Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ymmärtääksemme vaikutusten vuorovaikutuksen Mycoplasma ja solujen isäntä solun toiminnan, on tärkeää selvittää vaikutteita infektion solujen Mycoplasma ydin- entsyymejä kuten DNA-topoisomeraasi tyypin I (Topo I). Human Topo I osallistuu DNA kauppa prosesseja ja on tavoite syöpälääkkeiden, kamptotesiineistä (värikuvaputket). Tässä olemme tutkineet mekanismi, jonka infektio ihmisen kasvainsoluissa, joissa

Mycoplasma fermentansin

vaikuttaa aktiivisuuden ja ilmentymisen solun Topo I, ja syövän tehoa CPT. Ihmisen syöpäsolut tartutettiin tai hoidettiin eläviä tai sonikoidaan

M. fermentansin

ja aktiivisuus ja ilmentyminen Topo I määritettiin.

M. fermentansin

vähensi merkitsevästi (80%) Topo I aktiivisuus tartunta /kasvaimen soluihin vaikuttamatta tasoon Topo I proteiinia. Osoitamme, että tämä väheneminen entsyymin aktiivisuus johtui ADP-ribosylaatio ja Topo I-proteiinin Poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP-1). Lisäksi, Perk aktivoitiin seurauksena induktion MAPK-signaalin transduktioreitin mukaan

M. fermentansin

. Koska PARP-1 osoitettiin aktivoitava Perk, päättelimme, että

M. fermentansin

muutettiin solun Topo I aktiivisuuden aktivaatio PARP-I kautta induktion MAPK signaalitransduktioreitin. Lisäksi, infektio kasvainsolujen

M. fermentansin

vähentynyt estävää vaikutusta CPT. Tulokset Tämän tutkimuksen mukaan muutos Topo I aktiivisuuden

M. fermentansin

voi muuttaa solun geenien ilmentymistä, ja vaste kasvainsolujen Topo I-inhibiittorit, jotka vaikuttavat syövän kapasiteetti Topo I antagonisteja.

Citation: Afriat R, Horowitz S, Priel E (2013)

Mycoplasma fermentansin

inhiboi Cellular DNA topoisomeraasi I aktivointi PARP1 ja muuttaa tehokkuus sen Anti-Cancer estäjä. PLoS ONE 8 (8): e72377. doi: 10,1371 /journal.pone.0072377

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2013; Julkaistu: 27 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Afriat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli antamat Seed Research Fund, Ben-Gurion University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mykoplasmat, jotka kuuluvat Mollicutes luokan, ovat pienimpiä itsemonistuvista eubakteerit, puuttuu soluseinä ja ympäröi vain plasmamembraanin. Niiden pieni genomin koko (vaihtelee 580-1380 kbp) johtaa rajoitettu metabolisen valmiuksia ja parasitismin [1], [2]. Mykoplasmat löytyy kuin loisia monenlaisia ​​isännistä ihmisten, eläinten, hyönteisten, kasveja, ja soluja kasvatetaan kudosviljelmässä.

Ihmisillä jotkut Mycoplasma lajeja löydetty kommensaalina asukasta, kun taas muut näytettiin liittyvän tartuntatauteja ja post-infektion patologioiden [3], [4].

Useimmat tunnetut Mycoplasma lajia tavataan niin kalvon pinta loisia, ja viime aikoina jotkut osoitettiin pääsevät soluihin ja tulevat solunsisäinen asukkaat [5].

Mycoplasma voi aiheuttaa kroonisia infektioita johtuen kehittyneitä mekanismeja veronkierron peräisin immuunivalvonnan (eli molekyyli matkiminen, ainutlaatuinen tyyppi antigeenien vaihtelun), ylös-säätö- tai alaspäin säätäminen sytokiinieritystä, adheesiomolekyylien ilmentyminen, transkriptiotekijät ilmaisu, MAP-kinaasien toimintaa, apoptoottisia reittejä, ja [2], [3].

Viime aikoina monet raportit tukeneet vahvasti kykyä Mycoplasma aiheuttaa tai edistää syövän syntyyn [6 ] – [9], ja etsiä välisen yhteyden Mycoplasma ja syövän selvitellään parhaillaan [10].

lipoproteiinien (LPMf) on

Mycoplasma fermentansin

, ihmisen taudinaiheuttaja, oli tutkitaan perusteellisesti viime vuosikymmenen aikana. LPMf on osoitettu muuttavan toimintoja immuunijärjestelmän solut indusoimalla ekspressio, onkogeenien [1], joka vaikuttaa useita tekijöitä, jotka osallistuvat signaalin siirtoon proteiinit [11] – [13], transkription [14], ja apoptoottisen prosessin [11], [15], [16].

