Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisäksi geneettisiä muutoksia, esiintymisen epigeneettiset muutokset liittyy kertymistä sekä geneettisten ja epigeneettiset tapahtumat, jotka edistävät ja etenemiseen ihmisen syövän. Aiemmin kerroimme joukko kandidaattigeenejä jotka muodostavat osan syntymässä ”syöpä methylome”. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme testattiin ensin 23 kandidaattigeenit promoottori metylaation pieni määrä ensisijainen paksusuolen kasvain kudosten ja valvontaa. Näiden tulosten perusteella, me tutki metylointi taajuus

onkostatiini M-reseptori-β

(

OSMR

) useammissa kudosta ja ulosteen DNA-näytteitä kerättiin paksusuolensyöpä potilaiden ja verrokkien. Olemme havainneet, että

OSMR

on usein metyloitunut ensisijainen paksusuolen syövän kudoksissa (80%, 80/100), mutta ei normaaleissa kudoksissa (4%, 4/100). Metylointi

OSMR

havaittiin myös ulosteissa DNA peräsuolen syöpäpotilailla (38%, 26/69) (cut-off in TaqMan-MSP, 4). Havaitseminen muita metyloituja merkkiaineiden ulosteessa DNA parantunut herkkyys juurikaan vaikutusta spesifisyys. Promoottori metylaatio välittämä vaiennettu

OSMR

solulinjoissa, ja CRC-solut, joilla on alhainen

OSMR

ilme oli resistenttejä kasvun inhibitiolle Onkostatiini M. Tuloksemme antavat biologinen perusteet vaiennettu

OSMR

paksusuolen syövän etenemiseen ja korosta uusi terapeuttinen tavoite tässä sairaudessa. Lisäksi havaitsemiseksi ja sen määrän

OSMR

promoottori metylaatio ulosteiden DNA on erittäin spesifinen diagnostinen biomarkkeri CRC.

Citation: Kim MS, Louwagie J, Carvalho B, Terhaar sive Droste JS, Park HL, Chae YK, et al. (2009) Promoottori DNA metylointi

onkostatiini M-reseptori-p

kuin uusiin diagnostiikan ja terapian Marker Colon Cancer. PLoS ONE 4 (8): e6555. doi: 10,1371 /journal.pone.0006555

Editor: Jonathan Weitzman, Université Paris-Diderot, Pariisi 7, Ranska

vastaanotettu: 06 helmikuu 2009; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 07 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute (U01-CA84986) ja Oncomethylome Sciences, SA, ja Alankomaiden Cancer Society (hanke numero RUG 2004-3161). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Under välisen lisenssisopimuksen OncoMethylome Sciences, SA: n ja Johns Hopkins University, Dr. Sidransky on oikeus osuuteen royalty saamien yliopiston tuotteiden myyntiin kuvattu tässä artikkelissa. Dr. Sidransky omistaa OncoMethylome Sciences, SA kalusto, joka on asetettu tiettyjä rajoituksia University politiikkaa. Tohtori Sidransky on maksettu konsultti OncoMethylome Sciences, SA ja on maksanut jäsen yhtiön tieteellinen neuvottelukunta. Termi Tämän järjestelyn on hallinnoi Johns Hopkins University mukaisesti eturistiriitoja politiikkaa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä miehillä ja naisten ja osuus 10% kaikista uusista syöpätapauksista ja syöpään kuolee vuosittain [1]. Yleinen 5 vuoden elossaolo alkaen paksusuolensyöpä on kasvanut viimeisten 20 vuoden aikana, koska varhaisen havaitsemisen lisääntyneestä seulonnasta. Huolimatta paljon edistystä, kehittyneempiä tietoa molekyylitason patogeneesin CRC tai keskeisiä ympäristöön /ruokavaliotekijät CRC kehittämiseen tarvitaan edelleen. Lisäksi löytää mahdollisia diagnostisia markkereita ja terapeuttisia kohteita CRC auttavat varhaisen havaitsemisen ja hoidon paksusuolen syöpä. Useimmat CRC syntyvät adenomatoottisen esiasteista, ja kertyminen voitto-of-function mutaatiot esikasvaintekijät ja menettämisestä toiminnon mutaatioiden tuumorisuppressorigeeneille (APT) johtaa etenemiseen adenomatoottisten vaurioiden kohdunkaulan [2], [3], [4].

lisäksi geneettisiä muutoksia, joihin mutaatiot onkogeenien ja APT, karsinogeeninen etenemiseen hyvänlaatuinen kasvain ja adenokarsinooma voi tapahtua epigeneettiset muutoksia geenien promoottorit [5]. Poikkeava geenin ilmentyminen on luonteenomaista ihmisen syövissä, ja muutokset DNA: n metylaatio tila voi olla syvällisiä vaikutuksia geenien ilmentymistä. APT näyttö sekä geneettiset ja epigeneettiset inaktivaation ihmisen kasvaimissa, ja transkription hiljentämisen APT on perustettu hypermetylaation yhteisenä mekanismi menetys TSG funktio ihmisen syövissä [6] mukaan lukien paksusuolen syöpä [7], [8]. Niinpä tieto metylaatiovyöhykkeiden koko genomi voi auttaa tunnistamaan keskeiset APT inaktivoituu aikana kasvaimen muodostumisen [9], [10], [11].

