Krooninen sairaus

tiivistelmä

Testasimme ituradan varianttien osoittaa yhdistyksen paksusuolensyöpä etäpesäkkeiden käyttämällä genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa, jossa verrattiin Ashkenazi juutalainen yksilöiden vaihe IV metastaattinen paksusuolen syöpiin verrattuna niihin, joilla on vaiheen I tai II ei-metastaattinen paksusuolen syöpiä. In kaksivaiheinen tutkimuksen suunnittelu, osoitimme merkittävää yhteyttä kehittää etäpesäkkeitä varten rs60745952, että Ashkenazi löytö ja validointi kohortteja vastaavasti osoitti kerroinsuhde (OR) = 2,3 (P = 2.73E-06) ja OR = 1,89 (P = 8.05E-04) (yli validointi kynnyksen 0,0044). Merkittävät yhdistys metastaattinen paksusuolen syövän varmistettiin edelleen meta-analyysi rs60745952 näissä aineistot lisättynä Ashkenazi validointi kohortti (OR = 1,92; 95% CI: 1,28-2,87), ja permutaatio testi, joka osoitti merkittävästi pidempi haplotyypin ympäröivä rs60745952 siinä vaiheessa IV näytteitä. rs60745952, sijaitsevat intergeenisessä kromosomi 4q31.1, eikä aikaisemmin yhdistetty syöpään, on siis ituradan geneettinen markkeri alttius kehittää paksusuolen syövän etäpesäkkeiden keskuudessa Ashkenazi juutalaisten.

Citation: Markowitz SD, Nock NL, Schmit SL, Stadler ZK, Joseph V, Zhang L, et al. (2016) ituradan Variant kromosomissa 4q31.1 Associatesin Alttius kehittäminen Colon Cancer Metastasis. PLoS ONE 11 (1): e0146435. doi: 10,1371 /journal.pone.0146435

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu 4 helmikuuta 2015 Hyväksytty: 03 huhtikuu 2015; Julkaistu: 11 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Markowitz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla NCBI (hakunumero: PRJNA306392).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health myöntää R01 CA144040 (SDM), P50 CA150964 (SDM), P30 CA043703, U19 CA148107 (SBG ), P30 CA014089 (SBG), K07 CA129162 (NLN), T32 ES013678 (SLS), R01 CA160356 (PS ja SDM), ja R01CA136726 (LL); ja, jonka Leonard ja Joan Horvitz Foundation (SDM), Richard Horvitz ja Erica Hartman-Horvitz Foundation (SDM), Anton B. Burg Foundation USC Norris, Sharon Levine Corzine Research Fund ja, Robert ja Kate Niehaus Clinical Genetics Initiative MSKCC. Tätä työtä tukee osittain National Cancer Institute, National Institutes of Health alle RFA # CA-09-002. Pohjimmiltaan tämä käsikirjoitus ei välttämättä edusta tai politiikkaa National Cancer Institute tai jollekin yhteistyökeskusten että corect konsortio, eikä mainita kauppanimiä, kaupallisia tuotteita, tai organisaatioiden merkitse, Yhdysvaltain hallituksen tai corect konsortio.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolemaa Yhdysvalloissa, jossa 136830 uutta tapausta diagnosoidaan ja 50310 kuolemantapausta vuosittain [1]. Maailmanlaajuisesti peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä, ja toiseksi naisilla, joilla 746000 tapauksissa ja 614000 tapauksissa vastaavasti [2].

Lähes kaikissa tapauksissa, peräsuolen syöpä kuolema johtuu kehittämiseen syövän etäpesäkkeiden kaukaisiin elimiin, useimmiten yleisesti maksassa [3]. Aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että kaikki somaattisista mutaatioista esiintyy paksusuolen syövän metastaaseja oli jo läsnä sovitetun edeltävä paksusuolensyöpä primaaristen kasvainten-, joka on uusia geenimutaatioita ei tarvitse aloittaa paksusuolen syövän etäpesäkkeitä [4].