M. fermentansin

on osoitettu estävän apoptoosin prosessin aiheuttamaa tuumorinekroositekijä α (TNFa) [17], [18]. Kaikki nämä johti olettamukseen, että infektio kasvainsolujen Mycoplasma voivat vaikuttaa aktiivisuuden ja ilmentymisen olennaisen ydin- entsyymien, kuten topoisomeraasit, jotka ovat tavoitteet useiden syöpälääkkeet ja siten häiritä syövän tehoa näitä lääkkeitä. DNA topoisomeraasit ovat perheen olennainen ydin entsyymejä, jotka ovat vastuussa ohjaamiseksi topologinen tilan DNA-molekyylien. He osallistuvat useimmissa DNA liiketoimet kuten replikaatio, transkriptio, rekombinaatio, ja chromatin remodeling [19] – [21]. DNA topoisomeraaseista luokitellaan joko tyypin I (pilkkoo yksi osa DNA) tai tyypin II (pilkkoo kaksi DNA-säiettä). Molemmat entsyymi tyypit ovat edelleen luokiteltu alaryhmiin rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet. Jäsenet kunkin perheen entsyymien ovat erillisiä järjestyksessä, rakenne ja toiminnot. [22]

katalyyttinen aktiivisuus DNA-topoisomeraasien liittyy muodostumisen ohimeneviä kovalenttisten siltojen entsyymi-DNA-kompleksit. Tyrosyyli ryhmä aktiivisessa entsyymin hyökkää fosfodiesterisidoksen DNA selkäranka ja edelleen kovalenttisesti kiinnitetty toiselle puolelle tauko, jolloin vastakkaisen vapaan hydroksyyliryhmän (OH) pää, joka mahdollistaa religatoitiin vaiheessa, kun DNA topologia on ratkaistu, toisella nukleofiilisellä hyökkäyksellä kovalenttisen entsyymi-DNA fosfotyrosiini bond vapauttaen entsyymin seuraavaa katalyyttinen sykli. Joka edistää näiden entsyymien olennainen soluprosesseihin merkinnällä topoisomeraaseista yhtä tärkeitä kohteita anti-syöpähoitoihin ja kehittämiseen voimakas, tehokkaampia, syöpälääkkeiden [22], [23]. Sytotoksisuus Topoisomeraasit estäjien kuten Kamptotekiini (CPT) ja sen johdannaiset TPT ja CPT-11 (joka on hyväksytty kliiniseen käyttöön), johtuu niiden kyvystä vakauttaa katkaistavissa oleva kompleksi Topo-DNA, joka esittelee yhden ja kahden hengen katkeamiset DNA [21], [24], [25]. Topoisomeraasiaktiivisuutta vaikuttavat monet translaation jälkeiset modifikaatiot, niiden joukossa fosforylaatio, poly-ADP-ribosylaatio, ja ubikitinaatio. Viimeaikainen työ laboratoriossamme osoitti O-GlcNAcylation of Topo IB, joka vaikuttaa sen toimintaan [26].

fosforylaatio DNA topoisomeraasi I kaseiinikinaasi II (CK II) ja proteiinikinaasi C (PKC) up-säädellä entsyymin DNA relaksaatiovaikutuksen, kun taas defosforylaatio AFOS esti tätä toimintaa. Lisäksi, poly-ADP-ribosylaation poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP-1) entsyymin proteiinin havaittiin alas-säädellä sen toimintaa [20], [27]. PARP-1: n tiedetään aktivoida DNA taukoja; kuitenkin viime aikoina on raportoitu, että PARP-1 voidaan aktivoida fosforyloidun ERK2 ilman stressiä olosuhteissa tai DNA-vaurio [28]. Viimeaikaisissa tutkimuksissa Mycoplasma osoitettiin kykenevän aktivoimaan eri MAPK, kuten SAPK /JNK, p38, NF-kB, AP-1, ja ERK 1/2 vastauksena Mycoplasma peräisin oleva kalvo lipoproteiinien [11], [29] – [31]. Siksi on tärkeää tutkia mahdollisuutta, että solujen Topo I ja tehoa värikuvaputket kuin syöpälääkkeet saattaa vaikuttaa Mycoplasma infektio.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

