Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vastauksena ionisoivaa säteilytystä ja tietyt kemoterapeuttiset aineet, kuolevat kasvainsolut saavat aikaan tehokas syövän immuunivasteen. Kuitenkin mahdollista vaikutusta wogonin (5,7-dihydroksi-8-methoxyflavone) syöpää immunogeenisuutta ei ole tutkittu. Täällä osoitettu ensimmäistä kertaa, että wogonin saa aikaan voimakas antituumorivaikutuksen immuniteetin vaikutusta indusoimalla translokaatio kalretikuliini (CRT) ja anneksiini A1 soluun solukalvon sekä vapauttamista korkean liikkuvuuden ryhmä proteiini 1 (HMGB1) ja ATP. Signaalin reittejä mukana tässä prosessissa tutkittiin. Huomasimme, että wogonin aiheuttama reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto aiheuttaa Endoplasmakalvosto (ER) stressin vastaus, kuten fosforylaatiota PERK (PKR kaltainen Endoplasmakalvosto kinaasi) /PKR (proteiinikinaasi R) ja eIF2α (eukaryoottinen initiaatiofaktoria 2α ), joka toimi ylävirtaan signaalin aktivoimiseksi fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) /AKT, indusoimaan kalretikuliinin (CRT) /anneksiini A1 solukalvon translokaatio. P22 /CHP, Ca

2 +: ta sitovaa proteiinia, liittyi CRT ja vaadittiin CRT translokaatio solukalvoon. Päästöihin HMGB1 ja ATP wogonin käsiteltyjen MFC soluja, yksin tai yhdessä muiden mahdollisten tekijöiden, aktivoitu dendriittisolujen ja indusoi sytokiinien julkaisuista. In vivo tutkimus vahvisti, että immunisaatio wogonin-esikäsitellyt kasvainsoluja rokotus esti merkittävästi homoplastic oksastettu mahakasvaimen kasvua hiirillä ja mahdollisen tulehdusvasteen oli mukana. Lopuksi aktivoituminen PI3K reitin aikaansaama ER stressiä CRT /anneksiini A1 translokaatio ( ”syö minua” signaali) ja HMGB1 julkaisu, välittävä wogonin aiheuttama koskemattomuuden kasvainsolun rokotetta. Tämä osoitti, että wogonin on uusi tehokas ehdokas immunoterapian vastaan ​​mahakasvaimen.

Citation: Yang Y, Li X-J, Chen Z, Zhu X-X, Wang J, Zhang L-b, et ai. (2012) Wogonin aiheuttama kalretikuliini /anneksiini A1 Altistuminen sanelee immunogeenisuutta syöpäsoluja PERK /AKT riippuvaisella tavalla. PLoS ONE 7 (12): e50811. doi: 10,1371 /journal.pone.0050811

Editor: Marc Tjwa, University of Frankfurt – University Hospital Frankfurt, Saksa

vastaanotettu: 20 tammikuu 2011; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro. 91129731 ja 81072661), Project ohjelma valtion Key Laboratory of Natural Lääkkeet, Kiina Pharmaceutical yliopisto (nro JKGZ201102) New Century Excellent Talents ohjelma tohtori Yong Yang tukema Opetusministeriö Kiina (NCET-09-0771), perustutkimus rahastojen Central yliopistot (nro JKZ2009006), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (nro BK2012025 ja BK2011632), ja ”Major Drug Discovery” tiede ja teknologian suurhankkeiden of China (nro 2011ZX09102-001-20). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Perinteiset syövän hoitomenetelmät ovat leikkaus, sädehoito, kemoterapia, ja joitakin syöpätyyppejä, hormonihoito. Vaikka hyödyt saadaan monet potilaat, ne ovat harvoin parantavia varten harvoista jäljellä levittää kasvainsoluja, ensisijainen kuolinsyy syöpäpotilailla. Tärkeä syy miksi kasvaimia ei ole ohjattu immuunijärjestelmä on, että alhainen immunogeenisyys. Käyttöön syövän rokotteiden aikaan terapeuttisen tuumorin vastaisen immuunivasteen harkiten valittu kasvainantigeenejä ilmaistaan ​​kasvaimen solut voidaan etsiä ja tappaa levittää kasvainsoluja. Yksi mahdollinen strategia tämän liittyy immunisaatio syöpäsolujen on käsitelty tietylle kemoterapeuttisten.

