Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cytoglobin on solunsisäinen globiini tuntemattoman funktion, joka on ilmaistu enimmäkseen soluissa myofibroblastin linjaa. Mahdolliset toiminnot cytoglobin puskuroivat solunsisäisten hapen ja vieroitus reaktiivisia hapen lajeja. Edellinen työ laboratoriossamme ovat osoittaneet, että cytoglobin suojelunormin hapettavista aiheuttaman DNA-vaurion, kun yli ilmaistaan ​​

in vitro

, mutta tärkeä tämä enemmän fysiologisesti asiaa malleja tauti ei tunneta. Cytoglobin on ehdokkaana tylosis ruokatorven syöpään geeni, ja sen ilme on vahvasti säädellä vähentävästi ei-syöpä ruokatorven koepaloja potilaista, joilla TOC verrattuna normaaliin koepaloja. Siksi ruokatorven solut tarjoavat ihanteellisen kokeellinen malli testata hypoteesia, jonka downregulation cytoglobin ilmaisun herkistää soluja haitallisia vaikutuksia reaktiivisia happiradikaaleja, erityisesti oksidatiivisen DNA-vaurioita, ja että tämä saattaa edistää TOC fenotyypin. Nykyisessä tutkimuksessa testasimme tätä hypoteesia manipuloimalla cytoglobin ilmentymistä sekä normaaleissa ja ruokatorven syövän solulinjat, joilla on normaalin fysiologisen ja ei ilmentymistä cytoglobin vastaavasti. Tuloksemme osoittavat, että yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa, yli ilmentyminen cytoglobin syöpäsolulinjoissa antoi suojan kemikaalien aiheuttamien oksidatiivista stressiä, mutta tämä todettiin vain ei-fysiologiset pitoisuudet cytoglobin. Lisäksi alas säätely cytoglobin normaaleissa ruokatorven soluissa ei ollut vaikutusta niiden herkkyys oksidatiivista stressiä arvioituna useita päätepisteenä. Yhteenvetona toteamme, että normaalia fysiologista pitoisuudet cytoglobin eivät tarjoa solusuojaus peräisin reaktiivisia happiradikaaleja, ainakin nykyisessä kokeellisessa mallissa.

Citation: McRonald FE, Risk JM, Hodges NJ (2012) Suoja Solunsisäiset Oksidatiivinen stressi by Cytoglobin Normal ja syöpä ruokatorven solut. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10,1371 /journal.pone.0030587

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 marraskuu 2011; Hyväksytty: 22 joulukuu 2011; Julkaistu: 16 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 McRonald et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer Research UK kohdeapuraha C7738 /A10476. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cytoglobin on jäsen globiinin perheen haemoproteins, jotka sisältävät hemoglobiinin ja myoglobiinin, samoin kuin äskettäin tunnistettu neuroglobin, joka ilmentyy pääasiassa soluissa CNS [1]. Kiderakenne cytoglobin on ratkaistu ja tutkittu yksityiskohtaisesti [2], [3], [4] osoittaa, että cytoglobin on monia yhtäläisyyksiä muihin globiinit, kuten klassinen kolmen-over-kolme alfahelikaaliset globiinin kertaiseksi ja P

O2 (happiaffiniteetti) noin 0,2 Torr, joka on samanlainen kuin myoglobiinin [esim 5], [6]. Korkea affiniteetti cytoglobin hapen on johtanut ehdotukseen, että cytoglobin voi toimia ”solunsisäinen” hapen liikennejärjestelmää. Tässä skenaariossa cytoglobin ehdotetaan tuottaa happea mitokondriot ylläpitää oksidatiivinen fosforylaatio, tavalla, joka on samankaltainen kuin toiminto myoglobiinin lihassoluissa. Mielenkiintoista, happi affiniteetti näyttää olevan redox-herkkiä, ja säätelee muodostumista disulfidisillalla kahden ulkoisen kysteiinitähteen (Cys B2 ja Cys E9). Redox-arkaluontoisia cytoglobin happiaffiniteettiin ehdottaa mahdollista roolia cytoglobin hapen ”sink /varaus”, jolloin happi vapautuu vasta, kun solut tulevat hypoksinen. Vaikka nämä ovat houkuttelevia hypoteeseja, cytoglobin ekspressio näyttää suurelta osin rajoittuvat soluihin fibroblasti alkuperää ei ole selvää korrelaatiota metabolista aktiivisuutta kudoksissa ja tasot cytoglobin ilmentymisen, jotka joka tapauksessa on melko alhainen useimmissa solutyypeissä tutkittiin [7] , [8]. Nämä havainnot ovat johtaneet etsiä vaihtoehtoisia elintoimintojen (t) cytoglobin.

