Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC1 kasvaimeen liittyvä antigeeni ilmentyy voimakkaasti erilaisia ​​kasvaimia. Sen laaja jakelu ensisijaisen kasvaimia ja etäpesäkkeitä tekee siitä houkuttelevan immunoterapian kohteena. Synteesin jälkeen MUC1 lohkaistaan, jolloin saadaan suuri liukoisen ekstrasellulaarisen alfa-alayksikön, joka sisältää tandem-toistojen array (TRA) domain spesifisesti sitoutuneen kautta ei-kovalenttisella vuorovaikutuksella, on pienempi beeta-alayksikön sisältävä läpäisevä ja sytoplasminen domeeni. Toistaiseksi, epäluotettavat teho on raportoitu anti-MUC1-vasta-aineita vastaan ​​liukoisen alfa-alayksikköön. Kohdistaminen soluun sitoutuneen beeta-alayksikön, voi ohittaa rajoituksia aiheuttamat kierrättämällä TRA verkkotunnuksia. MUC1: n signaalipeptidi (SP) domain promiscuously sitoo useita MHC-luokan II ja I luokan alleelit, jotka rokotettaessa, syntyy vankka T-solu immuniteetin MUC1-positiivisia kasvaimia. Tämä on ensimmäinen osoitus ei-MHC liittyvä, MUC1 erityisiä, solujen pinnalla läsnä MUC1 SP verkkotunnuksen. Polyklonaalisia ja monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​tuotettujen MUC1 SP domeeni sitoutuvat spesifisesti monenlaisia ​​MUC1-positiivisen ihmisen kiinteiden ja hematologisten kasvainsolulinjoissa; MUC1-positiivisten luuytimestä peräisin plasmasta, jotka oli saatu multippeli myelooma (MM) -patients, mutta ei MUC1 syöpäkasvain soluja, ja normaali naiivi ensisijainen veren ja epiteelisoluissa. Membraani- MUC1 SP näkyy lähinnä itsenäisenä yksikkönä, mutta myös yhteistyössä lokalisoitu täydellä MUC1 molekyylin. MUC1-SP spesifinen sitoutuminen BM johdettuja plasmaa solut voivat auttaa valinnassa potilasta on hoidettu anti-MUC1 SP terapeuttista rokotetta, ImMucin. Terapeuttinen mahdollisia anti-MUC1-SP-vasta-aineiden ehdotti niiden kyky tukea komplementin lyysin MUC1-positiivisiin kasvainsoluihin mutta ei MUC1 negatiivisia kasvainsoluja ja normaaleja naiivi ensisijainen epiteelisoluja. Nämä havainnot viittaavat siihen uutta solun pinnalla läsnä MUC1 SP domain, potentiaalisen terapeuttisen hyödyn anti-MUC1 SP vasta-aineiden MUC1-positiivisten kasvainten ja valikoima väline MM potilaita on hoidettu anti-MUC1 SP rokote, ImMucin.

Citation: Kovjazin R, Horn G, Smorodinsky NI, Shapiran MY, Carmon L (2014) Cell Surface-Associated Anti-MUC1-Derived signaalipeptidin Antibodies: Implications for Cancer Diagnostics and Therapy. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10,1371 /journal.pone.0085400

Editor: Stefan Dubel, Technical University of Braunschweig, Saksa

vastaanotettu: 09 lokakuu 2013; Hyväksytty: 05 joulukuu 2013; Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Kovjazin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta nro 48447 Israelin johtava tutkija teollisuus- kauppa- ja työ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Lior Carmon on perustaja ja toimitusjohtaja ja Rivan Kovjazin, ja on vanhempi tutkija on Vaxil Biotherapeutics Oy, start-up yhtiö, joka kehittyy ImMucin, anti-MUC1 SP terapeuttista rokotetta vastaan ​​MUC1-positiivisia kasvaimia. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Toinen Kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja.

Johdanto

MUC1 on limaa kaltainen glykoproteiini ilmentyy voimakkaasti eri epiteelin karsinoomien, kuten keuhko-, rinta-, munasarja-, eturauhas- ja paksusuolen, kuten sekä pinnalla hematologiset kasvaimet, kuten multippelin myelooman (MM) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Sen laaja jakelu sekä ensi- kasvain ja etäpesäke, mukaan lukien syövän kantasolut [7], on perustettu sitä laajalti tutkittu immunoterapian kohteena [1], [8], [9], [10]. Itse asiassa, MUC1 oli lueteltu National Cancer Institute pilottihankkeen toiseksi lupaavimmista kohde luettelosta 75 mahdollisten kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) [11].

