Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpää yleisesti osoittavat geneettistä poikkeamia fosfatidyyli 3-kinaasi signalointireitin. Tässä olemme seulotaan mutaatioiden

PIK3R1

, joka koodaa p85α, yksi säätelyalayksiköt PI3K. Kaksisataa ja kuusikymmentäneljä virtsarakon kasvaimia ja 41 virtsarakon kasvainsolulinjoja seulottiin ja 18 mutaatioita havaittiin. Kolmetoista mutaatiot olivat C-terminaaliset domeenit, ja ennustetaan häiritsevät vuorovaikutusta p85α ja p110α. Viisi mutaatiot olivat BH alalla PIK3R1. Tämä alue on liitetty p110α riippumaton roolit p85α, kuten sitoutuminen ja muuttamalla toimintaa PTEN, Rab4 ja Rab5. Expression näistä mutantti BH-p85α muotoja hiiren alkion fibroblastien p85α Knockout osoitti, että kaikenlainen, paitsi katkaisu mutantit, voi sitoa ja vakauttaa p110α mutta ei kasvanut AKT fosforylaatiota, mikä viittaa siihen, että BH mutaatiot toimivat itsenäisesti p110α. Paneelissa 44 virtsarakon tuumorisolulinjoja, 80% oli alentunut PIK3R1 mRNA: n ilmentymisen suhteessa normaaliin urothelial soluihin. Tämä yhdessä mutaatio

PIK3R1

, voi muuttaa BH domain toimintaa. Tuloksemme viittaavat siihen, että mutantti-muodot p85α voi olla onkogeenisen rooli virtsarakon syöpä, ei vain kautta menetys kyky säädellä p110α mutta myös kautta muuttuneeseen toimintoon BH verkkotunnuksen.

Citation: Ross RL, Burns JE, Taylor CF, Mellor P, Anderson DH, Knowles MA (2013) tunnistaminen Mutaatiot Erilliset alueiden p85 Alpha uroteelisyöpä. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10,1371 /journal.pone.0084411

Editor: Karl X Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2013; Hyväksytty: 18 marraskuu 2013; Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Ross et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tarjoamat Yorkshire Cancer Research (https://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) ja University of Leeds MRC stipendi (MK, RR), Kanadan Institutes of Health Research (http: //www.cihr-irsc.gc. ca /e /193.html) (MOP84277) (DA), ja Saskatchewan Health Research Foundation Fellowship (https://shrf.ca/)(PM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) signalointireitin on keskeisessä asemassa sääntelyn solujen kasvua, lisääntymistä ja selviytyminen [1] ja mutaatioita, jotka johtavat poikkeavaan aktivoitumisen reitin löytyy lähes kaikenlaisten syöpä. In urothelial karsinooma (UC) virtsarakon, useita genomista muutoksia, jotka johtavat vapauttamisen koulutusjakson on tunnistettu. Näitä ovat inaktivoivat mutaatiot

PTEN

ja

TSC1

ja aktivoivia mutaatioita

PIK3CA

ja

AKT1

[2,3,4,5,6, 7,8]. Aiemmin olemme osoittaneet, että useat näistä tapahtumista ovat ei-tarpeeton, viittaa siihen, että mutaatio on useampi kuin yksi reitti jäsen voi olla additiivinen tai synergistinen vaikutus [4]. Näitä muutoksia esiintyy sekä matala-asteista, ei-invasiivisia ja lihas-invasiivisia UC, mikä osoittaa, että tämän reitin on ratkaiseva merkitys UC kehittämiseen ja viittaa siihen, että se on merkittävä terapeuttinen tavoite näiden syöpien.

PI3 kinaaseja fosforyloida 3` kantaa inositoli rengas phosphinositol-4,5-bifosfaatin (PIP2) tuottamaan lipidien toinen messenger phosphinositol-3,4,5-trifosfaatti (PIP3), joka aktivoi AKT alavirran signalointia. Luokan IA PI3Kαis obligatorinen heterodimeeri, joka koostuu p110αcatalytic alayksikön (p110α), jota koodaa

PIK3CA

-geenin, ja säätelyalayksikön, jota koodaa yksi 3 geeneistä,

PIK3R1, PIK3R2

ja

PIK3R3

. Sääntely alayksiköt ovat välttämättömiä vakauden p110α ja lepotilassa tukahduttaa sen katalyyttinen aktiivisuus [9]. Jokaisella on kaksi SH2-domeenia, joka voi sitoutua aktivoida kalvoon sitoutuneita kasvutekijäreseptoreita tai sovittimen molekyylejä, jotka muuttavat sen konformaatio, lievittää estyminen p110α ja mahdollistaa p110α fosfory- PIP2 [10].