Cytoglobin tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna 2001 [9] aikana proteomic näytön maksan tähtisolut eristettiin fibrotic rotan maksakudosta ja todellakin oli alunperin nimeltään stellate soluaktivaation yhdistys proteiini (STAP) tunnustuksena tästä [9]. Tämän jälkeen työssä – sekä

in vitro

ja

in vivo

[10] – [13], viimeksi käyttäen siirtogeenisiä eläimiä yli-ilmentävien cytoglobin [14], [15] näyttävät vahvistavan, että cytoglobin on rooli fibroottisen vasteen useissa elimissä, mukaan lukien maksan ja munuaisten. Vaikka täsmälliset roolia cytoglobin fibroosiin vielä ole tiedossa, pertubation redox homeostaasiin on hyvin tunnettu ominaisuus fibroosia ja on painavaa näyttöä (kanssa varsinkaan keuhko ja munuainen), että eteneminen fibroottisten leesioiden liittyy sykliä oksidatiivisen reperfuusiovaurion jälkeen kudoshypoksia. Lisäksi on osoitettu, että cytoglobin ilmentyminen voidaan voimistuvan hypoksia [16] – [19]. Siksi on todennäköistä, että cytoglobin osallistuu sopeutumisreaktio liittyvät tähän vammoja.

liittyvät havainnot vuonna fibroositaudin on myös syntymässä elin mekanistista näyttöä siitä, että cytoglobin voi tarjota suojaa oksidatiivista cellular vahinkoa muissa olosuhteissa, mahdollisesti seurauksena sen kyky poistaa reaktiivisia happiradikaaleja [20] – [23]. Itse työ omassa laboratoriossamme ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen cytoglobin alentaa tasoa kemikaalien aiheuttamien reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja antaa suojaa pro-hapetin aiheuttama vamma (lipidiperoksidaatiossa ja oksidatiivisen DNA katkeamisen) [24]. Edelleen tukea rooli vieroitus ROS, on raportoitu, että cytoglobin on peroksidaasiaktiivisuutta [9]. Mielenkiintoista on, viime aikoina on raportoitu, että rauta cytoglobin on pseudo-peroksidaasin aktiivisuus lipidien, mikä viittaa siihen, että olosuhteissa, oksidatiivisen stressin, liikevaihdon rasva perustuu solusignalointimolekyylien voi myös olla osa cytoglobin-riippuvaisen hapettumisen vaste [25]. Lisäksi toinen selkärankaisten globiini, globiinin X, on havaittu olevan solukalvoissa ja mahdollisesti mukana suojaa lipidien hapettumiselta [26].

Kiinnostavaa lisäksi mahdollisista rooleista edellä on esitetty, cytoglobin geeni (

CYGB

) on myös ehdokas tuumorisuppressorigeeniä [27], [28], [29] ja olemme tunnistaneet

CYGB

ehdokkaaksi tylosis ruokatorven syöpä (

TOC

) geeni [30] – [33]. Vaikka

CYGB

ei mutatoitunut tylotic yksilöt [31] tai sarjassa satunnaista levyepiteelisyövän ruokatorven karsinoomat [34], olemme osoittaneet, että sen ilmentyminen on voimakkaasti vaimentua in ei-syöpä ruokatorven koepaloja sairastavista potilaista TOC verrattuna normaaliin koepaloja [33].

