Krooninen sairaus

tiivistelmä

kadheriinin-17 (CDH17), yksi jäsen 7D-kadheriinin superperheen, yliekspressoitui mahasyövän (GC) ja oli yhteydessä huonoon säilymiseen, kasvaimen uusiutumisen, etäpesäke, ja kehittynyt kasvain vaiheessa. Toistaiseksi solujen toiminnan ja signalointi mekanismi CDH17 GC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yli 66% GC solulinjojen (20/30) oli CDH17 positiivisia. Tissue mikrosiru (TMA) määritys osoitti, että 73,6% Kiinan GC kudokset (159/216) oli CDH17 positiivisia, kun taas 37% vastaavan viereisen normaaleissa kudoksissa olivat CDH17 positiivisia. Knockdovvn CDH17 inhiboi solujen lisääntymistä, muuttoliike, tarttuvuus ja pesäkkeiden muodostumista, ja myös aiheutti solukierron pysähtymisen ja apoptoosin AGS ihmisen GC soluja. Toisaalta, yliekspressio CDH17 helpottaa MGC-803 GC kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Vasta-aine array ja Western blotting määrityksessä osoitti, että knockdovvn CDH17 vuonna AGS soluissa alassäädetty integriinin β-sarja proteiineja, edelleen inaktivoitu Ras /Raf /MEK /ERK-reitin ja johti p53 ja p21 kertymistä, mikä johti leviämisen estäminen, solusyklin pidätys ja apoptoosin induktio. Yhdessä meidän data ensiksi osoittaa kapasiteetin CDH17 säännellä toimintaa Ras /Raf /MEK /ERK koulutusjakson soluproliferaation GC, ja viittaavat siihen, että CDH17 voi toimia houkutteleva terapeuttinen kohde tulevalle tutkimukselle.

Citation: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Targeting kadheriinin-17 inaktivoi Ras /Raf /MEK /ERK Merkinanto ja estää Cell Proliferation mahasyövän. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, France

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 26 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä License, mikä mahdollistaa rajoittamattoman käytön jakelua, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäisen tekijän ja lähteen hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä tai entisten työntekijöiden Roche R ja se myös merkittävästi liittyvän imusolmuke etäpesäke mahasyövän [14]. Pudotus CDH17 kanssa lentivirus-välitteisen miRNA inhiboivat, sitoutuminen, kasvaimen kasvu ja etäpesäke BGC823 ihmisen mahasyövän sekä in vitro ja in vivo [15] – [17]. CDH17 on ehdotettu onkogeenin ja käyttökelpoinen markkeri diagnoosia varten syöpien [18]. On todistettu, että CDH17 välittämä onkogeeninen signalointia HCC liittyy Wnt-signalointireitin [5]. Äskettäin on raportoitu, että CDH17 indusoi kasvaimen kehittymisen ja imusuonten etäpesäkkeiden GC aktivaation kautta NFKB-signalointireitin [19]. CDH17 säännelty α2β1 integriinin signalointia aiheuttaa tietyn polttovälin adheesiokinaasi ja Ras aktivointi, joka johti kasvuun soluadheesiota ja lisääntymistä koolonkarsinoomasoluissa [11]. Kuitenkin tärkein rooli ja signalointi mekanismi CDH17 GC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa vahvistaa CDH17 mahdollisena terapeuttisena kohteena GC ja tutkia signalointi mekanismi CDH17 GC, olemme tunnettu ilmaus CDH17 ihmisen GC solulinjoissa ja Kiinan GC kudoksissa, tarkastetaan vaikutuksen CDH17 knockdown tai yli- ilme tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen vaikutus GC solulinjojen, ja tutki mahdollinen signaali kaskadeista liittyviä CDH17. Havaitsimme suuren CDH17 ilmentymistä ihmisen GC solulinjoissa ja Kiinan GC kudoksiin, ja selkeä esto solujen lisääntymisen, migraation, pito, pesäkkeiden muodostumista, apoptoosin induktio ja solusyklin pysähtymisen jälkeen hiljentäminen of CDH17 ihmisen GC solulinjoissa. Lisäksi tuloksemme ensinnäkin osoittavat kapasiteettia CDH17 säännellä toimintaa integriini-Ras /Raf /MEK /ERK koulutusjakson soluproliferaation GC, ja viittaavat siihen, että CDH17 voi toimia houkutteleva terapeuttinen kohde tulevalle tutkimukselle.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