ihmisen rintasyövän solulinjat -MCF7 (American Type Culture Collection, HTB-22) ja ihmisen glioblastooma cells- U251 (HTB-17) ystävällisesti saatu Porgador A, Ben-Gurion University. Soluja viljeltiin yksikerrosviljelminä DMEM tai RPMI 1640 väliaine (Biological Industries, Beith Haemek, Israel), vastaavasti, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 50 IU penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja L-glutamiinia (0,29 μγ /ml ). Solulinjoja kasvatettiin kosteutetussa inkubaattorissa, jota oli täydennetty 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Entsyymit, vasta-aineet, ja yhdisteet

kantaliuokset Kamptotesiini (Sigma, Israel) nimellä 20 mM (liuotettuna 100% DMSO) säilytettiin erinä -70 ° C: ssa ja laimennetaan DMSO: hon ennen kuin lisätään reaktioseokseen tai solujen elatusaineesta. Superkierteistä DNA-plasmidi pUC19 ostettiin MBI Fer- (Hanover, MD, USA). PD98059 ja 3-aminobentsamidin (3AB) ostettiin Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel).

Ensisijainen antiseerumit olivat seuraavat: hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine (MP Biomedicals, LLC); vuohen polyklonaalinen IgG: tä (C-15) ja anti-topo I, hiiren monoklonaalista IgG antiphospho-ERK (E-4), ja kaniinin polyklonaalinen IgG anti-ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA); Hiiren monoklonaalinen anti-poly-ADP riboosi vasta, (Serotec, Oxford, UK); ja vuohen anti-hiiri ja anti-kani-IgG-vasta-aineita (Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA). Sillä immunosaostusmääritykset, anti-Topo I-vasta-aine on johdettu sklerodermapotilaalla seerumia käytettiin (TopoGene, Florida, USA).

Enhanced chemiluminescence (ECL) reagenssit hankittiin Biological Industries (Beit Haemek, Israel).

Mycoplasma Growth

M. fermentansin kanta

K7 viljeltiin SP4 liemessä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kunnes log-vaiheeseen. Yhden ml: n eriä, jotka sisältävät 2 x 10

8 pesäkettä muodostavaa yksikköä (CFU) pidettiin jäädytettyinä -70 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Kutakin koetta varten, yksi alikvootti sulatettiin, viljeltiin SP4 liemessä laimennoksena 1/10 24 h (37 ° C, 5% CO

2), jota seurasi laimennus 1/50, kunnes tukin faasi oli havaittu (n. 24 tuntia). Tarkka määrä

M. fermentansin

määritettiin laskemalla CFU: ta, kuten aiemmin on kuvattu [32], [33].

mycoplasmal proteiiniuutteen valmistus

M. fermentansin

kasvatettiin kuten edellä; 500 ml: n viljelmä pelletoitiin (13000 x g, 30 min 4 ° C: ssa) ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen PBS: ään. CFU /ml määritettiin, ja suspendoidaan uudelleen pelletti varastoitiin -70 ° C: ssa vielä kokeita. Jäädytetyt pelletit

M. fermentansin

sulatettiin ja sonikoitiin 4 ° C: ssa 4 x 30 s 80% teholla (50% duty cycle, Heat Systems Ultrasonics, Inc.) läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorin fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF, 0,001 M). Nämä ehdot sonication johti ei-live mycoplasmal valmiste (ei kasvua havaittu toistettiin viljelemällä menettelyt). Proteiinikonsentraatio sonikoitiin

M. fermentansin

määritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä Kit (Richmond, CA); 1 x 10

8 CFU vastasi 10 ug mykoplasman proteiinia.

pahanlaatuisten solulinjojen Live

M.

fermentansin

tai

M. fermentansin

Total Protein

MCF7 ja U251-solut, esipesty kerran PBS: llä (1200 rpm, 5 min 4 ° C: ssa) ja suspendoitiin uudelleen uuteen elatusaineeseen pitoisuutena 2 x 10

5 solua /ml, viljeltiin 96-kuoppaisilla steriilit levyt (Corning Inc., Corning, NY), jonka lopulliseksi pitoisuudeksi 4 x 10