MUC1 olemassa useita isoformeja [12 ], jossa laajimmin tutkittu muoto on polymorfinen tyypin I transmembraaniproteiinia (MUC1-TM), jotka koostuvat ekstrasellulaarisen domeenin, joka sisältää 20-125 20 aminohappoa pitkä tandem repeat paneelit (TRA), jota seurasi transmembraanidomeeni ja lyhyt sytoplasminen häntä [13], [14]. MUC1 käsitellään eritysreittiin, jolloin saatiin suuri solunulkoinen alfa-alayksikön, joka sisältää TRA domeenin, ei-kovalenttisesti sitoutunut pienempään beeta-alayksikön, joka sisältää molekyylin läpäisevä ja sytoplasminen domeeni [15]. Tähän mennessä, kun taas useimmat anti-MUC1-vasta-aineita kohdistaa TRA domeenin solunulkoisen alfa-alayksikön [16], [17], [18], tutkimukset ovat osoittaneet ristiriitaisia ​​tuloksia, jotka koskevat immunoterapeuttista tehoa kuten vasta-aineisiin perustuvia TRA-epitoopin kohdistaminen [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Nämä epäjohdonmukainen havainnot ehdotetaan olevan seurausta ei-kovalenttinen sidos TRA verkkotunnuksen kasvainsolun pinnalla; liukoisen, kiertävä muoto toimii houkuttimena anti-TRA-vasta-aineita, jotka rajoittavat niiden kykyä saavuttaa MUC1-ilmentäviä tuumorisoluja [23], [25]. Niinpä kohdistaminen MUC1 noncirculating epitooppeja yksinomaan ilmentyy tuumorisolujen pinnoilla voi mahdollisesti ohittaa nämä rajoitukset. Tätä tarkoitusta varten epitooppeja solunulkoinen ja solunsisäinen segmentit ympäröivästä MUC1 TRA verkkotunnuksen, yhdessä epitooppien MUC1: n signaalipeptidiä (SP) verkkotunnuksen, havaittiin [20], [21], [27], [28].

SP ovat lyhyitä 13-50 aminohappoa pitkä lipofiilisen sekvenssit tyypillisesti sijaitsee aminopäässä proteiinien tarkoitettu erityksen tai integrointi solukalvon [29]. Kun proteiini käännös on valmis, SP sisällytetty endoplasmakalvostossa (ER), kalvo yleensä poistetaan kypsän proteiinin, mutta voi silti tulla ER ontelon ja sitoa MHC-molekyyleihin, joko suoraan, koska ainutlaatuinen proteaasiaktiivisuutta ER-membrane- liittyvä signaalipeptidi peptidaasi (SPP) [29], tai epäsuorasti, kuten muutkin huonontuneen sekvenssit, kautta kuljetusliikkeen liittyy antigeenin prosessointia (TAP) koneet [30]. Silti ER lokalisointi ja MHC sitova pätevyyttä SP [31] nojataan sekä niiden hydrofobisesta luonteesta ja tietyssä järjestyksessä. Nimittäin rinnalla ylläpito konsensus motiivin tarpeen, koska kohdistaminen signaali, eri SP osoittavat suurta vaihtelua ja antigeenispesifisyydeltään [29], [32], [33]. Näin ollen, SP domeenit voivat toimia rokote-ehdokkaina (VC), antigeenispesifisen immuunivasteita suuri osa väestöstä.

21-mer SP domeenin MUC1 (MUC1 SP), Tässä keksinnössä MUC1- SP-L tai VXL100 peptidin tai formuloida terapeuttista rokotetta, ImMucin [28], käsitellään ja esitetään yhdessä useiden MHC-luokan I ja II solun pinnalla sekä antigeeniä esittelevien solujen ja eri MUC1-positiivisia kasvainsoluja, jotka voivat aiheuttaa vankka T-solu immuniteetin MUC1-positiivisia kasvaimia [28]. Lisäksi MUC1-spesifisen humoraalisen vasteen voidaan tuottaa vastaan ​​MUC1 SP, kuten ilmenee merkittävää nousua luonnon autovasta-aineiden verenkiertoon MM potilaista, mutta ei terveillä luovuttajilla [34]. Koska liukoisen MUC1 SP ei havaittu potilaiden seerumit [34], se on arveltu, että luonnostaan ​​tuottamat autovasta-esikäsiteltiin ei-MHC-rajoitettu, MUC1-liittyvän kasvainsolun-sidottu SP. Nykyisessä tutkimuksessa selvitettiin tätä mahdollisuutta tuottamalla polyklonaalisia ja monoklonaalisia vasta-aineita MUC1-SP-L. Solun pinnalla läsnä MUC1 SP havaittiin käyttäen esiin vasta-aineet, kasvaimen solulinjojen ja primaaristen kasvainten, mutta ei naiivi primäärisiä soluja. Lisäksi niiden suoran kasvaimia vastustavaa hoidollista potentiaalia, nämä vasta-aineet voivat parantaa valintakriteereitä MM potilaita, joiden tarkoituksena on käsitelty ImMucin anti-MUC1 SP terapeuttista rokotetta.

