PLoS ONE: Genome Wide Methylome Muutokset Lung Cancer
tiivistelmä
Aberrant sytosiini 5-metylaatio taustalla monet vapautettiin elementtejä syöpä. Niistä pariksi ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC), pyrimme profiili DNA 5-metyyli-sytosiini ominaisuuksia, jotka voivat taustalla genominlaajuisten sääntelyn purkaminen. Yhdessä tiheämpää kuulusteluissa on methylome, me näytteitä 1,2 miljoonaa CpG sivustoja kaksikymmentäneljä NSCLC kasvain (T) -ei-kasvain (NT) paria käyttäen metylaatioherkät rajoitus entsyymejä perustuu HELP-mikrosirujen määrityksessä. Löysimme 225350 erilaisesti metyloitua (DM) sivustoja adenokarsinooman
versus
viereisen ei-kasvainkudoksen jotka vaihtelevat taajuuden poikki genomista osastoon, erityisesti huomata geeni elimissä (GB; p 2.2E-16). Lisäksi, kun DM kytkettiin porrastetun transcriptome (DE) samoissa näytteissä, 37056 ero lokuksen adenokarsinooma syntynyt. Noin 90% DM-DE suhteet olivat ei-kanoninen; Esimerkiksi, promoottori DM liittyy DE samaan suuntaan. Niistä kanoninen muutoksia huomattava, promoottori (PR) DM lokusten vastavuoroisesti muutoksia ilmaisun adenokarsinooman mukana
HBEGF
,
AGER
,
PTPRM
,
DPT
,
CST1
,
MELK;
DM GB lokusten yhtäpitäviä muutoksia ilmaisun mukana
FOXM1
,
FERMT1
,
SLC7A5
ja
FAP
geenejä. IPA analyysit osoittivat adenokarsinoomaa-promoottori DMxDE overlay tunnistaa tuttuja keuhkosyövän solmut [
tP53
,
Akt
] sekä vähemmän tuttuja solmut [
HBEGF
,
NQO1
,
GRK5
,
VWF
,
HPGD
,
CDH5
,
CTNNAL1
,
PTPN13
,
DACH1
,
SMAD6
,
LAMA3
,
AR
]. Ainutlaatuinen tutkimuksen tulokset sisältävät löytö lukuisia ehdokas Ainutlaatuinen tutkimuksen tulokset sisältävät löytö lukuisia ehdokas metylaatiokohtia sekä PR ja GB alueilla ei ole aiemmin tunnistettu NSCLC, ja monet ei-kanoninen suhteet geenien ilmentymistä. Nämä DNA: n metylaatio piirteet voitaisiin mahdollisesti kehittää riskin tai diagnostisia biomarkkereiden tai Ehdokaskohteiden uudemmille metylaation lokuksen kohdistettuja ennaltaehkäiseviä tai terapeuttisia aineita.
Citation: Mullapudi N, Ye B, Suzuki M, Fazzari M, Han W, Shi MK, et ai. (2015) Genome Wide Methylome Muutokset Lung Cancer. PLoS ONE 10 (12): e0143826. doi: 10,1371 /journal.pone.0143826
Editor: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut of Experimental hematologian ja Transfusion Medicine, SAKSA
vastaanotettu: 18 elokuu 2015; Hyväksytty: 10 marraskuu 2015; Julkaistu: 18 joulukuu 2015
Copyright: © 2015 Mullapudi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: Tähän liittyviä tietoja voidaan luettavissa GEO arkistossa-GSE315520, GSE 31552.
Rahoitus: Tätä työtä tukivat NCI 1RC1 CA145422-01 (SDS); 1K24-CA139054-01 (SDS); Stony-Wold Herbert Foundation (NM); 1R01-CA180126-01 (SDS Co-PI); P30 CA013330 (Albert Einstein Cancer Center ydin avustus).
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Keuhkosyöpä vastaa korkeinta määrä syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. Syöpä on ominaista genominlaajuisten muutoksia CpG metylaatio, mukaan lukien yleinen genominlaajuisten hypometylaatio (tappio metylaatio) mukaan lukien onkogeenien, ja vastavuoroisesti hypermetylaation tiettyinä loci (lisääntynyt metylaatio), mukaan lukien tuumorisuppressorigeeniä promoottorit [2,3]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että toiminnallinen seurauksena 5-metylaation sytosiini riippuu genomisen yhteydessä ja tietyssä järjestyksessä, jossa se esiintyy [4,5]. Metylointi CG tähteiden CG saaret (CGI) geenien promoottorit liittyy geenien. Kuitenkin metylaatio CGI sisällä geeni elimissä on todettu olevan yhteydessä kudosspesifisiä ilmaisun ja geeniaktivaatiota syövässä genomien [6-8].