Kertyvät todisteet osoittavat, että useat kemoterapia-aineiden (mukaan lukien antrasykliinit ja oksaliplatiinin), ja ionisoivaa säteilytystä (kuten γ säteitä ja ultravioletti C (UVC) valo) aiheuttaa immunogeenisen syöpäsolun kuoleman [1], [2]. On ehdotettu, että niillä on kyky ajaa kalretikuliinin (CRT) translokaatio kasvainsolun pinnalla, joka toimii ”syö minua” signaalin, tunnistetaan dendriittisolut (DC: t), mikä johtaa tuumorin vastaisen T-soluvasteen [3]. Elementit koulutusjakson välittävä ennalta apoptoottisten CRT altistuminen liittyy altaan CRT että kuljettuaan Golgin laitteessa ja erittävät SNARE riippuvaisen eksosytoosilla [4].

HMGB1 (high-liikkuvuusryhmän proteiini 1), ydin- proteiini, joka vapautuu kuolee solusta, on ligandi Toll-kaltainen reseptori 4 (TLR4) [1]. Ehtyminen HMGB1 kuolemasta kasvainsoluja lakkautetaan TLR4 riippuva, ​​DC-välitteinen antigeenien esittely kuolemasta kasvainsoluja in vitro ja in vivo [1]. Joten, HMGB1 julkaisu tarvitaan immunogeenisyyden solukuoleman kautta vaikutus TLR4. Kuitenkin, ei HMGB1 tai CRT (tai molempia) voi edistää täysin DC: iden kypsymisen, mikä osoittaa, että etsintä immuunijärjestelmää stimuloivien molekyylien tuottaman kuolevat solut on jatkettava [5].

Wogonin (5,7 dihydroksi-8-methoxyflavone), aktiivisen komponentin eristetty

Scutellaria baicalensis

radix, on raportoitu olevan huomattava syövänvastainen toimintaa indusoimalla solujen erilaistumista, apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen [6] – [8]. Tässä tutkimuksessa testasimme ovatko wogonin, kuten jotkut kemoterapiaa huumeita edellä mainittiin, kykenee indusoimaan immunogeenisen syöpäsolun kuoleman, ja jos on, mahdollinen signaali reittejä mukana tässä prosessissa arvioitiin. Löysimme ensimmäistä kertaa, että wogonin saa aikaan voimakas antituumorivaikutuksen immuniteetin vaikutusta indusoimalla translokaatio CRT ja anneksiini A1 soluun solukalvon sekä vapauttamaan HMGB1 ja ATP. Huomasimme, että Endoplasmakalvosto (ER) stressivaste, kuten PERK (PKR kaltainen Endoplasmakalvosto kinaasi) /PKR (proteiinikinaasi R) ja eIF2α (eukaryoottinen initiaatiofaktoria 2α alayksikön) fosforylaation ja sitä seuraavan aktivaation PI3K /AKT signalointireitille ovat mukana tässä prosessissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki eläimet pidettiin erityinen patogeenittomassa olosuhteet, ja kaikki kokeet suoritettiin Federation of European Laboratory Animal Science Association ohjeita. Eettinen komitea Kiina Pharmaceutical yliopisto hyväksyi kaikki eläinkokeet (Permit numerot: SYXK2007-0025).

Kemikaalit ja reagenssit

Wogonin sovellettiin DMSO: hon 10 mM ja varastoitiin -20 ° C. Doksorubisiini, Rapamysiini, LY294002, AKT-estäjällä X (Akti) hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). EGFR, ERK1 /2, AKT1 /2, Ku 80, vuohen anti-kaniini-IgG-HRP: tä ja vuohen anti-hiiri-IgG-HRP-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). N-asetyyli-kysteiini (NAC) ja hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini saatiin Sigma (St. Louis, MO). p-PERK (Thr980), PERK, p-eIF2-α (Ser51), eIF2-α, p-PKR (Thr446 /451), PKR, p-AKT (Ser 473), p-AKT (Thr 308), anneksiini A1, p-S6K (Thr389), p-4E-BP1 (Ser 65), S6K, 4E-BP1, p-GSK3p (Ser 9), s-S6 (S235 /236), p-ERK (Thr202 /Tyr204) , p-JNK (Thr183 /Tyr185) ja p-p38 (Thr 180 /Tyr182) vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Bevery, MA).

