Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimukset ovat osoittaneet, että ytimen reseptorin corepressor 1 (NCOR1) voi olla tärkeä rooli ihmisen syövissä . Kuitenkin yksityiskohtainen molekyylitason mekanismeja, joilla se toimii

in vivo

vaikuttaa syövän etenemiseen eivät ole selkeitä. Tässä tutkimuksessa selvitetty

in vivo

toimiin NCOR1 karsinogeneesis- käyttäen hiirimallissa (

Thrb

PV /PV

hiiriä), kehittää spontaanisti kilpirauhassyöpä.

Thrb

PV /PV

hiiret satama vallitsevasti negatiivinen tyroidihormonireseptorin β (TRp) mutantti (merkitään PV). Hyväksyimme menettämisestä toiminnon lähestymistapa ylittämällä

Thrb

PV

hiiriä hiirillä että maailmanlaajuisesti ilmaista NCOR1 mutantti proteiini (NCOR1ΔID), jossa reseptori vuorovaikutus verkkotunnuksia on muutettu niin, että se ei voi olla vuorovaikutuksessa kanssa TRp tai PV, hiirillä. Merkillistä, ilmentyminen NCOR1ΔID proteiinin pienentää kilpirauhasen kasvainten kasvua, merkittävästi myöhässä syövän etenemiseen, ja pitkäaikainen selviytyminen

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä. Kasvainsoluproliferaation estyi lisääntyneen ekspression sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori 1 (p21

waf1 /CIP1;

Cdkn1A

), ja apoptoosia aktivoitiin kohonnut ilmentyminen pro-apoptoottisten Bcl-Associated X (

Bax

). Edelleen analyysit osoittivat, että p53 rekrytoitiin p53-sitoutumiskohta proksimaaliseen promoottori

Cdkn1A

ja

Bax

geenin yhteistyössä repressori monimutkainen PV /NCOR1 /histoni deacetylas- 3 (HDAC-3), joka johtaa tukahduttaminen

Cdkn1A

sekä

Bax

geenin kilpirauhasen on

Thrb

PV /PV

hiirillä. Vuonna kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä, p53 /PV monimutkainen voinut palkata NCOR1ΔID ja HDAC-3, mikä johtaa de-tukahduttaminen molemmat geenit estävän syövän etenemistä. Esillä olevissa tutkimuksissa edellyttäen suoria todisteita

in vivo

että NCOR1 voisivat toimia onkogeenin kautta transkription sääntelyn hiirimallissa kilpirauhassyövän.

Citation: Fozzatti L, Park JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Sy (2013) onkogeeninen toimet ytimen reseptorin Corepressor (NCOR1) hiirimallissa kilpirauhassyövän. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10,1371 /journal.pone.0067954

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 23 toukokuu 2013; Julkaistu: 26 kesäkuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Intramural Research Program Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhasen hormonin (TR) ovat kriittisiä välittämisessä genomisessa toimia kilpirauhashormonin (T3) kasvuun, kehitykseen, erilaistuminen, ja ylläpitää metabolisen homeostaasin. Kaksi TR geenejä, α ja β, sijaitsevat kahdessa eri kromosomeissa, koodata kolme suurta T3 sitova TR isoformeja (α1, β1, ja β2). Tutkimukset käyttäen geenitekniikalla hiiriä osoitti,

in vivo

, TR isoformit on yhteisiä toimintoja, mutta voi myös aiheuttaa isoentsyymiselektiivisiä kanteet kohdekudoksissa [1], [2]. Transkription aktiivisuus TR säännellään monilla tasoilla. Sen lisäksi, että sääntelyä T3 ja tyyppisiä DNA: ta sitovan elementtien edistäjiä kohdegeenien transkription aktiivisuus TR on hienosäädetty joukko ydin- koaktivaattoreiden ja korepressoreiden [3], [4]. Koska T3 unliganded TR rekrytoi ytimen reseptorin corepressor 1 (NCOR1) ja ytimen reseptorin corepressor 2 /hiljentäminen välittäjänä retinoidi ja kilpirauhashormonin reseptoreihin (NCOR2 /SMRT) transkription repression. Sitoutuminen T3 johtaa konformaatiomuutoksen TR joka vapauttaa NCOR1 /NCOR2 monimutkainen ja mahdollistaa rekrytointi multiproteiinikompleksissa koaktivaattorikompleksien monimutkainen transkription aktivaation [5].

