Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kehittyy monivaiheisen prosessin kautta, jossa normaalit solut edetä pahanlaatuisia kasvaimia kautta kehittymisestä genomien seurauksena hankinnan mutaatioiden syövän kuljettajan geenejä. Lukumäärä, tunnistetiedot ja toimintatapa syövän kuljettajan geenejä, ja miten ne edistävät kasvaimen kehittymistä ei juuri tunneta. Tutkimuksessa käyttöön Hiiren nisäkasvainviruksen (MMTV) kuin insertionaalisiin mutageeni löytää sekä kuljettajan geenejä ja verkostoja, joissa ne toimivat. Käyttämällä syvä pistokohtaan sekvensointi tunnistimme noin 31000 retroviruksen integraation sivustoja 604 MMTV aiheuttamaa nisäkasvaimia hiiristä kanssa maitorauhasen erityisiä poisto

Trp53

,

PTEN

heterotsygoottista hiirten, tai villityypin kantoja . Havaitsimme 18 tunnetaan yhteinen integraation sivustot (CISS) ja 12 aiemmin tuntematonta Ciss merkintä uuden ehdokkaan syöpä geenejä. Jäsenet

Wnt

,

Fgf

,

FGFR

,

RSPO

ja

PDGFR

geeniperheistä olivat yleisesti mutatoitunut toisiaan yksinomainen muoti. Sekvenssi data muodostimme saatiin myös tietoa klonaalisuuden insertioille yksittäisten kasvainten, jotta voimme kehittää data-driven malli MMTV aiheuttaman kasvainten kehittymiseen. Insertionaaliset mutaatiot lähellä

Wnt

ja

Fgf

geenien merkitse aikaisintaan ”aloittamista” tapahtumia MMTV aiheuttamaa kasvainten synnyssä, kun taas

FGFR

geenit suunnattu myöhemmin syövän etenemiseen. Tuloksemme osoittavat, että insertiomutageneesiin voidaan löytää mutaation verkot, ajoitus mutaatioiden, ja geenit, jotka käynnistävät ja ajavat kasvaimen kehittymistä.

Citation: Klijn C, Koudijs MJ, Kool J, kymmenen Hoeve J Boer M, de Moes J, et al. (2013) analyysi kasvain heterogeenisuus ja Cancer Gene Networks Käyttäen Deep sekvensointi MMTV-indusoidun hiiren nisäkasvaimia. PLoS ONE 8 (5): e62113. doi: 10,1371 /journal.pone.0062113

Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 helmikuu 2013; Hyväksytty: 25 helmikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 14, 2013

Copyright: © 2013 Klijn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea Alankomaiden Cancer Society (avustus 2001-2489 JH), Association for International Cancer Research (AICR myöntää 07-585 JJ), Alankomaat Genomics Initiative /Netherlands Organization for Scientific Research (NGI /NWO Program avustus 050 -10-008 että MVL; NGI /NWO Horizon läpimurto apurahan 40-41009-98-9109 ja NGI /NWO Horizon Zenith myöntää 40-41009-98-11097 JJ), Alankomaissa Consortium for Systems Biology (NCSB), Cancer Genomics Centre (CGC), ja Cancer Systems Biology Center (CSBC). D.J.A. rahoittaa Cancer Research-Britannian ja Wellcome Trust (76943). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

With seuraavan sukupolven DNA sekvensointiteknologioihin mutaatioprosessiin maisema useiden kasvaintyypeille on määritelty paljastavat, että on olemassa lukuisia geneettisiä polkuja pahanlaatuisen [1]. Kasvain heterogeenisyys on osa tätä monimutkaisuutta [2], [3], mikä vaikeuttaa meidän kyky erottaa kuljettajan mutaatioita matkustajista. Hiiri kasvainmuodoista esittää puhdas, toistettavissa

in vivo

järjestelmässä tutkia osuus kuljettajan geenejä kasvaimien syntyyn ja määrittää niiden taustalla olevat biologiset vaikutusmekanismeja [4].

insertiomutageneesiin (IM) käyttämällä retroviruksia tai transposonien on ollut yksi tärkeimmistä välineistä indusoimiseen hiirissä [5] – [8]. Hiiren nisäkasvainviruksen (MMTV) on hitaasti muuttamassa retrovirus, jota on käytetty tutkimaan rintarauhasen kasvaimien syntyyn hiirissä. Tämä virus aiheuttaa nisäkasvaimia integroimalla sen proviraalisen DNA tai lähellä syöpä geenit. Toistettuja insertiomutaatiolla ja kloonilaajenemisen johtaa nisäkasvaimia kuljettaa useita klonaalisia ja osa-klonaalisia MMTV integraatiot, mukaan lukien mutaatiot liittyvät sekä kuljettajan geenejä, sekä matkustajien mutaatioita.