Solut kulttuuri

Ensisijainen hiiren viljellyistä monosyytti -johdannainen dendriittisolut (MoDCs) olivat B6-hiirten luuytimen, ylläpidetään MEM-alustassa (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 10% FBS: ää plus GM-CSF: ää (50 ng /ml). Western blot -analyysiä varten, solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 2 x 10

5 solua /ml tuoretta täydellistä viljelyalustaa. Ihmisen mahakarsinoo- MKN-45-solut, hiiren mahasyöpä MFC peräisin olevia soluja 615 hiiristä (Military Medical Sciences, Beijing), WT ja AKT1 /2 hengen Knockout MEF (ostettu Shanghai solupankki Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina) pidettiin DMEM-väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA), penisilliini /streptomysiini (1:100, Sigma, St. Louis, MO) ja 4 mM L-glutamiinia (Sigma, St. Louis, MO), joka CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Kaksiulotteinen geelielektroforeesin ja proteiinin tunnistaminen massaspektrometrialla

menetelmiä viitataan edelliseen tutkimuksen [9]. Lyhyesti, Isoelektrinen fokusointi (IEF) suoritettiin koskevasta Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience) 24 cm immobilisoitu pH-gradientti liuskat (pH 3-10; Amersham Bioscience). Geelit (kolme toistoa kutakin) olivat hopeavärjätyssä julkaistujen menetelmien mukaisesti ja skannataan käyttäen Atrix scan 1010 plus (Microtek, Taiwan, Kiina), ja tuloksena kuvat analysoitiin käyttämällä ImageMaster 2D Platinum ohjelmisto (Amersham Bioscience) piste- havaitsemiseen, kvantifiointi, ja vertaileva ja tilastollisia analyysejä. Havaitut täplät ja neljä ohjaus paikkoja nonstained geeli alueilla leikattiin (noin 1 mm

3 kuutiot) päässä geelit värjättiin Coomassie Brilliant Blue. Näytteen valmistus matriisi laserdesorptio /ionisaatio-of-lennon (MALDI-TOF).

Kahden Triple-Label Immunofluoresenssikoe konfokaalimikroskopia

MFC solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja käsitellä immunofluoresenssilla, kuten aiemmin on kuvattu [10], paitsi että Cy5, fluoreskeiini isothiocyanate- ja /tai tetrametyylirodamiini B-isotiosyanaatti-leimatut sekundääriset vasta-aineet (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) käytettiin. Sitten solut pestiin lyhyesti PBS: ssä ja asetettiin lasilevyille käyttäen pidentää mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää kit asennus reagenssilla (Molecular Probes). Soluja visualisoitiin Axiovert S100 käännettyä mikroskooppia (Carl Zeiss), joka on kytketty ve confocal yksikkö (Atto Bioscience, Rockville, MD) ja Hg höyryn valonlähde. Kuvat kerättiin Openlab ohjelmistoversio 3.0.9 (Improvision, Lexington, MA), jossa on ORCA-ER digitaalikamera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japani) ja suodatin sarjat fluoreseiini (484 nm), tetra- B-isotiosyanaatti (555 nm ), ja Cy5 (650). Kuva-analyysi konfokaali kuvien suoritettiin käyttäen Adobe Photoshop 5.5. Sallimaan intensiteetti vertailuja, käytimme samoja ehtoja kerätä ja käsitellä kuvia kussakin kokeessa.

Western blotit

Kuten edellä mainittiin [11], 30 ug proteiinia kustakin osoitti hoitojen erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Bedford, MA). Kun oli salvattu 10% maitoa 30 min, membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa seurasi inkubointi sekundaarisia vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin tehostetun kemiluminesenssin (ECL) havaitsemisjärjestelmä. Western blotit tulokset kvantifioitiin Image J ohjelmisto.

biotinylointi MFC solupintaproteiinien

biotinylointi ja talteenotto solupintaproteiinien suoritettiin menetelmällä muokattu viite [1]. Lyhyesti, 15 x 10

6 MFC-solut sijoitettiin jäille ja pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS-Ca

2 + -Mg

2+ (PBS 0,1 mM CaCl

2 ja 1 mM MgCl

2). Kalvon proteiinit jälkeen biotinyloitiin 30 minuutin inkuboinnin 4 ° C: ssa NHS-SS-biotiinia 1,5 mg /ml (Pierce) juuri laimennettiin biotinylaatio puskuriin (10 mM trietanoliamiini, 2 mM CaCl

2, 150 mM NaCl, pH 7,5) varovasti sekoittaen. MFC solut huuhdeltiin PBS-Ca

2 + Mg

2+ + glysiiniä (100 mM) ja pestiin tässä puskurissa 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa sammuttamiseksi reagoimattoman biotiini. Sitten solut huuhdeltiin kahdesti PBS-Ca

2 + Mg

2+, kaavittiin kylmässä PBS: ssä, ja pelletoitiin 3000 rpm 4 ° C: ssa. Pelletit liuotettiin 45 min 600 ul: aan lyysipuskuria (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,5), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 14000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit inkuboitiin yön täytettyyn streptavidiini-agaroosi-helmiä palauttaa biotinyloitu proteiineja. Sitten helmet pelletoitiin sentrifugoimalla, ja supernatantin otettiin edustaa sitoutumattoman, solunsisäinen allas proteiineja. Biotinyloitu proteiinit eluoitiin helmistä kuumentamalla 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan SDS-PAGE-näytepuskuriin ennen kuin ne lastataan 10% SDS-PAGE-geelissä. Sen varmistamiseksi, että vuotoa biotiini soluihin, systemaattisesti todennettujen puuttuessa solunsisäisen proteiinin aktiinille biotinyloidun otteita.