tärkeä sääntelyn rooli NCOR1 vuonna reseptorin toimiin näkyy sen poikkeavien vuorovaikutuksessa reseptorien taustalla ihmisten sairauksia kuten resistenssi kilpirauhashormonin (RTH) [6], [7] ja lipodystrophic vaikea insuliiniresistenssi [8]. RTH johtuu mutaatioista

THRB

geeni [9], [10]. Mutaatiot peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (

PPARy) B johtaa lipodystrophic vaikea insuliiniresistenssi [8]. Lisäksi, poikkeava vuorovaikutus NCOR1 /SMRT kanssa fuusioidun geenin tuotteet retiinihapporeseptorin α-geenin (

RARa) B tai promyelosyyttinen leukemia geenin (

PML

) (PML-RAR- α) tai promyelosyyttinen leukemia sinkkisormen geeni (

PLZF

) (PLZF-RAR-α) johtaa estää myelooisen erilaistuminen [11]. Osallistuminen NCOR1 muissa ihmisen syövissä, kuten rinta- ja virtsarakon syöpien osoitettiin tiivis yhdistys NCOR1 epänormaali ilmaisun kanssa syövän kehitykseen [12], [13], [14], [15]. Viimeaikaiset tutkimukset The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network paljasti myös homotsygoottisia geenin poisto NCOR1 joillakin potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma [16], eturauhasen adenokarsinooma [17], munasarjakarsinooma [18] tai maksan maksasyövän (julkaisematon-Väliaikainen in TCGA data base). Lisäksi nonsensemutaatiota ja silmukointivariantit on

NCOR1

havaittiin myös potilailla, joilla on rintasyöpä [19]. Vaikka nämä assosiaatiotutkimuksiin nosti esiin mahdollisuuden, että NCOR1 voisivat toimia vaikuttaa syövän etenemiseen, suora todiste sen tehtävistä karsinogeneesis-

in vivo

puuttuu edelleen.

saatavuus hiirimallissa, joka kehittää spontaanisti metastaattinen follikulaarinen kilpirauhassyöpä (FTC) antoi meille tehokas keino arvioida roolia NCOR1 syövän kehittymisen ja etenemisen.

Thrb

PV /PV

hiiri satamat knock hallitseva negatiivinen mutaatio, joka tunnetaan nimellä PV,

Thrb

geenilokukseen [20]. PV mutaatio tunnistettiin kärsivän potilaan vastustuskykyä kilpirauhashormonin [21]. Kuten

Thrb

PV /PV

hiirten ikää, niiden kilpirauhasen tehdään patologisten muutosten hyperplasialta kapsulaaristen ja verisuonten invaasio, anaplasia, ja lopulta etäpesäke keuhkojen [22]. Patologinen etenemistä, reitti, ja taajuus etäpesäkkeiden

Thrb

PV /PV

hiiret ovat samanlaisia ​​kuin ihmisen FTC. Laaja molekyyli- analyysejä muuttuneen signalointireittien osoittavat, että löydetty ihmisen FTC,

Thrb

PV /PV

hiirillä poikkeava signalointireitteihin jotka sisältävät konstitutiivisen aktivaation inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] ja integriini-Src-MAPK signalointi [25] ja poikkeava kertyminen onkogeenisten aivolisäkkeen kasvain muuttaa geenin proteiinia (PTTG) [26], [27] ja ß-kateniinin [28]. Siten

Thrb

PV /PV

hiirimallissa uskollisesti yhteenveto siitä molekyyli poikkeavuuksien löydetty ihmisen kilpirauhassyöpä ja on todellakin prekliinisissä hiirimallissa FTC.

Tässä tutkimuksissa me hyväksyi menettämisestä toiminnon lähestymistapa ylittämällä

Thrb

PV

hiirillä, globaalisti ilmaista NCOR1 mutantti proteiini (NCOR1ΔID). Tässä NCOR1ΔID mutantti proteiini, kahden eniten aminopään reseptorivuorovaikutuksessa verkkotunnuksia kutsutaan RID 3 ja RID2, puuttuvat. Tämä mutantti voi liittää TR, koska RID3 vaaditaan ehdottomasti NCOR1-TR vuorovaikutus [29], [30], [31]. Johdonmukaisesti olemme myös osoittaneet, että NCOR1ΔID mutantti proteiini voi olla vuorovaikutuksessa TRβPV

in vivo

[32]. Puute vuorovaikutusta TRβPV kanssa NCOR1ΔID johtaa oireiden parantaminen resistenssin kilpirauhashormonin

Thrb

PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä, mikä osoittaa, että NCOR1 säätelee vallitsevan negatiivisen vaikutuksen TRp mutanttien

in vivo

[32].

