli /kloroformi /isoamyylialkoholia (25/24/1), jota seurasi sentrifugointi (12000 rpm per 10 min), jolloin saatiin vesifaasi. Jälkeen toistamalla näitä puhdistusvaiheita kahdesti, DNA saostettiin 20 ° C: ssa 24 tunnin ajan 100 ul: lla natriumasetaattia (lopullinen konsentraatio 7,5 M) ja kaksi kertaa vesifaasi tilavuus 100% etanolia. DNA-pelletti otettiin talteen sentrifugoimalla 15 minuuttia 12000 rpm 4 ° C: ssa, pestiin 70% etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan TE-puskuria (10 mM Tris-emästä, 1 mM EDTA, pH 7,5). DNA määrä ja laatu analysoitiin NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA).

PCR-monistus ja HPV genotyypitys.

monistaminen HPV L1 konsensusalueen suoritettiin geneeristen alukkeita GP5 + ja GP6 + (syntetisoitiin Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasilia) tuottaa PCR-tuotteen noin 150 emäsparin kuten aikaisemmin on kuvattu (syntetisoitu Invitroge

n

, Sao Paulo, SP, Brasilia; eteenpäin alukesekvenssin : GP5 +

TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC

; käänteisaluke- järjestyksessä GP6 +

GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC

) [27], [28]. Negatiiviset näytteet näillä alukkeilla tehtiin sisäkkäistä PCR käyttämällä ensimmäisen kierroksen monistuksella alukkeilla PGMY09 ja PGMY11, aiemmin kuvattu (syntetisoitiin Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasilia; eteenpäin Alukesekvenssi: PGMY11A

GCACAGGGACATAACAATGG

, PGMY11B

GCGCAGGGCCACAATAATGG

, PGMY11C

GCACAGGGACATAATAATGG

, PGMY11D

GCCCAGGGCCACAACAATGG

, PGMY11E

GCTCAGGGTTTAAACAATGG

; käänteisaluke- järjestyksessä: PGMY09F

CGTCCCAAAGGAAACTGATC

, PGMY09G

CGACCTAAAGGAAACTGATC

, PGMY09H

CGTCCAAAAGGAAACTGATC

, PGMY09I

GCCAAGGGGAAACTGATC

, PGMY09J

CGTCCCAAAGGATACTGATC

, PGMY09K

CGTCCAAGGGGATACTGATC

, PGMY09L

CGACCTAAAGGGAATTGATC

, PGMY09M

CGACCTAGTGGAAATTGATC

, PGMY09N

CGACCAAGGGGATATTGATC

, PGMY09P

GCCCAACGGAAACTGATC

, PGMY09Q

CGACCCAAGGGAAACTGGTC

, PGMY09R

CGTCCTAAAGGAAACTGGTC

, HMB01

GCGACCCAATGCAAATTGGT

) [29]. Jokainen PCR-määritys mukana positiivisena kontrollina Hela solujen DNA (HPV18-DNA) ja negatiivisen mallin valvontaa. Eheys näytteen DNA varmistettiin monistamalla 110 emäsparin fragmentti β-globiinigeenin alukkeilla PC03 ja PC04. Monistamiset suoritettiin GeneAmp PCR System 9700 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems), ja kaikki PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelissä.

Lopullinen reaktiotilavuus oli 75 ui puhdistettiin GF -1 DNA Recovery Kit (Vivantis, Oceanside, CA, USA), jotta genotyypin. Sekvensoimiseksi, joka sisälsi 3,2 pmol kutakin aluketta (GP5 + tai GP6 +), 5-10 ng PCR-tuotetta, 2,5 ui Big Dye Terminator v 3,1 Cycle Sequencing Kit (osanumero 4337455; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja MilliQ vettä täyttämällä varten lopputilavuuteen 10 ui valmistettiin. Seokset analysoitiin ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) osoitteessa DNA PDTIS /Fiocruz Platform [30]. Rinnastukset saatiin suoraan on-line blastn- palvelimelle tai fylogeneettisesti analysoida ohjelmiston MEGA5 [31]. Tapaukset eivät monistettiin PCR tai kykene Sekvensoitavat jossa tarkistetaan HPV-DNA avulla INNO-LiPA HPV genotyypin v2 (Innogenetics, Gent, Belgia). Kolme epäselviä tapauksia analysoitiin myös, että PapilloCheck Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa).

immunohistokemia (IHC).