immunosaostus (IP) B

Kuten edellä on mainittu [11], solut käsitellään sopivalla ärsykkeisiin lyysattiin lyysipuskurilla, 200 mM NaCl (pH 7,4), 1% Triton X-100, 10% glyseroli, 0,3 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, ja proteaasi-inhibiittorin cocktailit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Alikvootit 600 ug proteiineja jokaisesta näytteestä esipuhdistettiin inkuboimalla 20 ui proteiini-A /G Sepharose (helmiä) (Amersham, IL) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Esiselkeytettiin näytteitä inkuboitiin anti-kalretikuliinin (CRT) Vasta-aine (cs-2891, Cell Signaling Tech), tai anti-DNA-PKcs (sc-9051, Santa Cruz vasta-aineet) lyysipuskurissa yön yli 4 ° C: ssa. 30 ui proteiini-A /G-helmiä lisättiin ja näytteitä inkuboitiin 2 tuntia 4 ° C: ssa. Helmet pestiin viisi kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kerran lyysipuskurilla, keitetyt, erotettiin 10% SDS-PAGE ja siirrettiin PVDF-kalvolle, jota seuraa Western blot-analyysi, kuten edellä on kuvattu.

CRT-konfokaali immuuni-fluoresenssi

Syöpäsolut kanssa osoitetun hoidon kiinnitettiin ja blokattiin 10% BSA: ta PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten 1:100 kanin anti-kalretikuliinin (CRT) Vasta-aine ( cs-2891, Cell Signaling Tech) 1 h (testaus CRT translokaatio) ja sen jälkeen FITC-anti-kaniini-vasta-ainetta (Cell Signaling Tech, MA) 1:100 30 minuutin ajan ja CRT immuuni-fluoresenssia ei havaittu konfokaalimikroskopia (Leica TCS SMD FCS, Leica, Saksa), Hoechst 33342 käytettiin värjäämään ydinvoiman.

sirna (siRNA) knockdown tutkimukset

Kuten aiemmin on kuvattu [11], siRNA varten PERK (sc-36214), DNA-PKcs (sc-35200) tai P22 (sc-142330) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Syövän soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa, joka ei sisältänyt antibiootteja 4 päivää. Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 1 päivä ennen transfektiota ja niitä viljeltiin 60% konfluenssiin seuraavana päivänä. RNAi-kokeissa, 6,25 ui Lipofectamine ™ LTX yhdessä 2,5 ui PLUS ™ Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) laimennettiin 90 ul: aan DMEM: ssa 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Sitten 10 ui siRNA (20 uM) sekoitettiin DMEM: iin, joka sisälsi Lipofectamine yhdessä PLUS-reagenssia ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa kompleksin muodostumista. Lopuksi, kompleksi lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät 2 ml: ssa alustaa, jossa on 100 nM lopullinen siRNA pitoisuus. P22 (ab56953, Abcam) tai PERK (sc-13073, Santa Cruz) proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot 48 tuntia transfektion jälkeen.

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) havaitseminen

Kuten aikaisemmin [11], syövän solut esiasennettuna 1 uM fluoresoivaa ainetta dihydrorodamiini (DHR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) kaksi tuntia ennen ilmoitettu hoitoja, jotka reagoivat ROS-soluissa ja johtaa fluoresenssin muutos. Sen jälkeen, kun on käsitelty asianomaiset hoidot, syöpä solut trypsinoitiin, suspendoitiin jääkylmään PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etyylialkoholia -20 ° C: ssa. Muutokset fluoresenssissa huumeisiin käsitellyissä soluissa kvantitoitiin FACS-analyysi. Induktio ROS sukupolvi ilmaistiin mielivaltaisina yksikköinä. ROS tuotanto havaittiin myös visualisoimalla dihydrorodamiini (DHR) fluoresoivana konfokaali immuuni-fluoresenssimikroskopiaan.