Aikaisemmin on raportoitu joukko kandidaattigeenejä jotka muodostavat osan syntymässä ”syöpä methylome” käyttämällä uutta promoottoria rakenne algoritmin ja mikrosirujen tuottaman tiedon 22 syöpäsolulinjasta johdettu 5 tärkeimmät syöpätyyppeihin [12]. Tässä aikaisemmassa tutkimuksessa tutkimme vastatunnistetun syöpää erityisiä metyloitu geenien paneelia 300 primaarikasvainten edustavat 13 syöpien riskiä. Tietojen perusteella, määrä tunnettuja syövän erityisiä metyloitua geenien kasvoi noin 40%.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutki uudelleen metylaatiostatuksen syöpää erityisiä metyloituneiden geenien suurempi määrä kudosten ja uloste DNA paksusuolen syöpäpotilaiden sekä potilaita ilman syövän. Huomasimme, että

onkostatiini M-reseptori-β

(

OSMR

) ja

β-1,4-galaktosyylitransferaasia 1

(

B4GALT

) olivat erittäin metyloitavaa ensisijainen CRC kudoksissa mutta harvoin vastaavassa normaalissa viereiseen limakalvoon eikä ole pahanlaatuisia normaalin paksusuolen kudoksiin. Metylointi näistä geeneistä havaittiin myös ulosteesta DNA paksusuolen syövän potilaille, mutta yleensä puuttuu ei-syöpäpotilaita. Lisäksi

OSMR

ja

B4GALT

mRNA: n ekspression paksusuolensyöpä kudoksissa oli merkitsevästi alassäädetty verrattuna normaaleihin kudoksiin. Funktionaaliset tutkimukset paljastivat tukahduttava rooli

OSMR

paksusuolen syövän etenemiseen. Siksi

OSMR

metylaatio on biologisesti relevantti ja voidaan usein havaita ensisijainen CRC kasvaimia ja Hyväksytty ulosteesta DNA.

Tulokset

mikrosiruanalyysi kolmella ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa ( HCT116, HT-29 ja DLD1) tunnistettiin 52 potentiaali geenikohteet perustuu uudelleen aktivoituminen hoidon jälkeen 5-atsa-dC [12]. Näistä 52 geenit,

Sirtuin 2

(

SIRT2

) laskettiin kahdesti meidän kandidaattigeenifragmenttikloonien luettelosta, koska sillä on kaksi erilaista geeniä tunnusnumerot (NM_012237 ja NM_030593) NCBI tietokantaan. Lisäksi,

O6-metyyliguaniini-DNA metyylitransferaasi

(

MGMT

) on aiemmin raportoitu satamaan syövän promoottorin metylaation useita syöpätyyppejä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [9], joten ulkopuolelle

MGMT

meidän tarkempaa analyysiä (52 -2 = 50).

Eritettyä frizzled liittyvä proteiini 4

(

SFRP4

) on aiemmin raportoitu metyloitavaa paksusuolen syöpä [16], [17], ja se sisällytettiin positiivisena kontrollina geenin metylaation tutkimuksessamme.

neurotrofiinireseptorin tyrosiinikinaasireseptori tyypin 2

(

NTRK2

) ja

urokinaasi plasminogeeniaktivaattori

(

Plau

) on myös mukana, koska mitään raportteja metyloinnin kahden geenin paksusuolen syöpä on julkaistu vielä. Meillä on siis tutkinut metylaatiostatuksen yhteensä 50 geenien bisulfiitti-sekvensointi tai C-MSP in koolonsyöpäsolulinjaa (HCT116, DLD1, RKO, ja SW480) (Kuva S1). Tämän tuloksena löydettiin 23 geenien metyloitavaa enemmän kuin yksi solulinja (taulukko 1). Metylaatio muiden 27-geenien ei havaittu missään testatuissa solulinjoissa.

geenien tunnistamiseksi kätkeminen syöpä-promoottori metylaation, tutkimme metylaatiostatuksen 23 geenien viisi vaille kymmenen paria Hyväksytty ensisijainen CRC (PT) ja vastaavat normaali paksusuoli (PN) kudoksiin. Normaali paksusuolen limakalvon kudoksissa ei-syöpäpotilasta (NN) on myös vertailla metylaatio spesifisyys syövän ja muiden kuin syöpäpotilailla. Me ulkopuolelle geenit tunsivat metylaation NN kanssa taajuusalueella yli 30%. Tuloksena havaitsimme, että

3′-phosphoadenosine 5′-fosfosulfaatti nopaliinisyntaasin 2

(

PAPSS2

),

γ-tubuliinin geeni 2

(

TUBG2

),

NTRK2

,

B4GALT1

, ja

OSMR

sekä

SFRP4

kanna syöpäspesifisessä metylaatio korkeat taajuudet ( 30 %) (taulukko 2). Kaikki 6 näistä geeneistä ei satama metylaatio kaikissa NN testattu, ja erot NN

vs.