Paneelit tunnettu ehdokas tuumorisuppressorigeeneille on tutkittu kliinisissä keuhkosyöpä yksilöitä luonnehtia promoottori-metylaatio [9,10], jolloin saadaan tiivis metylointi allekirjoituksia [11] sekä erottamaan eri histologisia alatyyppejä [12]. Metylointi tapahtuu muutoksia varhaisessa kehityksen aikana keuhkosyövän [13] ja sitä voidaan käyttää ennustavaa markkereita havaita mahdolliset syöpäsairauksia [14,15]. Siten tunnistaminen syrjivien metylaation merkkien voidaan kehittää osaksi diagnostiset määritykset tukiin riskinarvioinnin ja diagnostiikka.
DNA: n metylaatio voidaan mitata kohdennettuja menetelmiä kuten bisulfiittia sekvensointi (tBGS) [16], methylation- PCR (MSP) [17], ja massaspektrometrialla perustuvat menetelmät (Epityper
®) [18]. Jokainen alustan määrityksiä lokus-erityisiä metylaation Tarkempaa, jossa määritellään paneelin geenejä voidaan arvioida metylaatiotilan valita useita CpG tähteiden sisällä. Kuitenkin nämä menetelmät ovat riippuvaisia aiempaa tietoa tietyn epigenomic loci suunnitella määrityksessä.
joukossa löytö menetelmiä havaita metylaation on genomin laajuisesti, yksi lähestymistapa on käyttää metylaatioherkät ja kestävä isoschizmer restriktioentsyymeillä ( HELP, RLM, muut). Muut lähestymistavat ovat kromatiinin immunosaostus metyloitua DNA: ta sitovia vasta-aineita (MBD, MeDIP, muut) tai bisulfiitin sekvensointi alennetun osan genomin (RRBGS, muut) [19]. Kukin näistä menetelmistä on omat harhojen ja välttämättömyys mittakaavassa näytteitä vain pienessä määrässä ihmisen methylome. Koko genomin bisulfiitti sekvensointi [20] tarkoituksena on tiheään kyselyn koko methylome kerta base-tietyllä tarkkuudella. Kuitenkin tällä hetkellä tämä menetelmä on liian kallis ja analyyttisesti intensiivinen suorittaa suuria otoskokoja.
Viimeaikaiset tutkimukset ovat arvioineet genominlaajuisten metylaation keuhkosyöpä löytää kasvain erityisiä metylaation allekirjoituksia syövän genomien [13,21,22] . Selamat
et al
[23] käytti Illumina Infinium HumanMethylation27k alustan luonnehtia genominlaajuisten metylaatio ~ 27000 CpG sivustoja 59 Hyväksytty T /NT keuhkoadenokarsinooma näytteitä, ja kytketty että transcriptome paneelit. Kattava molekyyli profilointi 230 potilasta (adenokarsinooma) ja 178 potilasta (okasolusyöpää) mukaan TCGA [24,25] käytti laajennettu versio samalla alustalla, HM450k, joka tekee kyselyn yli 480000 CpG sivustoja, yli-CpG-saarekkeiden ja rantojen ihmisen genomissa.
Oletimme, että puolueeton genominlaajuisten kasvain vs ei-kasvain etsiä erilaisesti metyloidut loci johtaa tunnistamiseen uusien ja tunnettujen lokusten vapaimpiin keuhkosyöpä. Lisäksi tutkii sama yksilöille ero geenien ilmentyminen sallisi tunnistamisen suurempi vaikutus DM loci, nojalla mahdollinen vaikutus ilme. Testata näitä hypoteeseja, käytimme HELP määritys [26] määrittämään CpG metyloinnin 24 paria kasvain (T) ja viereisen ei-kasvain (NT) ihmisen näytteitä. Tämä määritys kyselyt 1,2 miljoonaa CCGG motiivi määriteltyjä fragmentteja poikki genomiin restriktioentsyymeillä
Hpa
II (metylaatioherkän) ja
Msp
I (metylaatio kestävä) eristämiseksi differentiaalisesti metyloidut fragmentteja genomin. Nämä fragmentit ovat sitten adapteri ligoitiin ja monistettujen ja leimattujen, jonka jälkeen ne ovat yhdessä hybridisoidaan korkea tiheys microarray. Metylaatio havaitaan päissä entsyymin syntyvän fragmentit (CCGG sivustot) ja mitattuna suhteessa
Msp
I syntyvän fragmenttien
Hpa
II syntyvän fragmentteja. Päättely, että metylointi-vapautettu geenit saattavat olla selvemmäksi jos sukulais /lähelle geenin ilmentyminen on muuttunut, me tutki vielä yhdistyksen erilaisesti metyloitua (DM) alueet, joilla on ilmennetty eri (DE) geenit, käyttäen mRNA ekspressiotietojen samasta pariksi T ja NT kirurginen resektio näytteitä.