Measurement solunulkoisen ATP-tasot

ATP synteesi mitattiin MFC-soluilla eri hoidossa wogonin. Vuonna sextuplicates, 5 x 10

3-soluja viljeltiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 24 h, ATP: n määrä supernatantissa mitattiin käyttäen Molecular Probes ”ATP määritys Kit (Kaiji, Nanjing) mukaan valmistajan ohjeita. Tämä sarja perustuu bioluminenssi havaitsemiseen ATP, käyttämällä rekombinantti-tulikärpäsen lusiferaasi ja sen substraatti, lusiferiini. Yhteensä kemiluminesenssin kerättiin luminometrillä. ATP: n määrä peräisin testi liuos määrä mitataan vertaamalla kalibrointikäyrä ATP kuin vakio.

Sytokiini Kvantifiointi

MFC syövän soluja käsiteltiin osoitti hoitojen 36 tuntia; Supernatantti kerättiin ja arvioitiin HMGB1 ELISA sarjat (Shino-Test Corporation, ST51011) mukaan sen protokollan. Sytokiinin vapautumisen, MoDCs käsiteltiin supernatantin MFC-solujen 24 tunnin ajan, supernatantti MoDCs kerättiin ja arvioitiin IL-6 (Mouse IL-6 ELISA Kit, BD OptEIA, 550950) ja TNF-α (Mouse TNF-a ELISA- Kit, BD OptEIA, 560478) mukaan niiden protokollien.

in vivo kasvaimia solun rokotus kokeilu

3 x 10

6 MFC soluja, suspendoidaan 200 ml: aan PBS, joko vasen hoitamaton tai hoidettu wogonin (100 uM) 4 tuntia. Wogonin käsitelty MFC soluja istutettiin ihonalaisesti alempaan kylkeen 6-viikkoisen naaras-615 hiirten (Military Medical Sciences, Beijing), kun taas 5 x 10

5 käsittelemättömät solut ympättiin contralateral kylkeen 7 päivää myöhemmin kuvatulla tavalla edellisessä tutkimuksessa [1].

-fagosytoosikoe

-fagosytoosikoe suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. MoDCs säädettiin 2,5 x 10

4cells /ml DMEM-alustassa, ja viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta. Ne annettiin tarttua 24 h, minkä jälkeen solut leimattiin 4 uM PKH26. Me valmistettiin MFC-soluja, jotka olivat joko käsittelemättömiä tai käsitelty eri pitoisuuden wogonin (50, 100 ja 200 uM) 2 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun MoDCs pestiin kylmällä PBS: llä kolme kertaa, MFC-solut leimattiin 0,5 uM CFSE lisättiin 24-kuoppaisille levyille -fagosytoosianalyysit. 15 min kuluttua 37 ° C: ssa, fagosytoosin havaittiin Leica DFC 450C ohjelmisto, käyttäen ImageJ1.38 kuvankäsittelyn ja analyysi-ohjelmisto laskettaessa prosenttiosuus MoDCs kokemat ainakin yksi kasvainsolujen vähintään 100 solua.

tilastollinen analyysi

arvot kuvioissa ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Luvut tässä tutkimuksessa olivat edustajia yli 3 eri kokeessa. Tilastollinen analyysi dataa kontrolli- ja testiryhmään suoritettiin opiskelija t-testillä. Arvot p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Wogonin indusoi kalretikuliinin (CRT) translokaatio solun pinnalle kalvo on riippuvainen PERK ja PI3K /AKT

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ulkoinen lähde signaalien indusoivien kalretikuliini (CRT) solukalvon altistuksen, joka toimii ”syö minua” signalointi, joka antaa immunogeenisyyden muuten immunogeenisiä solukuoleman, mikä mahdollistaa optimaalisen syöpälääkkeiden [1]. Seuraavaksi testasimme wogonin voisi myös käyttäytyvät samalla matalapainelaminaattikannet syöpäsoluja. Kuten näet kuvassa. 1A, wogonin (100 m) indusoi voimakkaan CRT solun pinnalla translokaatio matalapainelaminaattikannet syöpäsoluja kuin havaitaan Western blotit testaus solun pintaan CRT. Niistä signaalien kulkureiteillä joka säätelee CRT translokaatio ja vastaava immunogeeninen solukuolema /apoptoosin, se on nyt vakiintunut, että pre-apoptoottisia ER stressiä ja fosforylaation eukaryoottitranslaatioon initiaatiofaktoria 2α (eIF2α) ja ylävirran signaalin kinaasi proteiinikinaasi R-like Endoplasmakalvosto kinaasi (PERK) ovat tärkeimmät [13]. Fosforylaatio eIF2α jonka PERK anterogradista kuljetusta CRT alkaen ER: sta Golgin laitteeseen ja eksosytoosilla CRT sisältävien rakkuloiden lopulta johtaa CRT translokaation päälle solukalvon pinnan, joka toimii avain ”syö-me” signaali [1 ], [4], [14] – [17]. Täällä, huomasimme, että Knockdown PERK kohdelajiryhmän siRNA pitkälti esti CRT translokaation wogonin (Fig. 1A), mikä osoittaa mahdollista osallisuutta PERK ja ER stressiä tässä prosessissa. Yllättäen PI3K /AKT esto joko farmakologisen estäjä (LY 294002 ja AKT-estäjällä X) tai geneettinen taintumisen (käyttäen AKT1 /2 double pudotuspelit MEF) myös laajalti esti CRT translokaatio (Fig. 1 B-D), vaikutus AKT estoa wogonin aiheuttama CRT translokaatio vahvisti myös immuuni-fluoresenssi konfokaali määritys kuten kuvassa. 1C. Yhdessä olemme huomanneet, että wogonin indusoi CRT translokaatio solun plasman pinnan, PERK ja PI3K /AKT voisi olla mukana tässä prosessissa.