tässä tutkimuksessa tutkimme vaihtoehtoinen geneettistä mallia kehittämiseen paksusuolensyöpä etäpesäkkeitä, joka testaa onko geneettinen vaihteluja ihmisen ituradan voi antaa yksittäisen alttiutta metastaattisen leviämisen paksusuolensyöpä. Testata tätä mallia, suoritimme Genome Wide Association Study (GWAS), joihin arviointi ituradan yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) Ashkenazi juutalaista syntyperää, joilla on asteen IV metastaattinen paksusuolen syöpä verrattuna niihin, joilla on vaiheen I tai vaiheen II paksusuolen syöpiä, jotka tekivät ei etäispesäkkeitä. Valitsimme Ashkenazi juutalaisväestö tätä tutkimusta, koska perustaja-alleelit, jotka ovat erittäin havaittavissa GWAS, ovat jo hyvin ennakkotapauksia useiden muiden sairauksien tässä potilasryhmässä [5,6]. Käyttämällä dataa meidän löytö kohortin, kehitimme alustava teho analyysi, joka mahdollisti ennalta määrittää rajoitettu määrä SNP jonka tarkastelussa on validointi kohortin antaisi replikointiin kohtuullisen valtaa 5%: n merkitsevyystaso. Top SNP tunnistettu löytö aineisto arvioitiin sitten toinen populaatio paksusuolen syövän potilaiden Ashkenazi juutalaista syntyperää (validointi aineisto # 1). Perustuen tuloksiin löytö ja validointi aineistoja, alkuun SNP kiinnostava arvioitiin edelleen kolmannessa kolorektaalisyövän potilasaineistossa Ashkenazi juutalaista syntyperää (validointi aineisto # 2), ja yhdistetty analyysi (meta-analyysi) tämän top SNP saatettiin päätökseen tuloksia kolmen Ashkenazi juutalainen aineistoja. Edelleen ylimääräisen testin, pituus haplotyypin ympäröivät tätä SNP havaittiin olevan huomattavasti pitempi joukossa metastaattinen verrattuna ei-metastaattinen paksusuolen syöpiä.

Tulokset

yksityiskohtaiset kuvaukset löytö ja validointi ikäluokat annetaan ao. Keskimäärin potilaat löytö tutkimuksessa väestöstä oli 71 vuotias, joka oli samanlainen kuin keski-ikä oli 72 ja 65 validoinnissa aineistot # 1 ja # 2, (taulukko 1). Löytö väestö koostui 52% miehistä ja 48% naisia ​​ja sukupuolten jakaumat validiointityöhön aineistot olivat samanlaisia. Jakaumia vaiheen IV ja vaiheen I ja II tapaukset olivat myös samanlaiset kaikilla kolmella aineistot (taulukko 1).

Kuten taulukosta 2 ja kuvio 1 merkittävimmät yhdistys havaittu verrattaessa vaihe IV vaiheeseen I /II paksusuolensyöpä potilaista löytö GWAS oli rs2024846 kromosomissa 6 (OR = 2,62; 95% CI: 1,76-3,92; p = 1.2×10

-6). Toiseksi merkittävin yhdistys havaittujen oli kaksi SNP (rs72737810, rs60745952) kromosomissa 4q31.1 (OR = 2,83; 95% CI: 1,81-4,44; p = 2.73×10

-6), jotka on erotettu 5kb ja ovat vahvoja kytkentäepätasapainossa (katso kuva 2). Nämä kaksi SNP sijaitsevat käytettäessä intergeenisessä alueella kaukana lähimmästä geenistä,

NR3C2

, jonka 380kb (kuvio 2). Vaikka tilastollista merkitystä yhdistyksen näitä top SNP eivät ylitä standardin genomin laajuinen merkitys tasolle, silmämääräinen tutkimus QQ juoni havaitun p-arvot vs. odotettu jakautuminen viittaavat siihen, että ylin SNP arvo oli arvioida tarkemmin (S1 File) , motivoiva meidät jatkamatta replikointi tutkimus suunniteltiin tutkimaan 20 top SNP (taulukko 2), jotka ennalta voimalla replikointiin kuvatulla ao.