tulokset
Genome laajuisen tutkimuksen erilaisesti metyloitua loci keuhkojen kasvain vs. ei-kasvain
Niistä 24 NSCLC keuhkojen resektio luovuttajien (S1 taulukko), käyttäen HELP-mikrosirulla määritystä tunnistimme 452754 HpaII fragmentteja merkittävästi erilaisesti metyloitua (DM; p 0,05, FDR-oikaistu) kasvaimen verrattuna viereiseen ei-kasvain (taulukko 1). Näistä DM sivustoja, 57% havaittiin koodaavat alueet (sisältää 38% näistä CCGG sivustojen edustettuina array). (Kuvio 1) Toinen 39% näistä havaittiin intergeenisessä alueilla (48% näistä sivustoista edustettuna array) ja käytti enimmäkseen hypometyloidut kasvaimissa. Noin 7% havaittiin promoottorialueille (26% näistä sivustoja array). Gene promoottorit (PR) ja geenien elimet (GB) osoitti sekä hyper- ja hypo-metylaatio. (Pöytä 1). Promoottori hypometylaatio ylitti hypermetylaation määrä (taulukko 1). Perustuen permutaatio testi suoritettiin käyttäen satunnaisotantaa sisällä osastoissa (PR /GB /IG) huomasimme, että DM loci ovat huomattavasti yliedustettuina geeni kehon alueilla (p 2.2e-16).
452754 loci ovat merkitsevästi erilaisesti metyloitua (DM) välillä T ja NT perustuvat FDR 0,05. Suurin osa DM loci ovat hypometyloidut T vs NT.
(A) Noin 91%: n 1,2 miljoonan loci edustettuna HELP microarray sijaitsevat geenin rungon (GB) ja geenien välinen (IG) alueet, jossa on pieni vähemmistö (9%) käyrän sijaitsevat promoottorit (PR). (B) Tilastollisesti merkittävä (Y-akseli) vs. delta (X-akseli) (suuruus) DM. Delta (X-akseli) ilmaisee eron metylaation välinen kasvain (T) vs ei-kasvain (NT) tietyssä lokuksessa. Loci hypermetyloitunut T suhteessa NT olla delta 0. P-arvo (Y-akseli) on laskettu Benjamini Hochberg säädetty FDR. At FDR p 0,05, 433505 loci kaikilla genomista osastot on todettu differentiaalisesti metyloitavaa T vs NT. Punaisia pisteitä osoittavat tilastollisesti merkitsevä DM loci.
suuruus ero metylaation (delta) vaihteli lokero ja muutoksen suuntaa. Kohtalainen /suuri astetta DM hypermetylaation PR ja GB (delta 1, PR = 74%, Gt = 63%) olivat yleisempiä kuin pieni astetta (1 delta 0,5; PR = 24%, Gt = 33%) hypermetylaation muutokset näissä tiloissa (kuvio 2). Suuruus kohtalainen /suuri hypermetylaation muutokset olivat eroaa hypometylaatio muutoksia, joissa kohtalainen /suuri jakautuminen genomin alueella oli PR = 12%, Gt = 14%, IG = 17%. Sisällä kasvainjouduttimet, CG saaret (CGI) ja CG rantojen (CGS) on useammin hypermetyloitunut kuin hypometyloidut (kuvio 2B). Kaiken jakelu DM loci vaihteli PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut) kaikkien NSCLC histologialtaan (Khin p = 2.2E-16) ja joukossa adenokarsinoomaa-only (ChiSquare1.9E-4). Oli huomattava DM ulkopuolella CGI ja CGS.
(A) Kaikki NSCLC histologialtaan DM on luokiteltu merkityksetön, pieni tai kohtalainen perusteella itseisarvo. (1 abs delta 2 on Kohtalainen /Suuret; 1 abs delta 0,5 on pieni, 0,5 abs delta 0 on mitätön). DM lokusten FDR p 0,05 perustuu pariksi T-testi katsottiin tähän analyysiin. Suurin hypermetylaation tuumoreissa havaittu olevan kohtalainen /suuri voimakkuus promoottoreita ja geenin elimet, kun taas geenien välisen alueen, pienet muutokset ovat yleisimpiä. Valtaosa hypometylaatio havaitaan olevan pieni suuruusluokkaa kaikissa kolmessa lokeroa. Merkittävä osa hypometylaatio muutokset ovat vähäisiä suuruusluokkaa vielä tilastollisesti merkitsevä. (B) suunta DM ja jakautuminen promoottorien luokiteltu perustuen sijainnista CG-saaret ja CG-rantojen. Kun on kyse DM promoottori loci, hypermetylaation on yleisempi kasvaimissa verrattuna hypometylaatio niille loci sisällä CG-saaret ja CG-rantojen. Kaiken DM erot eivät vaihtelevat PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut); kaikki NSCLC histologialtaan olivat Khin p = 2.2E-16; adenokarsinoomaan vain histologia Khin p = 1.9E-4.