4/200 ul /kuoppa. Elävät

M. fermentansin

log-vaiheessa, esipesty kerran PBS: ssä (13000 x g, 30 min 4 ° C: ssa), ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 10% inaktivoitua FCS: ää, 1% penisilliiniä ja 1% glutamiinia, lisättiin soluviljelmiin MOI 1000:1 (4 x 10

7 CFU /kuoppa). Co-Viljelmiä inkuboitiin viisi tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sillä kokeiluja

M. fermentansin

kokonaisproteiinin, jonka pitoisuus on 20 ug /ml (vastaa 2 x 10

8 CFU) lisättiin tutkittiin kasvaimen solut (2 x 10

5 solua /ml) 24 tunnin ajan 37 ° C, 5% CO

2.

DNA monistaminen

M. fermentansin

Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) käyttäminen nukleotidisekvenssin sisällä Insertion Sequence-Like Element

Kokonais-RNA uutettiin tartunta MCF7 ja U251-soluihin käyttäen TRI-reagenssia (T9424; Sigma- Aldrich, Rehovot, Israel), sitten käänteiskopioitua käyttämällä 1 ug kokonais-RNA: ta tutkittiin solujen Oligo-dT-aluketta käyttäen RevertAid Kit (K1621; Fermentas, Vilna, Liettua). Eri cDNA eristettiin

M. fermentansin

infektoiduista soluissa eri välein (1,5, 3, 6, 12, ja 24 tuntia) monistettiin käyttäen REDTaq Ready Mix (R2523, Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Sekvenssit synteettistä oligonukleotidialuketta pari (RWO04 ja RWO05), jota käytetään spesifisten DNA-monistamisen

M. fermentansin

ja asemiaan insertiosekvenssi-Like Element (IS-elementti) on aiemmin kuvattu [34]. Alukesekvenssejä ja kokoisia PCR tuotteet olivat seuraavat: RW004 Primer (24 nt): 5’GGA CTA TTG TCT AAA CAA TTT CCC ja RW005 Primer (24 nt): 5’GGT TAT TCG ATT TCT AAA TCG CCT. Koko diagnostinen DNA bändi on 206 emäsparia. Terminen pyöräily profiilia vahvistus kuului 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 sekuntia (240 sekuntia ensimmäisessä jaksossa), 62 ° C: ssa 60 sekunnin ajan ja 72 ° C 60 sekuntia (nousi 10 minuuttia lopullisen sykli). PCR-tuotteet visualisoitiin 1% agaroosigeelillä värjättiin etidiumbromidilla.

tumaproteiiniuutteet valmistus

Nuclear uutteet ja topoisomeraasi määrityksiä ja Western blot analyysi MCF7 ja U251-solut valmistettiin, kuten on aikaisemmin on kuvattu [27], [35] – [40], ja proteaasi-inhibiittorien seos (lopulliset pitoisuudet: 2 ug /ml aprotiniinia, 2 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 2 ug /ml antipaiinia, 100 ug /ml PMSF: ää) lisättiin uuttamista puskureita. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinin määritys kit (Bio-Rad Lab, CA, USA).

määrittäminen taso Topo I Proteiinin Western Blot analyysi

Equal määriä tumaproteiinien peräisin Mycoplasma käsiteltyä tai käsittelemätöntä MCF7 ja U251-solut, analysoitiin Western blot-analyysillä käyttämällä joko anti-Topo I-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology Inc.) tai anti-β-aktiini-vasta-aineita (MP Biomedicals, LLC) kuten aiemmin on kuvattu [36], [39], [41]. Immunokompleksien havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL).

Topo I Assay

Topo I-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26], [37]. Kasvavia pitoisuuksia tumaproteiinien lisättiin Topo I sisältävä reaktioseos, että lopullinen tilavuus on 25 ui: 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM ditiotreitoli, 20 mM KCI, 10 mM MγCl

2, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 30 ug /ml naudan seerumin albumiinia, ja 250 ng pUC19 superkierteisen DNA-plasmidi (MBI, Fermentas, Hanover, MD). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 30 min, reaktio lopetettiin lisäämällä 5 ui lopettamisen puskuria (lopullinen konsentraatio: 1% natriumdodekyylisulfaattia, 15% glyserolia, 0,5% bromifenolisinistä, ja 50 mM EDTA, pH 8). Reaktion tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä käyttäen Tris /boraatti /EDTA-puskuria (89 mM Tris-HCI, 89 mM boorihappo, ja 62 mM EDTA), 1 V /cm, värjättiin etidiumbromidilla (1 ug /ml) ja valokuvattiin käyttäen lyhyen aallonpituuden UV-lampulla (ChemiImager ™ 5500 laitteet, Alpha Inotech Corporation, San Leandro, CA). Densitometrinen tulosten analysointi suoritettiin EZ-Quant-Gel analyysin ohjelmisto (EZ-Quant, Rehovot, Israel), ja prosenttiosuus Topo I aktiivisuus laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: (1 – (näyte /kontrolli)) × 100 [37].