pystyakseli osoittaa (-log

10 muuttaneet) havaittiin P-arvo ja vaaka-akseli osoittaa kromosomiasemassa kunkin SNP. Nuoli osoittaa asemaa rs60745952 ja rs72737810, jotka eivät ole yksittäin havaittavissa tässä mittakaavassa esitys.

vaaka-akseli osoittaa SNP: iden pitkin kromosomaalisen alueen ja vasemmanpuoleinen pystyakseli osoittaa (-log

10 muuttaneet) havaittiin P-arvo. SNP lähellä merkittävin SNP (rs60745952) on värikoodattu kuvaamaan niiden LD tämän SNP (johdetaan pairwise R2 arvot HapMap CEU tiedot). rs60745952, joka näkyy violetti ympyrä, on vahva LD kanssa rs72737820, joka havainnollistaa punaisen ympyrän. Arvioitu rekombinaatio alk HapMap piirretään oikealla pystyakselilla syaanin vastaamaan paikallisen LD rakennetta.

Taulukossa 2 luetellaan havaitut tulokset validointi aineisto # 1 varten 20 SNP ennaltavalitut testaus yhdessä vaiheessa IV vs. vaiheen I tai II paksusuolensyöpä. Replikaatio havaittiin kaksi SNP: kromosomissa 4q31.1, rs72737810 ja rs60745952. Vuonna datajoukolla # 1, nämä kaksi SNP osoittivat yhdessä kehittämiseen etäpesäkkeitä p = 9.12×10

-4 (OR = 1,89; 95% CI: 1,27-2,82) ja p = 8.05×10

-4 (OR = 1,89; 95% CI: 1,27-2,80), vastaavasti (taulukko 2). Vahvuus yhdistyksen näiden kahden vastaaviin SNP molemmat ylittivät P 0,0044, mikä oli meidän ennalta määritelty merkitys kynnyksen replikointiin (kuten esitetään yksityiskohtaisesti menetelmät). Koska voimakas LD näiden SNP, me mielivaltaisesti valittu rs60745952 arvioimaan toisessa validointi aineisto. Vuonna pienempiä ja erittäin virtansa validointi aineisto # 2, yhdistyksen välillä rs60745952 ja kehittäminen etäpesäkkeitä ei ollut tilastollisesti merkitsevä, mutta vaikutus arvio oli samaan suuntaan suurentunut riski vähäinen alleelin (OR = 1,31; 95% CI: 0,81-2,12) (kuvio 3, paneeli A).

Koska löytö aineisto ja molemmat validointi aineistot kaikki osoittivat lisääntynyt riski etäpesäkkeitä paksusuolen tai paksusuolen ja peräsuolen syöpä potilailla, jotka kantavat vähäisiä alleeli rs60745952, meta-analyysi suoritettiin saamaan paras arvio kokonaisvaikutus kokoa. Kuten kuviossa 3 (paneeli B), yhteenvedon vaikutus arvio yhdistetyn analyysin (meta-analyysi) alle kiinteiden vaikutusten malli oli tilastollisesti merkitsevä (OR = 1,93; 95% CI: 1,50-2,49; p = 5,20 x 10

-7). Koska havaitsimme jonkin verran näyttöä heterogeenisyys testi homogeenisuus (Q-tilasto = 5,01; df = 2, p = 0,08; kuvio 3, paneeli A), me arvioitiin myös sattumanvaraiset vaikutukset mallia ja totesi, että tiivistelmä vaikutus olivat samanlaisia (OR = 1,92; 95% CI: 1,28, 2,87; p = 0,001); kuitenkin odotetusti luottamusväli oli tiukempaa, että kiinteiden vaikutusten mallia.