IHC reaktiot tehtiin TMA silaanilla päällystettyä dioja (Sigma , St. Louis, MO, USA), kuten aiemmin on kuvattu [32]. Lyhyesti, objektilasit poistettiin vaha ksyleenillä, vedettömät kautta porrastettu etanolissa, pestiin tislatulla vedellä ja käsiteltiin sitten liuoksen kanssa metanolissa, joka sisältää 0,3% vetyperoksidia 10 minuuttia poistamaan endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Antigeeni haku kaikille immunohistokemia suoritettiin keittämällä kudoksiin Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA, USA). Ei-spesifinen vasta-aineen sitoutuminen estettiin inkuboimalla kohdat seerumittomalla proteiini lohkon (1% BSA: ta). Kudosleikkeet peräkkäin inkuboitiin yön yli kostutetussa kammiossa 4 ° C: n lämpötilassa, jossa primäärinen vasta-aineita (laimennukset): monoklonaalinen vasta-aine anti-Ki67 (käyttövalmis – Dako, Carpinteria, CA, USA), monoklonaalinen vasta-aine anti-p53 (1 /10 – Santa Cruz, Biotechnology, Inc-CA-USA) ja monoklonaalinen vasta-aine anti-p16

INK4a (1/250 – Santa Cruz, Biotechnology, Inc-CA-USA). Toissijainen biotinyloitu Multilink-vasta-ainetta 30 minuutin ajan ja sen jälkeen streptavidiini-peroksidaasi 30 minuutin ajan. Entsymaattinen reaktio kehitettiin liuokseen, jossa oli 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAKO, Glostrup, Tanska) altistumisen 5 min lukuun ottamatta p53 jossa FastRed kromogeeni on käytetty (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä 1 min, pestään tislatulla vedellä, vesi väkevyydeltään etanolia, poistetaan ksyleenillä ja kiinteästi asennettu Entellaniin (Merck, Darmstadt, Saksa).

Arvio IHC dioja ja solujen laskenta

Kaksi itsenäistä tarkkailijaa tarkistetaan ja määrällisesti ilmaus kaikkien immunohistokemiallisella tahrat. Ki-67 ja p53 tahra sisältyvät tumavärjäystä vain. Kaksi edustavalla kunkin ytimen olivat käsin laskettiin tarkkailijoiden ja Ki-67, luokitellaan: negatiivinen, alle 25% positiivista syöpäsolun ytimiä, 25-50% positiivisia tai yli 50% positiivista. P53 pisteytysjärjestelmä oli seuraava: negatiivinen, mutta pienempi kuin 5% positiivista syöpäsolun ytimiä, 5-25% positiivinen ja suurempi kuin 25%. Immunohistokemiallinen lauseke p16

INK4a oli määrällisesti käyttäen läsnäolo (positiivinen tai negatiivinen), sijainti solussa (ydin- ja sytoplasmista), värjäyksen voimakkuus (heikko, kohtalainen ja vahva) ja hajonta malli (diffuusi tai paikallinen).

tilastollinen analyysi.

