Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ef reseptorityrosiinikinaaseilla välittävän juxtacrine signaaleja olemalla vuorovaikutuksessa ”in

trans

” ligandeilla ankkuroitu pinta naapurisolujen kautta GPI-ankkuri (efriini-As) tai transmembraaninen segmentti (efriini-B), joka johtaa reseptoriin klustereiden ja lisääntynyt kinaasiaktiivisuus. Lisäksi, liukoiset muodot efriini-A-ligandit vapautumaan solun pinnalta matriksimetalloproteaaseja voi myös aktivoida EphA-reseptorin signalointia. Näiden

trans

vuorovaikutusta, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Eph reseptoreihin ja Efrii- yhdessä ilmenivät neuronit voivat myös osallistua sivusuunnassa ”

cis

” yhdistyksiä, jotka vaimentavat reseptorin aktivaatio Efrii- in

trans

kriittiset toiminnallisia seurauksia. Vaikka on tärkeää, että Ef /efriini järjestelmän kasvainten synnyssä, Ef reseptori-efriini

cis

yhteisvaikutuksia ei ole aiemmin tutkittu syöpäsoluissa. Tässä osoitamme, että syöpäsoluja, ekspressoidaan efriini-A3 voi estää kykyä EphA2 ja EphA3 sitoa Efrii- in

trans

ja aktivoituvat, kun taas efriini-B2 voi inhiboida ei vain EphB4 myös EphA3.

cis

esto EphA3 by efriini-B2 merkitsee sitä, että joissakin tapauksissa Efrii- joka voi aktivoida tietyn Ef reseptorin

trans

voidaan kuitenkin estää sen signalointia valmius

cis

-alueella. Huomasimme myös, että EphA3 mutaatiosta keuhkosyövän Parantaa

cis

vuorovaikutus efriini-A3. Nämä tulokset viittaavat siihen, uudella mekanismilla, joka voi edistää syövän synnyssä se vaimentaa kasvaimen tukahduttamalla vaikutukset Ef reseptorin signalointipolkujen aktivoidaan Efrii- in

trans

.

Citation: Falivelli G, Lisabeth EM, de la Torre ER, Perez-Tenorio G, Tosato G, Salvucci O, et al. (2013) vaimennus Ef -reseptorikinaasi Activation syöpäsoluissa koekspressoida Efriini Ligands. PLoS ONE 8 (11): e81445. doi: 10,1371 /journal.pone.0081445

Editor: Renping Zhou, Rutgers University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 elokuu 2013; Hyväksytty: 21 lokakuu 2013; Julkaistu: 29 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Falivelli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää P01CA138390 ja P01HD025938 myöntää 18XT-0099 alkaen tupakka-tautiin liittyviä tutkimusohjelma (EBP), jälkeisten apurahan Espanjan Foundation for Science and Technology (FECYT, ERT), National Institutes of Health tohtorintutkinnon koulutus avustus T32CA121949 ja tutkijatohtorin 20FT-0076 alkaen tupakka-tautiin liittyviä tutkimusohjelma (EML), ja tutkijatohtorin Dnr 2009-7360 Ruotsin Research Council (GP). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jäsenet suuren Ef reseptorityrosiinikinaasia perheen, ja erityisesti EphA2 ja EphB4, on yli-ilmentynyt monenlaisia ​​kasvaintyyppien [1,2]. Ef reseptoreihin signaalin olemalla vuorovaikutuksessa ”in

trans

” kanssa Efrii- ilmentyy viereisiin soluihin, mikä edistää reseptorin klusterointia, autofosforylaation ja kinaasiaktiivisuuden [3]. Liukoisia muotoja efriini-A-ligandit vapautumaan solun pinnalta matriksimetalloproteaaseja voi myös aktivoida EphA-reseptoreihin [4-7]. Kuitenkin Ef reseptorit syöpäsolut ovat usein huonosti tyrosiinifosforyloituu [3]. Tämä viittaa alhainen aktivointi Efriini ligandien ja on yhdenmukainen kasvaimen tukehduttamisvaikutusten raportoitu useista Ef reseptorin alavirran signalointireitteihin [1,8,9].