päätteli lisäksi, että jos yhdistys rs6074592 on riski kehittää etäpesäkkeitä johtui kytkentäepätasapainossa perustaja etäpesäke alttiusalleelin, ja jos tämä perustaja-alleeli oli syntynyt viime aikoina kuin Ashkenazi koko väestöä, tämä alleeli olisi erottelevat on haplotyypin lohkon suurempi koko läsnä etäpesäkkeitä verrattuna ei-etäpesäkkeitä liittyvät genomien. Voit testata tätä mahdollisuutta, tutkimme LD rakenteen alueella lähellä rs60745952 SNP yksilöiden vaiheessa IV vs. vaiheen I tai II paksusuolen syöpiä. Kuvio 4 esittää kuvaajia D ”välillä rs60745952 (sininen viiva) ja kaikki muut SNP alueella. Klusterointi SNP D ’= 1 rs60745952 määrittelee haplotyypin, joka on selvästi pidempi yksilöiden vaiheessa IV verrattuna vaiheeseen I /II paksusuolen syöpiin sekä löytö ja validointi # 1 aineistot (punaiset ympyrät kuvassa 4 osoittavat SNP yhteistä sekä löytämisen ja validointi # 1 aineistot). Tarkemmin, havaitsimme, että määrä SNP D ’= 1 IV vaiheessa (58, permutaatio varianssi = 11,71) oli merkittävästi suurempi kuin havaittu vaiheen I /II (41, permutaatio varianssi = 7,60) löytö aineisto ( p = 2,73 × 10-5) (taulukko 3, S4 File). Tulokset validointi # 1 aineisto oli samanlainen, vain hieman vähemmän merkittävä (p = 5,00 × 10-5).

Pystyakseli on LD D ”varten rs60745952 SNP (sininen viiva) ja muut SNP ennen ja jälkeen tämän sijainnin saatavilla genotyypityksen paneelit. Punaisia ​​pisteitä osoittaa SNP jotka olivat genotyypin paneelit sekä Discovery Dataset ja validointi Dataset # 1.

Lisäksi selvitimme mahdollisia yhdistyksen välillä rs6074592 ja vaiheen IV versus Stage I /II paksusuolen syövän valkoihoinen väestö paksusuolen syöpäpotilaiden Kentucky ja totesi, että yhdistys ei ollut tilastollisesti merkitsevä (OR = 0,89; 95% CI: 0,55-1,46; p = 0,65), mikä viittaa siihen, yhdistyksen välillä rs6074592 ja metastaattinen paksusuolen syöpä on nimenomaan potilaalla on Ashkenazi juutalaista syntyperää.

keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus raportoi geneettisiä kytkentöjä ihmisen ituradan varianttien kanssa riski sairastua paksusuolen syövän etäpesäkkeiden, erityisesti tämän tutkimuksen toteamalla, että joukossa Ashkenazi juutalainen yksilöiden paksusuolen syöpä, kuljetukseen alaikäisen alleeli rs60745952 oli merkitsevästi yhteydessä kehitysvaiheessa IV sairaus, jossa kaukainen urut etäpesäkkeitä, versus paikallinen vaiheen I tai II sairaus, jossa OR on lähes 2 vähäinen alleeli rs60745952 kuljetetaan 31% yleisestä Ashkenazi väestö, ja jopa noin 50%: Ashkenazi yksilöiden vaiheen IV paksusuolensyöpä, ja siten on merkittävä tekijä kehittämiseen paksusuolensyöpä etäpesäkkeiden tässä potilasryhmässä. Todennäköisyys, että tämän potilasryhmän perustaja etäpesäke alttius variantti voimakkaassa kytkentäepätasapainossa (LD) kanssa rs60745952 on itsenäisesti ehdottanut toteamalla, että Ashkenazi yksilöiden vaiheen IV paksusuolensyöpä, rs60745952 piilee LD lohko, joka on huomattavasti pidempi kuin havaitaan yksilöiden kuin etäpesäkkeitä I tai II sairaus. Olemme edelleen sitä mieltä, että yhdistys rs60745952 etäpesäkkeitä todennäköisesti spesifinen Ashkenazi juutalaisväestö, koska tämä yhdistys ei havaittu, kun arvioidaan yleisessä valkoihoinen väestö paksusuolen syöpäpotilaiden Kentucky. Kun otetaan huomioon hyvin erilaiset evoluution historiassa Ashkenazi juutalainen väestö, havaitut erot eivät ole yllättäviä.