Mahalaukun masolulinjassa MFC-solut transfektoitiin scramble siRNA (Ctrl, 200 nM) tai PERK siRNA (200 nM), 48 tunnin kuluttua, ilmentymisen taso PERK havaittiin Western-blotit tarkistaa PERK tason jälkeen siRNA hoidon. Onnistuneesti Perk pudotus soluja ja niiden valvonta-soluja (Ctrl siRNA käsitellyt solut) käsiteltiin wogonin (100 uM) 2 ja 4 tuntia. Solun pinnan proteiineja solukalvon fraktion kuin biotinyloitua ja testattiin CRT, EGFR ja aktiini. Kokosolulysaattia saatiin myös testata CRT, PERK ja aktiini (A). MFC-soluja esikäsiteltiin AKT spesifinen inhibiittori X (Akti 100 nM) tai PI3K /AKT-estäjällä LY294002 (100 nM), 2 tunnin ajan, minkä jälkeen wogonin (100 uM) käsiteltiin 2 ja 4 tuntia, CRT, EGFR ja aktiinin plasmassa membraaniproteiini osa havaittiin Western-blotit. CRT, p-AKT (ser 473), AKT1 /2 ja aktiini yhteensä solulysaattia myös havaittiin Western-blotteja (B) .crt translokaatio solun pinnalle sen jälkeen, kun wogonin hoidon vahvistettiin myös konfokaalisella immuuni-fluoresenssimikroskopialla, translokaatioprosessin oli estävät Akt estäjä X (Akti 100 nM), doksorubisiini (Dox, 1 uM, 2 h hoito) käytettiin tässä positiivisina verrokkeina. (C). WT ja AKT1 /2 double pudotuspelit MEF hoidettiin wogonin (100 uM) 4 tunnin ajan; CRT, EGFR ja aktiinin solukalvon proteiinin osa havaittiin Western-blotit. P-S6 (S235 /236), p-AKT (S473), AKT1 /2, CRT ja aktiinille kokosolulysaatissa havaittiin Western-blotteja (D). Kokeita tässä kuviossa toistettiin vähintään 3 kertaa ja samanlaiset tulokset saatiin. Bar = 10 pm.

Wogonin indusoi ROS riippuvainen ER stressin vastaus, katkaisten kuin alkupään signaali aktivointia PI3K /AKT-reitin

Kuten edellä, nykyinen tiedot viittaavat siihen, että että wogonin aiheuttama CRT translokaation, ja PERK ja PI3K /AKT reitti voi olla mukana tässä prosessissa. Seuraavaksi yritimme leikellä tämän signaalireitin. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, wogonin (100gM) indusoi selvää PI3K /AKT aktivaation MFC soluissa lyhyessä ajassa (jopa 2 tuntia); Kiinnostavaa AKT aktivointi alassäädetty jälkeen pitkäaikainen altistuminen wogonin (Fig. 2A ja B). Samaan aikaan, altistuminen wogonin indusoi myös selvää, ER vasteen osoituksena vahva fosforylaatio ER stressiproteiinien (PERK, PKR ja eIF2α) in wogonin käsiteltiin MFC-solut (Fig. 2C). PERK siRNA pudotus, joka on osoitettu estävän CRT translokaatio (Fig. 1A), suurelta osin estivät wogonin indusoimaa fosforylaatiota eIF2α ja PI3K /AKT aktivaation MFC-soluissa (kuvio. 2D ja E), joka osoittaa, että PERK toimii ylävirran signaali wogonin indusoi PI3K /AKT signalointia. Yrittämällä tunnistaa alkupään signaali wogonin aiheuttamaa ER stressiä ja PERK fosforylaatio, huomasimme, että huomattava ROS tuotanto (Fig. 2F ja G), PERK /PKR fosforylaatio ja PI3K /AKT /mTORC1 aktivaatio laukaisee wogonin suurelta osin estyy anti- hapettimen N-asetyyli-kysteiini (NAC) (Fig. 2G-H). Tämän perusteella ehdotamme, että ROS muuttaa ER proteiineja ja saada ER stressin vastaus, joka johtaa PERK /PKR välittävien eIF2α fosforylaation ja myöhempää PI3K /AKT aktivointi, joka ohjaa CRT translokaation ja mahdollinen ”syö-me” signaali.