CYGB

on myös metyloitu ja vaimentua satunnaisissa ruokatorven, keuhkojen ja pään ja kaulan alueen syövät [27], [28], [33]. Äskettäin downregulation cytoglobin on myös osoitettu edistää kemiallisesti indusoidun syövän syntymistä jyrsijöiden maksassa [35].

On vahvoja todisteita siitä, että hapettumista DNA (esim 8-okso deoksiguanosiinin), jos ei korjata, edistää muodostumista mutaatioita, joiden tiedetään olevan tärkeitä etiologiassa ihmisen syövän synnyn [36], [37]. Siksi hypoteesin, että menetys cytoglobin ilmaisun tekisi ruokatorven soluja herkempiä haitallisia vaikutuksia ROS, ja että tämä vaikuttaa havaittuun fenotyyppi

TOC

. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme testanneet hypoteesia manipuloimalla cytoglobin ilmentymistä sekä normaaleissa ruokatorven epiteelisoluissa ja ruokatorven okasolusyöpä soluja, joilla on normaalin fysiologisen ja ei endogeenistä ekspressiota cytoglobin, vastaavasti.

Tulokset

manipulointi cytoglobin ilmaisun

Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että TE-8 okasolusyöpä ruokatorven tasyöpäsolulinja on erittäin alhainen endogeenisten tasojen CYGB ilmaisun (alle 10

-5 suhteen beeta aktiini (ACTB)), kun taas NE1 normaali ruokatorven keratinosyyttejä ilmaista CYGB noin 0,1 x ACTB. Tämä luonnollinen taso CYGB ilmentymistä NE1 solujen katsottiin olevan normaalin fysiologisen tason, koska se on samassa suuruusluokkaa kuin, joka havaittiin paneelin normaaleja kudoksia (tietoja ei esitetty). CYGB ilmentymistä moduloidaan näissä kahdessa solulinjassa joko väliaikaisen transfektion geenin (TE-8 solua) tai ohimenevä Knockdown käyttämällä RNA-interferenssi (NE1 solut). Cytoglobin ilmentyminen keinotekoisesti noin 4 tai 7 suuruusluokkaa TE-8-soluista, ja väheni noin viisinkertaiseksi siRNA pudotus on NE1 soluissa (kuvio 1).

Tasot CYGB ilmentymisen, verrattuna ja ACTB ilmaisun määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR rinnakkain näytteestä kutakin comet suoritettu. Nämä ekspressiotasot siis liity suoraan komeetta koetulokset esitetään kuvassa 3. geometrinen keskiarvo kaikki kokeet esitetään sekä TE-8-soluista (oranssi pylväät) ja NE1 solut (vaaleanpunainen palkit).

karakterisointi solujen

Normaali ruokatorven epiteeli- (NE-1) ja ruokatorven syöpä (TE-8) solut analysoitiin tasoilla oksidatiivisen stressin käyttäen redox-herkkien yhdiste 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H2DCF -DA) läsnä ollessa ja puuttuessa buthionine sulfoxamine (BSO).

tulokset osoittivat, että BSO kykeni indusoimaan oksidatiivista stressiä sekä TE-8 ja NE1 solulinjoissa, joiden pitoisuus-riippuvainen vaste on ilmeistä (kuvio 2). TE-8-soluja, tämä saavutti tilastollisen merkitsevyyden käsittelemättömien solujen (p = 0,0134) ja CYGB transfektoidut solut (p = 0,0034), mutta ei mock transfektoiduissa soluissa (p = 0,092). Kuitenkin vastaava suuntaus havaittiin mock transfektoiduissa soluissa. Normaalissa ruokatorven solulinja NE1, samanlaisia ​​tuloksia saatiin: tässä tapauksessa BSO pitoisuudesta riippuvainen oksidatiivisen stressin vasteen oli tilastollisesti merkittävä kaikissa kolmessa ryhmässä soluja. BSO kykeni indusoimaan oksidatiivista stressiä kontrollisoluissa (p = 0,0032), negatiivinen kontrolli-siRNA käsiteltyjen solujen (p = 0,0283), ja solut altistettiin siRNA knockdovvn CYGB (p = 0,0077). Vaikka suuntaus havaittiin TE-8-soluista kohti yliekspressio CYGB liittyessä alhaisempi ROS verrattuna mock transfektoituja soluja, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Ei vaikutusta CYGB Knockdown havaittiin NE1 soluissa. Koska meidän ensisijainen kysymys oli tarkastella ROS liittyvän DNA-vaurioita, eikä oksidatiivisen stressin