Puute merkittävä Ef reseptorin aktivointi on joissakin tapauksissa alhaisten ilmentymisen Efriini ligandien syöpäsoluissa korkean reseptorin ilmentymisen [1,10-13]. Lisäksi useat muut mekanismit voivat pitää Ef reseptorin aktivoitumisen alhainen syöpäsolut ilmentävät myös efriini ligandeja. Esimerkiksi syöpä mutaatioiden on osoitettu häiritä efriini sitova kyky tai kinaasiaktiivisuutta Eph-reseptorien [14,15]. Lisäksi ei ole E-kadheriinin riippuvainen solu-solu-adheesio voi heikentää EphA2 reseptorin aktivoitumisen rintasyöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, tehotonta EphA2

trans

vuorovaikutus Efrii- [16]. Toinen mahdollinen mekanismi heikentää Ef reseptorin alavirran signalointia syöpäsoluissa voisi käsittää inhiboiva sivusuunnassa

cis

vuorovaikutukset Eph-reseptorien ja Efrii- yhdessä ilmenivät samassa soluissa [2,17,18]. Inhiboiva

cis

yhteisvaikutuksia Efrii- on osoitettu olevan tärkeä rooli hienosäätöä Ef reseptorin aktivaatio hermoston tarkasti valvoa Axon Polunetsintä ja synaptisen toiminnan [1,18-21]. Kuitenkin

cis

vuorovaikutuksia ei esiinny kaikissa neuronien ilmensi Ef reseptorit ja Efrii- koska joissakin neuronien reseptorien ja ligandien miehittää erillistä mikrodomaineja solukalvon ja näin ollen voi sekoittua [20,22]. Olipa

cis

vuorovaikutukset Eph reseptorien ja Efrii- voi esiintyä myös syöpäsoluja ei ole aiemmin tutkittu.

Biokemialliset ja rakenteelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että

cis

vuorovaikutusta siihen kuuluu Ef reseptori-efriini sitovan rajapinnan eroaa välittävä korkean affiniteetin vuorovaikutus

trans

[18,23]. Ekstrasellulaarisen alueen sekä EphA ja EphB-reseptorin luokat sisältää N-pään ligandia sitovan domeenin, joka on kysteiinirikas alue ja kaksi fibronektiinin tyypin III domeeneja [3]. Toinen fibronektiinidomeeniin seuraa transmembraaninen segmentti ja sytoplasminen alue, joka sisältää tyrosiinikinaasidomeeniin, SAM-domeenin ja PDZ sitova motiivi. Efrii- koostuvat N-terminaalisen Ef reseptoria sitova domeeni on liitetty lyhyen linkkerin alueen glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) ankkuri efriini-As ja transmembraanisen segmentti, jota seuraa lyhyt sytoplasminen alue varten efriini-B. Ef reseptorin efriini sitoutumisen

trans

on lähinnä vuorovaikutuksen G-H-silmukan efriini ja tasku sisällä ligandia sitovan domeenin Ef-reseptorin [24]. Nämä rajapinnat pääasiassa tukevat siveetön vuorovaikutukset Ef reseptorien kanssa Efrii- kuuluvat samaan A tai B-luokan. Toisaalta,

cis

vuorovaikutus on ehdotettu mukaan fibronektiinin tyypin III domeeneja, että Eph-reseptorin ja alueen reseptoria sitovan domeenin efriini, joka on erillään GH silmukan [18,23 ].

Tässä osoitamme, että Ef reseptoreihin ja Efrii- yhdessä ilmenivät syöpäsolut voivat harjoittaa

cis

vuorovaikutuksia, jotka estävät Ef reseptorin aktivoitumisen Efrii- in

trans

. Mielenkiintoista on, että olemme havainneet inhibitio EphA3 aktivaation kautta

cis

vuorovaikutus ei ole vain efriini-A3, mutta myös efriini-B2, joka ei ole aktivoiva ligandi EphA3 [25], mikä viittaa siihen, että

cis

vuorovaikutukset eivät näytteille saman reseptorin ligandi selektiivisyys kuin

trans

vuorovaikutusta. Olemme myös havainneet, että keuhkosyöpää mutaatiosta toisen fibronektiinin tyypin III toistoa EphA3 parantaa

cis

yhdistys reseptorin kanssa efriini-A3.

Tulokset

Efriini-A3 -parin syöpäsoluissa vaimentaa EphA reseptoriaktivaatiossa in trans liukoinen efriini-A3

vaikutuksen tutkimiseksi efriini -parin on Ef reseptorin signalointia syöpä solut, tutkimme EphA3 (an Ef reseptori jolle estävää

cis

vuorovaikutuksia efriini-As on tutkittu laajasti hermosoluissa [17,18,20]) ja EphA2 (jäljempänä EphA reseptoria laajimmin ilmaistu syöpäsoluissa [1,26-28] mutta joiden vaikutukset

cis

yhteisvaikutuksia ei ole aiemmin tutkittu). Olemme tartunnan NCI-H226 ja A549 keuhkosyövän solulinjoja lentivirukset koodaa EphA3 ja ZsGreen peräisin bisistroninen transkriptin tai vain ZsGreen kontrollina. Valinnan jälkeen FACS-lajittelu, olemme edelleen tartunnan solut lentivirukset, joka koodaa efriini-A3 merkitty mCherry tai vain mCherry kontrollina, jota seurasi valinta käyttäen. Kaksi lentivirally tartunnan syöpäsolulinjoissa, jotka eivät ilmennä havaittavissa endogeenistä EphA3 tai efriini-A3 (kuvio 1), käsiteltiin sitten efriini-A3 Fc (liukoinen muoto efriini-A3-ligandin fuusioituna Fc-osaan ihmisen IgG