Yksittäiset syövän geenien tunnistaa ero metylaation
25 parasta erilaisesti metyloituja loci sisällä promoottorialueille ja geenin elimet luetellaan (S2 Taulukko). Lyhyesti, kaikille histologialtaan yhdistetty DM havaittiin monissa promoottorit (S2A taulukko) [hypermetylaation in
C7orf54
,
DARS
,
SPTAN1
,
DOM3Z
,
PCNX
,
CTNNAL1
, muut; hypometylaatio in
NQO1
,
SIRP1B
,
UNC5CL
,
NFIA
,
CST1
, muut] ja geeni- elimissä [hypermetylaation in
NOL10
,
ARHGEF12
,
UST
,
RGS3
,
MBNL2
, muut; hypometylaatio
FBXL7
,
RyR2
,
NTRK3
,
ADAMTS12
,
PARK2
, muut]. Sillä adenokarsinooma sanottuna DM havaittiin promoottorit [hypermetyloitunut
RASL12; SPTAN1
,
mir-26a
, hypometyloidut
NQO1
,
SIRPB1
,
NF1A
] ja geeni elinten [hypermetyloitunut
AKAP13
,
ANK perhe
,
PRKCE
,
ROS1
; hypometyloidut
FAM171A1
,
PARK2
,
BCAS3
,
RHOJ
] ja monet muut.
Heat karttoja top 50 eniten differentiaalisesti metyloidut loci sisällä osajoukko adenokarsinoomat (kuvio 3A ja 3B) B
(A) Promoottorialueet; ja (B) Gene kehon alueilla. Useat geenit osoittavat ero metylaatio (DM) useamman kuin yhden lokuksen ja näkyvät useita kertoja lämpökartta. Sininen = Non Kasvain, punainen = Tumor.
Top 50 eniten DM loci (FDR säädetty p 0,05, paremmuusjärjestykseen suuruus delta), kuvastavat erottaminen T ja NT useimmissa pariksi näytteistä lukuun ottamatta näytteet 603T, 653T ja 542T. Useat loci samassa geenissä DM, jolloin uusiutumisen geenin nimiä lämpöä karttoja. Ne useita loci geenin sisällä (esim PR:
TMEM88
,
GIMAP6
,
RUSC2
, toiset, GB:
CDH13
,
CACNA203
,
NOMO3
, muut) olivat yleensä yhdenmukaisia, vaikkakin epätäydellisesti, suunnan kanssa DM (hyper- vs hypometylaatio).
CpG metylaatio validointi
metylaatio valtiot kolmen edustajan DM CCGG loci perusteella valittu DEM suuruuden (yksi edistäjä DARS ja kaksi edistäjä RGS3) määritettiin kvantitatiivisesti korkean resoluution Sequenom MassARRAY
® menetelmällä, ja verrataan tuloksia alkaen HELP microarray perustuva määritys käyttäen Spearmanin järjestys korrelaatio ohjelmisto [27]. Korrelaatio (rho) oli 0,72 (p = 0,0006), mikä osoittaa, että tulokset HELP määrityksen korreloi merkitsevästi viitaten tulokset Sequenom MassARRAY
® viite määritys (S1 kuvio) B
tunnistetiedot syrjivä luokittelijoiden
keskimääräinen tarkkuus top 100 tai top 25 DM loci kasvain vs. ei-kasvain luokitus malleja, kaikki NSCLC histologialtaan yhteenlaskettuna, oli 87% ja 90% vastaavasti. On adenokarsinooma datan alijoukon, keskimääräinen tarkkuus huippu 100 ja top 25 DM loci oli 80% ja 79% respectivelyIn Yleensä luokittelua mallit ovat yleensä tarkempia kuin herkkä. (S7 taulukko). Kaksi loci (
LOXL4
ja
LINC00841
) on toistuvasti valittu top DM loci aikana luokitteluprosessia.
Metylointi x Expression Yhdistä
DNA loci integroitiin aiemmin tuotettu mRNA transcriptome microarray data joukossa 21 T-NT paria missä molemmat aineistot olivat käytettävissä. (S2 kuvio). Tämä analyysi tuotti N = 433666 DM loci kaikissa osastoissa (taulukko 2). Esimerkiksi yhdistämällä kaikki histologialtaan tunnistimme n = 75 lokuksen, jotka osoittivat hypermetylaation PR alueilla ja samanaikainen alas-säätely mRNA ilmaisun microarray. Oli n = 219 loci sisällä GB alueilla, jotka osoittivat samanaikainen hypermetylaation ja ylössäätöä ilmaisun.