sinänsä

, me seuraavaksi suoritetaan komeetta määritys kahdesta solulinjoissa: tämä on lisäetu on paljon herkempi indikaattori solujen hapettumista.

oksidatiivinen stressi mitattiin: TE-8 ja b: NE1 soluja. Mediaani DCF fluoresenssi on keskiarvo 5 toistoja. Kaikki arvot normalisoitiin tasolle nähdään ohjaus soluissa ilman BSO. Virhe palkit edustavat SEM. + 2020: transfektioreagenssia vain; + CYGB: solut, jotka on transfektoitu täyspitkä CYGB; ve siRNA: sekoitetun valvonta; CYGB k /d: CYGB siRNA. * Tilastollisesti merkitsevä konsentraatio-riippuvainen vaste (p 0,05) ** Tilastollisesti merkitsevä konsentraatio-riippuvainen vaste (p 0,01).

väliset oksidatiivisen DNA-vaurioita ja cytoglobin ilmaisun

Comet Pitoisuus.

TE-8-soluista, CYGB ilmentyminen keinotekoisesti palauttaa lyhytaikaisella transfektiolla (kuvio 1). Oksidatiivisen DNA-vaurioita mitattiin comet soluissa kahdella eri CYGB ilmaisun lisäksi perustason valvonta: keinotekoisen korkea yliekspressio (noin 10

2-kertainen suhteessa ACTB lauseke), ja pieni (suunnilleen fysiologinen) lauseke (noin 10

-1-kertainen suhteessa ACTB ilmaus). Keinotekoisen korkea CYGB ilmaisun, vähennetään merkittävästi oksidatiivisen DNA-vaurioita havaittiin olosuhteissa eksogeenisen oksidatiivisen stressin (1000 uM BSO) (p = 0,014) verrattuna mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3a) oli myös merkittävä ero oksidatiivisen DNA-vaurioita solujen välillä alhainen /fysiologinen ja korkea CYGB ekspressiotasot (p = 0,035). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa mock-transfektoituja soluja, ja ne, joilla on alhainen /fysiologinen CYGB ekspressiotasoja (p = 0,074); Samoin ei havaittu eroja ohjaus ja mock-transfektoituja soluja (p = 0,455). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CYGB kiinnostavuus suojaava vaikutus solujen hapettumista vain keinotekoisen korkein – ei-fysiologiset tasot ilmaisun. Vaikka vasta-intuitiivisesti oli lisääntymässä oksidatiivisen DNA-vaurioita, kun CYGB ilmaistiin alhaisilla /fysiologiset tasot, tämä suuntaus ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Vuonna NE1 soluissa, vähentäminen CYGB ilmaisun 90% käyttämällä RNA-interferenssi ei aiheuttanut mitään eroa oksidatiivisen DNA-vaurioita: tämä edelleen tukee väitettä, että CYGB vain kykenee sen cytoprotective vaikutuksia keinotekoisen korkea (ei-fysiologinen) ekspressiotasot (kuva 3b).

DNA säikeen-katkoksia (lähtötilanteessa ja oksidatiivisen-vaurioita aiheuttama) mitattiin FPG-modifioitu comet on: TE-8 ja b: NE-1-solujen eri CYGB ilmaisun (kuten on esitetty kuviossa 1). Keskiarvo mediaani prosentin komeetta hännän voimakkuus näytetään. Virhe palkit edustavat SEM. * Merkittävästi erilainen toisistaan ​​(p 0,05). # Merkittävästi erilainen toisistaan ​​(p 0,05).