1) aktivoi EphA3 kautta efriini sitova

trans

. Efriini-A3 Fc lisääntynyt reseptorin tyrosiinifosforylaation soluissa ilmensi EphA3 kanssa ohjaus mCherry, kuten odotettua, mutta ei soluissa ilmensi EphA3 kanssa mCherry-efriini-A3 (kuvio 1A, B). Efriini-A3 -parin myös heikennettyjä efriini-A3 Fc-indusoidun aktivaation endogeenisen EphA2 A549-soluissa (kuvio 1C). Siten keuhkosyövän soluja, ekspressoidaan efriini-A3 voivat estää EphA2 ja EphA3 aktivointi Efriini ligandeja.

(A, B) NCI-H226 ja A549 keuhkosyövän solut infektoitiin lentiviruksesta koodaavan EphA3 ja ZsGreen yksin tai yhdessä lentivirus koodaus mCherry-efriini-A3; kontrolli-solut infektoitiin lentivirukset koodaus ZsGreen ja mCherry. EphA3 immunopresipitaatit seulottiin immunoblottauksella fosfotyrosiinille (pTyr) ja uudelleenseulottiin varten EphA3. Lysaatit koestettiin mCherry-efriini-A3 anti-dsRed vasta-ainetta, joka myös tunnistaa mCherry varten EphA3, ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina. Histogrammit osoittavat mukaan normalisoidut keskiarvot ± SE määrällisesti 3 immunoblot sekä A ja B. yksi A549 kokeissa kvantifiointiin käytetään, solut stimuloitiin efriini-A5 Fc. ** P 0,01 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A3 Fc-käsitellyt solut ilmensivät sekä EphA3 ja efriini-A3 efriini-A3 Fc-käsitellyt solut ilmentävät vain EphA3. Huomattavaa on, että EphA3 tasot olivat korkeampia A549-soluja koekspressoivan efriini-A3 /efriini-B2 (katso myös kuviot. 2A, 3B, 4A ja 5C, D), mikä viittaa siihen, että tämä reseptori voidaan stabiloida ekspressoidaan Efrii-. (C) A549-soluja infektoitiin lentivirus koodaavan mCherry-efriini-A3 tai mCherry kontrollina. Immunosaostettiin endogeeninen EphA2 seulottiin immunoblottauksella fosfotyrosiinille (pTyr) ja uudelleenseulottiin varten EphA2. Lysaatit koetettiin anti-dsRed vasta-aine ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina. Histogrammi näyttää normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti 3 immunobloteista. ** P 0,01 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A3 Fc-käsitellyt solut ilmentävät tai ilmentävät efriini-A3.

koekspressiota kanssa efriini-A3 syöpäsoluissa heikentää kykyä EphA3 sitoa efriini-Kuten trans

tutkia syöpäsoluissa efriini-A3 samanaikaisen ilmentymisen heikentää kykyä EphA3 sitoa efriini-A ligandien

trans

, mittasimme sitova liukoisen muodot efriini-A5 tai efriini-A3 fuusioitu alkalisen fosfataasin (AP) ja NCI-H226 ja A549-solut ilmentävät EphA3 yksin tai yhdessä mCherry-efriini-A3. Olemme havainneet efriini-A AP: n soluihin sitoutumisen ainoastaan ​​ilmentävät EphA3, mutta ei soluihin, jotka ilmensivät efriini-A3 EphA3 (kuvio 2A). Immunoblottaus varmistanut, että efriini-A3 -parin ei vähennä yleistä EphA3 tasoilla (kuvio 2A). Biotinylointi solun pinnan proteiinien seurasi ELISA, jossa EphA3 vangittiin vasta-aineen kanssa, ja sen taso biotinylaatio havaittiin streptavidiini konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) osoitti, että efriini-A3 -parin ei vaikuta osa EphA3 läsnä solun pinta (kuvio 2B). Siten ekspressoidaan efriini-A3 keuhkosyöpäsoluissa estää efriini sitoutumista EphA3 in

trans

vähentämättä EphA3 ilmaisua tai pinta lokalisointi.