Aikaisemmat tutkimukset ryhmämme [4] osoitettiin, että kaikki somaattisten mutaatioiden havaittu paksusuolensyöpä etäpesäkkeitä oli jo saatavilla niiden edeltäjä ensisijainen paksusuolensyöpä kasvaimia. Näin paksusuolensyöpä etäpesäkkeitä ei vaadi hankkimaan uusia ”etäpesäkkeiden driver” mutaatioita. Tässä tutkimuksessa, esitämme näyttöä siitä, että yksi geneettinen elementti metastaasin etenemistä voidaan koodata isännän genomiin. Vaikka spekulatiivinen, mahdollinen isäntä koodattu merkityksellisiä kyseisessä metastaattisen prosessin sisältäisi elementtejä immuunivalvonnan elementtejä verisuonten läpäisevyyttä ja /tai angiogeneesin, ja mahdollisesti elementit signa- jotka voivat ratkaista soluvasteiden aktivoida onkogeenejä tai inaktivoida tuumorisuppressorigeeneille. Samanlainen havainnot monien GWAS tutkimusten rs60745952 piilee käytettäessä geenien välisen alueen, ja meillä ei ole suoria todisteita toiminnallisia eroja, jotka liittyvät kuljetukseen tämän SNP. Tulevaisuuden tutkimukset Tämän kysymyksen täytyy toteutetaan saatua biologisten näytteiden nimenomaan päässä Ashkenazi väestöstä.

Tulokset ilmoitetaan tässä todennäköisesti ei tullut valoa lukuunottamatta meidän työllistävät teho ohjattu suunnittelu lisääntymään, joka mahdollisti meitä säilyttämään riittävän tehon osoittamiseksi merkitys yhdistyksen jopa vaatimaton koko replikointi kohortissa. Tämä lähestymistapa on todennäköisesti arvokasta muut tutkijat, jotka yrittävät geneettisesti rikastamiseksi yhdistyksen signaalia tutkimalla valittu, mutta pienempi väestö, kuin ne, jotka on tyypillisesti käytetty GWASs. Testaus erot LD rakenteessa yhdenmukainen perustaja tauti variantteja voi myös olla hyötyä GWASs näissä pienempiä, mutta erittäin valitut populaatiot.

Materiaalit ja menetelmät

TET

Yleistä.

Colon syöpäpotilaiden neljästä eri aineistoja käytettiin tässä arvioinnissa. Kaikki potilaat saivat selville alla tutkimussuunnitelmissa hyväksymien Institutional Review Boards vastaavan toimielinten (Carmel Medical Center (Haifa), University of Southern California, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center ja yliopistollisen sairaalan asia Medical Center), kuten alla selitetään. Kaikki potilaat kunhan tietoisen kirjallisen suostumuksen. Kaikki lupamenettelyissä hyväksyttiin vastaava edellä mainitun Institutional Review Boards.

Discovery Dataset.

Osallistujat peräisin Molecular Epidemiology of peräsuolen syövän tutkimus (MECC), joka on väestöpohjainen tapaus -Säätimet tutkimus tapahtumasta paksusuolen ja peräsuolen syöpätapausta, joka on kuvattu aiemmin [7]. Lyhyesti, potilaat Pohjois Israel on värvätty MECC vuodesta 1998. Osana MECC-tutkimuksen demografiset ja kliiniset tiedot sekä otettiin verinäytteitä. Kotelot valittu Genotyyppausanalyysiin oli histologisesti varmennettu, mikrosatelliittimarkkereita vakaa paksusuolen syöpä. Tarkemmin sanottuna tutkimusväestöstä käytetään löytö aineisto tähän arviointiin koostui 89 yksilöiden vaiheen IV paksusuolensyöpä kaukaisiin urut etäpesäkkeitä, kaikki mukana maksaan, ja 234 yksilöiden vaiheen I tai vaiheen II koolonsyöpien jotka elin ahtaissa ja ilman metastasoituneen levitä. Nämä yksilöt varmistettiin vielä jäljellä olevat etäpesäke-ilmaiseksi kliinistä seurantaa ainakin 3 vuoden pituista. Valvonnan MECC löytö aineisto Tutkimusaineiston muodosti yksilöiden välillä ei ole aiempaa paksusuolen tai peräsuolen syöpä ja olivat yksilöllisesti sovitettu tapauksiin iän, sukupuolen, ja ensisijainen klinikalla. 139 valvonta genotyypattiin ja käytettiin määrällisesti vähäinen alleelin taajuus huippu SNP. Kaikilla potilailla oli itse ilmoitettu Ashkenazi juutalaista syntyperää.