mutaatiot

PIK3R1

, koodaus p85α, on raportoitu joidenkin syöpien. Hiirillä lymfooman aiheuttama X-säteilytys, typistetyn (p65), joka sisältää vain aminohappoja 1-571 tunnistettiin ja osoitettiin antaa lisääntynyt

in vitro

kinaasiaktiivisuuden on p110α [11]. Tämän katkaistun muodon p85α osoitettiin myöhemmin ei ole kriittinen inter-SH2 (iSH2) alue tarvitaan inhibition p110α toimintaa [12]. Samanlainen typistetty muoto on raportoitu ihmisen Hodgkinin lymfooman solulinjassa [13] ja 4 pienempiä deleetioita, eksonien 14 ja 15, jotka koodaavat iSH2 alueella, munasarjojen ja paksusuolen syövissä [14]. Kaksi silmukoinnin mutaatioita on havaittu myös, jotka molemmat johti eksonin 15 ilmentäminen näistä mutanttimuotojen, joissa oli deleetio eksonista 13 johti konstitutiivisen aktivaation PI3K reitin soluissa, jotka osoittavat, että mutantin p85 voi toimia onkogeeni ihmisen syövässä. -A-9 bp: n poistuman kattaa eksonin-intronin risteyksessä eksonin 12 [15], ja 9 muiden mutaatioiden, joista 8 on iSH2 alueella havaittiin glioblastoomat [16] ja 15 mutaatioita havaittiin paksusuolen syöpä, joista suurin osa oli osoitettu vähentävän sen p110α inhiboiva aktiivisuus säilyttäen samalla kyky stabiloida monimutkaisia ​​[17]. Yksi

PIK3R1

mutaatio äskettäin raportoitu tutkimus UC että seulotaan eksonit 12, 14 ja 15, ( 1% taajuus) [18]. Vastakohtana näille alhaisen mutaatio taajuuksia, se on viime aikoina raportoitu, että 20 – 40%, ja endomet- kohdun limakalvon syöpien sisältävät

PIK3R1

mutaatioita, enemmistön nSH2 ja iSH2 verkkotunnuksia [19,20].

edelliset havainnot mutaatioiden useissa komponentit PI3K väylän UC, ja toteamista

PIK3R1

mutaatiot muissa syöpätyypeissä, sai meidät etsimään mutaatioita

PIK3R1

. Todisteeksi on ilmennyt, että N-terminaaliset domeenit p85α on onkogeenisten toimintoja, päätimme näytön koko koodaava sekvenssi

PIK3R1

sijaan keskittyä eksonit 12, 14 ja 15. Tässä me raportoimme sarja mutaatiot UC-solulinjat ja ensisijainen UC kasvaimia, mukaan lukien deleetioita iSH2 alueella ja sarjan missensemutaatioita useat vuonna keskeytyskohta klusterin alueen homologia (BH) domain, joka on GTPaasi aktiivisuutta Rab5 [21] ja voivat sitoa PTEN [22,23]. Tuloksemme viittaavat siihen, että mutantti-muodot p85α voi olla onkogeenisen rooli virtsarakon syöpä, ei vain kautta menetys kyky säädellä p110α mutta myös kautta muuttuneeseen toimintoon BH verkkotunnuksen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksynyt Leeds East Research eettisen komitean (99/156) ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Patient Näytteet ja DNA Isolation

Kylmä kuppi koepaloja 264 urothelial karsinoomien (UC) kerättiin, snap-jäädytetään ja säilytetään nestemäisessä typessä. Loppuosa kudos upotettiin parafiiniin diagnostisia arviointia. Kasvain paneeli koostui 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 pT2G3, 5 G1, 8 G2 ja 4 G3 kasvaimet ilman taustalla stroman (PTX) ja 11 kasvaimet ilman tietoja [24,25]. Kaikki olivat siirtymäkauden cell carcinoma. DNA uutettiin jää- leikkeitä ja laskimoiden verinäytteitä kuten aikaisemmin on kuvattu [4].

urothelial solulinjoja

Neljäkymmentäneljä UC solulinjoissa (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97-24, 97-7, BC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, JO’N, KU -19-19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, SCaBER, SD, SW780, SW1710, T24, TCCSUP, U-BLC1, UM-UC3, VM -CUB-1, VM-CUB-2 ja VM-CUB-3) tutkittiin (taulukko S1). LUCC1-LUCC8 linjat perustettiin kirjoittajien laboratoriossa virtsarakon kasvain kudosten kanssa kirjallinen lupa. Solulinja identiteetti varmistettiin lyhyellä tandem repeat DNA-tyypitys käyttäen Powerplex 16 Kit (Promega). Profiilit verrattiin julkisesti saatavilla olevien tietojen (ATCC, DSMZ), tai kun ei vertailuprofiiliin ollut saatavilla, vahvistettiin niin ainutlaatuinen. DNA uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [4].

mutaatioanalyysi

koko koodaava sekvenssi

PIK3R1

tutkittiin 18 fragmenteista korkearesoluutioisia sulamisanalyysimetodologioilla, kuten on kuvattu [26 , 27]. DNA täsmäsi verinäytteistä analysoitiin vahvistaa somaattisen mutaation tila. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S2. Mutaatiot kirjattiin viitaten NM_181523.