PT ja metylaation

vs.

Unmethylation tapaukset olivat tilastollisesti merkitseviä. Edustavia tuloksia C-MSP, bisulfiitti-sekvensointi, ja COBRA solulinjoissa ja kudoksissa on esitetty kuviossa 1A ja kuviossa S2.

, metylointi tilan kunkin geenin tutkittiin CRC solulinjoissa ja kudoksissa C -MSP PCR: n jälkeen metylaatio-alukkeita. PCR-tuotteet ajettiin 4% agaroosigeeleillä valmiiksi värjätty etidiumbromidilla.

In vitro

metyloitu, bisulfiitti-käsitellyn ihmisen normaalia lymfosyytti-DNA (NL) käytettiin positiivisena kontrollina PCR, ja tislattua vettä (DW), käytettiin negatiivisena PCR-kontrolli.

β-aktiini

käytettiin varmistamaan eheyden DNA.

SLC39A4

ja

SLC9A3R1

metyloitiin sekä solulinjoissa ja kudoksissa, mutta

GANAB

,

Plau

ja

UBE3A

eivät olleet . Muut 5-geenit metyloitu yhteen kolmesta solulinjojen testattu, ja vain metyloitu CRC kudoksissa (PT). PN, pariksi normaali paksusuoli kudoksia paksusuolen syöpäpotilaiden; PT, pariksi CRC; NN, normaali paksusuoli epiteelin ei-syöpäpotilasta. C-MSP tulokset

OSMR

CRC solulinjoissa ja kudoksissa näytettiin aiemmassa raportissa [12]. B, sirontakaavioissa metylaation arvojen kuusi kandidaattigeenejä kudoksissa ja solulinjoissa (CL). Yleinen metylointi arvot (TaqMan metylaatio arvot, TaqMeth V) ja optimaalisen spesifisyys /herkkyys optimaalisella cut-off lasketaan ROC-analyysi on esitetty taulukossa 3. Nuolet osoittavat optimaalisen raja-arvot kullekin geeniä. Yhtään NN näkyy TaqMeth V yli optimaalinen raja-arvot ja

B4GALT1

ja

OSMR

. HEK293, ei-tuumorigeeninen solulinja, kanna korkean tason

B4GALT1

metylaatio (TaqMeth V, 101,12), mutta

OSMR

metylaatio ei havaittu solulinjassa (TaqMeth V, 0,00 ). *, Näytteet, joiden suhde nolla ei piirretään oikein log mittakaavassa, joten ne ovat tässä 0.1. Kaikki määritykset suoritettiin kahtena kappaleena muodossa, ja kokeet toistettiin kaksi kertaa. Tiedot osoittivat toistettavissa ja yhdenmukaisten tulosten kolmena kappaleena. TaqMeth V on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. C, kvantitatiivinen metylaatio tasot

B4GALT1

ja

OSMR

perusterveydenhuollossa paksusuolen kudoksiin. Sirontakuvaajaan on

B4GALT1

ja

OSMR

promoottori metylaatio. Nuolet osoittavat optimaalinen raja-arvot kullekin geenin (3,877 varten

B4GALT1

ja 22.01 varten

OSMR

).

Opiskella promoottori metylaatio näistä 6 geenien TaqMan-MSP reaaliaikainen analyysi, suunnittelimme alukkeita ja koettimia erityisesti kohdistaminen CpG-saarekkeiden kunkin geenin (kuva S3). Lisäsimme näyte numeroita yli 25 paria ensisijaisen CRC (PT) ja vastaavat normaali paksusuoli (PN) kudokset, sekä 13 normaalia paksusuolen limakalvoa kudoksia ei-syöpäpotilasta (NN). Jakelu metylaation arvot kullekin geenille on esitetty kuviossa 1B. Johtuen heterogeeninen klonaalisia laastaria tiedetään laajentua kasvaimen rajojen alhainen metylaation PN myös yleisesti havaittu. Yleinen metylaatio arvot (TaqMan metylaatio arvot, TaqMeth V) on esitetty taulukossa 3.