molekulaarinen kloonaus provirusrakenteen insertioiden MMTV- aiheuttama nisäkasvaimia johti löytö ensimmäisen MMTV Common Insertion Site (CIS) ja siihen liittyvä geeni

Wnt1

(alkuperäiseltä nimeltään

INT1

) vuonna 1982 [9]. Todettiin, että MMTV lisäykset lähellä

Wnt1

geeni edisti nisäkasvaimen kehitystä aktivoimalla Wnt1, perustajajäsen Wnt-signalointireitin. Pian havaitsemisen jälkeen

Wnt1

toinen onkogeeni,

Fgf3

(alunperin nimeltään

INT2

) tunnistettiin. Edelleen tutkimus osoitti, että tämä jäsen fibroblastikasvutekijän geeniperheen tehokkaasti tekee yhteistyötä

Wnt1

kasvainten muodostumiseen [10]. Sen jälkeen lupaus näiden varhaisten tutkimusten kasvava suosio MMTV kuin seulomalla tuloksena löydettiin useita muita geenit syövän kehittymisessä [11] – [17].

heterogeenisuus ja etenemistä MMTV- tuumoreita voidaan arvioida analysoimalla suhteellinen runsaus ( ”klonaalisuuden”) yksittäisten lisäyksiä tietyssä näytteessä. Erittäin runsas lisäykset osoittavat alussa, aloittamista insertiotapahtumat ja nöyrä runsas insertiot osoittavat tapahtumia myöhemmin kasvainten kehittymiseen, analoginen Viimeaikaisten tutkimusten yhden nukleotidin mutaatiot ihmisen kasvaimissa [2], [3]. Aikaisemmin käytetyt PCR-lähestymistavat eivät pysty luotettavasti mitata klonaalisuuden työntämisen sivustojen takia järjestyksessä vahvistusta harhat. Siksi kehittäneet menetelmän samanaikaista tunnistamista ja määrällinen arviointi klonaalisuuden insertiomutageneesin mutaatioiden kutsutaan Shear-Splink [18]. Käytimme tätä menetelmää analysoida suuri joukko MMTV aiheuttaman kasvaimia kahdesta villityypin hiirilajilla (BALB /c ja FVB /N) ja kaksi geneettisesti hiiri (GEM) malleja rintasyövän:

PTEN

+/-

kanta [19] ja

K14Cre; Trp53

malli [20]. Käytimme saatu aineisto käsitellä neljää asiaa: Ensinnäkin, voimme tunnistaa uusia MMTV CISS ja siten laajentaa ohjelmistoon ehdokas syöpään liittyvien geenien näissä malleissa? Toiseksi, voimme tunnistaa genotyyppi tietyn kuljettajan geenejä kussakin geneettisen taustat? Kolmanneksi voimme tunnistaa yhdessä esiintyvät tai toisiaan poissulkevia suhteita CISS ja siten määrittelevät toiminnalliset suhteet liittyy kuljettajan geenejä? Lopuksi voimme tuottaa kasvaimen etenemisen malli päässä klonaalisuuden tietoja sekvenssistä johdettua lukee yksittäisten lisäysten? Tällaisen mallin määrittää tapahtumien järjestys perustuu paikoilleen profiilin ja valottaa toiminnallisia suhteita geenien MMTV aiheuttama rintarauhasen kasvaimien syntyyn.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiri malleja käytetään MMTV infektio

Newborn BALB /c /Hän /A (merkitään BALB /c) hiiret infektoitiin MMTV Foster hoitotyötä C3H /A naaraiden kätkeminen maidon lähetetyn MMTV [21]. Infected naaraspuolisten BALB /c hiiret kehittävät nisäkasvaimia korkea esiintyvyys ( 95% ennen ikää 1 vuosi). Virus-tartunnan eläimet merkitään BALB /c

+ hiirillä. Tässä tutkimuksessa käytimme kaksi siirtogeenisen hiiren linjat ja niiden villityypin valvonta: kanta ehdollisesti puutteellinen varten

Trp53

vuonna rintaepiteelisolulinja kudos BALB /c-taustalla (Balb /c

K14Cre; Trp53

F /F

) ja ituradan heterotsygoottista knockout varten

PTEN

koskevasta FVB /N tausta.

BALB /c

K14Cre; Trp53

F /F

hiirikanta kertyi yhdeksän peräkkäisen backcrosses on

K14Cre; Trp53

F /F

eläimiä sekoitettu 129P2 /Ola ja FVB /N tausta [22] BALB /c-hiirissä. Tuloksena Balb /c

K14Cre; Trp53

F /F

kanta osoitti ainoastaan ​​vähäisen nisäkasvaimen esiintymistiheys ennen ikää 300 päivää. Nämä ehdollinen

Trp53

hiirten sairastui MMTV kautta edistää hoitotyön BALB /c

+ naisilla.

vertailua MMTV aiheuttama tuumorigeneesiä välillä villityypin ja

PTEN

+/- hiiret, ehdollinen

PTEN

knockout alleeli [23] käytettiin synnyttämään

PTEN

+/- FVB /N hiirillä.