Materiaalit ja menetelmät

Peptide Synthesis

MUC1-SP-L, MUC1-SP-M, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 ja TB-Rv0476 /4941-SP-L syntetisoitiin täysin automatisoitu, kiinteän faasin, peptidisynteesillä käyttäen fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) /tBu-strategia ja Rink-amidi-polystyreenihartsia (EMC Microcollections, Saksa ja ALMAC Sciences, UK). MUC1-TRA-L ja BAGE-SP-L syntetisoitiin käyttäen samaa menetelmää (GL Biochem, Kiina). Peptidin puhtaus ja identiteetti oli 95%, määritettynä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa ja massaspektrometriaa analyysejä.

Kasvainsolun-linjat ja hybridoomat

Ihmisen B-lymfosyyttisen leukemian linjat Raji ja Ramos ihmisen mM solulinjat U266, ja RPMI8226 ja ihmisen PC-leukemia line ArH-77 kasvatettiin suspensiona RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1 mM HEPES ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Ihmisen munasarjakarsinoomaprote- linja OVARCAR-3 kasvatettiin kiinnipysyväksi kerroksena RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 20% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Ihmisen munasarjakarsinooma line ES-2, melanooma SK-mel-28, ja rintasyövän solulinjoissa MCF7, MDA-231 ja MDA-453 kasvatettiin kiinnittynyt yksisolukerroksista ja ihmisen melanooma SK-mel-1 kasvatettiin suspensio DMEM, jota on täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikki solulinjat hankittiin ATCC: ltä (Manassas VA, USA). Kaikki hybridoomat Tässä tutkimuksessa käytetyt kasvatettiin DMEM täydennetty 10% hevosen seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikki kulttuuri reagenssit hankittiin Biological Industries, (Bet-Haemek, Israel).

Vasta

Anti-MUC1 TRA mAb H23, nosti vastaan ​​ihmisen rintasyövän T47D, [35 ] tunnustaa ei-glykosyloidun MUC1 epitoopin APDTRP, toimi positiivisena kontrollina. Hiiren anti-vuohen tai kanin anti-hiiri-IgG-FITC: tä (Jackson ImmunoResearch, USA) toimi negatiivisena kontrollina FACS-analyysit. Normaalin hiiren tai kanin IgG-vasta-aineita (Chemicon, Millipore, USA) käytettiin komplementin riippuva sytotoksisuus (CDC) analyysit.

Eläimet

Kahdeksan viikkoa vanhoja naaraspuolisia BALB /c-hiiriä (Tel Avivin yliopistossa kasvattamoksi) ja kahden kuukauden ikäinen kaneja (Harlan, Jerusalem, Israel) ylläpidettiin yliopiston eläinten tutkimuslaitoksesta.

Kaikki kokeelliset toimenpiteet, joissa hiirillä ja kaneilla oli hyväksynyt Tel Avivin yliopistossa animal Care komitea.

Patient luuytimenluovuttajien (BM) Aspiraatit ja Ensisijainen Naiivi terveitä soluja

BM aspirates (2-3 ml) vedettiin neljällä potilaalla (iät 50-75) hitaasti etenevän, oireettomia MM, joka oli seulottu ilmoittautuminen osaksi ImMucin n vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa (protokolla VAXIL-001). Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Hadassah yliopistollisen sairaalan, Jerusalem, Israel Israelin terveysministeriön ja rekisteröitiin PRS kuin NCT01232712. Analyysi BM-johdettu PC suoritettiin puitteissa seulontamenettely tutkimuksen ja kirjallinen suostumus päässä MM potilaista saatiin käyttämällä näytettä tutkimukseen. Tuore normaalin ihmisen BM (Cat. No. 1 M-105) ja ihmisen NHEC (Cat. No. CC-2251), ostettiin Lonza Bioresearch (Somerset, NJ, USA). Normaalit ihmisen valkosolut eristettiin buffy-coat näytteet lahjoittama Israelin National veripankki, 3 naiiveja luovuttajilta.

Tuotanto Anti-MUC1 SP Polyklonaaliset vasta

neljä kaneja (R22, R23, R32 ja R33) subkutaani- immunisoitiin neljä kertaa, kahden viikon välein, ja 500 ug keyhole limpet hemosyaniini (KLH) konjugoidun MUC1-SP-M, joka on emulgoitu täydelliseen Freundin adjuvanttiin ensimmäisen immunisoinnin ja epätäydellinen Freundin adjuvantti myöhemmät immunizations. KLH-peptidi konjugaation suoritettiin Adar Biotech (Rehovot, Israel) avulla glutaraldehydillä ajettu silloittumisen. Seitsemän päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen, kaniinin seerumia tutkittiin läsnäolo MUC1-SP-M-spesifisten vasta-aineiden; positiivinen seerumi (tiitteri 1:12,800) kerättiin ja yhdistettiin. IgG-fraktiot kanin R23, kutsutaan R23IgG, käytetään kaikissa immunologisia määrityksiä, tehtiin ammoniumsulfaatti (40%) saostumisen ennen käyttöä, kuten aiemmin on kuvattu [36].