Tämä tutkimukset osoittavat, että ilmentyminen NCOR1ΔID kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PV

hiirille esti kasvaimen kasvua, pitkittynyt selviytyminen, ja viivästynyt syövän etenemistä. Kasvainsoluproliferaation estyi lisääntyneen ekspression sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori 1 (p21 /WAF1;

Cdkn1A

), ja apoptoosia indusoitiin aktivoitu ilmaus Bcl-2-liittyvät X-proteiini (

BAX

). Sekä

Cdkn1A

ja

BAX

geenit ovat suoraan alavirtaan kohdegeenien kasvain vaimennin, p53. Yksityiskohtainen molekyyli analyysit osoittivat, että puute reseptorin vuorovaikutuksen verkkotunnus NCOR1ΔID johti kyvyttömyys p53 /PV kompleksin rekrytoida NCOR1 /histonideasetylaasi-3 repressori monimutkainen promoottorien näiden kohdegeenien, mikä lisää tukahduttamisen näiden geenien estävät syövän etenemistä. Tässä tutkimuksessa tarjotaan suoria todisteita

in vivo

osoittaakseen, että NCOR1 voisi toimia onkogeenin kautta transkription sääntelyn kilpirauhasen syövän syntymistä hiirimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

hiiri Kannat

eläinten tutkimus toteutettiin protokollan mukaisesti hyväksymän National Cancer Institute animal Care ja käyttö komitea. Hiiret kätkeminen

Thrb

PV

geeni (

Thrb

PV

hiiret) valmistettiin ja genotyypitetty kuten aiemmin on kuvattu [20].

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä kasvatettiin ensin ylittämällä

Thrb

+ /+ Ncor1

ΔID /+

hiirillä [29] kanssa

Thrb

PV /+

hiiriä ja sitten ylittämällä

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

hiirten

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

hiirillä [32]. Hiiret, joilla on erilaiset genotyypit käyttää esillä olevassa tutkimuksessa olivat intercrossed useita sukupolvia, ja samasta poikueesta, joilla on samanlainen geneettinen tausta käytettiin kaikissa kokeissa. Hiiriä seurattiin, kunnes ne tulivat kuolemaisillaan ja siksi lopetettiin. Kilpirauhasen ja muut kudokset kerättiin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä ja

Thrb

PVPVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä punnitsemiseen, histologista analyysi, ja molekyyli- ja biokemiallisista tutkimuksista.

RNA: n eristäminen ja määrälliset Real-Time RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin kilpirauhasen hiirten käyttäen TRIzol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin Quantitect SYBR Green RT-PCR-kittiä (QIAGEN, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja käyttäen LightCycler-lämpösyklilaitetta (Roche Diagnostics). Kokonais-RNA (200 ng) käytettiin RT-PCR-määritykset kuten aiemmin on kuvattu [33]. Spesifisten alukkeiden olivat seuraavat:

mp21

eteenpäin, 5′-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 ’ja reverse, 5′-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3’;

mBax

eteenpäin, ”-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3 ’ja reverse, 5′-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3’;

Mp53

eteenpäin, 5′-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 ’ja reverse, 5′-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3’.

Western Blot analyysi ja samanaikainen immunosaostus

Nuclear otteet kilpirauhasen valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Proteiininäytteet (25 ug) analysoitiin Western blot kuten aiemmin on kuvattu [28]. Anti-fosforyloidun retinoblastoomaproteiinia (pRb) (Ser780, # 9307) ja PUMA (# 7467) saatiin Cell Signaling Technologies (Beverly, MA) (1:500 laimennus), anti-sykliini D1 (sc-450), BAX (sc -7480), Rb (sc-50), p21 (sc-6246) ja p27 (sc-1641) vasta-aineet hankittiin valmistajalta Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ja käyttää tästä 1:200 laimennus. Anti-p53-vasta-aineita (OP03) olivat yhtiöstä Calbiochem (1:500 laimennus). Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttämällä NIH IMAGE ohjelmistoa (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH).

samanaikainen immunosaostus näyttää fyysisen vuorovaikutuksen p53 PV, 0,5 mg yhteensä kilpirauhasen uutteiden inkuboitiin ensin yön yli kanin anti-TR (Code 600-401-A96, Rockland) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, 0,6% NP-40 proteaasinestäjien kanssa (Roche) 4 ° C: ssa. Näytteet sekoitettiin sitten 20 ul proteiini-A-agaroosin (Roche) 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan, ja helmet pestiin viisi kertaa TBS-0,6% NP-40, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita. Sitoutuneet proteiinit analysoitiin Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita p53 (OP03; Millipore, Inc.,) kanssa 1:500 laimennus- ja anti-NCOR1 (PHQQ; 2 ug /ml), [32].