Alleelispesifisiä PCR (AS-PCR) suoritettiin vahvistaa vaihe paria mutaatioiden solulinjan LUCC3 ja kasvaimen näyte 2 (taulukko 1). Eteenpäin-aluke suunniteltiin erityisesti monistamaan mutantti alleeli on 5` mutaation ja oli sovitettu käänteinen aluke on sijoitettu sisällä toista mutaatio PCR-tuote (taulukko S3). Tuotteet ajettiin agaroosigeelillä tunnistaa onnistunut vahvistus kasvain /solulinjasta DNA, eikä mitään vahvistusta verestä ja WT DNA. PCR-tuotteet Sekvenssivarmistettu.

Näyte

Grade /vaihe

eksoni

nukleotidimuutos

Ennustettu aminohapon muutos

1TaG32

1c..409G AE137K2TxG35c.652GT E218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310

2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W

3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 liitos acceptorc.1986-1 G Cunknown Taulukko 1. Mutaatiot PIK3R1 tunnistettu rakkokasvaimista ja solulinjoissa.

1cDNA referenssijaksoa: NM_181523;

2 mutaation vain pieni populaatio sekvenssit;

3cell linja. CSV Lataa CSV

Ekspressiovektorit ja transduktio solulinjojen

kloonaus insertit koodaavan täyspitkää villin tyypin (WT) ihmisen p85α ja naudan p85α R274A mutantti pGEX-6P (GE Healthcare Life Sciences) on kuvattu [21]. Mutantit E137K, R162 *, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q luotiin kohdennetulla mutageneesillä käyttäen QuikChange-menetelmää (Stratagene, CA, USA) ja kloonattiin pFB Hyg [28] in-kehyksen N-terminaalisen HA-tag käyttäen InFusion menetelmää (Clontech, CA, USA).

Ohjaus cDNA, N564D ja p85Δ, oli ystävällisesti Genentech [17] ja subkloonattiin pFB Hyg samalla menetelmällä. Kaikki plasmidit olivat Sekvenssivarmistettu. Rakenteet transfektoitiin Phoenix soluihin käyttämällä TransIT 293 (Mirus, Madison, USA). Hiiren alkion fibroblasteja (MEF), jossa tyrmäys p85α, β, δ (ystävällinen lahjoitus Lewis Cantley, Harvard Medical School), NIH3T3 hiiren fibroblasteissa ja RAT1 rotan fibroblastien, inkuboitiin retrovirussupernatanttia sisältää 8 ug /ml polybreeniä ja valitaan 500 , 200 ja 250 ug /ml hygromysiini, vastaavasti.

toiminnallinen luonnehdinta BH verkkotunnuksen mutanttien

Solut hajotettiin ja proteiini uutettiin käyttämällä CelLytic Mammalian Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) mukaan valmistajan ohjeiden ja määrälliset kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Anti-HA-immunosaostus Kit (Sigma-Aldrich) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeita co-immunoprecipation kokeissa. Immunoblotattu proteiinit inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla; anti-p85α (Abcam, Cambridge, UK), anti-p110α, anti-Pakt (Ser473), anti-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, UK) ja anti-tubuliinin alfa (ABD Serotec, Kidlington, Oxford, UK). Sitoutuneet ensisijainen vasta-aineet detektoitiin käyttämällä HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore, Watford, UK). Ankkurista riippumaton kasvu suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29], ja pesäkkeet, joiden halkaisija on ≥50 um laskettiin kuluessa 2,5 mm

2.

Analyysi PIK3R1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen UC

PIK3R1 mRNA ilmaisun tietoja 105 virtsarakkokasvain näytteitä ja 52 normaalia virtsarakkonäytteet raportoineet Sanchez-Carbayo ym [30] oli näytetty. PIK3R1 proteiinin ilmentyminen arvioitiin 44 UC solulinjoissa ja yhdistettiin normaalin ihmisen urothelial soluja (NHU-pool) western-blottauksella ja normalisoitu tubuliiniin.