valmistus Anti-MUC1 SP-mAb:

Neljä BALB /c-hiiriä ihonalaisesti immunisoitiin kuten edellä on kuvattu. Kaksi viikkoa viimeisen immunisaation jälkeen hiiret seerumeista arvioitiin läsnäolo MUC1-SP-M-spesifisiä vasta-aineita. Pernasolut korkein positiivinen seerumi-laakeri hiiren kerättiin ja fuusioitiin hiiren NSO-myelooma- kumppani solulinja, käyttämällä polyetyleeniglykolia (molekyylipaino 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Saksa). Hybridoomat valittiin 2 viikon hybri- kasvualustaan ​​täydennetty 2% hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini ja viljeltiin edelleen hybridoomakloonausmaljoille kasvualustaan ​​täydennetty 2% hypoksantiini-tymidiiniä. ELISA suoritettiin näytön supernatantit läsnä anti-MUC1-SP-M IgG Abs. Positiiviset näytteet seulottiin ELISA ja olivat edelleen subkloonattiin ja laajennettu. Suuren mittakaavan Ab tuotannon valikoitujen kloonien saatiin aikaan puhdistamalla mAb: itä käyttäen anti-hiiri-IgG agaroosipylvääseen (Sigma, Israel, cat. No A6531). Isotyping mAb suoritettiin käyttäen IsoStrip kit (Roche, cat. No. 1493027).

ELISA-pohjainen seulonta hiiren hyperimmuuniseerumin ja Anti-MUC1-SP-M IgG tuottavat hybridoomat

ELISA-levyt (F96 Maxisorp, Nunc, Tanska) aktivoitiin 1 tunnin ajan 0,1% glutaraldehydiä (Sigma, Israel) karbonaattipuskurissa, pH = 9. Seuraavaksi levyjä päällystettiin 50 ul peptidi (5 ug /ml), karbonaattipuskurissa (yön yli, 4 ° C), minkä jälkeen salvattiin (2 h, huoneen lämpötila) PBS: llä, jota oli täydennetty 5% FBS: ää ja 0,04% Tween 20: tä (ICN Biomedical Inc., USA). Seeruminäytteitä MUC1-SP-M-Immunisoituihin sitten laimennettuna salpauspuskurilla, kun taas näytteet hybridomaviljel- ei laimennettu. Kaikki näytteet inkuboitiin (2 tuntia, huoneenlämpötila), ennen kuin pesty ja hoito (1 h, huoneen lämpötila) kanssa HRP-konjugoitua anti-hiiri-IgG (Jackson ImmunoResearch, USA; 50 ul /kuoppa) jälkeen 1:10,000 laimennuksen estopuskurissa. Perusteellisen pesemisen jälkeen levyt kehitettiin TMB /E-liuosta (Chemicon, Millipore, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

peptidi-vasta-aineen kilpailua määrityksissä hyperimmuuniseerumin ja hybridooman kasvualustaa inkuboitiin 1 ug /hyvin peptidit 96-kuoppaisia ​​ELISA-levyjä (F96 Maxisorp, Nunc, Tanska) aktivoitu glutaraldehydillä. Loput määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Väheneminen vähintään 50% OD oli positiivinen tulos.

virtaussytometria ja Imagestream

Vahvista pinta värjäys MUC1 kasvainten solulinjoissa ja koekspressoimalla MM markkereita ja MUC1 BM aspirates, solut pestiin ja niitä inkuboitiin 30 min värjäyspuskuriin, joka koostuu PBS, johon oli lisätty 3% FBS: ää, 10% ihmisen AB-seerumia ja 0,1% natriumatsidia. BM ”suuria soluja” alun perin aidatulla rinnan vs. sirontamittari. Seuraavaksi solut värjättiin yksi tai useampi seuraavista: anti-ihmisen CD138-APC kaupallisesti konjugoitu Abs (IQ Products, Alankomaat), anti-ihmis-kappa-kevytketju-eFluor 450 ja anti-ihmis-lambda kevyt ketju-PE (eBioscience, USA) ja /tai in-house-valmisteltu FITC- tai PE-konjugoidulla anti-ihmisen MUC1 (anti-MUC1-TRA H23), anti-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 ja SPmAb-2.1-vasta-aineita. FITC- ja PE konjugaatio suoritettiin valmistajan protokollan (Lighting linkki R-fykoerytriini konjugointi Kit, Innova Biosciences, USA). Leimattuja soluja pestiin kahdesti, kiinnitettiin BD CellFIX (Becton Dickenson, USA), mukaisesti valmistajan protokollan, ja varastoitiin 4 ° C: ssa analyysiin asti. Vähintään 1 x 10