Immunosaostusmääritys

hiiren monoklonaalinen anti-poly-ADP riboosi (PAR) vasta-aine (MCA 1480) hankittiin Serotec (Oxford, UK). Yhtä suuret määrät tumaproteiinit (200 ug), joka oli ennalta keitettiin 5 min, tehtiin immunosaostus anti-humaani Topo I-vasta-(SC), jonka lopullinen tilavuus oli 100 ui ydin-puskuria (10 mM Tris-HCI: a, pH 7,4, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, ja proteaasi-inhibiittorit: 2 ug /ml aprotiniinia, 2 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 2 ug /ml antipaiinia, 100 ug /ml PMSF) . Seosta pyöritettiin 4 ° C: ssa yön yli. Proteiini A-Sepharose (0,1 g /ml) TE-puskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) lisättiin vielä 1 h. Näytteet sentrifugoitiin 10000 x g: ssä 2 minuutin ajan ja helmet pestiin kolme kertaa TE-puskurilla. Pelletti suspendoitiin uudelleen 25 ul: aan näytepuskuria (lopullinen pitoisuus: 7,5% glyserolia, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% β-merkaptoetanolia, ja 0,025% bromifenolisinistä), keitettiin 5 min, ja sentrifugoitiin. Näytteet ladattiin 7,5% SDS-PAGE, ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen vuohen polyklonaalista IgG: tä (C-15) ja anti-Topo I tai anti-poly-ADP riboosi (PAR) vasta-aineita.

kuoriminen vasta-aineet nitroselluloosakalvolle

kalvo upotettiin strippaus puskurissa (100 mM 2-β-merkaptoetanolia, 2% SDS: ää, ja 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7), mitä seurasi inkubointi 50 ° C: ssa 30 min satunnaisesti sekoittaen. Membraani pestiin kaksi kertaa TPBS (31,25 mM Na

2HPO4, 12,5 mM Na

2HPO

4, 13,7 mM NaCl, 0,1% Tween) 10 min ajan huoneenlämpötilassa.

Cell sytotoksisuusmääritys

Solut (5000 /kuoppa, kolmena kappaleena) infektoitiin

M. fermentansin

2 x 10

1-2 x 10

3 MOI 6 tunnin jälkeen käsittelemällä 30 uM CPT tai 0,01% DMSO vielä 12, 24 tai 36 tuntia. Solujen eloonjääminen tutkittiin käyttäen Neutral Red määritys [42].

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testi käytettiin määrittämään merkitystä kokeellisen ja kontrollit.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä (*);

P

arvojen 0,01 (**) ja 0,005 (***) pidettiin erittäin merkittävä.

Tulokset

1. Elävät

M. fermentansin

Estää DNA rentoutuminen aktiivisuus Topo I

vaikutus elävien

M. fermentansin

toimintaa koskevat solujen topoisomeraasi l tutkittiin kahdentyyppisiä solulinjojen: ihmisen rintasyöpä (MCF7) ja glioblastooma (U251). Solut infektoitiin live

M. fermentansin

MOI 10

3CFU /solu, eri aikavälein (1,5, 3, 6, 12, ja 24 tuntia). Nuclear uutteet valmistettiin tartunnan saaneiden ja infektoitumattomien solujen ja Topo I aktiivisuus mitattiin. Yhtä suuret määrät tumauutetta proteiinien lisättiin Topo I DNA rentoutumista määrityksessä seosta, joka sisälsi superkierteisen DNA-plasmidi, kun entsyymin substraattia; Reaktion tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Topo I aktiivisuus mitataan muuntaminen superkierteisen plasmidin sen osittain tai täysin rento muotoja [19]. Molemmat solutyypit tartunnan