käyttö ja hoito koe-eläinten hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), Roche R käänteinen aluke: 5′-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3′) miRNA osoitti korkeimman tehokkuuden ja valittiin per muotoon BP rekombinaatio saamiseksi pENTR-miRNA. Tämä merkintä vektoria käytettiin sitten LR rekombinaatiolla pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nro K4920-00), jolloin saatiin pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus käyttäen Gateway® tekniikkaa (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus käytettiin transdusoimaan TR-AGS stabiileja soluja ja 200 ug /ml tseosiinia (Invitrogen, Cat. No. R250-05) käytettiin valita vakaan Tet-säädellään CDH17 shRNA ekspressiosoluja nimeltä TR-AGS-CDH17_KD vakaa solun line.

Stable MGC-803-solujen Tet-säädellään yliekspressio CDH17 geenin

Lyhyesti, CDH17 sekvenssi monistettiin PMD-18T-CDH17 plasmidi (Kiinan Biological Inc.) ja subkloonattiin IRES -EGFP vektori saamiseksi CDH17-IRES-EGFP käyttäen alukkeita: Forward-aluke: 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 ’; Reverse-aluke: 5’-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 ’). Tätä konstruktia käytettiin suorittamaan BP rekombinaation saada pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Sitten merkintä vektorin ja pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) vektori käytettiin LR rekombinaatioon saada pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Sitten lentivirus tuotettu transdusoida TR-MGC-803 stabiileja soluja ja 4 ug /ml blastisidiinia käytettiin valita vakaan Tet-säädellään CDH17 geenin ilmentymistä soluissa nimeltä TR-MGC-803-CDH17_Over stabiili solulinja.

Soluproliferaatiomääritys

siRNA ohimenevän transfektion määrityksissä soluja ympättiin 10 cm: n maljalla, jonka tiheys on 5 x 10

6 solua /malja ja transfektoitu 20 nM siCDH17 tai scramble siRNA. 48 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut erottaa toisistaan, ja siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 3000 solua /kuoppa, inkuboitiin sitten vielä 72 tuntia. Solujen elävyys määritettiin CCK-8 kit (Donjindo, Japani). TR-indusoituva AGS-CDH17_KD vakaa soluja, ympättiin 60 mm x 15 mm malja ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (0, 2,5 ja 5,0 ug /ml) eri aikaan. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 2, 3, 4, 5 ja 6 päivää, ja solujen määrä laskettiin ScepterTM Handheld Automated Cell Counter (Millipore). Proliferaatioon pelastus määrityksessä, TR-indusoituva AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin 60 mm x 15 mm malja ja niitä viljeltiin 10 päivää tai ilman 5,0 ug /ml Tet. Pelastus Ryhmä viljelyväliaine, joka sisälsi Tet korvattiin tuoreella alustalla päivänä 4, ja solut edelleen viljellä päivä 10. solut kussakin ryhmässä kerättiin päivänä 2, 4, 6, 8 ja 10 solujen määrä laskentaa ja Western blotting -analyysi.

Cell migraatiokokeessa

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja ympättiin 10 cm: n maljalla ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (5 ug /ml). Sen jälkeen 120 tunnin viljelyn jälkeen solut kerättiin ja laskettiin. 0,1 ml solususpensiota (1, 2, 3 x 10

4 solua /ml) lisättiin ylempään osastoon kammion. 0,6 ml 10% FBS: ia lisättiin alempaan osastoon kuin Chemo houkutinta. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, solut kiinnitettiin 90%: ssa EtOH: a 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten värjättiin 0,1% kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Ei-muuttajan solut poistettiin yläpinnasta Transvvell- kalvon pumpulipuikolla. Värjätyt solut myöhemmin valokuvattiin ja laskettiin valomikroskoopilla.