Histologinen analyysi

Kilpirauhanen, keuhkojen ja sydämen leikeltiin, kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja tämän jälkeen upotettiin parafiiniin. Jaksot 5 um paksuus valmistettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Thermo Scientific, Fremont, CA, # RB-9043-P0). Pesun jälkeen objektilasit inkuboitiin vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja huuhdeltiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Objektilasit inkuboitiin sitten 3,3′-diaminobenzidene (DAB substraattipakkausta peroksidaasin, Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK-4100), ja värjäyksen jälkeen kehitys, ne vastavär- vuonna Gillin hematoksyliinillä, huuhdellaan ja asennettu Permount-peitinlaseilla (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). Proliferatiivinen indeksi laskettiin prosenttiosuutena Ki-67-positiivisia ytimet kokonaismäärä ytimien kilpirauhasen osassa. Counting suoritettiin käyttäen National Institutes of Health (NIH) IMAGE ohjelmisto (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD).

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritys

siru määritys oli suoritetaan käyttäen chromatin DNA valmistettiin kilpirauhasen kasvaimet (50 mg /määritys) on

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä ja

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirissä, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Immunosaostetut-DNA 50 pl TE: n ja kvantitatiivinen PCR suoritettiin 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) käyttäen QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit (204154, QIAGEN). Virikkeellistämisstrategioita signaaleissa laskettiin immunosaostuksella signaalit vs. kokosolulysaatissa tuloa. Taitteen muutokset kilpirauhasen kasvainten

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

tai

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ChIP normalisoitiin negatiivinen kontrolli (hiiren IgG). Siru Käytetyt alukkeet olivat

Cdkn1A

eteenpäin, 5’TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 ’; ja kääntää, 5’TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 ’ja

Bax

eteenpäin, 5’GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3′; ja kääntää, 5’GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 ’.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Erot ryhmien tutkittiin tilastollista merkittävyyttä Studentin

t

testiä käyttämällä GraphPad Prism 4.0a (GraphPad Software); p 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

NCOR1ΔID pidensi elinaikaa ja Viiveet Kilpirauhasen Karsinogeneesi on

Thrb

PV /PV

Hiiret

ovat aiemmin osoittaneet, että

Thrb

PV /PV

hiirillä on korkeat aiheuttamaa kuolleisuutta FTC [22]. Olemme seurataan vaikutukset ilmentymisen NCOR1ΔID kilpirauhasen karsinogeneesin ensin vertaamalla selviytyminen

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä kanssa,

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä. Hiiriä seurattiin, kunnes ne tulivat kuolemaisillaan merkkejä kouraantuntuva kasvaimia, nopea painon lasku, kyyryssä asennot, ja vaivalloinen hengitys. Kuvio 1A osoittaa, että

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret selvisivät merkitsevästi pidempi (p 0,01; 50% eloonjääminen ikä: 11,3 kuukautta, n = 29) kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä (50% eloonjääneitä ikä: 9,3 kuukautta, n = 58) aikana 15 kuukauden tarkkailujakson aikana. Kuvio 1B esittää, että ilmentyminen NCOR1ΔID johti merkittävästi 35% vähennys kilpirauhasen paino

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirten (data set 2 vs. 1; p 0,0001 ).

(A) Kaplan-Meier eloonjäämiskäyriä

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä jopa 15 kuukauden iässä.

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(n = 29) selvisivät huomattavasti kauemmin kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiiriä (n = 58) (

p

0,0001). (B) kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä iältään 5 -15 kuukautta leikeltiin ja punnittiin. Tiedot on esitetty suhteet kilpirauhasen painon painoon. Erot kilpirauhasen painot

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret olivat merkitseviä (

p

0,0001), määritettynä Studentin

t

-testissä analyysi.

vaikutus NCOR1ΔID patologisesta etenemistä arvioitiin histopatologista analyysiä

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä vuotiaiden. Kuviossa 2A esitetään edustava patologisia piirteitä kilpirauhasen ja keuhkot 3- 15 kuukautta vanhan