B4GALT1

ja

OSMR

tunsivat korkeampi yleinen metylaation PT kuin PN ja NN, ja erot olivat huomattavat molempien geenien välillä PT ja PN (

P 0,001

) sekä PT ja NN (

P 0,001

). Kun metylaatio verrattiin yksittäisten paria PN ja PT näytteitä, huomattavasti korkeampi metylaatiotasoilla on

PAPSS2 TUBG2

,

NTRK2

, ja

SFRP4

todettiin 60% ( 18/30), 50% (15/30), 30% (9/30), ja 36% (11/30), vastaavasti, PN kuin vastaava tuumorinäytteessä (PT). Korkeampi metylaatio tasot

B4GALT1

PN näytteissä havaittiin vain 4 tapauksessa (13,3%, 4/30), ja metylaatio

OSMR

ei löytynyt mitään pariksi normaalit (0 %, 0/25).

metylointi 6 geenien kudoksessa osoittivat erittäin erotteleva vastaanotin-operaattori (ROC) käyrä profiilit, selvästi erottaa CRC (PT) normaalista paksusuolen limakalvo (NN) (

P 0,001

) (Kuva S4A). AUROC (alapuolinen alue ROC) oli yli 0,76 kaikissa geenit testattu. Jotta voidaan maksimoida herkkyyttä ja spesifisyyttä, optimaalinen raja-arvot, että 6 geenit laskettiin ROC-analyysi (PT

vs

. NN) ja on esitetty taulukossa 3. cut-off asettaa optimaaliseen spesifisyyden 90% tai enemmän, herkkyys kunkin geenin PT oli yli 70%. Yhtään NN näkyy TaqMeth V yli optimaalinen raja-arvot ja

B4GALT1

ja

OSMR

(100%: n spesifisyys). Herkkyyden

B4GALT1

ja

OSMR

oli 83% (25/30) ja 80% (20/25), tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittavat, että

B4GALT1

ja

OSMR

satama syöpää erityisiä metylaation CRC suurella taajuudella. Siksi olemme keskittyneet

B4GALT1

ja

OSMR

jatkotutkimuksiin.

tutki metylaatiostatuksen

B4GALT1

ja

OSMR

100 uutta paria CRC (PT) ja vastaava normaali (PN) kudoksissa TaqMan-MSP-analyysi (Fig. 1 C). TaqMeth V PT vaihtelivat 0-370,70 (mediaani-arvo 3,70) ja

B4GALT1

ja 0-+749,27 (mediaani-arvo 59,24) ja

OSMR

. Arvo PN vaihteli 0-9,70 (mediaani-arvo 0,26) ja

B4GALT1

ja 190,68 (mediaani-arvo 1,54) ja

OSMR

. Yleinen metylaatiotasoilla on

B4GALT1

ja

OSMR

havaittu PT (22.33 ± 48.69 varten

B4GALT1

ja 116,83 ± 151,52 varten

OSMR

, keskiarvo ± SD, n = 100) olivat myös merkittävästi korkeampia kuin PN (0,90 ± 1,37 ja

B4GALT1

ja 6,49 ± 21.52 varten

OSMR

, keskiarvo ± SD, n = 100) (

P 0,001

). Tällä optimaalinen raja-arvot (arvot, 3,87 ja

B4GALT1

ja 22.01 varten

OSMR

) lasketaan ROC-analyysi (PT

vs

. PN) (kuvio S4b) spesifisyys kahden geenin oli yli 96%. Herkkyyden

B4GALT1

ja

OSMR

oli 49% (49/100) ja 80% (80/100), tässä järjestyksessä. Yhdessä

B4GALT1

ja

OSMR

olivat usein metyloitavaa ensisijainen CRC kudoksissa mutta näytössä poissa tai alhainen metylaation vastaavissa normaaleissa kudoksissa.

Seuraavaksi teimme sokaissut analyysi geeni metylointianalyysi ulosteessa DNA kerättiin potilaalla ei paksusuolensyöpä. Kliinisen tilan potilaiden ei ole paljastettu vasta analyysi valmistui. Tutkimme myös hypermetylaatiota

SFRP1

positiivisena kontrollina havaitsemiseksi geenin metylaation ulosteessa DNA [18]. Tulokset ROC-analyysi ulosteessa DNA on esitetty kuviossa 2. Taulukossa 4 on esitetty herkkyys /spesifisyys kunkin geenin paksusuolen syövän havaittu ulosteessa DNA-näytteitä.

SFRP1

metylaatio ei havaittu potilailla, joilla endoskooppisesti normaali paksusuoli (0%, 0/15 -lisäaineeseen), ja todettiin 55% (11/20) CRC potilaista, optimaalisella raja-arvo lasketaan ROC-analyysi. Metylointi

B4GALT1

ja

OSMR

havaittiin 64% (9/14) ja 80% (16/20) ulosteen DNA-näytteet CRC potilaista. Kun metylaatio

SFRP1

ja

OSMR

yhdistettiin, herkkyys oli 60% (12/20), ja spesifisyys oli 100% (0/15 -lisäaineeseen). Syrjintä potilaiden välillä ilman syövän ja CRC potilaita

SFRP1

tai

OSMR

metylaatio oli tilastollisesti merkitsevä (

P 0,01

).