tiedot analysoitiin avulla STATA /SE 10.1 ohjelmisto. Tilastolliset vertailut suoritettiin käyttäen parametrical Student t-testiä jatkuvien muuttujien sekä chi-neliö testi ja Fisherin testiä kategorisen muuttujia. Testi trendi kaikkialla tilattu ryhmissä (nptrend) sisällytettiin tarkkailemaan jos biomarkkerit seurasivat lineaarisen trendin lauseke FIGO vaiheessa. Univariated logistinen regressio levitettiin tarkistaa yhdistyksen välillä demografisen, käyttäytymiseen ja kliiniset tekijät ICC: n kanssa ja kontrolliryhmiin. Herkkyys (todennäköisyys tosi positiivinen), spesifisyys (todennäköisyys tosi negatiivinen) ja Youdenin Index (YI) (YI = herkkyys + spesifisyys-1), mittana yleinen diagnostinen tehokkuus, laskettiin yksimielisyys diagnoosit FIGO III- IV ja II-IV. Kaikki p-arvot ovat kaksipuolisia; p-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Tutkimuskanta ominaisuudet analyysi

Tähän tutkimukseen osallistui 130 naista (keski-ikä 51,1 ± 13,1 vuotta vanha; valikoima 24- 88). Jotta vertailla kliinisten muuttujien ja FIGO vaiheessa sosiodemografiset, käyttäytymiseen ja kliinisiä tekijöitä kerättiin yksittäisen potilaan kaavioita. Kuitenkin jotkut tietoja ei ollut saatavilla kaikille potilaille kuin seuraavat (N -%): ikä (6-4,6%), koulutustaso (41-31,5%), tupakanpoltto (41-31,5%), alkoholin kulutus (43-33,1 %), ehkäisyvalmisteet (48-36,9), ensimmäinen yhdynnässä (53-40,8%), numerot raskauksista (33-25,4%), HIV-1 tila (86-66,2%) ja FIGO vaihe (17-19,5%).

yhdistysten histopatologia ja FIGO vaiheessa sosiodemografisiin ja kliinisiä tekijöitä

tässä väestömääränä univariated logistinen regressioanalyysi, todettiin, että tupakoinnin, alkoholin kulutus, ehkäisyvalmisteita (pillereissä ), ikä ensimmäisen yhdyntää, ja HIV-1 asema ei ollut yhteydessä kohdunkaulan syöpään. Oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä korrelaatio kohdunkaulan syövän ja kontrolliryhmien seuraaviin ryhmiin: potilaat yli 55 (OR = 16,6; CI95% = 3,5-79,2; p 0,001), naiset ilman muodollista koulutusta (OR = 8,0; CI95% = 1,5-43,4; p = 0,016), ja naiset, joissa on enemmän kuin neljä raskauksia (OR = 7,2; CI95% = 2,4-21,5; p = 0,001) (taulukko 1). Lisäksi joukossa potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä, oli tilastollisesti merkitsevästi yhteydessä lisääntyneisiin raskauksien (3 tai enemmän) sekä muodollisen koulutuksen puutteen verrattaessa FIGO vaiheen I FIGO vaiheissa II-IV (p = 0,005).

HPV esiintyvyys ja jakelu

Kaksi 43 kontrollinäytteiden tuottanut tyydyttäviä tuloksia DNA: n eristämisessä ja jätettiin HPV-DNA esiintyvyys analyysejä. Kolme näytettä negatiivinen PCR: llä GP5 + /6 + olivat positiivisia viruksen DNA sisäkkäistä PCR: llä käyttäen PGMY09 /11-alukkeita. Yhteenlaskettu esiintyvyys HPV DNA: n ohjaus ja kohdunkaulan syövän välillä oli 29,3% (12/41) ja 95,4% (83/87), tässä järjestyksessä. HPV genotyyppi jakautuminen valvonnan ja kohdunkaulan syöpä ryhmät esitetään taulukossa 2. infektiot, joissa on enemmän kuin kaksi HPV yhdessä näytteessä olivat harvinaisia; 2/92 HPV positiiviset näytteet osoittivat useita infektioita. Kontrolliryhmässä, HPV tyyppi 16 paljasti korkeimman esiintyvyys (72,7%), minkä jälkeen tyypit 35, 67 ja 6 (9,1% kutakin). Naisten kohdunkaulan syöpä, HPV tyyppi 16 oli myös yleisin (67,5%), jonka jälkeen tyypin 33 (12,0%) ja tyyppi 35 (3,6%). HPV-tyyppi 58 ja 6 havaittiin kahdessa tapauksessa (2,4%), kun taas HPV 18, 31, 52, 67, 70, 69 ja 30 havaittiin vain 1 tapauksessa (1,2%). Tartunnan saaneiden naisten HPV16 näytteillä tilastollisen merkittävää yhteyttä (p = 0,012) ja nuorempien keskimääräinen (50,9; SE 1,9) verrattuna naisiin muunlaisiin (59.9; SE 2,8).