Tulokset

tunnistaminen somaattisten

PIK3R1

mutaatiot

seulotaan koko koodaava sekvenssi

PIK3R1

mutaatioita 264 UC kasvainkudoksissa ja 41 UC solulinjat. Kolme tunnettua isoformeja PIK3R1, p85α p55α ja p50α sisältävät erilaisia ​​eksonia. Eksonit 1-6 ovat ainutlaatuisia p85α, eksoni 7 on läsnä vain p50α ja eksonissa 8 vain p55α. Eksonit 9-17 esiintyy kaikissa isoformeja, mutta käyttämällä kryptisen silmukointikohdan eksonissa 16 johtaa sukupolven cDNA jotka eroavat pituudeltaan 8 kodonit [31], jotka molemmat kuuluvat tämän ruudun. Kahdeksantoista mutaatioita tunnistettiin 13 kasvaimissa. Yksi tuumori (kasvaimen 2) sisälsi kolme ja yksi (kasvain 5) sisälsi kaksi mutaatiota (taulukko 1). Kaikki olivat vahvistettu somaattisista mutaatioista niiden läsnäolo kasvain- DNA mutta ei potilaan veressä. Yksi kasvainperäinen solulinja (LUCC3) sisälsi kaksi mutaatiota ja nämä olivat myös vahvistettiin somaattisen alkuperää. Kaikki mutaatiot vahvistettiin toistamalla PCR-monistukset poissulkemiseksi PCR esineitä. Luonne ja jakauma mutaatioiden on esitetty suhteessa p85α proteiinien rakenteeseen kuviossa 1. Viisi sijaitsivat BH domain (kuva S1). Yksikään ei ollut eksoneissa, jotka ovat ainutlaatuisia p50α tai p55α, vaikka useita sijaitsivat eksonien 2, 5 ja 6, jotka ovat ainutlaatuisia p85α. Ei mutaatioita tunnistettiin alueella eksonin 16, joka on vaihtoehtoisesti saumattu.

Alleelispesifisiä PCR (AS-PCR) käytettiin määrittämään, onko 2 mutaatiot solulinjassa LUCC3 (c.1519GC ja c.1670GC, E507Q ja R557P) ja 2 eksoni-mutaatiot kasvain 2 (c.652GT ja c.862AC, E218 * ja K288Q) oli läsnä

cis

tai

trans

. In LUCC3, mutaatio-aluke ja c.1519C monistettiin onnistuneesti PCR-tuote eksonista 13-14 (kuvio S2A). Sekvensointi tämän tuotteen varmisti mutaation c.1670C, mikä osoittaa, että molemmat iSH2 mutaatioista ovat samassa alleeli. AS-PCR-analyysi kasvaimen 2 vahvisti myös, että 2 eksoni mutaatiot (BH domain E 218 * ja K288Q mutaatiot) olivat läsnä samassa alleelin (kuvio S2B).

kasvain 5, sekvenssi profiilit osoitti, että yksi mutaatioista (R358 *) oli läsnä vain vähäinen molekyylien populaatiossa, kun taas toinen (Q579_Y580del) ilmestyi heterotsygoottinen. Genominen välinen etäisyys eksonien 10 ja 14 esti kehittäminen alleeli-spesifinen PCR-määritys sen määrittämiseksi, onko nämä mutaatiot olivat samalla alleeli. Pieni signaali R358 * mutaatio voi ilmoittaa, että se oli läsnä vain pieni osa uniklonaalisten tapahtuma. Tämä näytti olevan näin, koska analyysi kudosta myöhemmin uusiutunut tässä potilasryhmässä osoitti vain Q579_Y580del.

Arvioitu vaikutus mutaatioiden Protein Function

asennot missense mutatoitunut tähteitä, ovat edustettuina käytettävissä kiderakenne on esitetty kuviossa 2. Kaksi mutaatiota, R358 * ja N377K, tunnistettiin nSH2 domain. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että tällä alueella p85α toimii tukirakenteen p110α – p85α kompleksi, jossa vuorovaikutus C2, kierteiset ja kinaasi domeenien p110α ja p85α iSH2 [32]. R358 * katkaisee proteiini on nSH2 Phosphopeptide sitoutumiskohta (FLVRDAS). Tämä sama mutaatio äskettäin raportoitiin 5 endometriumsyöpään näytteitä, jos se edusti 5% kaikista mutaatioista tunnistettu [20]. Arginiini 358 on tunnistettu muodostamalla suola silta E542 on p110α [32] ja suunniteltu mutaatio R358A on osoitettu poistamaan fosfopeptidi sitovia [9]. Siten menetys R358 ja katkaisu tässä vaiheessa todennäköisesti aiheuttaa häiriöitä Phosphopeptide sitoutumisen ja vuorovaikutus p85α kanssa kierteisen verkkotunnuksen p110α ja voi jäljitellä vaikutus p110α kierteisen mutaatioista. Olemme osoittaneet aiemmin, että kierteisen mutaatioista E542K ja E545K ovat ylivoimaisesti yleisin mutaatiot löytyy