Sokkoutettu testi oli suoritetaan geeni metylointianalyysi ulosteessa DNA kerättiin potilaalla ei paksusuolensyöpä.

SFRP1

sisällytettiin verrata metylaatio taajuuden tunnetun syövän erityinen metyloituja geeniä. Herkkyys /spesifisyys perustuu optimaaliseen cut-off lasketaan ROC-analyysi on esitetty taulukossa 4.

OSMR

metylaatio testattiin sokkona yhdessä useamman riippumaton joukko ja ulostenäytteitä (ei päällekkäisyyttä näytteiden kanssa taulukossa 4). Ulosteesta DNA terveiden verrokkien, joilla ei ollut visuaalista abnormalties in kolonoskopia olivat mukana tutkimuksessa. Herkkyys

OSMR

metylaation CRC potilailla oli 38% (26/69) ja spesifisyys oli 95% (77/81) (taulukko 5). Ero CRC potilaiden ja normaalit kontrollit oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (

P 0,001

). Lisäksi

OSMR

metylaatio havaittiin 56% (15/27) ja 44% (8/18) ulosteesta DNA-näytteet CRC vaiheen II ja III potilaista. Lisäksi 34 41 tapauksessa (83%) ulosteen DNA sekoittava verrokeilla ilman CRC olivat täysin negatiivisia

OSMR

metylaatio. Muut kliiniset parametrit sekoittavia tarkastuksia, kuten divertikuliitti, hemorrhoid, ja polyypit eivät merkittävästi yhteydessä

OSMR

metylaatiostatuksen ulosteesta (tuloksia ei ole esitetty).

tarkastella transkription tasot on

B4GALT1

ja

OSMR

, suoritimme RT-PCR: llä tai Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi (Fig. 3) käyttämällä cDNA: ta valmistettiin CRC solulinjojen (HCT116, HT29, DLD-1 , RKO, ja SW480) ja ei-tuumorigeeninen solulinja, HEK293.

OSMR

ilmentyminen havaittiin vain soluissa, joissa metylaation

OSMR

ei löytynyt (HCT116 ja HEK293). Lisäys

OSMR

ilmentymisen 5-atsa-dC hoito on aiemmin raportoitu [12], mikä osoittaa, että ilmaus

OSMR

korreloi tiukasti kanssa promoottori metylaatio. Perusilmennystä

B4GALT1

todettiin kaikissa testatuissa solulinjoissa, ja kaikki näistä solulinjoista myös tunsivat metylaatio

B4GALT1

. Kuitenkin,

B4GALT1

lisättiin edelleen 5-atsa-dC (kuvio S5a), mikä osoittaa, että sen ekspressio on ainakin osittain vaimentaa promoottorin metylaation.

, Expression of

B4GALT1

ja

OSMR

solulinjoissa tutkittiin RT-PCR-analyysillä. Metylointi

B4GALT1

solulinjoissa tutkittiin C-MSP tai TaqMan-MSP. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. M, metylointi; U, unmethylation. B ja C, reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin viisi paria (a – e) normaalin (PN) ja kasvaimen valmistettua cDNA CRC potilaista (PT) (

jäljellä

). Expression of

B4GALT1

(B) ja

OSMR

(C) verrattiin myös potilaiden välillä paksusuolen syöpä (T) tai ilman syöpä (NN) (

oikea

). Suhteellinen ilmentyminen (Fold) laskettiin vertaamalla suhde mRNA ilmentymisen

B4GALT1

ja

OSMR

sisäiseen valvonnan geeni, GAPDH. Kokeet tehtiin kahtena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD. *,

P 0,05

. Kokeet tehtiin kahtena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD. *,

P 0,05

.

Suoritimme sitten Reaaliaikainen RT-PCR cDNA valmistettiin kasvain (PT) ja vastaavat normaalien kudosten (PN) viiden yksittäisen paksusuolensyöpä potilaat (Hyväksytty cDNA). 3 5 kasvaimen tapauksissa

OSMR

oli merkitsevästi alassäädetty (Fig. 3C,

jäljellä

). Ilmaisu on

B4GALT1

ja

OSMR

kasvaimen oli kolme ja neljä kertaa pienempi kuin normaalin kudoksen (NN), tässä järjestyksessä (Kuva. 3B ja C,

oikea

) . Immunohistokemiallisella värjäyksellä paksusuolen normaalin ja syöpäkudoksen mikrosirujen anti-OSMR vasta-ainetta, havaitsimme vahvaa ekspressiota

OSMR

kaikki ei-pahanlaatuiset normaalien kudosten (NN) ja viereisen normaalin paksusuolen limakalvon (PN) kaksoispiste syöpäpotilailla (Fig. 4 ja taulukko 6). Kuitenkin

OSMR

oli tuskin havaittiin lähes kaikkien primaarikasvainten (PT) (heikko ilmentyminen 4 10 tapausta). Nämä tulokset viittaavat siihen, tietyn lasku

OSMR

mRNA: ta ja proteiinia paksusuolen syövän kehittymisessä.