Soluadheesioanalyysi

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja ympättiin 10 cm: n maljalla ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (5 ug /ml). Pre-pinnoite 96-kuoppaisille levyille suoritettiin inkuboimalla kaivoja 25 ug /ml fibronektiiniä 4 ° C: ssa yön yli. Vähentää ei-spesifisen sitoutumisen, 1% naudan seerumin albumiinia (BSA), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 60 min ajan 37 ° C: ssa, BSA pestiin kaksi kertaa steriilillä PBS: llä. 120 h kuluttua pudotus CDH17 kanssa Tet, solut kerättiin ja ympättiin esipäällystetty 96-kuoppalevyillä 4 x 10

4 solua /kuoppa. 2 tuntia myöhemmin, tarttumattomat solut poistettiin pesemällä steriilillä PBS: llä kaksi kertaa. Tarttuneet solut määritettiin CCK-8 kit.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Ensinnäkin, 6-kuoppaisia ​​levyjä, jotka on valmistettu pohja-agarkerroksen (0,6% geeli). Sitten, TR-AGS-CDH17_KD soluja tai siCDH17 transfektoidut solut (kuten proliferaatiomäärityksessä) suspendoitiin täydelliseen alustaan, joka sisälsi 0,3% -0,4% Noble-agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja ympättiin valmistettiin 6-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin 7 tai 14 päivää. Solut värjättiin tiatsolyyli blue liumbromidi (MTT) 2 tuntia. Määrä solujen pesäkkeiden laskettiin.

Solusyklianalyysiä

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin kuusi kuoppalevylle 1,0 × 10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin 5 ug /ml Tet. 120 tuntia myöhemmin, solut kerättiin trypsiinillä ja kiinnitetään EtOH 4 ° C: ssa 3 h. Sitten soluja sentrifugoitiin 1500 g: ssä 5 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä. Suspendoitiin uudelleen solujen RNaasi /PBS liuokset (20 ug /ml), inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, sitten lisättiin PI /PBS liuokset (20 ug /ml) ja inkuboitiin RT: ssä 30 min, tarkastetaan värjätyistä soluista BD FACS Calibur ja analysoi tietoja BD CellQuest Pro -ohjelmisto.

Apoptosis analyysi

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin kuusi kuoppalevylle 1,0 × 10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin 5 ug /ml Tet. 120 tuntia myöhemmin, solut kerättiin trypsiinillä ja pestiin esijäähdytettyyn PBS kerran. Solut suspensoitiin uudelleen 500 ul: ssa 1 x sitovaa puskuria ja 5 ui PI ja 5 ui anneksiiniV (BD) lisättiin. Inkuboidaan pimeässä (huoneen lämpötila) 10 minuutin ajan, värjätään solut tarkastettiin BD FACS Calibur. Saatu aineisto analysoitiin BD CellQuest Pro -ohjelmisto.

Western blotting -analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla [150 mM NaCI, 1% NP40, 0,25% deoksikolaattia ja 10 mM Hepes (pH 7,4)], joka sisältää proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteiinikonsentraatiot mittaamaan bikinkoniini- happoa (BCA) menetelmä (Pierce). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia per näyte keitettiin latauspuskuria ja elektroforeesi 8-12% kaltevuus SDS-polyakryyliamidigeeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Kalvot vasta-aineilla (CDH17, integriini-β1, Integriini β4, Integriini β5, p-p53, p53, p21 olivat R 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression profiilia CDH17 mahasyövän

Ilmaisu taso CDH17 proteiinien 30 solulinjoissa luokiteltiin 4 ryhmään perustuu tietoihin optinen tiheys analyysi vastaan ​​beeta-aktiini. AGS solulinjaa käytettiin sisäisenä standardina välttää välistä ristiriitaa geelejä. Yli 66% GC-solulinjojen (20/30) oli CDH17 positiivisia (kuvio 1A).

(A) Kolmekymmentä mahalaukun solulinjat hajotetaan ja alistettiin Western blot -analyysi (vasemmalla). Kaikki testatut solut on luokiteltu 4 ilmentymistason CDH17, korkea, mediaani (Medi), Matala, Ei havaittu (ND), joka perustuu optinen tiheys analyysi vastaan ​​beeta-aktiini (oikealla); (B) edustaja IHC kuvia potilaasta 1 (hyvin erilaistunut mahalaukun syöpäkudoksen), potilas 2 (huonosti eriytetty mahalaukun syöpäkudoksen) ja potilaan 3 (viereiseen normaaliin kudokseen); CDH17 osoitti kirkas kalvo paikalla kasvain tai viereisten kudosten (C) edustaja IHC kuvia positiivisten CDH17 tahra pisteytys symbolista + +++.