Cytoglobin ja solun liikkuvuus

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että cytoglobin vaikuttaa solun motiliteettia ja pesäkkeenmuodostuskyvyn [29], mutta on nykyisessä tutkimuksessa ei ole vaikutusta cytoglobin pudotus, kun solujen kasvua havaittiin joko NE1 ruokatorven keratinosyyttien tai CCD-18Co paksusuolen myofibroblasteja, joko 25 tai 50 tunnin kuluttua haavan tekemisen jälkeen (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

Edellinen työ meidän ja muiden laboratorioiden on osoittanut, että cytoglobin on mahdollista puhdistaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS)

in vitro

kun yli-ilmennetään erilaisissa soluviljelysysteemeissä [20], [21], [22 ], [24]. Lisäksi downregulation cytoglobin RNAi on myös äskettäin osoitettu herkistää gliooma soluja oksidatiivista stressiä, indusoi sekä estämällä elektroninsiirtoketju kanssa antimysiini A, ja ionisoivaa säteilyä, [23]. Lisätukea rooli cytoglobin vieroitus ROS on biokemiallisia todisteita siitä, että cytoglobin proteiini hallussaan luontainen Peroksidaasiaktiivisuuden sekä antioksidanttisia ominaisuuksia ja on näyttöä siitä, että muut globiinit lukien neuroglobin ja globiinin X voi myös olla samanlaiset ominaisuudet [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. Kuitenkin, kun kyseessä on cytoglobin, on epävarmaa, onko tämä todellinen fysiologinen tehtävä cytoglobin tai artefakti kokeellisissa malleissa käytetään. Tähän mennessä ei ole ”cytoglobin reduktaasi” on tunnistettu, jotka voisivat vähentää Fe

3 + takaisin Fe

2+, joten ei ole selvää, miten hapetetut cytoglobin olisi kierrättää soluissa. On myös näyttöä siitä, että cytoglobin on katalyyttinen aktiivisuus reaktiivisen typen laji typpioksidin, joka katalysoi sen muuntaminen nitraatti missä askorbaatin ja sytokromi b (5) on tunnistettu mahdollisina vähentää teho [40]. Tämä otaksuttu aktiivisuus korreloi hyvin tarkkailuun korkeita cytoglobin ilmaisun fibroblasteissa ja sileän lihaksen soluissa verisuoniston, jossa typpioksidi on tunnettu signalointi molekyyli, joka välittää verisuonitonus [41]. Kuitenkin muut tutkimukset ovat kyseenalaistaneet typpioksidi dioxygenase on fysiologisesti relevantti entsymaattista aktiivisuutta cytoglobin [42]. Lisäksi on myös kehittymässä

in vivo

näyttöä suojaava rooli cytoglobin (ja neuroglobin) oksidatiivista stressiä vastaan, erityisesti malleissa fibroosin, joka liittyy hypoksinen reperfuusion ja myöhemmin oksidatiivisen vahinkoa [10] – [15] .

Suuri osa näistä tiedoista on tuotettu kokeellisissa malleissa, joissa cytoglobin on yli-ilmentynyt, joten vaikka nämä ovat mielenkiintoisia havaintoja, heidän fysiologinen merkitys on epäselvä. Nykyisessä tutkimuksessa, tutkimme cytoglobin ilmaisu olisi varaa suojan kemikaalien aiheuttamien oksidatiivisen DNA-vaurioita viljellyissä ruokatorven soluissa. Se on erityisen merkityksellistä, koska