Validation Dataset # 1.

Ensimmäinen validointi aineisto oli peräisin toisesta riippumaton näyte MECC tutkimukseen osallistuneista, jotka valittiin vähemmän rajoittavia kriteerejä kuin löytö aineisto. Erityisesti validointi aineisto # 1 käsitti edelleen yksilöiden joko paksusuolen tai peräsuolen syöpä, vaiheen I ja II tapauksia joille leikkauksen jälkeisen seurannan ei ollut saatavilla, ja henkilöitä, joiden syöpiä ei ollut testattu microsatellite epävakautta. Lisäksi tämä näyte mukana yksilöiden itse ilmoitettuun Sephardic sekä Ashkenazi juutalaista syntyperää. Validointi aineisto tähän arviointiin sisältyy 89 vaiheessa IV peräsuolen syöpätapausta ja 373 vaihe I ja II vaiheen peräsuolen syöpätapausta. Valvonnan validointi aineisto # 1 Tutkimusaineiston muodosti edelleen potilailla, joilla ei ole aiempaa paksusuolen tai peräsuolen syöpä ja olivat yksilöllisesti sovitettu tapauksiin iän, sukupuolen, juutalainen etnisyyden ja ensisijainen klinikalla.

Validation Dataset # 2.

Potilaat toisella validointi aineisto hoidettiin Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) ja oli histologisesti varmennettu peräsuolen syöpä. Potilaat todeta kahdella MSKCC kliinisiä protokollia välillä 2000 ja 2010. Tämä tutkimus väestö oli myös vähemmän rajoittavia kuin löytö aineisto kyseisessä validointi aineisto # 2 mukana yksilöiden joko paksusuolen tai peräsuolen syöpä ja henkilöille, joiden syöpiä ei ollut testattu microsatellite epävakautta. Tämä validointi aineisto koostui 86 yksilöiden vaiheen IV paksusuolensyöpä kaukaisiin urut etäpesäkkeitä, kaikki mukana maksaan, ja 256 yksilöiden vaiheen I tai vaiheen II paksu- tai peräsuolen syöpiä, jotka olivat urut ahtaissa ja ilman metastaaseja. Yksilöt, joilla nämä alkuvaiheen syöpien varmistettiin vielä jäljellä olevat etäpesäkkeiden ilmaiseksi kliinistä seurantaa ainakin 3 vuoden pituista. Kaikilla potilailla oli itse ilmoitettu Ashkenazi juutalaista syntyperää.

Kentucky valkoihoinen Dataset.

yksityiskohdat Kentucky tutkimusväestöstä on kuvattu muualla [8]. Lyhyesti aineisto käytetään tässä arvioinnissa koostui 77 potilailla, joilla on vaiheen IV paksusuolensyöpä ja 398 potilailla, joilla on vaiheen I /II paksusuolensyöpä. Kaikki potilaat tässä näytteessä oli valkoihoisia.

DNA Isolation, genotyypin ja laadunvalvonta

Discovery Dataset.

DNA kokoverestä lymfosyyteistä eristettiin käyttäen QIAamp DNA Veren Mini (Qiagen, Hilden, Saksa) ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti genotyypitykseen. Kaikki DNA-näytteet kävivät koko genomin monistamisen käyttäen Illustra Genomiphi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, kuvaston nro 25660032). Näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa.