Proteiinin ilmentymisen analyysi

suhteellisesta proteiinin ilmentymisen määritettynä immunohistokemia korreloi FIGO vaiheessa ja HPV-genotyypin HPV positiivinen kohdunkaulansyövistä.

Ki-67 lausekkeen

Ki-67 värjäys oli ydin- ja läsnä 34 (82,9%) hallintalaitteiden ja 82 (94,3%) ja kohdunkaulan syövistä. Oli kuitenkin merkittävä ero jakautumiskuvion Ki-67 kohdunkaulan syövän ja normaalissa kohdunkaulan epiteelin. Tarkemmin sanottuna Ki-67 positiiviset solut rajoittuvat pohjapinta epiteelin kerros normaalissa kohdunkaulan kudos ottaa huomioon, että kohdunkaulan syövän yksilöt, Ki-67 ilme oli hajanainen ja läsnä useimmissa syöpäsolujen pohjapinta näkökohta pintaan pahanlaatuinen kasvain. Jotta erotetaan ja kvantifioimiseksi ekspressiokuviota välillä kohdunkaulan syövän näytteitä ja ohjaus, Ki-67-ekspressio osoitetaan kirjaimet (A, B, C, D ja F). ”A” viitataan no Ki-67-signaalin, ”B” merkitään positiivisten solujen läsnä ainoastaan ​​pohjapinta /parabasal epiteelin, ”C” edustaa positiivinen solu todisteita tyvi /parabasal ja väli epiteelin, ”D”, johon viitataan signaalin pohja pinnan epiteeli, jossa on vähemmän kuin 25% positiivisia ydin, ”E”, johon viitataan signaalin pohja pinnan epiteeli 25%: sta 50% positiivisia tumaan ja ”F” on assosioitunut signaalin pohja pinnan epiteeli, jossa on yli 50% positiivisia ydin (kuvio 1). Kuten on ilmeistä taulukosta 3, oli merkittävä kasvu suuntaus Ki-67 ilme lisääntynyt FIGO vaiheessa (np

trendi = 0,008) (taulukko 3).

A, B ja C: kontrolli epiteelissä; D, E ja F: invasiivisen kohdunkaulan syövän epiteelissä. (A) Negatiivinen; (B) Tiukka positiivinen tahra Tyvisolukerroksessa; (C) positiivinen tahra pohjapinta ja välikerros; (D) on alle 25% positiivisia soluja koko epiteelin; (E) 25-50% positiivisten solujen koko epiteelin; (F) yli 50% positiivisia soluja koko epiteelin (DAB, ruskea tahra, Mag. 40 x).

P16

INK4a lausekkeen

Eri malleja p16

INK4a signaali havaittiin perustuu solujen sijainnin (ydin- ja sytoplasmaattinen), värjäyksen voimakkuus (heikko, kohtalainen ja vahva) ja hajonta malli (diffuusi tai paikallinen). Vain 5 (11,6%) ja kontrollit olivat p16

INK4a positiivinen, sitä vastoin 83 (95,4%) ja kohdunkaulan syövän kudokset positiivinen (kuva 2). Epätarkkarajaista kuvio p16: n ilmentyminen oli tilastollisesti (p 0,001) liittyy yleensä kohdunkaulan syöpä (85,5%) tapauksista verrattuna valvontaa. Tapaukset, joista on kohtalainen p16

INK4a ilme olivat yleisempiä kehittyneen FIGO vaiheissa III-IV (56,5%), kun taas heikko ilmentyminen liittyi varhaisessa FIGO vaiheen I (66,7%) (p = 0,023) (taulukko 4). No association välillä havaittiin solujen sijainti rakenteessa p16

INK4a värjäystä ja joko kasvaimen tai FIGO vaiheessa (p = 0,152 ja p = 0,183, tässä järjestyksessä).