CYGB

on alaspäin säännelty kummassakin tylosis ruokatorven syöpä ja satunnaista ruokatorven syöpiä [33], ja siksi oletettu, että menetys cytoglobin ilmaisun voisi herkistää näiden solujen DNA-vaurioita, mikä voi olla mukana etiologiassa ruokatorven syöpään. Kun cytoglobin yliekspressoitui TE-8 ruokatorven syöpä solulinjoja, joilla on vähän tai ei ollenkaan endogeenistä cytoglobin ilme, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten havaitsimme tilastollisesti merkitsevä suojaa BSO aiheuttamaa oksidatiivista DNA-vaurioita arvioituna FPG modifioidun comet. Tämä vaikutus oli kuitenkin pitoisuudesta riippuva: alemmilla cytoglobin yli-ilmentymisen suojaava vaikutus oli kadonnut. Tämän mukaisesti, knockdovvn fysiologisten tasojen cytoglobin vuonna primaareihin NE1 ruokatorven solut eivät herkistää heidät BSO aiheuttamaa oksidatiivista DNA-vaurioita arvioituna saman päätepisteen. Mielenkiintoista on, se on viime aikoina raportoitu, että pudotus on cytoglobin ekspression gliooma soluissa RNAi nostaa tasoja antimysiiniherkkien aiheuttama vetyperoksidin [23]. Nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme merkittävää eroa tasojen BSO aiheuttaman oksidatiivisen stressin arvioituna hapettamalla dikloorifluoreseiiniliuosta. Syy tähän eroon ei ole selvä, mutta se voi liittyä joko eri solulinjaa tai menetelmä aiheuttaa oksidatiivista stressiä.

tulokset viittaavat siihen, että vaikka induktio cytoglobin ilmentymisen, esimerkiksi seurauksena hypoksia tai vastauksena oksidatiivisen vahinkoa, on potentiaalia olla suojaavia, tutkimuksessamme tämä todettiin vain CYGB tasoilla todennäköisesti saavuteta

in vivo

. Lisäksi ei ollut mitään näyttöä lisääntynyt herkkyys ROS seuraavat knockdown RNAi soluissa, jotka ilmentävät cytoglobin klo fysiologiset tasot. Siksi cytoprotective rooli vastaan ​​hapettavasti indusoiman DNA: n vaurioiden ei näytä olevan funktio cytoglobin on ruokatorven solut ja muut selitykset cytoglobin toiminta ja menetys ilmentymisen tämän taudin mallissa tarvitaan.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Normaalit ruokatorven epiteelisoluissa (NE-1, A lahja professori GSW Tsao, Department of Anatomy, University of Hong Kong (katso [43]) ylläpidettiin T

75 dosviljelypulloihin käyttäen keratinosyyttien seerumivapaassa (Gibco), johon naudan aivolisäkeuutteella (25 ug ml

-1) ja rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (0,15 ng ml

-1). Viljelmiä rutiininomaisesti jaettu 01:03 noin joka 3-4 päivää käyttämällä trypsiini-EDTA ja soijapavun trypsiini-inhibiittori (Gibco) mukaan suositeltava protokolla keratinosyyttien seerumia. ruokatorven syöpä solulinja TE-8 (A lahja professori Toshio Kudo, cell Resource Centre for Biomedical Research , Tohoku University, Japani, [44]), kasvatettiin T

75 dosviljelypulloihin kanssa RPMI-10% FBS: ää ja 2% L-glutamiini. TE-8 solut jaettiin tarvittaessa käyttäen standardia trypsiini-EDTA-protokollaa. CCD-18Co paksusuolen myofibroblasteja (hankittu ATCC tuotenumero: CRL-1459; [45]), kasvatettiin DMEM: ssä, supplememented 10% FBS, 1% L-glutamiinia ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAAs). Nämä solut ovat vuotaneet tarvittaessa käyttäen standardia trypsiini-EDTA-protokollaa.

Cytoglobin Knockdown

NE-1 soluja tai CCD-18Co solut alikasvatettiin kuuden kuoppalevyillä (Komeetta määritys) tai kahdentoista kuoppalevyille (ROS määritys ja haavan paranemista määritys), ja sen annettiin saavuttaa 60-70% konfluenssiin ennen transfektiota. Solut transfektoitiin 25 nM lopullinen pitoisuus joko negatiivinen kontrolli salattu siRNA (Ambion, AM4611) tai CYGB siRNA (Qiagen; SI03228323 tai Ambion, s41571) käyttäen 15 ug ml

-1 TransIT siQuest reagenssia (Mirus Bio) mukaisesti valmistajan ohjeita. Sen jälkeen RNAi Knockdown, soluja inkuboitiin 42 tuntia ennen kokeiden suorittamista (24 tuntia haavan paranemista kokeilu). Expression of CYGB määritettiin RT-PCR: llä (katso alla).