PTEN

+/- hiiret risteytettiin FVB /N villityypin hiirillä. Naaras pentuesisarukset jälkeläisillä, sekä villin tyypin ja heterotsygoottinen

PTEN

, tartutettiin MMTV Foster hoitotyön BALB /c

+ naisilla kätkeminen maidon lähetetyn MMTV.

kaikki MMTV-tartunnan saaneista eläimistä seurattiin kehittämiseen nisäkasvainten, jotka eristettiin, kun noin 1 cm läpimitaltaan. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti Alankomaiden Code of Practice for Research Laboratory Animal in Cancer Research. Protokolla hyväksyi paikallinen kokeellinen eläinten eettisen komitean (DEC) (Luvan Numbers: 04065, 08061, 03008) ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Kaikki hiiret lopetettiin kun kasvaimen saavutti 1 cm

3 (päätepiste) hiilidioksidilla. Kaplan-Meier käyrät hiiren elinikää piirrettiin ja log-rank testejä laskettiin eloonjäämisen pakettia toteutettu tilastollinen ohjelmointikielellä R.

Cre välittämää poisto Floxed

Trp53

alleeleja tuumoreiden

K14Cre; Trp53

F /F

hiirissä arvioitiin Southern blot -analyysillä, kuten on kuvattu aikaisemmin 2001 [24]. Lyhyesti, suuren molekyylipainon genomista DNA: ta MMTV tuumoreita hajotettiin BglII: lla. DNA-fragmentit erotettiin 0,6% agaroosigeeleillä ja blotattiin nitroselluloosafilttereille. PCR merkitty 700 nt XbaI vastaava eksonia 11

Trp53

käytettiin koettimena poistetaan ja poistamattomia alleelit. Cre välittämä poistetaan eksonin 2-10 Floxed

Trp53

alleeli voitaisiin arvioida perustuu liikkuvuuteen siirtymä

Bgl

II DNA-fragmentti. Noin 50%: n kasvaimia osoitti bi-alleelinen menetys Floxed eksonien. Vain niiden kasvainten, joita käytettiin IM analyysiin.

Shear-Splink menetelmä insertiokohtaa kartoitusta

sekvensoida insertiokohtien kasvainten käytimme Shear-Splink protokollaa kuin aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, DNA leikattiin ja 100-1000 bp: n fragmentit, jotka tasapäiseksi ja liitettiin splinkerette sovittimia. Ensisijainen PCR suoritettiin spesifisesti monistaa virus-to-host risteykseen fragmentteja. Toinen PCR suoritettiin esitellä viivakoodi sekvenssit ja sovittimet tarvitaan 454 sekvensointia. Nämä PCR-tuotteet yhdistettiin ja sekvensoitiin 454 sekvensoinnilla. Raaka sekvensointi data on talletettu Sequence Lue Archive hakunumerolla ERP002483.

Tietojen analysointi

Tietojen analysointi menetelmät ovat yksityiskohtaisesti tukeminen Methods (Text S1).

RNA sekvensointi

RNA uutettiin 4 kasvaimista kuljettaa

Hbegf

lisäykset, ja 4 tapauksia kuljettaa

Myb

lisäys. Määritimme FPKMs sekä

Hbegf

ja

Myb

käyttäen Cufflinks [25] sen jälkeen, kun kohdistus käyttämällä BWA [26]

Tulokset

MMTV insertiomutageneesin villi -tyyppinen ja Trp53 tai PTEN mutanttihiirien

sen arvioimiseksi kasvain heterogeenisyys ja tunnistaa syövän geeni verkkoja MMTV aiheuttama hiiren nisäkasvaimia, suoritimme suurikapasiteettisten, suuren mittakaavan insertiomutageneesin tutkimuksessa, jossa syvä sekvensointi suuri ryhmä hiiriä 4 eri geneettisissä taustoissa. Kaavamainen yleiskatsaus lähestymistapamme on esitetty kuviossa S1. Analysoimme ikäluokat hiiristä kahden eri geneettisten taustat: FVB /N (jäljempänä FVB) ja BALB /c. Jokaista geneettinen tausta ostimme kasvaimia sekä villikannan sekä erityisistä geneettisesti hiiri (GEM) malleja. Sisällä FVB tausta, nisäkasvainten kerättiin MMTV-tartunnan villityypin hiirissä ja