Ilmaisu ja lokalisaation CDH17 perusterveydenhuollossa kudoksessa parafiiniin jaksossa havaittiin immunohistokemia kudossiruina. Verrattuna kontrolli dioja värjätään normaalin hiiren IgG, CDH17 mAb värjäys osoitettiin selvä solukalvon lokalisointi (kuvio 1 B). Niistä 216 tapauksissa vahvistettu patologian diagnoosi raportti, 73,6% syöpäkudokset (159/216) kanna positiivinen CDH17 tahra pisteytys symbolista + +++, kun taas 37% positiivisia CDH17 tahra vastaavan viereisen normaaleissa kudoksissa (taulukko 1). Vuonna CDH17 tautitapauksia, ekspressiotaso CDH17 on positiivinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke. Ilmaisulla taso on käänteisesti liittyy mahalaukun seinämän invaasio, kasvaimen etäpesäkkeiden ja kasvaimen TNM vaiheissa. Havaintomme oli yhdenmukainen aiempien kliinisten raporttien [20] – [22]. Niistä CDH17 positiivinen tapauksissa syöpäkudokset näytteillä vahvempaa värjäytymistä CDH17 (32,1% kun pisteytys +, 25,2% kun pisteytys ++ ja 42,8% kun pisteytys +++) kuin viereisten normaaleissa kudoksissa (62,5% kun pisteytys +, 21,3% kun pisteytys ++ ja 16,3% kun pisteytys +++). Vaikka mitään merkittäviä suhde havaittiin tahra pisteytys ja kliiniseen vaiheeseen. Kun kaikki tämä todistaa yhdessä, CDH17 voi olla diagnostinen markkeri alkuvaiheen mahasyöpä Kiinan väestö.

RNAi-välitteinen kaataa CDH17 GC solulinjoissa osoitti solujen proliferaatio ja pesäkkeiden muodostumista in vitro

tulosten perusteella on CDH17 mentymisprofiili paneelissa GC solulinjojen (kuvio 1A), AGS (korkeampi CDH17), BGC-823 (alempi CDH17) ja HGC-27 (ei mitään CDH17) solulinjoja valitaan edelleen in vitro solujen toimintakyvyn arvio, jossa RNAi-välitteinen CDH17 hiljentäminen. Western blotting osoitti, että AGS solut oli korkea CDH17 proteiinin tason ja ilmentymistä CDH17 pudotettiin lähes täysin mukaan siCDH17. BGC823 soluilla oli matala CDH17 proteiinin tason ja HGC-27 ei ollut CDH17 proteiinia (kuvio 2A). Verrattuna ryntäily ohjaus solut, CDH17 kaatamalla oli vain vähän vaikutusta proliferatiivinen kyky BGC823 ja HGC27 soluja, kun taas oli dramaattinen vaikutus AGS (60% 72 h, kuva 2B). Pehmeä agar määritys osoitti, että kyky muodostaa pesäkkeitä estyi AGS soluissa jos CDH17 oli kaataa (66% 14 d), mutta BGC823 soluissa ja HGC27 soluja, CDH17 kaatamalla oli vähän vaikutusta pesäkemuodostuksen kyky (kuva 2C). Ei ollut selvää eroa BGC823 solujen (matala CDH17 taso) ja HGC-27cells (non-CDH17) estossa leviämisen ja pesäkkeiden muodostumisen aiheuttama siRNA CDH17 knockdown.

(A) siRNA knock-down tehokkuus vahvistettiin Western-blottauksella 48 tuntia transfektion jälkeen 20 nM siCDH17 tai scramble siRNA; (B) Proliferaatiomääritys. Solut transfektoitiin 20 nM siCDH17 tai scramble siRNA 10 cm ruokia. 48 tuntia myöhemmin, solut suspendoitiin ja ne siirrostettiin uudelleen 96 kuopan levyille. Solun elinkelpoisuus määritettiin CCK-8 soluproliferaatiota kit 72 tunnin kuluttua kylvö. Koe suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta; (C) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä. Solut transfektoitiin siCDH17 kuin proliferaatiomäärityksessä ja siirrostettiin uudelleen 6-kuoppaisille levyille. Pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla jälkeen värjättiin MTT 14 päivän jakson kylvö. Koe suoritettiin kolmena kappaleena ja tyypillisiä kuvia näytettiin. Aineisto esitetään keskiarvona ± keskihajonta.