Kaikki histologialtaan (21 paria).
Promoottori-erityinen subcompartment jakelu (CGI , CGS, muut) on kanoninen DMxGE suhteista (
e
.
g
. promoottori hypermetylaation: geeni alassäätöä)
versus
kaanoniin suhteet (
e
.
g
. promoottori hypermetylaation: geeni ylössäätöä) näkyy kuvassa 4. Kaiken sisällä PR alueilla, CGI kuvioita taipumus seurata kanoninen DM: GE kuvioita (ensimmäinen palkki kutakin vasemmanpuoleisimman kaksi pylväsnäytön kolmoset sisällä paneeli) hieman harvemmin kuin muut promoottori osastoissa. Merkittävää on, että ei-kanoninen DM: DE suhteet olivat noin yhtä yleistä taajuus kanoninen suhteita, joka arvioidaan tämän analyysin. Kaikkien 21 paria (kaikki NSCLC histologialtaan, kuvio 4A), yleinen jakautuminen DMxDE erot eivät vaihtelevat PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut), Khin p = 3.32E-4. Samoin sisällä joukko adenokarsinoomien (kuvio 4B), yleinen DMxDE erot eivät vaihtelevat PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut), Khin p = 1.10E-7. Valtaosa PR DM loci liittyvät hypermetylaation kun DM loci ovat CG saaria. Tämä vaikutus on merkittävä joukossa adenokarsinoomista alijoukkoa samoin, kun DM hypermetyloitunut loci in CG saaret ovat useimmiten liittyy downregulation geenistä.
analyysi DM loci sisällä promoottorialueille ja niiden päällekkäisyys ero geenien ilmentyminen. (Vasen paneeli A) 21 paria (kaikki NSCLC histologialtaan), yleinen erot eivät vaihtelevat PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut), Khin p = 3.32E-4.
(oikea paneeli B) B sisällä joukko adenokarsinoomien kokonaiseroja eivät vaihtelevat PR genomista sijainti (CGI, CGS, muut), Khin p = 1.10E-7. Valtaosa DM promoottori loci liittyvät hypermetylaation kun DM loci ovat CG saaria. Tämä vaikutus on selvempi keskuudessa adenokarsinoomat, jossa DM loci in CG saaret ovat useimmiten liittyy downregulation geenin. KEY: ”M” = metylaation, ”E” = lauseke. Ylöspäin nuoli osoittaa kasvua ja alaspäin nuoli osoittaa laskua.
DNA-kohtien saatu ilmaisu-metylaatio overlay näkyy 3D koordinaatit paneelissa A (S3 kuvassa). Genominen koordinaatit myös näytetään circos tontteja; esimerkki kromosomi 3 näkyy paneelissa B (S3 kuvassa). Nämä levyt merkitsevät yleisen malleja geenin rungon sekä promoottorin metylaation ja mukana geeniekspression muutoksia. Välinen päällekkäisyys DM ja GE GB oli yleisempi kuin PR (osittain johtuen suhteellisesta yliedustus GB
versus
PR alueiden HELP mikrosirulla (taulukko 1). Kanoninen kuvio useimmiten nähty GB oli hypometylaatio ja alassäätöä (S3 kuvassa).
Esimerkkejä määrällinen suhde DM GE promoottoreita ja geenien elinten näytetään valittu sirontakuvaajiin (S4 kuvio). Useimmat geenit, jotka olivat laadullisesti kanoninen varten DM⬄GE suhde osoitti epäselvä määrällinen suhde (ei näy), ne geenit, jotka valitaan näytettäväksi eivät esimerkkinä kanoninen suhdetta.
kahdeksan eri tavalla ilmaistuna (DE) liittyvien geenien promoottori DM loci (S3 Taulukko:
FILIP
,
HBEF
,
TMEM88
,
VWR
,
CASP12
,
NQO1
,
CST
,
XAGE1D
) tehtiin kvantitatiivinen tarkastus microarray-pohjainen GE ilmentyminen muuttuu, käyttäen qRT-PCR skaalattu
GAPDH
sisäinen taloudenhoitaja. S5 Kuva näyttää nämä tulokset, osoittavat yleisesti yksimielisiksi suuntaan GE näiden alustojen välillä (microarray ja qRT-PCR;
r
2
= 0,9367815, p 0,0007), vaikkakin pakattu dynaaminen alue microarray data, kuten on tyypillistä kirjallisuudessa [28].