6, ja 3 x 10

4 tapahtumaa hankittiin virtaussytometriaa ja kuvan stream, vastaavasti. Sillä imagestream analyysiä, solujen tumat värjättiin Hoechst värjäysliuosta (3.030.145), mukaisesti valmistajan protokollan (MP Biomedicals, CA, USA). Virtaussytometrianalyysi suoritettiin LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, USA) ja tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (TreeStar, USA). Rinnakkaispaikantumisen analyysi suoritettiin Imagestream järjestelmän (ImageStreamX -virtaussytometrissä; Amnis Corp) ja analysoitiin käyttämällä IDEAS samankaltaisuus Kirkas Tarkka ominaisuus (IDEAL 6,0; Amnis Corp). Samankaltaisuus pisteet on mitta, missä määrin kaksi kuvaa korreloi lineaarisesti.

immunofluoresenssimikroskoopilla

kiinnittyneitä soluja (5 x 104 solua /kuoppa) maljattiin lasipeitinlevyille (Marlenfeld GmbH piezo-ohjattu Z-vaiheessa kaikki komennossa Slidebook ™. Kuvat otettiin kanssa Evolve EMCCD kamera (Photometrics; 100 × linssi, 1 x 1 binning, pikselin koko: 0,16 mikronia).

CDC

Various tuumorilinjoja ja HMEC (Target solut) ( 1 x 10

6 solua /ml) leimattiin 2 uCi /ml 3 [H] -tymidiinin (Amersham, UK), 18 tuntia 37 ° C: ssa. Seuraavaksi solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin (2 tuntia, huoneenlämpötila) 100, 50 tai 10 ug /ml H23, R23IgG, SPmAb-6 tai SPmAb-2,1-vasta-aineita. Sitten solut pestiin PBS: llä, ja 1 x 10

4-soluja inkuboitiin (5 h, 37 ° C) 4 ml: n putkissa 20 ul, 10 ui tai 5 ul ihmisen seerumia komplementin (Sigma, Israel). Sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 300 ul PBS: ää, ja siirrostettiin 100 ul /kuoppa kolmena rinnakkaisena, 96-kuoppalevyillä (Griner, De Groot, Saksa). Cell korjuu suoritettiin käyttämällä Unifilter 96-kuoppaisille levyille (PerkinElmer, USA). Radioaktiivisuus määritettiin beeta-laskuri (PerkinElmer, IL, USA). Spontaaniin hajoamiseen, soluja inkuboitiin samoissa olosuhteissa, mutta ilman komplementtia. Täydellistä hajoamista, 10% Triton X100 lisättiin leimattuja soluja. Spesifisen lyysin prosenttiosuus laskettiin seuraavasti: (CPM kokeellisissa hyvin – CPM spontaaniin näyte) /(CPM yhteensä näytteessä – CPM spontaaniin näytteessä) x 100.

Tilastollinen analyysi

Statistical merkitsevyys määritettiin käyttäen Studentin t-testiä. Kaikissa testeissä, vähimmäistaso merkitys 2-tailed testiä asetettiin p 0,01.

Tulokset

Generation MUC1 SP-spesifisten vasta-aineiden

edistämiseksi etsintä luonteesta, spesifisyys ja sijainti antigeenin johtaa sukupolven autovasta-aineiden MUC1-SP-L, KLH-konjugoitua 17-mer MUC1-SP-M peptidi (taulukko 1) käytettiin polyklonaalisten ja mAb: t. MUC1-SP-M valittiin perustuu in silico ennuste tiheän MHC-luokan II ja B-soluepitooppien sekä huomattavan pitoisuuden autovasta vastaan ​​tämän peptidin, löytyy seerumeista MM potilaista [34]. Anti-MUC1-SP-M polyklonaalisia vasta-aineita (positiivinen seerumi tiitteri on ≤1:25,000) saatiin hiirissä (tuloksia ei esitetty), ja kaksi immunisoitujen kanien R23 ja R32 (positiivinen tiitteri ≤1:12,800) (taulukko 1 ja kuvio . 1A vasen paneeli). Anti-MUC1 humoraalivaste osoitti rajoitettu ristireaktiivisuutta (tiitterit 1:800 laimeneminen) sekä eukaryootti (BAGE-SP-L, taulukko 1 ja kuvio. 1A keskimmäinen paneeli) ja prokaryootti (TB-Rv0476 /4941-SP- L, taulukko 1 ja kuvio. 1A oikea paneeli) SP. MUC1-SP-M sisempi epitooppeja eniten tunnustettu R23 olivat MUC1-SP-S1 ja MUC1-SP-S2 (taulukko 1, Fig. 1 B), jotka molemmat sijaitsevat MUC1 SP C-terminuksessa. Kompetitiomäärityksin arvioidaan spesifisyys polyklonaaliset vasta-aineet osoittivat, 50%: n inhibition sekä R23- ja R32-johdettujen vasta-aineiden MUC1-SP-M ja sen sisä- epitoopin MUC1-SP-S2 (Fig. 1 C). Esto 10% saavutettiin muilla MUC1 SP epitooppeja, erityisesti MUC1-SP-S4 ja MUC1-TRA-L, ja jonka BAGE SP domain BAGE-SP-L. Näiden tulosten perusteella, minimaalinen epitooppi R23 ja R32 sijaitsee MUC1-SP-S1 ja MUC1-SP-S2 sekvenssit, eli aminohappoja 12-21.