V: ohjaus epiteelin; B, C, D, E ja F: invasiivisen kohdunkaulan syövän epiteelissä. (A) Negatiivinen; (B) Focal kohtalainen ydin- ja sytoplasmaattinen ilmaisun; (C) Diffuusi heikko ydin- ja sytoplasmaattinen ilmaisun; (D) Diffuusi kohtalainen sytoplasmaattinen ilmaisu; (E) Diffuusi vahva ydin- ja sytoplasmaattinen ilmaisun; (F) Negatiivinen (DAB, ruskea tahra, Mag. 40 x).

P53 lausekkeen

Positiivinen p53 ilmentymistä havaittiin 43 87 (49,4% ) kohdunkaulasyöpätapauksista ja negatiiviset kaikissa valvonta tapauksissa. p53 ilmaistiin yksinomaan ydinvoiman osastossa kaikissa positiivisia tapauksia. Immunovärjäys alle 5%, 5-25% ja suurempi kuin 25% positiivisia syöpään solutumien havaittiin 26 (29,9%), 15 (17,2%) ja 2 (2,3%), vastaavasti kohdunkaulan syövistä (kuvio 3) .

A, B, C ja D: invasiivisen kohdunkaulan syövän epiteelissä. (A) negatiivinen; (B) on vähemmän kuin 5% tumaväriä positiivisuus; (C) 5%: sta 25% tumaväriä positiivisuus; (D) on suurempi kuin 25% (FastRed, punainen tahra; Mag 40 ×, kuvio Mag.20 ×).

Ki-67, p16

INK4a ja p53 Kliininen tehokkuus

tutki myös kliininen suorituskyky (herkkyys, spesifisyys ja Youdenin Index) eri positiivisia päätepisteitä p16

INK4a, Ki-67 ja p53 värjäys, ja markkereita yhdistetty suhteessa konsensuksen diagnoosit FIGO III- IV (FIGO III +) ja FIGO II-IV (FIGO II +). Yhdistämällä positiivinen intensiteetti päätepisteen p16

INK4a värjäystä Ki-67 ja p53, värjäys lisääntynyt spesifisyys ja tarkkuus FIGO III + ja FIGO II + havaitseminen (taulukko 5). Korkeimmat herkkyys ja spesifisyys havaittiin vaiheissa (FIGO II +) mukaan Youdenin indeksi; sovittamalla cutoff yli 25% ilmentävien solujen Ki-67 ja p16

INK4a kohtalaista tai voimakasta intensiteettiä 93,5%, 100% ja 93,5%.

suhde HPV genotyyppien Immunohistokemiallisten Havainnot

tutki HPV 16 tai tietyt yhdistelmät HPV genotyyppien voisi vaikuttaa ilmaus biomarkkereiden analysoitu ICC näytteissä. Korkea ilmentyminen Ki-67 liittyi muiden HPV-tyyppien verrattuna HPV 16 tai erillisiä eri ryhmissä (HPV 16 single-infektio, muut korkean riskin, alhaisen riskin ja epämääräinen, ja useita infektioita) kuten näytetään taulukossa 6. ei suhde havaittiin p16

INK4a ilmaisun ja HPV-ryhmä genotyyppejä. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota p53 ilme ja HPV-genotyypin (taulukko 6).