PTEN

+/-

heterotsygoottista hiirien. Sisällä BALB /c-taustalla MMTV-tuumoreita saatiin villityypin eläimiin ja

K14cre; Trp53

F /F

hiirissä, joilla on epiteeli-spesifinen deleetio p53. Kuten voidaan nähdä kuviosta 1 a, on elinikä ero villityypin valvontaa ja vastaavan GEM malleja, mikä osoittaa vuorovaikutuksen MMTV-indusoitua kasvaimen kehittymisen ja geneettisesti mutaation. Mielenkiintoista, mediaani latenssi MMTV aiheuttaman kasvaimen kehitystä vähentynyt

PTEN

+/-

kohortissa, mutta lisääntynyt

K14cre; Trp53

F /F

kohortissa verrattuna niiden villityypin valvontaa. Tämä havainto sai meidät oletuksen, että MMTV lisäykset saattavat osua geenejä, jotka tekevät yhteistyötä

PTEN

haploinsufficiency in

PTEN

+/-

hiirillä. Sen sijaan, MMTV-infektio voi vaikuttaa negatiivisesti pahanlaatuinen muutos

Trp53

– /-

nisäepiteelisoluissa tai päinvastoin. On myös suuri ero elinkaaren välillä MMTV-tartunnan villin tyypin FVB /N ja BALB /c-hiiret (kuva 1b). Tämä voi yksinkertaisesti osoittaa, että virus on hitaampi jäljittelyä FVB rasitusta verrattuna BALB /c-kannan, tai se voisi ilmaisemaan BALB /c-alleeleja, jotka edistävät MMTV aiheuttama tuumorigeneesiä. Tukemiseksi Jälkimmäisessä, BALB /c-hiiret sisältävät hypomorphic alleelin

Cdk2na

tuumorisuppressorigeenin [27].

Jokainen kuvaaja esittää vertailun kahden ryhminä. Pareittain log-rank testi suoritettiin kaikki graafit onko olemassa merkittäviä elinikä eroja kohortteja piirrettiin kunkin kaavion. P-arvot on esitetty oikeassa yläkulmassa. A. Kunkin erityinen hiiri tausta kantaa (FVB tai BALB /c +) vertasimme MMTV-tartunnan villityypin kohortti kanssa tartunnan geneettisesti linja (joko

PTEN

heterotsygoottinen FVB kohortin tai

Trp53

puutteellinen varten BALB /c + kohortti). B. Ero käyttöikä kahden villityypin kannoissa näkyy tässä.

kartta MMTV insertiokohtien käytimme Shear-Splink protokolla [18] poimia ja täydentää virus-isäntä-DNA risteyksessä fragmentteja, jotka sisältävät MMTV 5 ’LTR sekä viereisen hiiren genomisen sekvenssin. Me Barcoded fragmentit avulla voimme yhdistää jopa 48 yksittäistä kasvaimia ja järjestys ne 454 Genome Sequencer FLX järjestelmään. Raaka sekvenssit esikäsitellyt käyttämällä mukautettuja Perl-skriptit. Olemme tunnistaneet genominen sekvenssi lukee ja kartoitettu ne C57BL /6J (MGSC37) viite genomin. Kunkin lukea olemme vahvistaneet läsnäollessa 5’viruksen sekvenssin sekä läsnäolo DNA viivakoodi de-convolve altaat yksittäisiä kasvaimia koskevat tiedot. Yksi ainutlaatuisia ominaisuuksia lähestymistapamme on, että pystymme määrällisesti klonaalisuuden lisäysten laskemalla ainutkertaisten kasvaimeen isännän DNA risteykseen fragmentit merkitty ainutlaatuinen ligaatiolla pistettä (LPS) välillä hiiren genomisen sekvenssin ja splinkerette sovittimen. Koska useita ainutlaatuisia LP vastaa solujen määrä kuljettaa vastaavan MMTV lisäys, LP määrä voidaan käyttää mittana suhteellinen klonaalisuuden yksittäisten MMTV insertiot kunkin kasvaimen [18].

useita muita suodatus vaiheet tehtiin, kuten on kuvattu menetelmät osassa ja kuviossa S1 ennen tietojen merkittiin insertiomutageneesin Database (IMDB; https://imdb.nki.nl). Suodatuksen jälkeen oli edessä 30942 integraatiot 604 kasvaimia. Jokainen insertiot, jotka ovat

n

ainutlaatuinen LP taataan olleen läsnä vähintään

n

riippumaton soluja. Rikastamiseksi insertiot, jotka oli integroitu useamman kuin yhden tuumorisolun, me huomiotta insertiot vain yksi LP. Käyttämällä tätä suodatinta vähensimme data 6605 ainutlaatuista insertioita 600 kasvaimet (4 kasvaimet kuljettaa vain insertioita 1 LP). Tämä on vähennystä 78% kokonaismäärästä sisäänpanokohdat, mutta se muodostaa vain vähennys 21% kokonaismäärästä lukee, mikä viittaa siihen, että suodatus vastaan ​​insertiot yhden LP tehokkaasti vähentää tausta mutaatioiden tietomme.