Stable solulinjoja kuljettavat TR indusoituvaa knockdovvn CDH17 vuonna AGS soluissa ja yli-ilmentyminen CDH17 in MGC-803 solut

kohdesekvenssin exon13 (90-2) saatiin yli 90%: n vähennys mRNA-tasolla (kuvio 3A). Sitten käytimme pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus transdusoida TR-AGS vakaa solujen ja sai vakaan Tet-säänneltyjen ilmentymisen shRNA of CDH17 geenin solujen (TR-AGS-CDH17_KD) jossa CDH17 proteiini taso aleni noin 90%, kun indusoitiin 5 ug /ml Tet (kuvio 3B). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus käytettiin transdusoimaan TR-MGC-803 vakaa solut ja valittu blastisidiinia saada vakaa Tet-säänneltyjen ilmentymisen CDH17 geeni soluihin (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Yli-ilmentyminen CDH17 tässä stabiili solussa vahvistettiin proteiinin tason Western blottauksella (kuvio 4A).

Eri määritys kuvattiin materiaalit ja menetelmät. (A) Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti kolhi alas CDH17 mRNA tasolla AGS soluissa (C), AGS solut transfektoitiin ohimenevästi pcDNA

TM6.2-GW /EmGFP-scramble miR plasmidi (NC) ja pcDNA

TM6.2-GW /EmGFP-CDH17 miR plasmidit (90-1, 90-2, 90-3, ja 90-4); (B) Western blotting vaikutuksella CDH17 pudotus käyttämällä erilaisia ​​pitoisuuksia Tet 48 h TR-AGS-CDH17_KD soluissa; (C) Solulisääntyminen, muuttoliike (6 päivää hoidon jälkeen), tarttuvuus (6 päivän kuluttua hoidon. **

P

0,01) ja pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa (7 päivää hoidon jälkeen. **

P

0,01); (D) leviämisen pelastus määrityksessä. TR-indusoituva AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin 60 mm x 15 mm malja ja niitä viljeltiin 10 päivää tai ilman 5,0 ug /ml Tet. Pelastus Ryhmä viljelyväliaine, joka sisälsi Tet korvattiin tuoreella alustalla päivänä 4, ja solut edelleen viljellä päivä 10. solut kussakin ryhmässä kerättiin päivänä 2, 4, 6, 8 ja 10 solujen määrä laskentaa (vasemmalla) ja Western blotting-analyysi (oikealla); (E) Solusyklianalyysiä jälkeen soluja käsiteltiin 5,0 ug /ml Tet ja 6 päivää; ja (F) Cell apoptoosia analyysi sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 5,0 ug /ml Tet varten 6 päivää virtaussytometrialla.

(A) Western blotting osoitti induktion tehokkuuden CDH17 yli-ilmentymisen; (B) Kasvaimen kasvu nude-hiirissä. Kun kasvaimen määrä oli -100 mm

3, juomavesi korvattiin 2,5% sakkaroosia, joka sisälsi 0,2 mg /ml Tet tai ei. *

P

0,05, Tet-on ryhmä vs Tet-vapaa ryhmä; (C) Western blotting-analyysi ksenograftin kasvaimen kudokset.

knockdovvn CDH17 inhiboivan solujen lisääntymisen, migraation, tarttuvuus, pesäkkeiden muodostumisen ja induktio solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin

TR-AGS solut (kontrolli solut) ja TR-AGS-CDH17_KD soluja käytettiin arvioimaan mahdollisten solujen funktionaalisia vaikutuksia shRNA välittämää CDH17 knockdovvn sisään AGS soluissa. TR-AGS-CDH17_KD soluja käsiteltiin 5 ug /ml Tet vähensi solujen proliferaation (75,8%: iin 5 päivää), solumigraation kyky (mukaan 68,1% 16 h), soluadheesiota kyky (46,8% 30 minuuttia ), ja pesäkkeenmuodostuskyvyn (by 92,7% 7 päivää) verrattuna Tet ilmainen (kuvio 3C). Vuonna leviämisen pelastus tutkimuksessa CDH17 knockdown TR-AGS-CDH17_KD solujen aiheuttama Tet voidaan pelastaa poistamalla Tet. Poistamisen jälkeen Tet päivänä 4 uudelleen ilmentäminen CDH17 havaittiin päivänä 8 ja 10 kulttuurin CDH17 shRNA knockdownin AGS soluja. Re-ilmentymä CDH17 voisi pelastaa leviämisen kyky TR-AGS-CDH17_KD soluissa (kuvio 3D). Verrattuna Tet free TR-AGS-CDH17_KD soluja, Tet-solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt prosenttiosuus solujen G0 /G1 ja G2 /M-faasin ja dramaattisesti kuolleen solujen prosenttiosuutta S-vaiheessa (kuvio 3E). Tällä välin myös havaittu, että määrä apoptoottisten solujen (52,2% 5 päivää) korotettiin alas-säätely CDH17 TR-AGS-CDH17_KD soluissa (kuvio 3F). Mitään merkittävää eroa ei havaittu TR-AGS vakaa solulinjasta tai ilman Tet inkubointia.

yli-ilmentäminen CDH17 edisti kasvua kasvaimen nude-hiirissä

TR-MGC-803-CDH17_Over soluissa injektoitiin ihonalaisesti kylkiin BALB /c-nude-hiirten muodostamiseksi kiinteän kasvaimen. Ilmaus CDH17 oli valvonnassa Tet juomavedessä. Tulokset osoittivat, että 35 päivän jälkeen induktion, Tet aiheuttama ryhmä (kasvaimen tilavuus = 1849,08 ± 423.46m3) osoitti 2,27-kertainen kasvu etenemisen versus Tet-vapaa ryhmä (kasvaimen tilavuus = 814,04 ± 234.69m3) (p 0,05) ( kuvio 4B), ja indusoitiin CDH17 ilmentymistä tuumorikudoksessa voidaan analysoitiin Western blottauksella (kuvio 4C). Se osoitti, että CDH17 tärkeä rooli syövän synnyn mahasyövän. Käytimme myös TR-AGS-CDH17_KD solujen tarkkailla, onko hiljentäminen of CDK17 voi vaikuttaa tuumorigeenisyyden nude-hiirissä. Valitettavasti kasvaimen ottaa nopeudella tästä solulinjasta oli erittäin alhainen eikä luotettavaa in vivo tuloksia havaittiin TR-AGS-CDH17_KD solulinjassa.

määrittäminen siihen liittyvän proteiinin tasot jälkeen pudotus CDH17 by Vasta paneelit määrityksen

mukaan kasvaimia vaikutukset (soluproliferaation inhibointi, pesäkkeiden muodostumista, ja kasvaimen kasvua in vivo) ja metastaattinen vaikutukset (esto solu- migraation ja adheesion) ja CDH17 knockdown, me valitsemme kolme vasta-paneelit (R (B) muuttaminen suhde liittyvien proteiinien välillä Tet-on ja Tet-vapaa soluissa; (C) Muutokset liittyvien proteiinien löydetty vasta-array määrityksessä vahvistettiin käyttämällä Western blotting-analyysi.

knockdovvn CDH17 vuonna AGS vaimentua β-integriinien ja Ras /Raf /MEK /ERK signalointireitille

proteiini muuttuu vasta-array määritys varmistettiin Western blotting-analyysi. Tulokset osoittivat merkittävä väheneminen integriinin β1, β4, β5 ja fosfo-ERK in CDH17 pudotus AGS soluja, mutta ei merkittävää muutosta koko ERK (kuvio 5C). Sitten arvioitiin osallistumista muiden Ras /Raf /MEK /ERK signalointireitille komponentteja. Knockdovvn CDH17 johti alas-sääntelyn Raf, fosfo-MEK, ja fosfori-ERK proteiineja (kuvio 5C). TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo tutkimuksessa havaitsimme yliekspressio CDH17 tehosti integriini β1, β4, β5 ilme ja ERK aktivointi (kuvio 4C), ja se on yhdenmukainen edellä esitetyistä tuloksista.