(A) NCI-H226 ja A549 keuhkosyöpään solut infektoitiin jossa lentiviruksesta koodaus EphA3 ja ZsGreen yksin tai yhdessä lentivirus koodaus mCherry-efriini-A3; kontrolli-solut infektoitiin lentivirukset koodaus ZsGreen ja mCherry. Histogrammit osoittavat sitoutumisen efriini-A5 AP NCI-H226-solujen ja efriini-A3 AP A549-soluihin, paljastaen että efriini-A3 samanaikaisen ilmentymisen estää sitoutumisen efriini AP proteiinien EphA3. Normalisoitu keinoin 2 kokeissa (molemmissa triplikaattinäytteet) ± SE on esitetty. ** P 0,01 yksisuuntaisella ANOVA ja Dunnettin post-hoc-testi verrattuna soluihin, jotka ilmentävät vain EphA3. Immunoblottauksia osoittavat ilmentymistä EphA3, efriini-A3, ja β-tubuliinin kuten latauskontrollina solulysaateista, tarkastaa, että efriini-A3 -parin ei vähentänyt EphA3 tasoja. Itse asiassa, EphA3 tasoja esiintyi korkeampi A549-soluja, jotka ilmensivät samanaikaisesti efriini-A3. Valkoista aluetta osoittaa poiston merkityksetön kaistaa. (B) Solun pinnan biotinylaatio seurasi ELISA, jossa EphA3 vangittiin immobilisoidun vasta-aineen ja sen biotinylaatio havaittiin streptavidiini-HRP paljastaa samanlaisen osa EphA3 pinnalla ilmentävien solujen EphA3 yksin tai yhdessä efriini-A3. Histogrammi näyttää keinoin 2 kokeissa (molemmissa triplikaattinäytteet) ± SE. Inkubointi kaksi kertaa niin paljon lysaatit tulokset olivat samanlaiset, joka osoittaa, että maksimaalinen EphA3 sitoutuminen immobilisoidun vasta-aineen kuoppiin saavutettiin. ** P 0,01 yksisuuntaisella ANOVA ja Tukeyn post-hoc-testi verrattuna soluihin, jotka ilmentävät mCherry ja ZsGreen; p 0,05 vertailussa ilmentävien solujen EphA3 kanssa ja ilman efriini-A3. (C) EphA3 Fc käytettiin pull-alamäkiä kasvualustasta ja lysaatit A549 tai H226-solut infektoitiin ilmoitettu lentivirukset. Immunoblottauksella anti-dsRed-vasta-aine, efriini-A3 havaittiin vain lysaateissa. Pull-alamäkiä myös testattiin Fc tarkistaa tasoa EphA3 Fc. (D) Pinta-proteiinit biotinyloitua infektoiduissa soluissa lentiviruksien koodaa mCherry, mCherry-efriini-A3, tai mCherry-efriini-A3 yhdessä EphA3 ja ZsGreen. mCherry-efriini-A3 immunosaostumissa (anti-dsRed vasta-aine) oli tutkittiin streptavidiini-HRP, osoittaa samankaltaisia ​​solun pinnan tasoa efriini-A3 ilmaistaan ​​yksin tai yhdessä EphA3. IgG, ohjaus immuunisaostumassa ei-immuuni IgGs. Lysaatit koestettiin mCherry-efriini-A3 anti-dsRed vasta-aine.

Yksi mahdollinen selitys näille tuloksille voisi olla, että liukoinen efriini-A3 julkaistiin viljelyalustasta matriksimetalloproteaaseja [4-6] kilpailisi efriini-A3 AP sitoutumisesta EphA3 ligandia sitova verkkotunnuksen. Käsitellä tätä mahdollisuutta, käytimme solunulkoisen domeenin EphA3 fuusioitu Fc-vetää alas efriini-A3 viljelyalustasta tai solut hajotettiin tilavuutta, että viljelyalustan. Efriini-A3 ei voitu havaita immunoblot-pull-alamäkiä solulysaateista, mutta ei viljelyalustasta (kuvio 2C), mikä osoittaa, että suuri enemmistö efriini-A3 pysyivät liittyy solujen aikana 24-48 tunnin ajan meidän kokeissa. Lisäksi, yhden mCherry-efriini-A3 band havaittiin immunoblot, joten on epätodennäköistä, että huomattava osa efriini pilkottiin tuottaa pienemmässä jäljellä liittyy solujen sitoutumalla EphA-reseptoriin. Biotinylointi solun pinnan proteiinien, jota seuraa havaitseminen immunosaostetun biotinyloidun efriini-A3 streptavidiini-HRP vahvisti, että efriini-A3 on samalla paikallistettu A549 solun pinnalla, kun ilmaistaan ​​yksin tai yhdessä EphA3 (kuvio 2D).