Strong ilmentymisen

OSMR

todettiin kaikissa ei-pahanlaatuiset normaalien kudosten (NN) ja vieressä normaali paksusuolen limakalvo (PN). Sen sijaan,

OSMR

harvoin havaittiin neoplastisten solujen paksusuolen syövän potilaille. Kasvain laadut osoitetaan.

roolin tutkimiseksi DNA: n metylaation säätelyyn

OSMR

ilmaisua, me transfektoimme pGL3-

OSMR

-Pro2 -Luciferase rakentaa kolmeen solulinjoihin;

OSMR

-negatiivinen solulinja, SW480, ja kaksi

OSMR

positiivisia solulinjoja, HCT116 ja HEK293. Konstrukti käsiteltiin tai ilman

Sss

I metylaasin ennen transfektiota. Aktiivisuus

OSMR

promoottori ei havaittu SW480, mutta korkea-promoottorin aktiivisuuden havaittiin HCT116 ja HEK293-solut (Fig. 5A). Induktio CpG metylaatio

Sss

I metylaasin vähensi toiminnan vähimmäistason.

, analyysi

OSMR

promoottorin aktiivisuutta lusiferaasireportterista määritys OSMR-positiivisten (HCT116 ja HEK293) ja – negatiivinen (SW480) soluja. Promoottori konstrukti esikäsitelty kanssa tai ilman

Sss

I metylaasin 8 tuntia ennen transfektiota. Korkein aktiivisuus havaittiin HEK293-soluissa. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen kasvu yli pGL3-basic aktiivisuutta. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD. Keskiarvot on esitetty. B, An siRNA-allas kohdistus

OSMR

ja ei-kohdistuksen ohjaus transfektoitiin transientisti HCT116, ja soluja käsiteltiin rhOSM (50 ng /ml) (

vasemmalle

). HCT116-soluja käsiteltiin tai ilman Stat3 Inhibiittoripeptidi (Stat3 Inh, 100 uM) toimii hyvin valikoiva, voimakas estäjä Stat3 aktivointi (

oikea

). Solukasvu määritettiin MTT-määrityksellä. Tiedot ilmaistaan ​​absorbanssina aallonpituudella 570 nm. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD.

*, P 0,05

. C, 5-atsa-dC (5 uM) oli esikäsitelty 48 tuntia in SW480 ja DLD-1-solut, ja sitten yhdessä käsiteltiin rhOSM 48 tuntia. Solukasvu määritettiin MTT-määrityksellä. *, 5-atsa-dC-käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (

P 0,05

); #, 5-atsa-dC /rhOSM- käsitellyissä soluissa verrattuna 5-atsa-dC hoito yksinään (

P 0,05

). D, The fosforylaatio

Stat3

ja

Erk

vastauksena rhOSM (50 ng /ml) analysoitiin Western blotting in HCT116 ja SW480 solulinjoissa. rhOSM lisääntynyt fosforyloitu

Stat3

ja

Erk

vuonna HCT116-soluissa mutta ei SW480-soluissa (joka puuttuu LIFR see E alla). Equal Proteiinilisäyksen seurattiin yhteensä

Stat3

,

Erk

ja

β-aktiini

arviointi näytteissä. Uudelleen aktivointi

OSMR

5-atsa-dC hoito määritettiin SW480 ja DLD-1-solujen virtaussytometrialla (kuvio S6). E. ilmentäminen

LIFR

ja

gp130

tutkittiin CRC solulinjoissa RT-PCR.

LIFR

ilmentyi HCT116-soluissa mutta vaiennetaan useimmissa muissa CRC testatuilla solulinjoilla.

gp130

,

OSMR

heterodimeeri, oli läsnä kaikissa kaikissa testatuissa solulinjoissa. Promoottori metylaatiostatuksen Näiden kahden geenejä ei tutkittu.

onkostatiini M (OSM) on interleukiini-6 (IL-6) -tyypin sytokiinien, mutta aktiivisempia kuin IL-6 inhiboi leviämisen lukuisia kiinteiden tuumorien solulinjoissa [19], [20]. Äskettäin korrelaatio vastustuskyky kasvun inhibitiolle OSM erityisiä menetys

OSMR

ja Stat3 signalointi raportoitu [15]. Jotta voidaan tutkia CRC solujen vastustuskykyä kasvun inhibitiolle OSM, me ohimenevästi transfektoitu siRNA altaan kohdistaminen OSMR ja ei-kohdistuksen ohjaus siRNA osaksi