Näytteet genotyyppi on Illumina Omni 2,5-8 alustalla. Aineisto puhdistetaan laadunvalvonta suosittelemaa esiin Genomics työryhmässä [9]. QC menettelyihin kuuluu arviointi näytteen ja merkki puhelun hinnan, sukupuoli epäsuhta (Plink [10] ”-Check sukupuolta”), kaksoiskappaleet, Hardy-Weinberg tasapaino, näyte sukulaisuuden (Plink [10]; ”-genome”), ja väestön kerrostumista. Kaikkiaan 1491783 SNP sisällytettiin analyysiin jälkeen ilman SNP, joka oli vähäinen alleelifrekvenssit 0,01, puuttuvat tiedot yli 2% näytteistä, tai Illumina GenTrain tulokset alle 0,6. Kaikkiaan 5 vaihe IV potilaille, ja 7 vaiheen I ja II potilaat, poistettiin analyysit ottaa puhelun hinnat vähintään 98%, koska se ei ole sukupuolten tarkistaa tai olla tahaton kaksoiskappaleita (katso S1 File for lisätietoja). Kontrolloida väestöä kerrostuneisuus, kaksi ensimmäistä pääkomponentit (PC) on saatu moniulotteinen hajoaminen analyysi käyttäen ”cmdscale” toiminnon R.

Validation Dataset # 1.

peräsuolen Transdisciplinary ( corect) suorittama tutkimus genotyypin validoitavaksi aineisto # 1. Genotyypitys suoritettiin käyttäen mukautettua Affymetrix genomin laajuinen (jäljempänä Axiom® corect set) noin 1,3 miljoonaa SNP ja indeleitä; kuitenkin vain tietoja SNP tunnistettu Top SNP löytö aineisto uutettiin corect tähän analyysiin (katso Statistical Analyysit). Aineisto puhdistetaan laadunvalvonta samanlainen löytö aineisto (katso S2 File lisätietoja) [9].

Validation Dataset # 2.

DNA eristettiin joko kokonaan veren lymfosyyttejä tai formaliinilla parafiiniin upotettuja (FFPE) on normaalia koolonin kudokseen käyttäen Qiagen QIAamp DNA Extraction Kit tai QIAamp DNA veren Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti genotyypitykseen. Kaikki DNA-näytteet kävivät läpi koko genomin monistamisen käyttäen Repli-g DNA Amplification Kit (Qiagen, CA). Alaryhmän näytteitä, sekä FFPE ja verestä peräisin DNA olivat saatavilla ja niitä käytettiin testaamaan yksimielisiksi genotyyppien laadunvarmistusta. Genotyping for rs60745952 suoritettiin käyttäen Sequenom iPLEX määrityksiä ja analysoitiin käyttäen MassARRAY [11]. Genotyypit kutsuttiin käyttämällä typer 4.0.2 ohjelmistoa.

Kentucky valkoihoinen Dataset.

DNA eristettiin kaikista aiheista ja ABI TaqMan kemiaa käytettiin genotyypin rs60745952. Tämä edellytti custom design koettimien ja alukkeiden ABI. PCR [40 Cycles] suoritettiin ABI GeneAmp PCR System 9700 Dual Head Instrument ja päätepisteen lukee suoritettiin käyttäen ABI 7900 Sequence Detection System.

TILASTOANALYYSI

Logistinen regressio suoritettiin arvioitava mahdollisuudet yhdistyksen välillä jokaisen SNP ja vaihe IV vs. vaiheet I ja II koolonsyöpien alle log-lisäaine geneettistä mallia. Vaikka aluksi analyysejä käytetään Plink [10], lopullinen analyysi rs60745952 kolmessa tutkimuksessa aineistot käytetään SAS v9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC) asianmukaista sisällyttämistä covariates olettaen vain riippumattomuuden yksilöitä, ei alleelien [12 ] toteutettuna Plink [10]. Kaikki Regressioanalyysistä oikaistiin iän ja sukupuolen ja, jos kyseessä on löytö ja validointi aineisto # 1, joka oli GWAS, ensimmäiset 2 pääkomponentit. Lisäksi näissä kahdessa aineistoja emme tutki rs60745952 tehtiin pidemmällä haplotyypin IV vaiheessa potilailla kuin vaiheen I /II potilaille. Sen jälkeen löytää sopivat geenivirhe löytö tietojoukon käyttämällä LD kuvio syntyy Haploview [13] (S3 File), laskimme D ’kunkin SNP lohkossa ja rs60745952 ja lasketaan määrä SNP joille D’ = 1. sitten suoritetaan permutaatio testaus testata onko määrä SNP D ’= 1 oli merkitsevästi suurempi vaiheessa IV verrattuna vaiheen I /II potilaat (S4 File).