PIK3CA

virtsarakon syöpään [4] ja ovat tehokkaampia kuin H1047R indusoimisessa signalointi alavirtaan AKT ja uudiskasvua yhtymäkohta ja olosuhteissa ravinteiden ehtyminen kun ilmentyy normaaleissa urothelial soluissa [29]. Kuten R358X katkaisu mutantti poistaa sekä iSH2 ja cSH2 alueiden proteiinin, vuorovaikutus C2-domeenin p110α on menetetty, ja vaikutukset voivat jäljitellä niitä on kuvattu mutaatioita ja typistyksiä vaikuttavat nämä domeenit [33]. Vuodesta sekvenointitulosten, ja tieto siitä, että siellä oli vähän kontaminoivaa normaalia kudosta näytteessä, tämä mutaatio näytti olevan heterotsygoottinen. Näin ollen on odotettavissa, että sen lisäksi, että katkaistun proteiinin, ei-mutantti proteiini oli saatavilla p110α sitoutumisen ja stabilointi tämän kasvain.

. Nauha kaavio rakenteesta monimutkainen p110α kanssa niSH2 alueen p85α (PDB-koodi 2RD0) osoittavat tähteet mutatoitiin UC. B. suhde p85α nSH2 jotta p110α C2 domain osoittaa läheisyys N377 vuonna nSH2 C2 domain jäämien E365. C. suhde iSH2 verkkotunnus p85α kanssa C2 verkkotunnuksen p110α osoittaa läheisyys R557 ja N345 C2. D. Space täyttö malli osoittaa R481 ja R557 jäämiä iSH2 of p85α joutuessaan C2 p110α. E. rakenne p85 dimeerin (ATE koodi 1PBW) osoittaa aseman PIK3R1 piste-mutatoitunut tähteet E137, R262 ja K288 ja alue poistetaan (W237-Y242) UC suhteessa osallistuvat tähteet p85 dimerisaation (M176, tummanvihreä /valo syaani, L161, I177 ja V181, vaaleanvihreä /syaani). Asema Jäännös R274 (magenta), joka on liitetty Rab-GAP aktiivisuus on myös esitetty. Lisäksi kolme glutamiinihappotähteissä (E266, E284 ja E291), jotka ovat vuorovaikutuksessa R262 on merkitty, ja E291 myös vuorovaikutuksessa K288.

N377, joka oli mutatoitu lysiini, on lähellä G376, joka oli havaittu aikaisemmin on mutatoitu arginiiniksi 3 tapauksissa glioblastooma [16,34]. Molemmat tähteet sijaitsevat alueella (374-377), joka on ennustettu olevan vuorovaikutuksessa tähteiden 364-371 C2-domeenin p110α [32]. Kiderakenne on p110α kompleksina p85niSH2, sekä G376 ja N377 ovat vetysidoksen etäisyydellä E365 on p110α C kuviossa 2B.

Kuusi missensemutaatioita ja kaksi-frame deleetiot tunnistettiin iSH2 domain. Tämä on alue, jossa suurin osa mutaatioita on löydetty muissa syövissä, mutta yksikään muutokset täältä ovat samat kuin on raportoitu aiemmin [14,16,17,19,20]. Tämä alue on mukana proteiinia vuorovaikutuksessa sovittimen sitova alue p110α ja vakauttamisessa sekä estämällä sen katalyyttinen aktiivisuus pohjapinta tilassa kautta vuorovaikutus C2 domain. Ennustettu vaikutus joidenkin mutaatioiden iSH2 on häiritä rajapinta p110α C2 [16,33]. Esimerkiksi, p85α jäännös, N564, sijaitsee vetysidoksia etäisyys N345 on p110α C2 (kuvio 2C), jäännös, joka on löydetty mutatoitunut p110α [35]. D560Y raportoitu glioblastoma [16] sijaitsee myös vetysidoksen etäisyydellä N345 ja molemmat ennustetaan siksi jäljitellä onkogeenisen N345 mutaation. Tässä löysimme uuden mutaation, R557P joka on myös lähellä N345 of p110α (kuvio 2C). R481, joka todettiin mutatoitu tryptofaani, on myös lähellä C2 verkkotunnuksen p110α kuvio 2D).