Yksittäisten geenien paljasti DM x GE Yhdistä
Kaikki NSCLC histologialtaan
: päällekkäin DM x DE overlay (S3 taulukko) tuotti ylimääräistä genomista DM lokusten kanonisen ilme kuvioita (
e
.
g
. PR hypermetylaation: mRNA vaimentua ja PR hypometylaatio: mRNA voimistunut; GB hypermetyloitunut: mRNA voimistunut ja hypometyloidut: mRNA vaimentua) [PR n = 113; GB n = 3972] (taulukko 2). Merkittäviä hypermetyloitunut PR lokusten vastavuoroisesti laski ilme GE oli
HBEGF
,
DPT
,
AGER
,
SPARCL1
,
PTPRM
,
ARHGEF6
,
TMEM88
,
SEMA6A
. Ne PR hypometyloidut lokusten lisääntynyt GE oli
NQO1
,
CST1
,
TNS4
,
FUT2
,
MELK
,
FAM83A
,
MMP-9
,
ja SLCO1B3
. Ne GB lokusten yhtäpitävät metyloinnin ja ilmaisun mukana: hypermetyloitunut /lisääntynyt GE:
FERMT1
,
SLC7A5
,
FAP
,
KRT15
,
ETV4
,
TFAP2a TPX2
,
FOXM1
; hypometyloidut /vähentynyt GE:
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8
,
ABCB1
,
SEMA5A
,
GPM6A
.
Kun on kyse adenokarsinoomien yksin, yhdistimme tulokset DM kanssa DE, ja löysi useita lokusten ero metylaation promoottorit tai geeni elimet ja sukulais geeniekspression muutoksia. Hypermetyloitunut PR lokusten GE downregulation sisältävät
RPL23AP32
,
CTNNAL1
,
HBEGF
,
TMEM88 ja CASP12
. Loci osoittaa PR hypometylaatio ja säätelyä sisältävät
NQO1
,
CST1
,
XAGE1D
,
IGKC ja AIM2
. GB loci osoittaa hypermetylaation ja säätelyä sisältävät
FAP
,
NLN
,
TPX2
,
ja KIF26B
ym. GB loci osoittaa hypometylaatio ja downregulation sisältävät
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8 *
ja muut ( S3 taulukko) B
Metylaatiospesifinen Expression suhde CG-saarilla ja CG-rantojen
kysellä yhdistyksen välillä DM ja DE DM loci sijaitsevat promoottori CG saaret (CGI) ja CG rantojen ( CGS; määritellään 2 kb ylävirtaan CG saaren kuvio 4, S5 taulukko). Havaitsimme vain pieni osa DNA-kohtien (3-11%), joka osoitti DM CGI tai CGS liittyvä odotettu muutos geenien ilmentyminen lähimmän geenin. Näitä ovat geenit, kuten
TMEM88
,
S1P1R
,
FZD4
,
GIPC2
,
DNAJB4
,
ADAMTS1
(hypermetyloitunut CGI ja CGS ja vaimentua) ja BUB1 (hypometyloidut ja voimistuvan).
Pathway analysoi
taulukkoyhteenveto IPA analyysien tarjotaan S6 taulukossa. Kaikki DM loci (Bejamini-Hochberg adj p 0,05), joka vastaa kahdeksaan luokkaan (perustuvat genomiseen lokero, histologian ja /ei geeniekspressiota yhdistämisen) on erikseen analysoitiin IPA, tunnistaa geeni verkkoihin rikastettua sisällä sarjaa DM loci. Kaikissa kahdeksassa tapauksessa, ”Syöpä” oli alkuun liittyvä sairaus lähtötiedot asettaa, vaikka osatekijän geenit olivat erilaiset. Canonical jaksot kekseliäisyyttä tietoperustaa jotka todettiin rikastettua geenissä, joissa on adj. p 0,05 raportoidaan. Kolme verkkojen (All NSCLC histologialtaan, DM vain, GB; adenokarsinoomat DM vain, GB, ja adenokarsinoomista DM + DE molemmat, PR) joukossa kahdeksaan luokkaan havaittiin tilastollisesti merkittävää yhteyttä kanoninen polkuun adj. p 0,05, ja edelleen kuvattu alla.
IPA syöpään liittyvien Networks kuvauksia.
Verkot analyysi näitä merkittäviä verkkojen taulukoitu S6 taulukossa esitetään yhteenveto S6 kuvassa. Näytöt osoittavat, että useat geenit, joilla on tärkeä rooli syöpään liittyvien reittien differentiaalisesti metyloitavaa T suhteessa NT eri luokkiin, ja tuodaan esille joitakin geenejä, joita ei tiedetä tehdä niin. Esimerkiksi yhdistämällä kaikki NSCLC histologialtaan, S6A kuvio esittää syöpään liittyvien verkon johdettu IPA kaikkien DM loci (adj. P 0,05) sisällä GB kaikissa 24 T /NT paria. Geenit kuten
EZH2
,
CDH1
,
CDKN2A
ja
DNMT3A /3B
löytyvät keskeiset kohdat tässä verkossa.