OSMR

ilmentävillä HCT116-soluissa, ja suoritetaan standardin solukasvumäärityksessä hoidon jälkeen solujen rekombinantin ihmisen OSM (rhOSM). Havaitsimme merkittävän kasvun esto rhOSM vuonna HCT116-soluissa, ja esto purettiin knock-down on

OSMR

(Fig. 5B, vasen). Stat3 Inhibiittoripeptidi (Stat3 Inh), joka kumosi Stat3 aktivointi (Fig. 5D) esti rhOSM aiheuttaman kasvun eston HCT116-soluissa (kuvio. 5B, oikealla). Tasaisen vähentävän solujen kasvua rhOSM ei havaittu SW480 ja DLD-1-solujen

OSMR

promoottori metylaatio (Fig. 5C). Mielenkiintoista on, että solujen kasvun inhibitio 5-atsa-dC hoitoa SW480 ja DLD-1-soluja (*,

P 0,05

) on merkittävästi parannettu käsittelemällä rhOSM (#,

P 0.05

). Lopulta havaitsimme, että rhOSM aktivoitu Stat3 fosforylaation HCT116-soluissa riippumatta OSMR ekspressiotasot (Fig. 5D, vasen). Expression of

gp130

ja

LIFR

mRNA havaittiin HCT116-soluissa (kuvio. 5E), mikä osoittaa, että aktivointi Stat3 in HCT116-soluissa, joilla on hyvin alhainen OSMR ilmentymisen aiheuttaman siRNA transfektio voi tapahtua gp130 /LIFR (tyyppi I OSM-reseptoriin) -välitteisen signalointi. Erk-fosforylaation lisääntyneet HCT116 transfektoiduissa soluissa siRNA kohdistaminen

OSMR

, ja pohjapinta taso fosfo-Erk in SW480-solujen

OSMR

metylaatio oli suurempi kuin HCT116-soluissa (kuvio. 5D). 5-atsa-dC osittain vähentynyt aktivoitu Erk on SW480-soluissa, ja rhOSM talteen pohjapinta Erk phopshorylation, että läsnä oli 5-atsa-dC. Siten metyloitu

OSMR

merkittävästi vähentynyt kasvainta estävä signaaleja rhOSM ja keskeisten alavirran signalointia tapahtumista.

Keskustelu

Promoottori metylaatio keskeisten sääntelyn geenien ohjaa syövän prosessi ja oikea konteksti voi toimia diagnostisen markkerin ja terapeuttisena kohteena. Cancer-erityisiä metylaation toimii tärkeänä biomarkkerina varhaiseksi havaitsemiseksi syövän. Tällaiset markkerit voivat täydentää cytopathological arviointiin kudosbiopsioista tai mahdollisesti omillaan markkereina taudin eri kehon nesteiden kuten ulosteesta. Tätä varten, metylointi taajuus tunnistettujen geenien primaarisissa kudoksissa on tärkeitä kliinisiä seurauksia.

joukko geenejä yleisesti hypermetyloitunut peräsuolen syöpä (CRC), joka sisältää

hMLH1

,

p16INK4a

,

p14ARF

,

RAR-β

,

APC

,

MGMT

,

sykliini A1

,

CDX1

,

MYOD1

,

COX-2

ja

WT-1

[21], [22], [23]. Kuitenkin geenit metyloituja ainoastaan ​​neoplastisen kudoksista korkealla taajuudella (yli 40%) ovat harvinaisia. Tässä tutkimuksessa tunnistimme

PAPSS2

,

TUBG2

,

NTRK2

,

B4GALT1

ja

OSMR

[12], [ ,,,0],24] kuten geenit kätkeminen syövän promoottori metylaation ihmisen peräsuolen syöpä. Teoreettinen herkkyys Kunkin metyloitu geenin oli yli 70% ja erityispiirteet olivat yli 90%: iin TaqMan-MSP. Metylointi taajuus kunkin geenin riveissä vain muutamia muita geenejä metyloitu korkealla taajuudella CRC (

sykliini A1, CDX1, RAR-β, MYOD1, p15INK4b ja COX-2

) on syöpä-spesifisellä tavalla [ ,,,0],10].

Tutkimukset

B4GALT1

ja

OSMR

on raportoitu ihmisen syövän.

B4GALT1

on lokalisoitu sekä Golgin monimutkainen ja solun pinnalla [25], ja ilmentyy kaikissa kudoksissa, mukaan lukien ihmisen paksusuolen ja peräsuolen limakalvolle [26], paitsi aivoissa [27]. Rooli solun pinnan

B4GALT1

ihmisen syövässä on raportoitu; se on estrogeenisäädeltyjen geenin MCF-7-solujen [28], ja sen taso oli muuttunut erittäin metastaattisen keuhkosyövän soluja verrattuna sen vähemmän metastaattinen emosoluilta [29].