EphA3-efriini-A3 cis vuorovaikutus ei vaadi reseptorin ligandia sitovan domeenin

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että cis-vuorovaikutukset vaativat kalvon sijaintipaikkaa Ef reseptorin ja efriini [18]. Siksi tutkia, onko EphA3 ligandisitoutumisdomeenista on välttämätöntä

cis

vuorovaikutus efriini-A3 vai fibronektiinin tyypin III toistot ovat riittävä välittämään

cis

sitova [18,23] olemme transfektoitiin lyhytaikaisesti HEK293-solut, jotka ilmentävät stabiilisti mCherry-efriini-A3 koodaavien plasmidien kanssa EphA3 Dn (typistetty muoto EphA3, josta puuttuu N-pään ligandia sitovan domeenin ja kysteiinirikkaan alueen) tai täyspitkä EphA3. In coimmunoprecipitation kokeissa anti-EphA3-vasta-aine, joka tunnistaa C-terminaalisen alueen reseptorin, havaitsimme yhdistys efriini-A3 sekä täyspitkät ja katkaistun EphA3 (kuvio 3A). Tämä vahvistaa, että EphA3 ligandisitoutumisdomeenista, joka välittää suuren affiniteetin sitoutumisen

trans

, ei ole välttämätöntä EphA3-efriini-A3

cis

vuorovaikutusta.

(A) HEK AD-293-solut infektoitiin lentivirus koodaavan mCherry-efriini-A3 tai mCherry kontrollina. Tämän jälkeen solut transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat täyspitkää EphA3 tai typistetty muoto, josta puuttuu ligandia sitovan domeenin ja kysteiinirikkaan alueen (EphA3 An). EphA3 immunosaostumat koetettiin anti-efriini-A3 antiseerumin ja uudelleenseulottiin ja EphA3, paljastaa, että efriini-A3 yhdessä EphA3 ei edellytä EphA3 ligandia sitovan domeenin. Histogrammi näyttää normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti päässä immunoblot 2 kokeita. p 0,05 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A3 sidottu EphA3 Dn tai täyspitkä EphA3. (B) HEK AD-293-soluja, jotka on infektoitu lentivirus koodaavan mCherry-efriini-A3, The mCherry-efriini-A3 E129K-mutantti, tai mCherry kontrollina, transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa EphA3 An. EphA3 immunopresipitaatit koetettiin varten efriini-A3 ja uudelleenseulottiin varten EphA3, paljastaen että E129K mutaatio ei poista

cis

vuorovaikutusta EphA3. Histogrammi näyttää normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti 3 immunobloteista. p 0,05 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A3 E129K versus efriini-A3 villityypin sidottu EphA3 An. (C) HEK AD-293-solut transfektoitiin kontrolli pcDNA3, pcDNA3-efriini-A3, tai pcDNA3-efriini-A3 E129K. Histogrammi esittää keinot kahden kokeita sitoutumisen EphA3 AP Efriini-A3, joka vahvistaa, että efriini-A3 E129K-mutantti ei sitoudu EphA3 on

trans

. *** P 0,001 yksisuuntaisella ANOVA ja Dunnettin post-hoc-testi verrattuna soluihin, jotka ilmentävät villityyppistä efriini-A3. Immunoblot osoittaa ilmentymisen efriini-A3 ja ephrinA3 E129K kaistoilla ladattu yhtä paljon koko lysaatit. On huomattava, että efriini-A3 yli-ilmennetään HEK-soluissa tuottaa kaksi vyöhykettä, ylemmän kaistan kokoa vastaava kypsän täyspitkän proteiinin.

vaikutuksen tutkimiseksi mutatoimalla efriini GH silmukka, tutkimme E129K mutaatio efriini-A3. Tämä mutaatio ei estänyt

cis

yhdistys efriini-A3 EphA3 Dn (kuvio 3B), vaikka se poisti

trans

vuorovaikutus EphA3 AP (kuvio 3C). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​saatujen vastaavan efriini-A5 E129K mutantti, joka voi myös edelleen heikentää kautta

cis

vuorovaikutuksen EphA3 fosforylaatio sekä EphA-välitteistä kasvun kartio romahtaa ja aksoniohjauksen laukaisee efriini-A ligandien in

trans

[18,20]. Siksi EphA3 ja efriini-A3 voivat yhdistää toisiinsa, vaikka puuttuvat alueet, jotka välittävät suuren affiniteetin sitoutumisen

trans

, tukevat yleistä osallistumista

cis

vuorovaikutukset Ef fibronektiinin tyypin III verkkotunnuksia ja efriini alue erillään GH silmukka.