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret (vasen ja oikea pylväät, tässä järjestyksessä). Kun kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä iässä 7 kuukautta, kehittynyt verisuonten invaasio ja polttoväli anaplasia havaittiin usein (nuolet kuvassa 2 aa ja 2AC, vastaavasti) . Lisäksi keuhkoetäpesäkkeet (kuvio 2ae, nuolet) olivat yleisempiä

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä. Vuonna

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä kuitenkin verisuonten invaasio oli harvoin (kuvio 2AB), mutta ilman havaittavaa anaplasia (kuvio 2AD) ja vähentynyt selvästi esiintyminen keuhkojen etäpesäkkeiden (kuvio 2AF). Nämä pathohistological havainnot on esitetty yhteenvetona kuviossa 2B. Kun nuorempana 3-5 kuukauden alempi esiintyminen Kapselipolysakkaridiantigeenin invaasion (-20%) havaittiin

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 2Ba), mutta samanlainen esiintymistiheys Kapselipolysakkaridiantigeenin invaasio havaittiin molempien mutanttihiirien vanhemmalla iällä ( 4) kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä (kaistat 1 2). Lisäksi vähennetään sykliini D1 johti alempaan proteiinin runsaasti fosforyloidun retinoblastoomaproteiinia (pRb) (Kuva 3B.I, paneeli b, vertaa kaistat 1 2 kaistat 3 4) muuttamatta koko RB-proteiinin tasot (paneeli c). Väheneminen fosforyloidun Rb esti etenemistä solusyklin alkaen G1 S-vaiheeseen. Johdonmukaisesti, proteiini runsaasti sykliiniriippuvaisen estäjä p21 ja p27 (kuvio 3B.I, paneelit d ja e, vastaavasti) oli myös pienempi kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä (vertaa kaistoja 3-4 kaistojen 1-2). Kvantitatiivinen data kaistaintensiteettejä esitetään kuvassa 3B.II. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen NCOR1ΔID johti tuumorin solujen proliferaatiota, osittain viivästyttämällä G1-S solusyklin etenemisen.

Onko apoptoosin myös osaltaan laski kilpirauhasen kasvaimen kasvua kuviossa 1B arvioitiin myös tutkimalla keskeiset sääntelyviranomaisten apoptoosin. Proteiini runsaus Bcl-2-liittyvä X-proteiinia (BAX), joka edistää apoptoosin, oli suurempi kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 4aa, vertaa kaistat 3 4, 1 2). PUMA, joka on BH3 (Bcl-2-homologiadomeeni 3) -vain proteiini, joka indusoi apoptoosia mitokondriot reitin, oli myös korkeampi kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 4AB, vertaa kaistat 3 4, 1 2). Määrällinen kaistaintensiteettejä esitetään kuvassa 4BA, mikä viittaa 2-kertainen nousu BAX ja PUMA proteiinin taso. Lisäksi lisääntynyt halkaistut kaspaasi 3 (kuvio 4A, paneeli b, kaistat 3 4) ja väheni koko poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP), mutta lisääntyi lohkaistiin PARP (paneeli c, ylemmän kaistan ja alemman kaistan, vastaavasti, kaistoilla 3 4) in

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirissä verrattuna

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiiriä osoitus koholla apoptoottisen aktiivisuuden kilpirauhasen tuumorisolujen

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä (katso myös määrällistä tietoa kuvassa 4BB). Nämä tulokset osoittavat, että lisäksi viivyttää G1-S solusyklin etenemistä, lisääntynyt apoptoottinen aktiivisuus kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä myös osaltaan alentaa kilpirauhasen kasvua.

(A) tumaproteiiniuutteet valmistettiin kilpirauhasen kasvaimet

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(kaistat 1 ja 2) tai

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(kaistat 3 ja 4) hiirillä. On esitetty Western blot-analyysit BAX (paneeli a), PUMA (paneeli b), pilkottiin kaspaasi 3 (paneeli c), PARP ja pilkottiin PARP (paneeli d), ja aktiinin kuormituksen valvonta (paneeli e). (B) kvantitointi kaistaintensiteettejä esitetty (A). * P 0,05 Protein runsaasti BAX ja PUMA (paneeli a), lohkaistiin kaspaasi 3 ja halkaistut PARP (paneeli b) oli huomattavasti korkeampi ja koko PARP (paneeli b) oli alhaisempi kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä.