B4GALT1

edistää apoptoosia estämällä epidermaalisen kasvutekijän reseptori-reitin [30] ja lisää sykloheksimidillä: n indusoiman apoptoosin ihmisen maksasyöpä-soluissa [31]. Proteiinikinaasi B /Akt inhiboi apoptoosia alas-säätely

B4GALT1

[25]. Lisäksi parannettu epiteelisolujen proliferaatiota, ihon ja ohutsuolessa ja epänormaali erilaistuminen suoliston villi havaittiin

B4GALT1

vajausta hiirissä [32], mikä viittaa siihen, että

B4GALT1

tärkeä ja tukahduttava rooli leviämisen epiteelisolujen. Näin ollen, sen inaktivoitumisen promoottorin metylaation voi johtaa paeta normaalien solujen valvontaa ja syövän etenemisessä.

OSMR on reseptorin onkostatiini M (OSM), interleukiini-6 (IL-6) tyyppinen sytokiinin tunnistettu voimakas vaimennin kasvainsoluja. Ihmisen OSM alunperin kuvannut sen kykyä estää melanooman lisääntymistä in vitro [33], [34], ja sen tavoitteet kasvun estäminen kuuluvat keuhkosyövän [35], munasarjojen karsinoomat [36], ja rintojen kasvaimia [37]. Kestävyys kasvun estäminen OSM etäispesäkemelanoomassa solulinjoissa korreloivat tietyn menetys OSMR yhdessä alhaisempi histoni asetylointi on OSMR promoottorialueen, mikä viittaa siihen, että metastaattinen melanooma solut voisivat paeta kasvun säätelyssä OSM jonka epigeneettiset hiljentäminen of OSMR [15]. Huomasimme, että promoottori metylaatio vahvasti korreloi OSMR ilme ja totesi myös korrelaatio vastustuskykyä kasvun inhibitiolle OSM menetys OSMR CRC solulinjoissa. Niinpä promoottori metylaatio on keskeinen säätelijä OSMR ilmaisun ja kaikki nämä tulokset tukevat tukahduttava toiminto OSMR ihmisen syövässä.

Human OSM muodostaa kahdenlaisia ​​Heterodimeerisen signalointikompleksejaan; gp130 /leukemiaa estävä tekijä reseptori (LIFR) (tyyppi I OSM-reseptori-kompleksi) [39] ja gp130 /OSMR (tyypin II OSM-reseptori-kompleksi) [40]. gp130 /LIFR voidaan aktivoida LIF tai OSM, mutta gp130 /OSMR aktivoidaan OSM vain. Tyypin II reseptori kompleksi aktivoi OSM-signaloinnin reittien kautta JNK /SAPK ja STAT1 /Stat5: n reittejä, kun taas sekä tyypin I ja tyypin II kompleksit aktivoivat Stat3 ja Erk yhteisinä signalointireitteihin rintasyöpäsoluissa [41]. Lisäksi, tyypin I ja tyypin II reseptorin signalointi voi osoittaa antagonistista toimintoja [42]. Huomasimme, että OSM välittämiä solun kasvun estämistä ei havaittu HCT116-soluissa matalalla OSMR tasolla huolimatta Stat 3 fosforylaation. Koska HCT116 solut ilmensivät gp130 ja LIFR, rhOSM todennäköisesti fosforyloi Stat3 kautta tyypin I OSM-reseptorivälitteisen signaloinnin, mutta ilman gp130- /OSMR tämä vaikutus ei ole riittävä välittämään kestävän kasvun tukahduttaminen [41]. Tueksi tätä käsitystä, rhOSM ei kasvanut Stat3 fosforylaation SW480-soluissa, joista puuttuu LIFR ilmaisu

From kliininen kannalta, meidän tulokset ovat mahdollisia välittömiä diagnostisia ja terapeuttisia vaikutuksia ja ansaitsevat enemmän huomiota. Pidennetyn suoritetun ulosteesta DNA CRC potilaista,

B4GALT1

ja

OSMR

metylaatio onnistuneesti havaittu korkealla taajuudella ja on siten mahdollisuus tunnistaa yksilöiden paksusuolen syöpä. Kun testasimme lisäksi tunnetaan metyloitu geeni,

SFRP1

[18], yhdistettynä

OSMR

herkkyyttä lisääntynyt; 60% (12/20) paksusuolen syövistä havaittiin ulosteessa DNA täydellinen spesifisyys (

P 0,001

). Nämä tiedot viittaavat siihen, että promoottori metyloinnin

OSMR

voisi toimia todellinen indikaattori läsnäolo paksusuolensyöpä.

Terapeuttisesti, molemmat geenit tarjoavat houkuttelevan johtolankoja uusia lähestymistapoja hoidossa CRC. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.