Mahalaukun masolulinjassa MFC-soluja käsiteltiin wogonin (100 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina, AKT ja loppupään mTORC1 aktivaatio havaittiin western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla, AKT1 /2, S6K, S6 ja β-aktiini testattiin myös tasavertaisina kuormitukset (A). AKT fosforylaatio kvantifioitiin käyttäen Image J ohjelmisto jälkeen normalisoidaan AKT1 /2 (B). Huomaa, että Wogonin indusoi aikaista aktivointia, mutta myöhemmin inhibitio AKT. MFC-soluja käsiteltiin wogonin (100 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p-PKR (Thr446 /451), niiden vastaavat ei-fosfo-proteiinien ja AKT1 /2 havaittiin Western-blotteja (C). MFC-solut transfektoitiin PERK siRNA: ssa 48 tuntia, onnistuneesti transfektoitujen solujen (varmistettiin western blot) käsiteltiin wogonin (100 uM) 1 tunti, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p- AKT (Ser 473), p-4E-BP1 (Ser 65), PERK, niiden vastaavat ei-fosfo-proteiinit ja β-aktiini havaittiin Western-blotteja (D), AKT fosforylaatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen Image J ohjelmisto jälkeen normalisoitu AKT1 /2 (E). MFC Soluja esikäsiteltiin antioksidantti N-asetyyli-kysteiini (NAC, 400 uM) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen wogonin (100 uM) hoitoa 30 minuuttia, ROS havaittiin sekä fluoresenssin (F) ja FACS ( G) määrityksessä vastaavasti kuten edellä on kuvattu. MFC Soluja esikäsiteltiin antioksidantti N-asetyyli-kysteiini (NAC, 400 uM) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen wogonin (100 uM) 30 ja 60 minuuttia, p-PERK (Thr980), p-PKR (Thr446 /451), p-4E-BP1 (Ser 65), p-AKT (Ser 473) ja niiden vastaavat ei-fosfo-proteiinit havaittiin Western-blotteja (H). Kokeita tässä kuviossa toistettiin vähintään 3 kertaa ja samanlaiset tulokset saatiin.

#

P

0,05 vs. kontrolli siRNA ryhmä. *

P

0,05 verrattuna ryhmiin ilman NAC esikäsittelyä. Bar = 10 pm.

DNA- PKcs, muodostaa kompleksin PERK, välittää AKT aktivaatio Wogonin

vieressä yrittäneet indentify välissä pelaaja AKT: aktivoitumisen PERK mukaan tarkennus DNA-PKcs, äskettäin löydetty PI3K jäsen, joka voi aktivoida AKT [18] – [20]. DNA-PK koostuu 470 kDa katalyyttinen alayksikkö (DNA-PKcs) ja Ku antigeeni kompleksi (Ku80 /Ku70) ja mukana V (D) J rekombinaatio, korjaus DNA kaksijuosteisen taukoja homologisella loppuun liittymällä, apoptoosin, ja transkription sääntely [21] .Significantly, nyt se on vakiintunut, että DNA-PKcs, jäsenenä PI3K perhe, myös säätelee AKT fosforylaatio [22]. Lisäksi rooli DNA-PK: n aktivoinnissa AKT CpG-DNA: n on todettu käyttäen luuytimestä peräisin makrofagien [23]. Lisäksi Bozulic et ai. osoitti, että DNA-PK fosforyloi AKT induktion DNA kaksinkertainen katkeamisen [19]. Myös vaatimus DNA-PK fosforyloi AKT vastauksena ionisoivan säteilyn perustettiin myös in vivo [19]. Joten seuraava testasimme mahdollista osallistumista DNA- PKcs in wogonin aiheuttama AKT fosforylaatio. Pieni molekyyli estäjä DNA-PKcs, Nu7062, on erityisesti tässä käytetty inhiboimaan DNA-PKcs aktiivisuutta. Soluissa esikäsitelty Nu7026, wogonin aiheuttama AKT fosforylaatio oli lähes täysin kumottu (Fig. 3A). Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että DNA-PKcs voisi olla avain välinen sovittelee varten wogonin aiheuttama AKT aktivointia. Testata tätä edelleen, erityiset siRNA vastaan ​​DNA- PKcs käytettiin tästä pudotus DNA- PKcs. Täydessä tuen ansiosta tietoja NU7026 tutkimuksista, AKT fosforylaatio molemmin Ser473 ja Thr308 oli suurelta osin heikentynyt wogonin käsitellyissä soluissa köyhdytetyn DNA-PKcs (Fig. 3B). Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että DNA-PKcs, AKT ja PERK muodostavat monimutkainen Wogonin käsitellyissä soluissa, mikä on päinvastainen esikäsittelyssä DNA-PKcs -estäjä Nu 7062 (Fig. 3C), näiden tietojen perusteella ehdotamme, että DNA- PKcs, muodostaa kompleksin PERK, välittää AKT aktivaation wogonin. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi, jolla DNA-PKcs fosforyloi AKT in wogonin käsitellyissä soluissa on lisätutkimuksia.