spesifisyys ja määritelty minimaalinen epitoopin muodostetun anti-MUC1 SP polyklonaalisia vasta-aineita (A-C) ja mAb: t SPmAb-2.1 ja SPmAb-6 (D-E) arvioitiin vastaan ​​immunoivan peptidi MUC1-SP-M ja sen sisäinen epitooppeja MUC1-SP-S1-S5, ELISA määrityksissä. MUC1: n TRA epitoopin, MUC1-TRA-L, ja ei-MUC1 SP domain BAGE-SP-L, käytettiin näissä määrityksissä negatiivisina kontrolleina.

jälkeen perustamisen MUC1-SP -M immunogeenisyys kaneilla päätimme tuottaa mAb hiirillä. Seerumit kerättiin MUC1-SP-M-immunisoitu hiiri nro 1 (M1) (Fig. 1 D) sitoutuu voimakkaasti immunisoivaan peptidi, MUC1-SP-M ( 1:12,800 tiitteri), kohtalaisesti MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 ja MUC1-SP-S3 ( 1:1800-3600 tiittereitä) ja heikosti sitoutuneet MUC1-SP-S4 ja MUC1-SP-S5 ( 1:800 tiitteri). Sera ei onnistunut sitoutumaan MUC1-TRA-L. Sitoutumiskokeet seerumien kanssa hiiren nro 2 osoittaneet korkein tiitterit ( 1:1600) peptidien MUC1-SP-S4 ja MUC1-SP-S5 (tuloksia ei ole esitetty). Kloonauksen ponnisteluja tuotti kaksi mAb: t, yksi, jossa on Ig-gamma1 isotyyppiä, joka on nimetty SPmAb-2,1, ja toinen, jossa on Ig-gamma2a isotyyppiä, joka on nimetty SPmAb-6. mAb spesifisyys validoitiin sitomalla ja kompetitiomäärityksin (Fig. 1 E) eri peptidejä (taulukko 1). MUC1-SP-S2 voimakkaimmin esti SPmAb-2.1, kun taas MUC1-SP-S4 tehokkaimmin esti SPmAb-6 sitova, sekä määritellään minimaalinen epitooppeja vastaavien vasta-aineiden.

Anti-MUC1 SP vasta-aineet sitoutuvat MUC1 -positiivinen tuumorisoluissa

Virtaussytometria-analyysi osoitti kohtalaisen korkea SPmAb-2,1, SPmAb-6 ja R23IgG sitoutuminen MUC1-ilmentävät kiinteiden ja hematologisten kasvaimia (taulukko 2). Anti-MUC1-TRA mAb H23 [35], joka toimi MUC1 positiivisena kontrollina, osoitti yksiselitteisesti reaktiivisuus, ja sitomiskyky samanlainen kuin R23IgG vasta-aineita. Sen sijaan, MUC1-negatiivinen melanooma solulinjojen, SK-mel-28 ja SK-mel-1, ja MUC1-negatiivinen munasarjojen solulinjassa, ES-2, johdonmukaisesti ei reagoinut (pieni geometrinen keskiarvo), kaikkien testattujen vasta-aineiden (Taulukko 2), mikä osoittaa vasta-aineen selektiivisyys MUC1 SP. Lisätukea kasvaimen solu- ja MUC1 SP-vasta-aineiden spesifisyys, saatiin ilman sitoutumisen SPmAb-2,1, SPmAb-6-mAb: t ja R23IgG vasta-aineita ihmisen valkosolujen, erityisesti CD3

+ T soluissa, CD20

+ B-solujen ja CD14

+ myeloidisoluissa, samoin kuin naiivi normaalin ihmisen nisäepiteelisoluissa (HMEC) (taulukko 2).

Anti-MUC1 SP vasta-aineet Lokalisoi että kalvot MUC1-positiivisten kasvainsolujen

lokalisoinnin tunnistaman antigeenin eri MUC1-SP-vasta-aineita määritettiin kautta imagestream analyysi. MUC1 SP läsnäolo havaittiin käyttämällä PE-konjugoitua SPmAb-2,1, SPmAb-6-mAb: n ja APC:-konjugoidun H23 MUC1 TRA mAb, solun pinnalla MUC1-positiivisten munasarjojen OVCAR-3, kun taas mitään ekspressiota ei havaittu MUC1 -negatiivinen munasarjasolulinja ES-2 (Fig. 2A). Sulautuneella kuvia 30000 solujen osoittavat, että MUC1 SP ja MUC1 TRA paikallistaa pääasiassa yksin kalvon solujen. MUC1 SP havaittiin itsenäisenä membraani- verkkotunnuksen, kuten on osoitettu yksi PE