Kaksi lukukehyksessä deleetiot tunnistettu iSH2 (I566_D578del ja Q579_Y580del) poistaa aminohappotähdettä, jotka ovat todettu poistetaan munasarjojen ja peräsuolen syöpiä [14,17] ja glioblastooma [16] ja ennustetaan häiritä kierteisen sekundaarinen rakenne tällä alueella ja häiritä vuorovaikutusta p110α C2. Mutaatio Q579_Y580del on raportoitu sitovan ja vakauttaa p110α, mutta on vähentynyt kyky säädellä rasva kinaasiaktiivisuutta p85α p110α holoentsyymin [17]. Äskettäin yhdeksän nSH2 ja iSH2 mutaatiot löydetty muita syöpiä ilmaistiin kanan alkion fibroblasteissa ja kaikki aiheuttama muutos mitattuna painopiste muodostava aktiivisuus, lisääntynyt leviäminen ja tehostaa signaloinnin kautta PI3K [36]. Spesifiset inhibiittorit p110α, mutta ei inhibiittorit p110β p110γ tai p110δ poistettiin fenotyyppivaikutukset näistä kahden kasvain- mutanttimuotoja (KS459delN, DKRMNS560del), mikä osoittaa, että kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden näiden mutanttien on ainutlaatuisesti välittyy p110α.

N-päätä iSH2 mutaatiosta, N441I, on linkkeri välisellä alueella nSH2 ja iSH2, ja sijaitsee lähellä loppuun toisen alfa-heliksin iSH2. Tämä alue ei ratkaista julkaistun kiderakenteet ja sen mahdollinen vaikutus ei ole selvä. T654I on cSH2 verkkotunnus on lähellä useita tähteitä, joita mutatoitunut kolorektaalisyövissä [17] ja on välittömässä läheisyydessä FLVRES motiivi (tähteet 646-651) tarvitaan fosfotyrosiinille sitoutumista. Seriini- tai treoniinitäh- tässä asennossa löytyy SH2-domeenia monenlaisia ​​proteiineja. Useat mutaatiot tällä alalla on raportoitu paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [17], mutta ei glioblastoma [16,34], nostaa sitä mahdollisuutta, että voi olla kudosspesifisiä eroja.

Mielenkiintoista on, löydettiin viisi mutaatioita BH verkkotunnus PIK3R1 (28% mutaatioiden havaittu) (Kuva 1, Kuva S1). Aiemmat mutaatio näytöt ovat tunnistaneet vasta seitsemän mutaatiot tällä alueella (K142fs, E160 *, R162 *, I177N, E217K, N285H, E297K) yli 1550 näytettä muita kasvaimia raportoitu tähän mennessä [14,16,17,18,19, 20,34] ( 0,5%). Kaikki missensemutaatioita tällä alueella (E137K, R262T ja K288Q) ovat erittäin konservoituneita tähteitä (kuva S3). Rakennetta tällä alueella proteiinin (aminohapot 105-319), homodimeerinä on raportoitu [37]. Rajapinnassa BH domeenien on osoitettu olevan osallisena vuorovaikutus M176 yhden monomeerin kanssa L161, I177 ja V181 toisaalta. Kolme pistemutaatiot ja poisto tunnistettu täällä ovat kaukana tämän alueen vuorovaikutuksen (kuvio 2E).

P85α BH verkkotunnuksen mutantteja vuorovaikutuksessa ja vakauttaa p110α

Voit selvittää BH verkkotunnuksen mutanttiproteiineilla on p110α riippuvia vaikutuksia, testasimme niiden kyky olla vuorovaikutuksessa ja vakauttaa p110α. p85α, β δ knockout (pan-p85 null) MEF oli transdusoitu retroviraaliekspressiovektoreiden koodaavat N-pään HA-tagged p85α koodaavan cDNA BH verkkotunnuksen mutanttimuotoihin tunnistettu UC (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), muut mutanttimuodot kontrolleina (R162 *, p85Δ, R274A-naudan, N564D), villityypin (WT) tai tyhjän vektorin. R162 * mutantti p85α on BH verkkotunnuksen mutaatio aikaisemmin tunnistettu syöpää [17] ja kuten p85Δ puuttuu p110α sitova alue (n-iSH2) [38]. Molemmat on aiemmin osoitettu, ettei vuorovaikutuksessa p110α [17]. N564D iSH2 mutantti p85α käytettiin positiivisena kontrollina, sillä se on aiemmin osoitettu sitoutuvan p110α, lisätä PI3K ja AKT-vaikutusta, ja aiheuttaa solujen eloonjäänti, ankkurista riippumaton kasvu ja muuttuminen liittyviä fenotyyppejä, jotka olivat p110-riippuvainen [17]. Sitä käytettiin myös tässä voidaan arvioida mahdollisia eroja BH ja iSH2 verkkotunnuksen mutanttimuotojen p85. R274A on suunniteltu BH domeeni mutantin muodossa naudan p85α, joka on aiemmin osoitettu estävän p85-GAP aktiivisuutta ja oli onkogeenisten [21,39].