Euroopan EphA3 G518L keuhkosyöpä mutaatio parantaa cis vuorovaikutus ekspressoidaan efriini-A3

Viimeaikaiset sekvensointi tutkimuksissa on todettu EphA3 mutaatioita keuhkosyövän ja muiden syöpien, ja toiminnallinen luonnehdinta on paljastanut, että monet ovat tappioiden of-function mutaatioita, jotka estävät efriini sitova, kinaasiaktiivisuutta ja /tai solun pinnan sijaintia, mikä viittaa siihen, tuumorisuppressori rooli villityypin EphA3 [14,15,29]. Yksi harvoista mutaatioita, joita ei havaittu heikentävän tahansa EphA3 ominaisuuksia tutkittiin aikaisemmassa tutkimuksessa, vaan pikemminkin hieman lisääntyi EphA3 solun pinnan lokalisointi, on G518L mutaatio toisessa fibronektiinin tyypin III domeeni [14]. Koska G518 in EphA3 vastaa konservoituneen jäännöksen että EphA2-efriini-A5 kiderakenteen osallistuu

cis

käyttöliittymä, tutkimme onko G518L mutaatio saattaa vaikuttaa

cis

yhdistys EphA3 jossa ekspressoidaan efriini-A3. Keskittyä roolista cis vuorovaikutuksen, käytimme EphA3 Dn tai EphA3 Dn G518L mutantti. Coimmunoprecipitation kokeet, joissa käytetään HEK293-solut koekspressoivat mCherry-efriini-A3 EphA3 Dn tai Dn G518L mutantti paljasti lisää efriini-A3, joka liittyy mutantti (kuvio 4A). Mittaus efriini-A5 AP sitoutuminen varmistanut, että efriini-A3 koeskspressio täyspitkän EphA3 G518-mutantti inhiboi sen kyky sitoutua Efrii- trans (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että G518L mutaatio parantaa EphA3-efriini sitoutumisen

cis

ja tukee osallistumista

cis

käyttöliittymä säilytetty glysiinin toisen fibronektiinin tyypin III domeeni [23].

(A) HEK AD-293-solut infektoitiin lentivirus koodaavan mCherry-efriini-A3 tai mCherry kontrollina. Sitten solut transfektoitiin EphA3 Dn tai EphA3 Dn G518L mutantti. EphA3 immunosaostumat koetettiin anti-ephrinA3 antiseerumin ja uudelleenseulottiin varten EphA3. EphA3 G518L mutaatio löytyy keuhkosyöpä lisää affiniteetti sivusuunnassa vuorovaikutusta EphA3 ja efriini-A3. Histogrammi näyttää normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti päässä immunoblot 3 kokeita. * P 0,05 yhdellä otoksen t testi vertailu EphA3 Dn G518 mutantti vs. EphA3 An. (B) A549 keuhkosyövän solut infektoitiin lentiviruksesta koodaavan EphA3 villityypin tai G518L mutantti ja ZsGreen yksin tai yhdessä lentivirus koodaavan mCherry-efriini-A3; kontrolli-solut infektoitiin lentivirukset koodaus ZsGreen ja mCherry. Histogrammi esittää solujen sitoutumisen efriini-A3 AP (yksi koe) ja efriini-A5 AP (2 koetta), joka vahvistaa, että efriini-A3 samanaikaisen ilmentymisen estää sitoutumisen efriini AP proteiineihin EphA3 G518L mutantti. Normalisoitu keinoin 3 kokeita (kukin kaksoisnäytteillä) ± SE on esitetty. *** P 0,001 yksisuuntaisella ANOVA ja Tukeyn post-hoc-testi vertailua solujen ilmensi EphA3 ja efriini-A3 soluihin vain ilmentävät EphA3 ja vertailua solujen ilmensi EphA3 G518L ja efriini-A3 solujen kanssa vain ilmentävät EphA3 G518L. Immunoblot of solulysaateista osoittaa ilmentymisen EphA3, efriini-A3, ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina.

Efriini-B2 -parin syöpäsoluissa vaimentaa paitsi EphB4 vaan myös EphA3 aktivointia ja ligandeille sitova kapasiteetti trans

cis

vuorovaikutuksesta Ef fibronektiinin tyypin III domeeneja ja Efrii- voinut erottuva selektiivisyys verrattuna

trans

vuorovaikutuksesta, joihin sisältyvät Ef ligandisitoutumisdomeenista ja efriini GH silmukka [23]. Tämän tutkimiseksi käytimme efriini-B2, joka ei sitoudu korkealla affiniteetilla EphA3 ligandisitoutumisdomeenista [25]. Me tartunnan A549 keuhkosyöpään solujen ja MCF7 rintasyövän solut lentivirus koodaa efriini-B2 fuusioitu EGFP ja tutki ensin vaikutuksia endogeenisen EphB4, joka sitoo efriini-B2 ligandia

trans

. Kuten EphA2, EphB4 ilmentyy laajalti syöpäsoluissa [1,30] ja sen kykyä säädellä Efrii- in

cis

ei ole aikaisemmin tutkittu. Olemme havainneet, että efriini-B2 ilmentyminen inhiboi efriini-B2 AP solun pintaan (kuvio 5A) ja EphB4 tyrosiinifosforylaation indusoitiin