Mahalaukun masolulinjassa MFC Soluja esikäsiteltiin DNA-PKcs-estäjä (Nu 7062, 10 uM) ja 2 tunnin, jonka jälkeen wogonin (100 uM) käsittely 1 ja 2 tuntia, AKT fosforylaatio havaittiin Western blot ja DNA-PKcs ja AKT1 /2 havaittiin tasa-arvoisina kuormitukset (A). MCF-7-soluja transfektoitiin sekoituskoodin (Ctrl, 200 nM) tai DNA-PKcs (200 nM) 48 tuntia käyttäen transfektiomenetelmiä kädellään edellä, onnistunut transfektoituja soluja, joita käytetään testattaessa AKT signalointi wogonin käsiteltiin MFC-soluja (B). MFC Soluja esikäsiteltiin DNA-PKcs-estäjä (Nu 7062, 10 uM) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen wogonin (100 uM) hoito 1 tunnin esiselkeytettiin 600 ug: n alikvootit solulysaateista inkuboitiin anti-DNA- -PKcs, jonka jälkeen Western blot-analyysi, jossa anti-DNA-PKcs, AKT, PERK, Ku80, IgG ja β-aktiini vastaavasti (C). Kokeita tässä kuviossa toistettiin vähintään 3 kertaa ja samanlaiset tulokset saatiin.

* P 0,05 verrattuna ryhmiin ilman Nu7062,

* P 0,05 verrattuna ryhmiin ilman DNA- PKcs knockdown.

indentify anneksiini A1 ja p22 mahdollisimman kohteina wogonin

edelleen identifioimaan mahdollista tavoitteet wogonin, kaksiulotteinen (2D) geelielektroforeesi ja massaspektrometria-proteiinin analyysi on sovellettu tässä. Me valmistettiin kokosolu proteiinien Mahalaukun karsinoomasolulinja MKN-45-soluja, jotka olivat joko käsittelemättömiä tai käsitelty eri pitoisuuden wogonin (50, 100 ja 200 uM) 24 tunnin ajan. Vertailu kaksiulotteinen (2D) elektroforeeseilla, jonka jälkeen massa spektroskooppianalyysit, johti tunnistamiseen HMGB1 (high-liikkuvuusryhmän proteiini 1), P22 ja anneksiini A1 proteiineja, jotka voimakkaasti aiheuttama wogonin käsittely annosriippuvaisesti ( Fig. 4A ja B). Anneksiini A1 on ensimmäinen tunnettu jäsen anneksiini perheen proteiinien kykenee sitoutumaan (eli liittää) solukalvoihin kalsiumista riippuvalla tavalla. Alun perin kuvattu fosfolipaasi A2 (PLA2) -inhibitory proteiinia, anneksiini A1 voi vaikuttaa useita komponentteja tulehdusreaktion lisäksi arakidonihapon metaboliaan [24], [25]. Kiinnostavaa kyllä, anneksiini A1 on hiljattain osallisena apoptoottisten solujen ”syö minua” signaali ja seurannut fagosytoosin ja todisteet on kasautunut tukemaan rooli päätöslauselmassa vaiheessa tulehdus. Paperi by Arur et al. elegantisti osoitti, että anneksiini A1 voisi olla endogeeninen fosfatidyyliseriini (PS) ligandin [26], välittävä hautautumisen apoptoottisten solujen. Anneksiini A1 rekrytoimista PS-rikas alue solun pinnan ja välittää ”syö-me” signaalin ja vapauttaa solun kalsiumin [26]. Erityisesti olemme huomanneet, että anneksiini A1 sekä kalsiumia sitova proteiini p22 olivat molemmat altistuminen solun pinnalle sen jälkeen, kun wogonin hoidon mitattuna Western blot testaus solun pinnan proteiineja (Fig. 4C). Kuten on esitetty kuviossa.