kirkas membraani- värjäystä, 47% ja 56%: n analysoitu solujen käsiteltäessä SPmAb-6 ja SPmAb-2.1, vastaavasti. Rinnakkaispaikantumisen MUC1 SP ja MUC1 TRA-molekyylejä, osoittaa kaksinkertainen PE

kirkas /APC

kirkas membraani- värjäystä, oli vähäistä, ja havaittiin 18% ja 27% soluista alttiiksi SPmAb-6 ja SPmAb- 2,1, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty). Suuri samankaltaisuus MUC1 SP ja MUC1 TRA värjäytymistä (samankaltaisuus kertoimet 1,0) havaittiin (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, rinnakkaispaikantumisen näistä molekyyleistä on hyvin vähän valitut solut. Lisävahvistusta MUC1-spesifisyys näiden vasta-aineiden saatiin spesifinen sitoutuminen anti-MUC1 SP mAb SPmAb-2.1 ja MUC1-TRA mAb H23 ES-2 MUC1-negatiivinen munasarjojen solut ainoastaan, kun ne transfektoimalla MUC1-TM ilmentymisen rakentaa (kuvio 2B).

solun pinnan läsnäolo ja samankaltaisuuden analyysi MUC1 SP-domeenin ja MUC1 TRA arvioitiin OVACAR-3 MUC1-positiivisten ja ES-2 MUC1-negatiivisten kasvainsolujen solulinjojen imagestream analyysillä käyttäen PE- ja APC-tagged anti-MUC1 SP mAb: t SPmAb-2.1, SPmAb-6 ja anti-MUC1 TRA H23 mAb (A). Fluoresenssimikroskopia analyysi suoritettiin myös ES-2 MUC1-transfektoiduissa munasarjojen soluista vs. emo MUC1-negatiiviset solut (B). BF seistä Kirkas ja toissijainen stand anti-hiiri-IgG-vasta-aineita.

Anti-MUC1 SP vasta-aineet sitoutuvat MUC1-ilmentävien MM Plasma solut Fresh Luuydinaspiraatit

Juuri saatu luu luuytimen (BM) aspirates neljä MM potilasta käytettiin tutkimaan, R23IgG vasta sitoutuvat valikoivasti primäärikasvain soluja ex vivo, heterogeeninen asetus. Epäillään plasman soluja (PC) saatiin erotettua (Fig. 3 sarake A), ja niiden fenotyyppi varmistettiin värjäämällä ja kevyen kappa ja lambda ketjut (tuloksia ei ole esitetty). Aidatulla väestö ensi analysoitiin ilmentymisen MUC1 TRA (Fig. 3 sarake C) ja MUC1 SP (Fig. 3 sarake E) CD138-positiivisia soluja. Laji-sovitettua kontrolli vasta-MUC1-värjäystä käytettiin kussakin kokeessa (Fig. 3 sarakkeet B ja D). CD138-positiiviset PC BM aspirates MM potilaiden # 1, # 2 ja # 3 sitoutuneen R23IgG (78,2%, 66,3%, 95,9%, tässä järjestyksessä, on analysoitu solupopulaation) ja H23 (78,3%, 59,2%, 93,2% vastaavasti, on analysoitu solupopulaation) (Fig. 3 saraketta C ja E). Sen sijaan neljäs aspiroimalla (P # 4) osoittivat, alhainen reaktiivisuus sekä H23 ja R23IgG (0,37%, ja 0,45%, vastaavasti, ja analysoitiin väestöstä), vaikka kohtalainen CD138 ilmentyminen (74,9% ja 39,9% soluista, vastaavasti) tässä aspirate. Kontrollina, meillä oli samanlainen virtaussytometria-analyysi BM aspiraatista peräisin naiivi, terveestä luovuttajasta. Solut tässä analyysissä olivat aidatulla kappa ja lambda ilmaus, kuten CD138 ilme oli negatiivinen (Fig. 3 saraketta F). Tulokset (kuvio. 3 saraketta G ja H) vahvisti minimaalinen sitoutuminen ~ 1% sekä MUC1-TRA ja MUC1 SP sekä kappa ja lambda ketjuja. Yhteenvetona, nämä havainnot osoittavat, että R23IgG ja H23 tunnistavat tiettyjä pahanlaatuisia PC, tekee MUC1 SP antigeeni sopii hoitoon valintaan ja seurantaan.

solun pinnan läsnäolo MUC1 SP verkkotunnuksen arvioitiin aidatulla FACS analyysi PC-solujen tuoreita BM aspiraateissa saadut MM potilaista (A-E) ja normaalin naiivi näyte (F-H). Polyklonaalisia anti-MUC1 SP (R23IgG) käytettiin määrittämään MUC1 SP ilmaisu; MUC1 TRA verkkotunnuksen ilmentyminen määritettiin H23 mAb. Kutakin koetta varten, laji-sovitettua kontrolli vasta-MUC1-värjäystä varten: joko normaali hiiri-IgG-FITC: llä (B) tai kaniinin normaalilla IgG-FITC: tä (D). Anti-MUC1 SP mAb (SPmAb-2.1) käytettiin määritettiin MUC1 SP ilmaisu; MUC1 TRA verkkotunnuksen ilmentyminen määritettiin H23 mAb.