trans

by efriini-B2 Fc (kuvio 5B). Siten

cis

vuorovaikutus ekspressoidaan efriini-B2 inhiboi EphB4 ligandia sitova

trans

ja aktivointi syöpäsoluissa. Tutkia EphA3 voidaan myös säädellä

cis

vuorovaikutus efriini-B2, me tartunnan A549 keuhkosyövän soluista, jotka ilmentävät EphA3 kanssa lentiviruksien koodaavat EGFP-efriini-B2 tai vain EGFP kontrollina. Mielenkiintoista, efriini-B2 -parin heikennetty EphA3 aktivaation efriini-A3 Fc (kuvio 5C) ja esti kyky EphA3 sitoa efriini-A5 AP ilman vähenemässä EphA3 tasoja (kuvio 5D). EphA3 ilmentyminen lisäsi vain hieman sitovan solunulkoisen domeenin efriini-B2 AP soluihin (kuvio 5D), joka vahvistaa, että efriini-B2 ei tehokkaasti sitoudu EphA3 in

trans

[25]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka efriini-B2 ei ole aktivoiva ligandi EphA3, se voi vaikuttaa EphA3 toimintoa

cis

vuorovaikutusta. Tämä merkitsee sitä, että sitoutumisspesifisyys jotka ohjaavat

cis

ja

trans

Ef reseptori-efriini vuorovaikutukset eivät ole samoja.

(A) Histogrammi näyttää sitoutumisen efriini-B2 AP A549-soluihin tartunnan lentiviruksien koodaavat EGFP-efriini-B2 tai EGFP, paljastaen että efriini-B2 -parin inhiboi efriini-B2 AP sitoutumisen EphB4. Normalisoitu keinoin 3 kokeita (kukin triplikaattinäytteet) ± SE on esitetty. *** P 0.001 parittomalla t testi vertailua ilmentävien solujen efriini-B2 soluihin, jotka eivät ilmennä efriini-B2. Immunoblot of solulysaateista osoittaa ilmentymisen EphB4, efriini-B2 ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina. (B) A549 keuhkosyövän solut ja MCF7 rintasyövän solut infektoitiin lentivirukset koodaa EGFP-efriini-B2 tai EGFP. EphB4 immunopresipitaatit seulottiin immunoblottauksella fosfotyrosiinille (pTyr) ja uudelleenseulottiin varten EphB4. Solulysaatit koestettiin efriini-B2 anti-EGFP-vasta ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina. Histogrammit osoittavat normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti 2 immunobloteilla kunkin solulinjan. * P 0,05 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-B2 Fc-käsitellyt solut ilmentävät efriini-B2 soluihin, jotka eivät ilmennä efriini-B2. (C) A549-soluja infektoitiin lentiviruksesta koodaavan EphA3 ja ZsGreen yhdessä lentivirus koodaavan EGFP-efriini-B2 tai EGFP vain. Ohjaus solut infektoitiin Lentiviruksiin koodausta ZsGreen ja EGFP. EphA3 immunopresipitaatit seulottiin immunoblottauksella fosfotyrosiinille (pTyr) ja uudelleenseulottiin varten EphA3. Lysaatit koestettiin efriini-B2 anti-EGFP-vasta sekä EphA3 ja β-tubuliinin kuin latauskontrollina. Histogrammi näyttää normalisoitu keskiarvo ± SE määrällisesti 2 immunobloteista. * P 0,05 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A3 Fc-käsitellyt solut ilmentävät efriini-B2 soluihin, jotka eivät ilmennä efriini-B2. (D) Efriini-A5 AP: n sitoutumisen solun pinnan EphA3 inhiboi efriini-B2 -parin. Histogrammi osoittaa, keskiarvo ± SE 3 kokeissa (kukin kolmena rinnakkaisena näytettä) sitoutumisen efriini-A5 AP tai efriini-B2 AP: n A549-soluihin käytettiin kokeessa C. efriini-A5 sitova, ** p 0,01 yksisuuntaisella ANOVA ja Dunnettin post-hoc-testi verrattuna soluihin, jotka ilmentävät EphA3 ja EGFP; for efriini-B2 AP sitova, ** p 0,01 parittomia t-testin vertailemista varten soluista, jotka ilmentävät tai eivät ilmennä EphA3. Immunoblot of solulysaateista osoittaa ilmentymisen efriini-B2, EphA3 ja β-tubuliinin kuten lastaus valvonta, tarkastaa, että efriini-B2 -parin ei vähentänyt EphA3 tasoja. On huomioitava, että kaksinkertainen vastaa yli-ilmentynyt efriini-B2 ei johdu eriasteisia N-sitoutunut glykosylaatio, koska poisto N-sitoutuneiden oligosakkaridien kanssa PNGaasi-F endoglykosidaasiksi vastaavasti lisännyt SDS-PAGE liikkuvuuden molemmat bändit (ei esitetty). Onko ylemmän kaistan voi edustaa eräänlaista O-kytketyt oligosakkaridit [51] tai muut translaation jälkeisestä muutos on vielä määrittämättä.