Expression of p85α vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 3A). Typistetty p85α proteiini näkyi R162 * -MEF (18 kDa), mutta E218 * -MEF, katkaistun proteiinin (24 kDa), ilmaistiin hyvin alhaisella tasolla. Kolme riippumatonta transductions kanssa E218 * virus aiheutti johdonmukaisesti alhainen proteiinin ilmentymisen viittaa siihen, että tämä proteiini voi olla epävakaa. Mielenkiintoista on, että R162 * -MEF ilmaisivat myös pieni määrä täyspitkän p85α proteiinia.

. Immunoblot, joka esittää p85α proteiinin ekspressiotasot transdusoiduissa soluissa. B. Co-immunosaostus HA-merkityille proteiineille, jota seuraa immunoblottaus kanssa p85α ja p110α määrittää p85-p110 sitova. C. immunoblottianalyysi PI3K signalointia (tasot Pakt (Ser473)) seerumin sisältävässä väliaineessa ja pylväsdiagrammi näyttää määrällinen normalisoitu Pakt kokonaismäärään AKT suhteessa kontrolliin. D. immunoblottianalyysi Pakt (Ser473) seerumin sisältävässä väliaineessa ja pylväsdiagrammi näyttää määrällinen normalisoitu Pakt kokonaismäärään AKT suhteessa kontrolliin.

Pan-p85 null MEF on alhainen p110α, joka voidaan palauttaa ilmentymistä villityypin p85α [40]. Tämä vahvistettiin, ja osoittivat, että kaikki mutanttimuodot paitsi E218 *, R162 * ja p85Δ oli sama vaikutus (tuloksia ei ole esitetty). Co-immunopreciptation HA-merkitty p85-proteiinien käytettiin arvioimaan p110α sitoutumiseen (kuvio 3B). Tulokset osoittivat, että kaikki p85 proteiineihin kuin E218 *, R162 * ja p85Δ voisi sitoa p110α.

BH ja iSH2 verkkotunnuksen mutantteja p85α näyttää erilaisia ​​vaikutuksia AKT aktivointia ja ankkurista riippumaton kasvu

p85α C-terminaalista domeenia mutanttimuotoja vaikuttavia p110α toimintaa normaalisti johtaa aktivoitumiseen AKT. Tämä on osoitettu jo useita p85α mutantteja, jotka voivat sitoutua p110α [17,19,20]. Pannulla-p85 null MEF liuotetaan villin tyypin ja mutanttimuotojen p85α, olemme havainneet, että ainoastaan ​​N564D mutantti indusoi kohonneet fosfo-AKT (Ser473) sekä seerumia sisältävässä alustassa (kuvio 3C), ja olosuhteissa seerumin -deprivation (tuloksia ei ole esitetty). Tämä nähtiin myös NIH3T3 ilmentävät villin tyypin ja mutanttimuotojen p85α kun ylläpidetään seerumittomassa täydennetty olosuhteissa (kuvio 3D). Tämä on yhdenmukainen aiempien havainto NIH3T3 että naudan R274A ei vaikuta fosforylaation AKT stimulaation jälkeen PDGF [21]. Tämä malli näkyi leviämisen hinnat MEF ja NIH3T3-solut, kun ylläpidetään seerumia sisältävässä väliaineessa ja arvioitaessa kiinnittymisestä riippumatonta kasvua NIH3T3-solut (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi kiinnittymisestä riippumattoman kasvun RAT1 soluja, jotka ilmentävät villi- tyypin ja mutanttimuotojen p85α osoitti, että vaikka BH domain-mutanttien indusoima joitakin pesäkkeiden muodostumista verrattuna villityypin p85α, N564D oli suurin vaikutus (kuvio S4).

Suhde muihin mutaatioita PI3K koulutusjakso geenien

Aiemmin seulotaan analysoidut näytteet tästä

PIK3CA

mutaatio [[4] ja julkaisemattomia tietoja]. Vain kaksi näytettä sisälsi sekä

PIK3R1

ja

PIK3CA

(E545K) mutaatioita ja yksi näistä oli kasvain, joka oli BH verkkotunnuksen mutaatio (E137K) in

PIK3R1

. Kaiken kaikkiaan 61 kasvainten seulotaan sisältävät

PIK3CA

mutaatioiden (23%). Siten

PIK3CA

mutaatio aliedustettuina osajoukossa, joka oli

PIK3R1

mutaatio (1 havaittu, 5 odotetaan). Siten

PIK3R1

mutaatioita ole BH domain näyttävät olevan toisensa poissulkevia kanssa

PIK3CA

mutaatio UC. Ei ollut mitään merkittävää suhdetta

PIK3CA

tai

PIK3R1

mutaation kanssa kasvaimen tai vaiheessa. Neljä näytteet sisältävät

AKT1

mutaatioita (E17K), joista mikään ei rinnalla oli

PIK3R1

mutaatio.