CIS analyysi MMTV integraatiopaikkoja

määrittää globaali CISS kaikille kasvaimia aineisto. Määrätä merkitykselliset Ciss käytimme Gaussin ytimen konvoluutio puitteet [28] toteutetaan IMDb. Useimmat kasvaimet villityypin hiiret vaikuttivat ainakin yhden insertion, jotta CIS (taulukko 1). Osuus on pienempi, että alttiita taustoja. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että jotkin

K14Cre; Trp53

F /F

ja

PTEN

+/-

hiiret kehittävät nisäkasvaimia, joita ei ohjaa MMTV insertiomutageneesiin. Kaikkiaan löydettiin 30 merkittävää Ciss, joista 18 oli jo tunnettuja ja 12 olivat uusia (taulukko 2). Kaikki lisäykset liittyvät CIS pääsee IMDb. Me määritettävä manuaalisesti mahdollinen kohde geenejä näihin CISS. Esimerkkinä näytämme kaksi yleisintä uusi CISS ja kartoitus MMTV lisäyksiä näissä CISS suhteessa kohdegeenin kuvassa 2. Sekä

Hbegf

ja

Myb

ovat hyvin uskottavalta ehdokas kohdegeenien kuten MMTV integraatiot ovat hyvin todennäköisesti ilmentymisen tehostamiseksi (tuotantoketjun integraatiot) tai vakauttaa mRNA ennenaikainen transkription päättyminen ja samanaikainen poisto mRNA epävakautta motiivien takia integraatiot 3 ’UTR (jos kyseessä on

Hbegf

). Lisäksi sekä

Hbegf

[29], [30] ja

Myb

[31] on aikaisemmin liitetty syöpään. Lopuksi ilmaisu sekä Hbegf ja Myb on korkea näytteissä kuljettavat integraatio, joka osoittaa, että nämä geenit ovat kohdistu suoraa viruksen integraation (kuva S2).

oletetun kohdegeenin on esitetty, jossa nuoli osoittaa transkription suunta. Nuolenpäät osoittavat genominen sijainti viruksen integraatiot, ja nuolen osoittaa viruksen transkription suunta. Värit ilmaisevat kohortin josta integraatiot otettiin talteen.

Monet CISS me talteen ovat kanoninen CISS MMTV insertiomutageneesiin. In MMTV aiheuttama nisäkasvaimia, proviraalinen lisäykset ovat usein lähellä

Wnt

geeni perheenjäsenet (

Wnt1

,

Wnt3

ja

Wnt3a

), kasvu tekijä liittyvät geenit (

Fgf

ja

FGFR

geenejä,

PDGFR

geenejä ja

IGF2

), R-spondin geeniperheen jäsenet (

Rspo1

,

Rspo2

ja

Rspo3

) ja mitogeeni signalointireitin geenit (

Eras

ja

Map3k8

) [11]. Havaitsimme useita uusia Ciss näissä perheet, joita ei aiemmin tunnistettu:

Hbegf

,

Rspo1

ja

FGFR3

. Nämä uudet tavoitteet voidaan talteen suuressa tutkimuksessa, koska niitä esiintyy paljon harvemmin kuin aikaisemmin tunnistetut perheenjäseniä. Olemme myös talteen useita harvinaisia ​​Ciss jotka ovat todennäköisesti totta MMTV osuu koska ehdokas kohdegeeneissä kuuluvat geeniperheistä johon myös jäseniä, jotka ovat usein MMTV tavoitteita. Tämä havainto tukee pätevyyden muita harvinaisia, mutta merkittävä uusi CISS tunnistimme meidän näytöllä, kuten

Sfi1

,

Dock5

ja

Fezf1

. Itse asiassa ihmisen homologi

Fezf1

(tunnetaan

ZNF312B

) on kuvattu onkogeenin mahasyövän [32]. Lisäksi useita tunnettuja ja uusia kohdegeenien havaittiin toistuvasti monistettiin paneelin yli 700 ihmisen syöpäsolulinjoissa (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi ) tai listattu mutaatiokaavojen tavoitteet COSMIC tietokannassa (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Tämä osoittaa, että geenit liittyvät CISS in MMTV aiheuttama nisäkasvaimia saattaa olla merkitystä ihmisen syövässä.

genotyyppispesifinen Ciss

lisäksi löytää uusia MMTV Ciss olimme kiinnostuneita löytämään genotyyppispesifinen insertioita. MMTV tartunnan