M. fermentansin

osoittanut merkittävää vähenemistä, jopa 80%, DNA rentoutumista entsyymin aktiivisuutta, verrattuna infektoimattomiin soluihin. Asteittainen väheneminen Topo I vaikutus havaittiin alkaa 1,5 tunnin kuluttua infektion

M. fermentansin

, ja huippu vähentäminen entsyymin aktiivisuus (80%) havaittiin 6 tuntia infektion jälkeen. Merkittävä väheneminen DNA rentoutumisen aktiivisuus Topo olin myös havainnut 12 ja 24 tuntia infektion jälkeen (30-50% for MCF7, 25-40% U-251, vastaavasti) (kuvio 1A-D). Kuitenkin aste vähentäminen Topo I aktiivisuus vähenee ajan myötä, mikä viittaa siihen, että tehokkuus signaalin välittämä Mycoplasma on heikentynyt, kuten aiemmin osoitettu Mycoplasma välittämä signaalintransduktioreitteihin [31], [43]. Sen vahvistamiseksi, että solut todella tartunnan ja Havaittu vaikutus johtuu läsnäolo

M. fermentansin

, me määritettiin läsnäolo Mycoplasma DNA: n tartunnan saaneiden solujen RT-PCR (RT-PCR) määritys, jossa käytetään

M

.

fermentans-

alukkeita. Tulokset vahvistivat, että tutkittu kasvainsolulinjat todellakin infektoitiin

M. fermentansin

(kuvio 2A).

MCF7 (A, B) ja U251 (C, D) syövän solut infektoitiin live

M. fermentansin

(

M.f

) eri välein MOI 10

3CFU /solu. Yhteensä ydin- proteiinin (12,5 ng) lisättiin tiettyyn reaktioseokseen Topo I Reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. (A, C) Edustava kuva (n = 4-5) ja Topo I DNA-relaksaatiovaikutuksen. (B, D) kvantifiointi analyysi Topo I toimintaa. Symbolit: R ja S ovat rento ja superkierteisessä muoto pUC19 DNA, vastaavasti; Topo- proteiinia ei lisätty reaktioseokseen.

t

-testi: *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,005.

näytteitä MCF7 ja U251 infektoituneiden solujen (kuvattu kuviossa 1) analysoitiin havaitsemiseksi mykoplasman DNA: sta PCR (A, B). Nuclear saaduissa MCF7 ja U-251-infektoidut solut määritettiin Topo I-proteiinin tasolla käyttäen Western blot -analyysillä anti-Topo I tai anti-β-aktiini-vasta-aineita, ja kvantifioidaan densitometrinen analyysi käyttäen EZquant ohjelmisto (C-F).

tutkia lasku Topo I aktiivisuuden tartunnan kasvainsoluissa on seurausta vähentämisestä Topo I proteiinia tasolla, ydin- saaduissa sekä tartunnan ja infektoimattomat solut analysoitiin Western blot kanssa asianmukaista anti-Topo I-vasta-aineita. Kuten kuviossa 2C-F, taso Topo I proteiinin infektoituneissa soluissa oli samanlainen kuin terveillä soluissa. Tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen Topo I toiminta ei johtunut laskusta entsyymiproteiinia määrä.

2. Esto DNA Rentoutuminen aktiivisuus Topo I sonikoitua

M. fermentansin

onko Mycoplasma vaikutus Topo I kohdistamaa materiaaleista erittyy Live Mycoplasma tai rakenteellisia proteiineja tämän bakteerit, tutkimme Topo I aktiivisuutta kasvainsoluissa käsitelty ei-live, sonikoitiin

M. fermentansin

. Solut (MCF7 ja U251) käsiteltiin 24 tunnin yhä proteiinipitoisuus (5, 10, ja 20 ug /ml) on johdettu sonikoitiin

M. fermentansin

. Tumauutteesta valmistettiin käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen ja Topo I DNA rentoutumista aktiivisuus mitattiin. Kuten kuviossa 3A, D, vähennetään merkittävästi Topo I vaikutus havaittiin, annoksesta riippuvalla tavalla, käsitellyissä soluissa

M. fermentansin

proteiinit (ultraäänellä). Kvantifiointi Topo I toiminto [37] useista kokeista (n = 4) suoritettiin. Vähentäminen 40-80% (

p

0,05) Topo I aktiivisuuden havaitaan soluissa, joita käsiteltiin 5-20 ug /ml sonikoitua

M. fermentansin

proteiineja 24 tuntia (kuvio 3B, E). Vaikka väheneminen Topo I aktiivisuuden soluissa käsitelty sonikoidaan Mycoplasma havaittiin, taso Topo I proteiinia ei vaikuttanut (Fig. 3C, F).