Endogeeninen efriini-As vaimentaa aktivointi ekspressoidaan EphA2 syöpäsoluissa

Sen tutkimiseksi, Efrii- endogeenisesti ilmaistu syöpäsolut voivat harjoittaa myös

cis

vuorovaikutuksia, jotka estävät aktivoituminen ekspressoidaan endogeenisen Ef reseptoreita, päätimme SKBR3 ja MCF7 rintasyövän solulinjoissa. Nämä linjat ilmentävät korkeita efriini-A ligandeja yhdessä EphA2 [11] (broadinstitute.org/ccle), vaikka reseptori ilmentyy suhteellisen alhaiselle tasolle, sopusoinnussa täydentävä ilmaus Ef reseptorit ja Efrii- havaittu monissa syöpäsolulinjoissa [1]. Koska sekä SKBR3 ja MCF7-solut ilmentävät useita efriini-A-ligandeja, jotka ovat GPI-ankkuroitu, käytimme entsyymin fosfatidyyli-spesifisen fosfolipaasi C (PI-PLC) poistaa kaikki efriini-alkaen solun pinnalla. Molemmissa solulinjoissa, poistamalla endogeeninen efriini-Koska solun pinnalta johti tehostettuun EphA2 aktivaation efriini-A1 Fc

trans

käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 6, B). Sitä vastoin PI-PLC hoitoon ohjaus Fc-käsitellyt solut vähenivät alhaisen pohjapinta EphA2 aktivointi, mikä viittaa siihen, että endogeeninen efriini-As voi aiheuttaa joitakin EphA2 aktivointia. Koska efriini-A1 on raportoitu lohkaista pinnasta syöpäsolujen matriksimetalloproteaaseja, myös käsitelty SKBR3-solujen laajakirjoinen matriisi-estäjä GM-6001 [4,6,31]. Hoito estäjän 24 tuntia edelleen lisättävä solun pintaan liittyvä efriini-A1. Kuitenkin, se ei olennaisesti vaikuta EphA2 tyrosiinifosforylaatio aiheuttama efriini-A1 Fc sitoutumisen

trans

, johtuen mahdollisesti jo korkea

cis

inhibitio korkea efriini-A1 läsnä myös Koska GM-6001. Niinpä syöpäsolut

cis

vuorovaikutus endogeenisen efriini-A ligandit voivat vaimentaa EphA2 aktivaation efriini-Kuten esitetty

trans

, tukemalla merkitys

cis

vuorovaikutuksia syövän synnyssä.

(A) SKBR3- ja (B) MCF7 rintasyövän soluja käsiteltiin PI-PLC: ssa 4 tuntia ja sitten stimuloitiin efriini-A1 Fc. EphA2 immunopresipitaatit seulottiin immunoblottauksella fosfotyrosiinille (pTyr) ja uudelleenseulottiin varten EphA2. Lysaatit tutkittiin anti-efriini-A1-vasta tarkistaa poisto efriini-As PI-PLC; β-tubuliinia varmistaa yhtä suuri kuormitus kaistaa. Odyssey LI-COR järjestelmää käytettiin havaitsemiseen ja värikuvia muutettiin harmaasävy Photoshop. Histogrammit esittävät normalisoitu data 3 eri kokeissa * p 0,05 ja *** p 0,001 yhdellä otoksen t-testi vertailu efriini-A1 Fc-stimuloiduista käsitellyn tai PI-PLC. (C) SKBR3 soluja käsiteltiin PI-PLC A tai laajakirjoinen matriisi-estäjä GM-6001 24 tuntia. Immunosaosteita ja lysaatit seulottiin kuten on ilmoitettu.

Keskustelu

Eri perheiden reseptorit ja solun pinnan liittyvä ligandeja, jotka yhdessä välittävät juxtacrine signaalit vuorovaikutuksessa

trans

poikki solu-solu-liittymissä myös, kun ekspressoidaan samassa solun pinnalla, vuorovaikutuksessa sivusuunnassa

cis

[32]. Nämä

cis

vuorovaikutuksia, jotka ovat pääosin tutkittu hermoston ja immuunijärjestelmän, tyypillisesti vaimentaa signaalia laukaisi

trans

vuorovaikutusten mekanismien kautta, että useissa tapauksissa ei ymmärretä hyvin [ ,,,0],32-34]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet keskeinen toiminnallisia rooleja estävää

cis

vuorovaikutukset Eph reseptorien ja Efriini ligandien yhdessä ilmenivät neuronien [17-21].