PTEN

+/- hiiret kehittävät nisäkasvaimia nopeammin kuin niiden villityypin valvontaa, mikä viittaa siihen, että MMTV lisäykset saattavat muuttua syöpää asiaa geenien yhteistyötä PTEN haploinsufficiency nisän kasvaimien syntyyn. Jos näin on meidän odottaa löytää rikastamiseen erityisiä CISS in MMTV aiheuttama

PTEN

+/-

nisäkasvaimia verrattuna hallita kasvaimia. Emme kuitenkaan löytäneet mitään merkittävää yhteyttä joko taustalla tutkimuksessamme (taulukko 2). Tämä viittaa siihen, että MMTV integraatiot esiintyy tai lähellä samaa syövän kuljettajan geenejä, riippumatta

Trp53

tai

PTEN

tila. Oli myös suuri ero käyttöikä välillä MMTV-tartunnan FVB ja BALB /c villityypin hiirissä (kuva 1b). Myös täällä, emme löytäneet mitään merkittävää yhdistyksen välillä CISS ja rasitusta tausta. Vaikka havaitsimme lisäykset lähellä

Hbegf

vain FVB taustalla (kuva 2), tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä, johtunee esiintyvyys on alhainen lisäyksiä lähellä tätä geeniä. Se kuitenkin vihjaavat kohti sitä mahdollisuutta, että aktivointi

Hbegf

voi olla onkogeeninen in FVB hiirillä mutta ei BALB /c-hiirissä.

Co-esiintyminen ja molemminpuolisen poissulkemisen välillä Ciss

meidän analyysi yhteisistä sisäänpanokohdat tuottanut useita uusia mutta harvoin merkitty loci. Analysoimme lisäys kaavoja kaikille CISS kaikissa kasvaimet luoda suhteita lisäys kuviot näissä CISS. Insertiot voi esiintyä toisensa poissulkevia integraatio malli, joka voisi merkitä toiminnallinen redundanssi välillä kohdegeeneissä kuten on esitetty

Myc

ja sen paralogi

N-myc

[33]. Toisaalta yhdessä esiintyvät insertioita voidaan havaita, jos kasvaimia synnyttävän vaikutuksen molempien lisäyksiä on synergistinen. Tunnistamaan tällaiset toiminnalliset suhteet, päätimme yhdessä esiintyminen ja molemminpuolisen poissulkemisen välillä tilastollisesti merkitsevä CISS tutkimuksessamme kuvatulla tavalla Menetelmät jaksossa (kuva 3).

CISS ilmaistaan ​​niiden käsin kuratoinut kohdegeenin. Red reunat osoittavat yhteistyön esiintyminen suhde, kun taas vihreät reunat osoittavat toisensa poissulkevia suhdetta. Numero suluissa ja koko solmut osoittavat määrän kasvainten virusperäisen lisäys asianomaisessa CIS. Paksuus reunoilla on mitta merkitystä suhde solmujen.

Useat havainnot voidaan tehdä tämän analyysin. Ensinnäkin, merkittävä yhteistyö esiintyminen tapahtuu pääasiassa välillä harvoin lisäyksiä ja molemminpuolisen poissulkemisen pääasiassa välillä erittäin usein lisäyksiä. Tämä harha on todennäköisesti johtuu tavasta testaus, joka on alimitoitettu alhaisen lisäys taajuuksilla. Harvoin, toisensa poissulkevia insertiot tarvita vieläkin otoskoko tulla merkittävä, kun taas harvoin, yhdessä esiintyvät insertiot voi nopeasti tulla merkittävä.

Toiseksi mielenkiintoinen suhteet todettiin jäsenten välillä

Fgf

-ligandiperheen ja niiden reseptorien,

FGFR

geenejä. Esimerkiksi FGFR ligandien FGF8 ja FGF3 näyttäisi olevan vastavuoroinen parempana reseptoria FGFR1, koska

Fgf3

lisäykset ovat toisensa poissulkevia kanssa

FGFR1

lisäykset taas

Fgf8

lisäyksiä merkitsevästi yhteistyössä esiintyä

FGFR1

lisäyksiä. Tämä saattaa viitata etuoikeutettu sidoskumppanien eri ligandien ja valikoiva etu lisäävä säätely sekä ligandin ja sen Hyväksytty reseptori.

Lisäksi havaitsimme molemminpuolisen poissulkemisen jäsenten välillä yksittäisten geeniperheiden (esim

Wnt

geenit ja

Fgf-Hbegf

geenejä). Piirtämisen kumulatiivinen lisäys kaavoja viisi erillistä perheille CIS geenien (

Wnt

,

Fgf /EGF

,

FGFR

,

RSPO

ja

PDGFR

) paljasti tyypillisen toisensa poissulkevia integraatio malli geenien kunkin perhe (kuva 4), joka osoittaa, että MMTV tartunnan soluja saa juurikaan mitään valikoivaa etua MMTV lisäykset lähellä useita jäseniä saman geeniperheen. Näiden tulosten perusteella päätimme etsiä suhteita CIS geeniperheistä sijasta yhden CIS geenien.