TSC1

mutaatiostatus tunnetaan 148 kasvaimia sarjassa, joista 14 sisältävät mutaation [4]. Yksi näistä kasvaimista oli mutaatio BH-domeenin

PIK3R1

(W237_Y242del). Kuitenkin otoskoko ja mutaation taajuudet ovat liian pieniä merkittäviä sattumaa tai molemminpuolisen poissulkemisen voidaan tunnistaa.

PIK3R1 ilmentymistä vähennetään UC ja solulinjoissa

p85α mutaatiot voivat muuttaa proteiini: proteiini-vuorovaikutuksia ja p85α, joista jotkut, erityisesti ne, jotka ovat BH verkkotunnuksen, saattaa viitata tuumorisuppressori rooli pidimme sitä mahdollisuutta, että downregulation proteiinin voisi edistää kasvainten kehittymistä.

PIK3R1

sijaitsee kromosomissa 5 (5q13.1). Loss Heterotsygoottisuuden (LOH) ja kopioluvun menetys sekvenssit 5q on raportoitu virtsarakon syövän [41,42]. By array CGH olemme havainneet, että 29% lihaksen invasiivisen UC on kopio numero menetys alueella

PIK3R1

[43]. Tutkiminen julkisesti saatavilla ilmaisun tulokset osoittivat, että UC on merkittävä väheneminen PIK3R1 ilmentymisen RNA-tasolla (kuvio 4A).

. Analyysi p85α mRNA: n ekspression tasojen 105 virtsarakon tuumorin näytteissä ja 52 normaalissa virtsarakossa näytteitä. Tiedot Sanchez-Carbayo ym [30]. B. kvantitatiivinen analyysi p85α immunoblotattu proteiininäytteitä virtsarakon syövän solulinjoista normalisoitu tubuliinia ja esitetään suhteessa yhdistettyä normaalia ihmisen urothelial soluja (NHU-allas).

arvioitiin p85α proteiinin ilmentymistä 44 UC solussa ratoihin western blotting. Tämä paljastui suuri vaihtelu ekspressiotasoja kanssa useimpien solulinjojen (80%), joissa on näkyvissä vähensi p85α proteiinin ilmentymisen verrattuna normaaliin urothelial soluihin (kuvio 4B).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa löytyi

PIK3R1

mutaatioiden 4,9% UC. Korkeampi taajuus täältä kuin edellisessä tutkimuksessa UC [18] heijastaa arviomme koko geenin sijasta vain eksonit 12, 14 ja 15. Meidän tiedot näiden kolmen eksonien paljastui 5 mutaatiota (1,8% kasvaimista), yhteensopiva tämä aikaisempi tutkimus. Suurin osa mutaatiota sijaitsee C-terminaalisen alueen p85α samanlaisia ​​havaintoja muissa ihmisen syövissä [14,16,17,19,20]. Mutaatiot yksilöidyt nSH2 ja iSH2 verkkotunnuksia voi jäljitellä vaikutusta p110α mutaatioiden vapauttamalla estävää sääntelyä p110α jonka p85α ja kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden näiden mutanttien näyttää p110α riippuvainen [36].

Mielenkiintoista, löysimme korkeampi taajuus BH mutaatioista verrattuna edelliseen mutaatio näyttöjä. Onko tämä on spesifinen UC ei ole vielä selvä, koska painopiste monia tutkimuksia ainoastaan ​​p110α -interacting geenin alue. Viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että BH-domeeni mutanttimuotojen p85α voi muuttaa vakautta PTEN [20]. p85α sitoutuu fosforyloitumaton PTEN sisällä korkean molekyylipainon PTEN liittyvä kompleksi (PAC) [22]. Tämä vuorovaikutus sisältää N-terminaalisen alueen p85 (SH3-BH) ja sen on osoitettu positiivisesti säädellä lipidi kinaasiaktiivisuutta PTEN on kasvutekijä-riippuvaisella tavalla [23]. Expression of p85α kanssa poistetaan BH verkkotunnuksen yksinään vähensi vuorovaikutusta PTEN ja poistetaan kummankin verkkotunnuksen poistanut sen, mikä lisää amplitudi ja kesto AKT aktivoinnin seuraavista kasvutekijän stimulointi [23]. Siten PTEN: p85α vuorovaikutus näyttää voimistaa kykyä PTEN alentaa PIP3 tasoilla ja lopettaa signalointi AKT. Itse mutaatio E160 * tunnistettu kohtukarsinooma on osoitettu horjuttaa PTEN ja suurentaa AKT fosforylaatio [20].

BH alue osoittaa myös sekvenssihomologia RhoGAP proteiineihin ja sillä GAP aktiivisuutta Rab5, Rab4, Cdc42 ja Rac1 [21].