EZH2
(hypometyloidut) on jäsenenä Polycomb-ryhmä perheen ja tärkeä rooli solujen lisääntymisen, kasvun, solusyklin etenemistä, transkription repression ja hyökkäystä.
DNMT3A Twitter /3B (hypermetyloitunut) koodaa DNA metyyli-transferaasin joka on väitetty suorittaa de novo metylointi ja sillä on tärkeä rooli transkription repressiomekanismi signalointi.
CDH1
(hypermetyloitunut) koodaa E-kadheriinin, tunnettu pinta adheesiomolekyyli vaimentua syövissä. CDKN2A (hypermetyloitunut) on inhibiittori CDK4 kinaasi ja on merkittävä tuumorisuppressorigeeniä, tiedetään mutatoitunut tai eri syöpiä.
ZEB1
, GB hypometyloidut, on myös korostettu keskeinen solmu tässä syöpään liittyvien verkkoon. Se koodaa sinkkisormen transkriptiotekijän (tunnetaan myös nimellä
TCF8
), jonka tiedetään indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon NSCLC [29].
Kun on kyse adenokarsinoomat erityisesti ( 16 paria S6b kuvassa näkyy syöpään liittyvien geeni verkko tunnistaa merkittävimmät (oikaistu p 0,05) DM loci (sisällä GB). keskeinen solmukohta tämä verkko on geeni
AR
(androgeenireseptorin), joka havaitaan olevan GB hypometyloidut kasvaimissa. AR on transkriptiotekijä aktivoidaan steroidihormonireseptori androgen. Se on tärkeä rooli solujen kasvun, proliferaation, solukuolemaa ja hyökkäys. Koska ilmeinen keskeisyyden tässä nimenomaisessa DM verkko, me tutkia edelleen DM mety- AR kuin se koskee sukupuoleen. Havaitsimme, että nämä kaksi asiaa DM fragmentteja (vajaan GB) oli merkittävä siinä hypermetylaation GB miehillä verrattuna naisilla NT kudoksessa ainutlaatuisesti (t-testi FDR, fragmentti 1 = 0,041, fragmentti 2 = 3.76E-5). Supervillin
(SVIL) B, on myös geeni, jonka napa tämän verkon (S6b kuvio), ja on GB hypometyloidut kasvaimissa.
SVIL
on perifeerinen kalvoon proteiini, joka säätelee solun liikkuvuus, leviäminen ja jonka tiedetään lisäävän solujen eloonjäämistä vuorovaikutuksessa kasvaimen p53 ja sen loppupään tavoitteet [30].
adenokarsinooma-specific promoottori DM x DE overlay ei korosta tuttuja (
SMAD6
,
tP53
,
CTNNB1
,
NQO1) B sekä tuntemattomia keuhkosyöpä IPA solmuja ( S6c kuvio). Syöpä liittyvät verkon johdetut analyysi koostui yhdestä hypometyloidut geenin promoottori (NQO1) solmussa klusterin vuorovaikutuksessa
TP53
,
HSP70 ja NPM1
. Useat hypermetyloitunut-geenin promoottorit, kuten
HBEGF
,
SMAD6
,
PTPN13
,
CDH5
ja
SFTPC
havaittiin kehällä verkko. Tämä verkosto koostuu useista geenejä, joita ei tunnistettu DM Tutkimuksessamme mutta eivät muodosta osaa verkosta johtuen niiden aiemmin julkaistu vuorovaikutus muiden DM loci, kuten on esitetty avoimessa /valkoinen muotoja.
nykyinen vs entiset tupakoitsijat
otosjoukko 24 henkilöä koostui 11 entiset tupakoitsijat ja 10 tupakoijilla. Tutkimme läsnäolo erilaisesti metyloitua loci perustuu tupakoinnista. At oikaistu p 0,05 tasolla, ei loci todettiin DM välillä nykyisten ja entiset tupakoitsijat.
Keskustelu
Raportoimme methylome vertailua kysely joukon NSCLC kasvainten
versus
pariksi ei-kasvainkudoksessa in poistettu kirurgisella näytteiden tunnistamiseksi genominlaajuisten metylaatio allekirjoitusten keuhkosyöpää, ja suodattaa ne niille germane geenien ilmentymisen muutoksia samasta näytteistä. Tavoitteena on tiedottaminen diagnostinen biomarkkereiden työtä jo käynnissä laboratoriossa, [31] ja tavoite tunnistamista varten tulevaa kehitystä diagnostisia ja ennaltaehkäiseviä /terapeuttiset tutkimuksissa [32,33].