Keskustelu

Havaitsimme yhä ilmaus Ki-67, p53 ja p16

INK4a vuonna kohdunkaulan syöpä yksilöitä verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Koska Ki-67 on klassinen leviämisen markkeri ja sitä on käytetty erottamaan hyvän- vs. pahanlaatuisia kasvaimia eri sivustoja, voimakas korrelaatio Ki-67 ja kohdunkaulan maligniteetin odotettiin [33]. Ki-67 ilmentyi kaikissa kerroksissa levyepiteelin kanssa kohdunkaulan syöpä. Todettiin myös normaaleissa kudoksissa, mutta rajoittuu pääasiassa parabasal kerroksen alueella. Nämä tiedot ovat yhtä mieltä useissa tutkimuksissa, joissa Ki-67 on esillä korkeat spesifisyys ja herkkyys biomarkkerina kohdunkaulan intraepiteliaalisten neoplasia [33], [34].

p53-proteiini ei osoittanut merkintöjen normaaliepiteelissä. Vuonna invasiivisen kohdunkaulan syövän yksilöitä huomasimme, että 49,4% (43/87) oli positiivisia, mutta osoittavat ilmentymisen paljon vähemmän ytimet karsinoomasoluja verrattuna ekspressiokuviota muita merkkejä. Kirjallisuus kuvaa ristiriitaisia ​​tietoja p53 ilmentymistä kohdunkaulan syövän, jossa hinnat vaihtelevat erittäin alhainen prosenttiosuudet 62,0% syöpäsoluja [21], [25]. Vaikka tämän perusteella merkittyjä epäsuhta tulosten on epäselvä, se voi koskea eri syitä, kuten eri kudosten kiinnittäminen, sekä antigeeni hakumenetelmät ja antoi leikkaus kohdat [35]. On myös tunnettua, että monenlaisissa ihmisen syövän, p53 on yli-ilmentynyt seurauksena mutaatioita, jotka muuttavat transkription aktiivisuus, joka voi puolestaan ​​vaikuttaa muiden säätelevien proteiinien esimerkiksi MDM2 (kutsutaan myös HDM2 ihmisen proteiini) . Kuitenkin, kun kyseessä on kohdunkaulan syöpä, se näyttää olevan erilainen, koska E6-proteiinin HPV suuri riski liittyy ubikitinaation p53 ja sitä hajoamiselta proteasomin. Kuitenkin tämä ei sulje pois sitä mahdollisuutta, että jotkut kohdunkaulan karsinoomien näytteille pistemutaatioita p53 [36]. Tuloksemme koskevat p53 ilme on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa kuten Bahnassy et al. (2007) ja Skomedal et ai. (1999), jotka löysivät vastaavasti 44,2% (19/43) ja 55,4% (41/74) invasiivisen kohdunkaulan syövän yksilöitä positiivinen p53 ja molemmissa tutkimuksissa, ei missään tapauksessa ollut positiivinen kontrolli yksilöt [33], [37 ].

Mitä p16

INK4a, useat tutkimukset ovat dokumentoineet yli-ilmentyminen, jossa diffuusi ja voimakas kuvio, paitsi laadukkaat kohdunkaulan intraepiteliaalisia vaurioita, mutta myös kohdunkaulan syöpä verrattuna normaaliin yksilöt [13] , [18], [33]. Tutkimuksemme osoittaa kasvun perusteella ilmaisun kohdunkaulan syöpä verrattuna kontrolleihin näytteitä. Löysimme 95,4% (83/87) ja kohdunkaulan syöpä oli positiivisia p16

INK4a verrattuna 11,6% (5/43) valvonnan. Harvat paperit ovat havainneet p16

INK4a ilmentymistä normaaleissa kudoksissa [36], [38], [39]. Silti se on vakiintunut, että ei dysplastic epiteelisolujen voi ilmaista p16

INK4a esimerkiksi tietyin fysiologisissa olosuhteissa, kuten lyhentäminen telomeres vanhemmissa kudoksissa. Tässä ilmauksen p16

INK4a heti indusoi solusyklin pysähtymiseen ja voi lopulta aiheuttaa apoptoosin kanssa lopputulokset ovat polttoväli kuvio heikko intensiteetti [40].

Mitä kliinisessä vaiheessa kohdunkaulan syöpä, meidän