Kasvaimen kasvun estäminen aktivoimalla p53-signalointireitin että kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Hiiret

havainnot että proteiini runsaus p21 ja BAX muutettiin kuten yllä sai meidät tutkimaan, onko niiden ilmentymistä mRNA-tasolla vaikuttivat myös. Todellakin, huomasimme, että

Cdkn1A

(

p21

WAF1

) mRNA-tasot olivat merkittävästi korkeammat Kilpirauhasen

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 5A, bar 2 vs. bar 1). Vastaavasti

Bax

mRNA oli korkeampi kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä kuin

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 5B, bar 4 vs. bar 3). Nämä kaksi geeniä ovat suoraan säätelee p53 [35], [36]. Siksi arveltu, että muuttamalla aktiivisuutta p53 kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret johtaisi aktivaatioon transkription

Cdkn1A

ja

Bax

geenejä. Ensin tutkittiin, p53 mRNA ja proteiini muuttui, mikä muuttaa toimintaa kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä. Olemme havainneet, että ilmentyminen NCOR1ΔID ei ollut vaikutuksia p53 mRNA-tasolla (tangot 5 ja 6, kuvio 5A). Lisäksi olemme havainneet, että proteiini runsaasti p53 oli samalla alhainen kilpirauhasen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiret (kuvio 5B, ylempi paneeli, kaistat 3 ja 4, vastaavasti). Näin ollen, mitä suurempi

Cdkn1A

ja

Bax

mRNA-tasot eivät johtuneet aktivointi p53 transkription aktiivisuuden korotetussa p53-proteiinin ilmentymistä. Koska se on aikaisemmin osoitettu, että villityypin TR fyysisesti vuorovaikutuksessa p53: n kanssa ja säädellä negatiivisesti transkriptionaalista aktiivisuutta p53 [37], [38], seuraavan kerran tutkittu sitä mahdollisuutta, että aktiivisuuden p53 voitaisiin muuttaa kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen välityksellä PV kilpirauhasen mutanttihiirten. Samanaikainen immunosaostus analyysi osoitti, että PV liittyi p53 kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 5B, yläpaneeli, kaista 1). PV myös samalla liittyy p53 kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirissä (kuvio 5B, ylempi paneeli, kaista 2). Tärkeää on, samanaikainen immunosaostus osoitti lisäksi, että PV liittyi myös NCOR1 kilpirauhaseen ydin- otteet

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirissä (kuvio 5B, alapaneeli, kaista 1) , mutta ei vuorovaikutuksessa NCOR1ΔID kilpirauhaseen ydin- otteet

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä (kaista 2). Kaistat 3 ja 4 osoittavat, että saman määrän NCOR1 ja NCOR1ΔID vastaavasti havaittiin suoralla Western blot-analyysi (kuvio 5B, alempi paneeli). Nämä tiedot osoittavat, että PV vuorovaikutuksessa p53 ja NCOR1 on kolmen komponentin kompleksin (p53 /PV /NCOR1) kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä, mutta muodostivat vain p53 /PV monimutkainen kilpirauhasen

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä.

(A) Aktivoitu ilmaus

Cdkn1A

ja

Bax

geenien kilpirauhasessa on

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirillä. Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät ja materiaalit. Kukin kilpirauhasen näyte ajettiin kolmena rinnakkaisena yhteensä hiirellä numerot 3-5. Erot ilmaisu ovat merkittäviä ilmaus

Cdkn1A

(kaistat 1 ja 2) ja

Bax

geenejä (kaistat 3 ja 4) välillä

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä (kaistat 5 ja 6). (B) Co-immunosaostus PV p53 ja NCOR1 kilpirauhaseen on

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

hiirillä (kaista 1), mutta ei NCOR1ΔID kilpirauhasen otteita

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiiriä (kaista 2). Kaistat 3 ja 4 esittävät p53 bändi (yläpaneeli) ja NCOR1 ja NCOR1ΔID suoralta Western blot analyysi kilpirauhasen ydin- otteet

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ja

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

hiirille. (C ja D) rekrytointi PV ja NCOR1 p53 /DNA sitoutumiskohdista promoottori

Cdkn1A

geeni (C) ja

Bax

geeni (D). ChIP-määritys suoritettiin käyttäen IgG (pylväät 1 ja 6) tai anti-p53 (palkit 2 ja 7) tai anti-PV (palkit 3 ja 8) tai anti-NCOR1 (tangot 4 ja 9), tai anti-HDAC-3 ( baareja 5 ja 10) vasta-aineita, kuten on kuvattu

menetelmät ja materiaalit

. Sitoutuminen ilmaistiin kertaisesti muutosten viitaten negatiiviseen kontrolliin, jossa IgG käytettiin immunosaostukseen. * P 0,05 ja *** p 0,001.