Kullekin viisi perhettä pilarien osoittavat kasvaimia sisälsi asetettiin paikoilleen kyseisen perheen jäsen. Rivit osoittavat erityisiä kasvaimia.

malli MMTV kasvainprogression

Tuloksemme osoittavat, että MMTV ensisijaisesti kohdistettu melko rajallinen joukko geenejä ja geenien perheitä. Jos annamme pelkästään CIS geenejä ja CIS perheitä, jotka ovat alttiita MMTV lisäyksiä kymmenen tai enemmän kasvaimia, meillä on jäljellä vain 11 ryhmien CIS geenien (taulukko 2). Olimme kiinnostuneita nähdä, jos voisimme löytää ero klonaalisuuden näiden geenin ryhmissä. Verrattaessa insertiot lähellä kaksi jäsentä näistä ryhmistä yhden kasvain, joka on enemmän klonaalinen insertioita on myös korkeampi klonaalisuuden pistemäärä perustuu ainutlaatuiseen LP laskee. Tämä saattaa merkitä aikaisempaan tapahtumaan ja /tai voimakkaampi osuma johtaa vahva positiivinen valinta. Testasimme kaikkien 11 ryhmille CIS geenien kaikkien paria lisäyksiä joka tapahtui samassa kasvain, jotta voidaan testata, jos jäsenet yhden ryhmän on jatkuvasti suurempi klonaalisuuden tulokset kuin jäsenet toisen ryhmän samanaikaisen käytön mutatoitunut samassa kasvain (katso menetelmät lisätietoja).

Kuvio 5a esittää lämpökarttana kanssa CIS-geenin /perhe paria on ollut huomattava klonaalisuuden suhteen mukaan binominal testi. Tämä analyysi paljastaa merkittäviä suhteita

Wnt /Fgf

geeniperheiden (korkeampi klonaalisuuden) ja

RSPO

,

Sfmbt2

,

PDGFR

,

FGFR

,

Irs4

,

Eras

ja

Map3k8

(alempi klonaalisuuden). Kuvassa 5b me visualisoida ainoastaan ​​nämä merkittävät suhteita sekä niiden suuntatoiminto. Tästä data-driven mallia voimme muotoilla yksinkertainen etenemisen malli MMTV aiheuttama hiiren maitorauhasen tuumorigeneesiä. Kasvain-aloittamisen MMTV integraatiot ovat todennäköisin lähelle

Fgf

tai

Wnt

geeniä, kun taas lisäykset kohteen muu IVY geenit ovat toissijaisia ​​tapahtumia. Kaikkien muiden suhteiden testattu ei joko ole selkeää klonaalisuuden suhteessa tai ei ole kasvaimia, jossa ne ovat yhteistyössä mutatoitunut. Kaikissa 47 kasvaimia, jotka osoittivat co-mutaatio

Fgf

ja sen reseptori

FGFR

,

Fgf

lisäys oli klonaalinen, jotka osoittavat, että FGF ligandi on aina aktivoitu aikaisemmin kuin FGF-reseptori aikana MMTV syövän etenemiseen.

. Lämpökarttana kaikista yhdistelmistä geenin perheiden ja yksittäisten geenien ole määritetty perheeseen. Merkitsevää eroa klonaalisuuden jokaiselle perheelle on laskettu käyttäen binominal testi kaikille näytteille, jotka ovat yhteistyössä asetettu kyseisen geenin (perhe) pari. Sininen neliö osoittaa merkittävää klonaalisia suhteessa ryhmästä merkitty Y-akselilla ryhmään merkitty X-akselilla. Keltainen neliöt osoittavat merkittävää klonaalisen suhde ei X-akselin ja Y-akselin. Musta neliöt osoittavat ei ole merkittävää yhteyttä. B. verkko otetaan heatmap A. näytetään vain merkitsevä (P 0,05) klonaalisuuden suhteita. Reunan pistettä enemmän klonaalinen geeni (perhe) pienimpään klonaalisia geeni (perhe). Paksuus reunan on mitta merkityksestä klonaalisuuden suhteen. Sillä osa näkyy reunat, osoittaja edustaa monta kertaa isäsolmuna oli korkeampi klonaalisuuden pisteet, kun taas nimittäjä edustaa monta kertaa lapsisolmun oli korkeampi klonaalisuuden pisteet, on kasvain, joka sisälsi insertioita molemmissa solmuissa.

keskustelu

Viimeaikaiset tutkimukset ovat eläytyä heterogeenisen meikkiä ihmisen kasvaimista [2], [3] osoittaa, että tasainen kerääntyminen tausta mutaatioiden kattaa sitä, että vain kourallinen ajo mutaatioiden aiheuttaa onkogeenisia erilaistumista. Hiiren järjestelmä, pystyimme määrittelemään selkeästi kuljettajalle geenit MMTV aiheuttama nisäkasvainten ja järjestys, jossa ne saavat purettu.