yli-ilmentyminen cytoglobin

TE-8 ruokatorven okasolusyöpä soluja alikasvatettiin kuusi- tai kahdentoista kuoppalevyillä, kuten aiemmin. Ohimenevä transfektio on

CYGB

toteutettiin Transit 2020 transfektioreagenssin (Mirus Bio) (2 ui tai 5 ui per kuoppa 12-kuoppaisille tai 6-kuoppaisilla levyillä vastaavasti), ja täyspitkä

CYGB

cDNA-klooni on pCMV6-AC vektorin (Origene) (0,6 ug tai 1,5 ug 12-hyvin tai 6-kuoppaisilla levyillä vastaavasti), kohti vakioprotokolla transfektioreagenssi. Transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 42 tuntia ennen kokeiden suorittamista. Expression of CYGB määritettiin RT-PCR: llä (katso alla).

RNA, ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi ja RT-PCR-analyysi

eristäminen kokonais-RNA: ta suoritettiin käyttäen RNeasy Minikit ( Qiagen) on suora hajotus viljelmän soluista levy, ja homogenointi käyttäen QIAshredder putkia. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen RETROscript Kit (Ambion) kanssa, oligo-dT-alukkeita ja 1 ug kokonais-RNA: ta, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-PCR Master Mix, joka sisälsi TaqMan 2 x master mix (Applied Biosystems), β-aktiini VIC /MGB koetinta endogeenisen ohjaus (Applied Biosystems 4326315E), CYGB pohjamaali ja koetinseosta (sense 5′-CTC TAT GCC AAC TGC GAG GAC-3 ’, anti-sense 5′-AAC TGG CTG AAG TAC TGC TTG-3′ ja koetin FAM-5′- TGG CCA TCC TGG TGA GGT TCT TTG TG-3’-musta aukko sammuttaja) RNaasi vapaata vettä. Standardi kaksivaiheista protokollaa käytettiin reaaliaikaista RT-PCR-analyysi (50 ° C 2 minuuttia, jota seurasi 50 sykliä 95 ° C: ssa 15 minuuttia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti). Cycle Threshold (Ct) arvoja käytettiin laskettaessa reaaliaikaisen kvantifioinnin arvo (RQ) hyödyntämällä ΔΔCt menetelmä, jossa ACTB Ct-arvoja ja käsittelemättömät /transfektoimattomilla soluja käytetään normalisointikertoimia.

FPG muutettu komeetta määritys

menetelmä perustuu jonkin Singh et al [46] pienin muutoksin. [47] Käsittelyn jälkeen solut pestiin kylmällä PBS: llä ja raaputettiin hellävaraisesti 1 ml tuoretta PBS: ää (TE-8-soluista) tai trypsiinillä (NE1 solut). Sentrifugoinnin jälkeen (8000 rpm, 5 minuuttia), pelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään (150 ui). Alikvootti uudelleen suspendoidut solut (30 ui) pantiin steriiliin putkeen, joka sisältää alhaisessa lämpötilassa sulavaa agaroosia (300 ui) ja tätä solususpensiota siirrettiin kahden lasin mikroskoopin (150 ui per slide), jotka oli esipäällystetty 0,5% normaali sulavaa agaroosia. Lasipeitinlevyille lisättiin ja liukuu sijoitettava metallisen alustan yli jäillä 10 minuutin ajan. Peitelaseja poistettiin ja levyt inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa lyysipuskuria (2,5 M NaCl, 0,1 M Na

2EDTA, 10 mM Tris-emästä, 1% natrium-N – lauryylisarkosinaatti, 10% DMSO: ta ja 1% Triton X -100). Objektilasit pestiin (3 x 5 minuuttia) ja FPG puskuri (40 mM HEPES, 0,1 M KCI, 0,5 mM EDTA: ta 0,2 mg /ml naudan seerumin albumiinia, pH 8,0) ja inkuboitiin 1 yksikön FPG entsyymin (Trevigen) 50 ul: ssa FPG-puskuria 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan (kontrolli Levyjä inkuboitiin FPG vain puskuria). Dioja siirrettiin vaakasuoraan elektroforeesisäiliöön sisältävät elektroforeesin-puskuria (300 mM NaOH: a ja 1 mM Na-