Käyttämällä HELP määritystä, pystyimme kyselyn 1,2 miljoonaa epäjatkuvia CCGG loci (~ 1% methylome) tavalla edustava kaikkien kolmen genomista (PR, GB, IG) alueilla. Käyttämällä FDR säätää p 0,05 cutoff, 452754 loci kaikilla alueilla ja histologialtaan osoittaa tilastollisesti merkitsevä ero metylaatio kasvaimia. Jakauma Näiden DM sivustoja oli selvästi enemmän keskittynyt geenien elimissä kuin promoottorialueille, edes harkitse alueellisen edustuksen muunnelmia ilmaisimen microarray, mitä tukee permutaation testi.
Tutkimukset ovat toistaiseksi yleensä keskittyneet promoottori metylaatio keuhkosyövän, hyödyntäen promoottori-keskittynyt mukautetun mikrosirut [10,15,34] tai helmi paneelit [23,35] ja siten usein kysely vain ennalta valittujen genomialuetta ja käyrän. Tämä on yksi niistä harvoista tähänastisten tutkimusten että enemmän agnostically tutkii genominlaajuisten metylaatio kaikilla alueilla keuhkosyövän genomin useiden näytteiden. Alueet genomin määritettiin HELP määritys riippuvat esiintymät CCGG sivustojen genomissa, eikä mitään etukäteen toiminnallista tai osastoon-viisasta luokituksen loci. HELP määritys on vähemmän promoottori puolueellinen (GB ja IG alueet ovat edustettuina 3,5x kertaa promoottorialueille), mikä mahdollistaa löytö romaanin liittyviä tapahtumia metylaatio muilla genomialuetta Tuumorinäytteissä [36]. Kuitenkin HELP määritys piti ei-CCGG sulautettujen CpG sivustoja sekä ne CCGGs jotka määrittävät kokoluokan ulkopuolelle kohdefragmentin kokoluokassa (200-2000bp). HELP (toisin Infinium HM paneelit) ei keskittynyt havaitsemiseen vierekkäin CpG: t ennalta määriteltyjä geenin promoottorit. Vaikka suuruus yleistä DM eroja kasvainten ja nontumor keuhkokudoksesta tietyssä lokuksessa taipumus olla pieni (yleensä 2-kertainen), rauhoittavia on, että validointi esivalittujen DM lokusten hyvin verrattuna määrällisten viittaustekniikka ( Sequenom MassARRAY
®).
kun tutkitaan geeni luettelot alkuun DM loci löydetty joukosta muita julkaistuja genominlaajuisten tutkimuksia keuhkosyöpään kuin raportoitu tutkimuksessamme havaitsimme, että, kuten odotettua, verran päällekkäisyyttä meidän ja muut tutkimukset on vaatimaton, mahdollisesti osoittaa erot HELP alustalle (joka havaitsee fragmentteja, joita rajoittaa yksittäisten CpG sivustoja, mutta ei ylimääräistä fragmentti-sisäinen CpG sivuille), ja kohdealueilla tiedustella (jotka HELP ovat jakautunut tasaisesti PR, GB, ja IG genomin alueita. lisäksi toteamme, että laajuus päällekkäisyys eri tutkimuksissa käytetty samoja microarray-pohjainen metylaatio (esim Infinium array) ([23,24,35] ei myöskään ollut suuri. Tämä voi johtua eri aihe ja näytteen heterogeenisuus tekijät ja kriteerit sijoitus DM loci. Esimerkiksi Sandoval
et al
[35] yksilöitiin
HOXA7
alueen joukossa alkuun kaikkein muuttuja CpG promoottorit, kun taas saman lokuksen ei raportoitu TCGA tutkimuksessa [24], joka hyödyntää samaa alustaa. Toisaalta, nämä molemmat tutkimukset raportoivat ero metylaatio
HOXA9
lokukseen. Molemmat loci kuulumattomista luettelot alkuun DM loci meidän tutkimuksessa.
Kaiken tutkimuksen tulokset kuuluvat että: on olemassa monia yksittäisiä DM loci /geenejä, erityisesti geenin elimissä (S2 ja S3 taulukot ); on olemassa monia ei-kanoninen DMxDE suhteita; ja genelists ja verkostosuhteita koota aiemmin tunnustettu ja lukemattomia aiemmin tunnistamattomia loci. Kuten aiemmin tunnustettu, genomi on yleinen enemmän hypometyloidut, mutta näyttää myös promoottori hypermetylaation syövän versus pariksi ei-syöpä kudoksiin, kuten oli totta alusta genominlaajuisten tutkimukset ero metylaation keuhkosyövässä [2,21-23].