MMTV insertiomutageneesiin

Tässä tutkimuksessa analysoitu suuri ryhmä hiiriä, jotka kehittyi kasvaimia kautta MMTV insertiomutageneesiin. Sisällä aineisto 6600 ei-tausta MMTV insertiot 600 kasvaimista, tunnistimme 30 yhteinen sisäänpanokohdat kattaa 1271 ja 6600 lisäykset (19,3%). Käytimme tätä aineisto käsitellä useita kysymyksiä MMTV aiheuttama hiiren maitorauhasen tuumorigeneesiä. Ensinnäkin, halusimme nähdä, jos voisimme tunnistaa uusia MMTV Ciss tässä suuressa aineisto käyttämällä suuren läpimenon Shear-Splink lähestymistapaa. Huomasimme, että 30 MMTV CISS kohdistaa rajoitettu määrä hyvin määriteltyjä geenin perheiden ja hyvin vähän muita geenejä. Kaikkiaan 53 MMTV CISS on aiemmin tunnistettu (taulukko S1). Päällekkäisyys välinen luettelo tunnetuista MMTV CISS ja lista on vain 18 CISS. Tämä tarkoittaa, että 66% aiemmin todettu CISS ei voitu vahvistaa tässä tutkimuksessa. Vaikka on mahdollista, että CISS hyvin subclonal insertiot ei havaitse meidän Shear-Splink menetelmä, uskomme, että tutkimus on sekä vähemmän puolueellinen (käyttämällä DNA leikkaus sijasta restriktioentsyymikatkaisukohdan) ja vankempi (koska me mitata paljon lukee saman insertion) kuin vanhemmat tutkimukset perustuvat eristämiseen ja Sangerin sekvensoinnin yksittäisten MMTV insertiokohtia. Myös käyttö LP pisteet suodattaa taustan lisäyksiä tiedoista on tehokas tapa rajoittaa vääriä positiivisia havaintoja. Vaikka on mahdollista, että menetelmä tuottaa vääriä negatiivisia, on ehkä enemmän todennäköistä, että jotkut aikaisemmin tunnistetut Ciss matkustajia tai satunnainen integraatio sivustoja. Tuloksemme viittaavat siihen, että MMTV aiheuttama rintarauhasen kasvaimien syntyyn on hyvin erityinen sairaus, johon liittyy rajallinen määrä solukohteeseen geenejä, jotka voivat edistää lisääntymistä, eloonjääntiä ja /tai itsensä uusimisen MMTV-tartunnan rintarauhasen epiteelisolujen. Sinänsä MMTV ei ole kovin joustava insertiomutageneesiin järjestelmä ja siksi ehkä ole paras lähestymistapa tunnistaa uusia ehdokas rintasyöpägeeneihin villityypin hiiriä tai kasvaimeen taipumusta GEM malleja. Tätä käsitystä tukee se, että emme voi löytää erityisiä MMTV insertioita nisäkasvaimen-altis hiirillä, joilla on heterotsygoottinen

PTEN

poisto tai kudosspesifisiä menetys

Trp53

, vaikka MMTV-tartunnan

PTEN

heterotsygoottista hiirille kehittyi nisäkasvaimia nopeammin kuin niiden villityypin kollegansa. MMTV aiheuttama tuumorigeneesiä ilmeisesti hyötyy haploinsufficiency varten

PTEN

mutta mutaatio tiettyjen yhteistyökumppaneita ei tarvita tämän ehdon. Tuloksemme eivät sulje pois, että MMTV voi antaa asiasta eri lisäys kuvio hiirten maitorauhasen-erityinen yli-ilmentyminen voimakkaan onkogeenin.

Huolimatta vahvasta bias MMTV aktivoimiseen Wnt /Fgf perheenjäseniä, voisimme silti tunnistaa useita uusia CISS MMTV koska suuri määrä näytteitä me mukana meidän analyysi. Jotkut uusista CISS kuulu perustettu kohdegeenin perheet, joka osoittaa, että meidän menetelmä pystyy tunnistamaan tosi positiivisia, vaikka ne vain tapahtuvat 1% näytteistä, kuten on laita

FGFR3

. Voidaan olettaa, että ylimääräiset harvinaisia ​​MMTV Ciss voidaan tunnistaa lisäämällä edelleen näytteen koko tutkimuksen.