Compliment riippuva sytotoksisuus Tukena Anti-MUC1 SP Vasta

käännöskelpoisten antigeenin ja kasvainspesifiteeteillä anti-MUC1 SP vasta toiminnallinen immunoterapeuttiset mahdollisia osoitettiin tehokas lyysin MUC1-ilmentävien solujen R23IgG (Fig. 4A), SPmAb-2.1 ja SPmAb-6 (Fig. 4B), joka osoittaa niiden mahdollisuuksia anti-kasvain efektoreja. R23IgG vasta-välitteisen 60-100% lyysi kiinteää OVACAR-3 munasarja- soluja, ja hematologiset, U266, RPMI 8226, MM, ArH-77 ja Ramos Leukemia kasvainsoluja. Samalla tavalla, SPmAb-2.1 ja SPmAb-6 laukeaa erittäin spesifinen lyysi 90% ja 60-80%, vastaavasti, saman solulinjoissa. Vertailun vuoksi H23 indusoi hajoamista 80-90% testatuista solupopulaatioiden (Fig. 4B). Lysis aiheuttama kaikki anti-MUC1-vasta-aineita oli erittäin merkitsevä (p 0,001 Studentin t-testi) in MUC1-ilmentäviä tuumorisolulinjoja, kun verrataan munasarjasolulinja ES-2, melanoomasolulinjan SK-mel-1 ja NHEC, kolme MUC1-negatiivisia solulinjoja. Yleensä CDC hajoamista teho korreloi voimakkaasti MUC1 solun pinnalla ekspressiotasot, arvioitiin virtaussytometrialla analyysi (taulukko 2), lukuun ottamatta SPmAb-6-mAb, joka osoitti korkean solun pinnalla läsnä, mutta kohtalainen CDC.

sytotoksisia ominaisuuksia anti-MUC1 SP polyklonaalista R23IgG (A) ja monoklonaalisia SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb (B) arvioitiin CDC-analyysillä käyttäen erilaisia ​​kiinteitä, ei-kiinteä, MUC1-positiivisten ja -negatiivinen kasvaimet ja HMEC. MUC1 TRA domain-specific mAb H23, NMS ja NRS eikä (W /O) vasta-aineet arvioitiin valvontaa.

Keskustelu

Huolimatta laajaa tutkimusta koskeva Immunoterapeuttisina potentiaalia MUC1 , vieläkään ei ole lisensoitu tuote vastaan ​​tämän tavoitteen. Epäonnistuminen eristää solusitoista, liukenemattomia MUC1 epitoopit on haitannut kehittää tehokas MUC1 liittyvän immuuniterapeuttista agentti. Merkittävä edistysaskel tehtiin Rubinstein ja työtovereiden [37] ja viime aikoina, jonka Pichinuk ja työtovereiden [24], joka tuotti vasta-aineita alfa- /beeta risteyksessä solujen MUC1s. Nämä vasta-aineet osoittivat erittäin valikoivia MUC1 sitova ja indusoi sytotoksisuutta MUC1-positiivisten kasvainten, kun se liitetään toksiiniin [24]. Perustuen aiempien havaintojen luonnollisesti syntyy anti-MUC1 SP autovasta MM potilailla, mutta ei naiivi terveiltä luovuttajilta, [34] Nykyisessä tutkimuksessa hyväksyi eri strategiaa kohdistaa liukenemattomia MUC1 SP domain. R23IgG, SPmAb-2.1 ja SPmAb-6-vasta-aineiden nostimme, spesifisesti sitoutuneen MUC1 SP, ilman sitovia etuyhteydettömille SP (Fig. 1A) ja MUC1-TRA epitooppeja (Fig. 1 B-E). Minimaalinen tunnistamia epitooppeja nämä vasta-aineet sijaitsee karboksipään MUC1 SP (Fig. 1 C ja 1 E).

Havainnot viittaavat siihen, että SP domeenit voisi mahdollisesti ohjaamaan proteiinit joko solukalvoon tai solunulkoiseen osastoon [33]. Katkaisematon SP domeeneja, kuten tapauksessa proteaasi-inhibiittoreiden, kuten plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-2 [38], tai sen chick homologin, ovalbumiini [39], ohjaavat proteiinin ER ja ei tukikalvon telakka, jolloin saatiin eritys ehjä proteiini. Kun kyseessä on lymfosyyttinen koriomeningiittivirus (LCMV) prekursori- proteiini C, lisätään proteiinin ER kalvo välittyy epätavallinen 58 aminohappoa pitkä SP, joissa pidennetyn N-terminaalinen alue.