2EDTA, pH 13,0), ja DNA: n annettiin rentoutua 20 minuutin ajan. DNA tehtiin elektroforeesi (25 V, 0,8 V cm

-1, 20 minuuttia) ja liukuu neutraloitiin pesemällä (3 x 5 minuuttia) ja neutralointi puskuria (0,4 M Tris, pH säädettiin arvoon 7,5). Objektilasit jälkeen värjättiin SYBR Gold 50 ui (Invitrogen, 10 × liuos neutralointi puskuri).

Objektilasit tutkittiin 320 x suurennus fluoresenssi (Zeiss Axiovert 10, Saksa), on varustettu 515 -560 nm: n virityksellä suodata ja este suodatin 590 nm. USB digitaalikamera (Merlin, Allied Vision Technologies) sai kuvia, jotka analysoitiin tietokoneella perustuvan kuvan analyysijärjestelmä Comet määritys IV (Perceptive välineet). Kuvia sadan satunnaisesti valitun ytimiä analysoitiin per slide. Mittaus prosenttia hännän DNA (TD%) valittiin laajuuden arvioimiseksi DNA-vaurioita kuin tämä on osoitettu kärsivät paljon vähemmän inter-run vaihtelua kuin muut komeetta parametrit, koska se on pitkälti riippumaton elektroforeesin jännitteen ja ajoaika [48] . Mediaaniarvot kolmen erillisen kokeen analysoitiin ANOVA ja post-hoc Studentin t-testiä, kuten suositeltiin DUEZ et al [49].

ROS määritys

reaktiivisia happiradikaaleja arvioitiin mittaamalla hapettuminen redox herkkä väriaine 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H2DCF-DA). Hydrolyysin jälkeen solunsisäisten esteraasien, tuloksena H2DCF ei pysty poistumaan solusta ja hapetetaan sitten ROS muodostamiseksi fluoresoiva DCF-molekyylin. Fluoresenssin taso on verrannollinen oksidatiivisen stressin soluissa. Jotta saadaan aikaan oksidatiivista stressiä keinotekoisesti, butioniinisulfoksimiini (BSO), joka estää nopeutta rajoittava vaihe glutationin synteesissä, lisättiin viljeltyihin soluihin 24 tuntia ennen koetta 100 tai 1000 uM.

lyhyesti, seuraavat käsittelyt 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (lopullinen konsentraatio 10 uM TE-8-soluista; 1 uM tai 0,1 uM NE1 solua) lisättiin ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Solut irrotettiin trypsinoinnilla, pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Näyte fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin (FITC-kanava) käyttäen FACScalibur ™ virtaussytometria (Becton Dickinson) ja CellQuestTM Pro -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Solut ilman fluoresoivaa väriainetta käytettiin negatiivisena kontrollina korjaamaan tausta autofluoresenssi.

haavan paraneminen Pitoisuus

NE1 ruokatorven keratinosyyttisoluja ja CCD-18Co paksusuolen myofibroblasteja kasvatettiin Kahdentoista kuoppalevyille, ja altistettiin RNAi knockdovvn CYGB kuten aiemmin on kuvattu, käyttäen sekä Ambion ja Qiagen siRNA: t ja CYGB, ja salattu ohjaus siRNA. Jokainen ehto toistettiin kuusi kertaa kunkin solulinjan. Solu kerros naarmuuntunut ristin muotoiseksi käyttämällä steriiliä pipetin kärki 24 tunnin kuluttua knockdown. Solut valokuvattiin 1, 25 ja 50 tuntia haavan tekemisen USB digitaalikamera. Kuvat analysoitiin TScratch ohjelmistojen [50], jossa analysoitiin muutoksia prosenttiosuuden Tyhjövalettu Area (OWA).