Design for replikointi Studies

tilastollinen mallinnus ehdotti, että replikointi kohortin paksusuolensyöpä tapauksista samankokoisia löytö kohortin toisi noin 80% teholla testata jopa 9 merkittävimmät ehdokas SNP (top SNP) kanssa Bonferroni korjattu merkitsevyystaso 0,04 /9 (= 0,0044), plus 8 lisäksi SNP klo Bonferroni korjattu merkitsevyystasolla 0,01 /8; Näin yleinen tyypin 1 virhettä säädettiin arvoon 0,05 (Samanlainen muotoilu käytettiin testaamaan vaiheen III vs. vaiheen I /II paksusuolensyöpä potilaista, mutta vain vertailun vaihe IV potilailla on raportoitu tässä). Virta replikointi laskettiin kunkin yksittäisen SNP perustuu 50% pienempi luottamusta rajan vastaavan riskisuhde [14] ja esiintyvyys SNP (katso S5 File). Kolme alkuun 9 SNP: tä mukana kumppani SNP, joka osoitti täydellistä kytkentäepätasapaino- meidän löytö kohortissa (D ’= 1,0), ja nämä 3 kumppani SNP: tä lisätty joukko top SNP testattavien replikointiin ilman tilastollista säätö, yhteensä 20 SNP ennalta määritetty analyysi validointi kohortissa. Ennen aloittamista validointitutkimuksella tämän analyysin suunnittelu ja identiteetit 20 ennalta määritetyn SNP talletettiin NCI ohjelman upseeri valvoa tutkimuksen kirjaa dokumentaatio tutkimuksen suunnittelu. Muita SNP, jotka olivat läsnä validointi aineisto # 1 genotyypityksen array ei pidetty tässä tutkimuksessa arvioinnissa.

Yhdistetty Data Analysis (meta-analyysi) B

Järjestö tulokset rs60745952 SNP vuonna kolme tutkimuksen aineistot kanssa Ashkenazi juutalaista syntyperää (Discovery Dataset, Validation Dataset # 1, Validation Dataset # 2) yhdistettiin käyttäen meta-analyysin kanssa käänteinen otoskoko painotettu lähestymistapa toteutetaan METAL [15]. Arvioimme homogeenisuus välillä yhdistys tuloksia käyttämällä Q-testi ja lasketaan yhteenvedossa vaikutus arvion käytettäessä satunnaista vaikutusten malli [15]. Laskimme yhteenveto vaikutus arvion käyttäen sekä kiinteitä ja satunnaisia ​​vaikutuksen malleja, koska p-arvo testi homogeenisuus oli marginaalisesti merkitsevä (taulukko 3; p 0,10), mikä viittaa siihen, jotkut heterogeenisuus saattaa olla läsnä ja varianssi tutkimusten välillä olisi sisällytetty analyysien saamiseksi luotettavuusrajat.

tukeminen Information

S1 File. Genotyypin QA /QC tiedot Discovery Dataset.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146435.s001

(PDF)

S2 tiedosto. Genotyypin QA /QC tiedot Validation Dataset # 1.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146435.s002

(PDF)

S3 tiedosto. LD Tontti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146435.s003

(PDF)

S4 tiedosto. LD Arviointi kautta Permutation Discovery ja Validation # 1 Tietoaineistot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146435.s004

(PDF)

S5 tiedosto. Valitseminen SNP varten Validation.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146435.s005

(PDF) B

Kiitokset

sisältö käsikirjoituksen ei välttämättä edusta tai politiikka National Cancer Institute tai jollekin yhteistyökeskusten että corect konsortio, eikä mainita kauppanimiä, kaupallisia tuotteita, tai organisaatioiden merkitse, että Yhdysvaltojen hallitus tai corect konsortio.