MCF7 (A-C) ja U251 (D-F ) syövän soluja käsiteltiin 24 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla

M. fermentansin

proteiineja. Yhteensä tumaproteiinit (12,5 ng) lisättiin tiettyyn reaktioseokseen Topo I Reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. (A, D) Edustava kuva (n = 4-5) ja Topo I DNA rentoutumista toimintaa. (B, E) kvantifiointi analyysi Topo I toimintaa. (C, F) Topo I proteiinin taso tutkittiin Western blot-analyysi. Symbolit: R ja S ovat rento ja superkierteisen muodon pUC19 DNA, vastaavasti, Topo- proteiinia ei lisätty reaktioseokseen.

t

-testi: *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,005.

Tämä tulos osoittaa, että joko suorina tai ei-live (sonikoitiin)

M. fermentansin

aiheutti samanlaisia ​​vaikutuksia solujen Topo I entsyymi.

3.

M. fermentansin

Vähentynyt CPT esto Vaikutus DNA Rentoutuminen aktiivisuus Topo I

Oli kiinnostavaa tutkia vaikutusta Mycoplasma tartunnan estävää kykyä tunnettujen Topo I antagonistit kuten CPT. Aluksi teimme sarja kokeita, joissa soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CPT, jotta voidaan valita CPT annos, joka aiheuttaa lähes täynnä ja estää entsyymin aktiivisuuden lyhyen ajan (ei esitetty). Valitsimme CPT annoksella 30 uM, mikä esti Topo I aktiivisuutta 90-95% 1,5 h (kuvio 4A, B, vertaa kaista 4 kaistaa 2). Solut infektoitiin live

M. fermentansin

6 tuntia MOI 10

3 CFU /solu, jota seurasi 30 uM CPT hoitoja vielä 1,5 tuntia. Merkittävä pieneneminen on CPT estävää vaikutusta (95%: n esto oli noin 60%) havaittiin MCF7 altistuneiden solujen yhdistelmä

M. fermentansin

infektio ja CPT käsittely (kuvio 4A, B, vertaa kaista 6 kaistaa 4,

p

0,005). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin U251-solujen (kuva S1 A-B). Solujen käsittely CPT tiedetään vähentävän määrän vapaata Topo I proteiinin läsnä nucleoplasm vuoksi vakauttamiseen entsyymin-DNA pilkottavissa komplekseja CPT. Todellakin, hoito syöpäsolujen kanssa CPT puolestaan ​​laskenut vapaan Topo I-proteiinin (kuvio 4C kaista 3). Yhdistelmä mykoplasmainfektio ja CPT hoito ei vaikuta tasoon vapaan Topo I proteiini tarkasteltuna suhteessa määrään β-aktiini-proteiinin (kuvio 4C).

MCF7-solut infektoitiin

M. fermentansin

(

M.f

) 6 tunnin ajan sen jälkeen CPT (30 uM) hoitoja vielä 1,5 tuntia. Yhteensä ydin- proteiinin (12,5 ng) lisättiin tiettyyn reaktioseokseen Topo I Reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. (A) Edustava kuva n = 5, on Topo I DNA-relaksaatiovaikutuksen. (B) kvantifiointi analyysi Topo I toimintaa. (C) Topo I proteiinin taso tutkittiin Western blot-analyysi. Symbolit: R ja S ovat rento ja superkierteisen muodon pUC19 DNA, vastaavasti, Topo- proteiinia ei lisätty reaktioseokseen

t

-testi: *

p

0,05, * *

p

0,01, ***

p

0,005.

4. Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) antagonistit esti Mycoplasma aiheuttama estävä vaikutus Topo I Activity

Edellä mainitut tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen Topo I aktiivisuutta kasvainsoluissa kohdistama

M. fermentansin

saattaa johtua translaation jälkeisiä modifikaatioita entsyymin proteiineja. Topo I käy läpi useita translaation jälkeisiä modifikaatioita, jotka vaikuttavat sen toimintaan: n fosforylaatio Topo I Kaseiinikinaasi II tai PKC kasvattaa aktiivisuutta, kun taas Poly-ADP ribosylointi by PARP-1 vähentää sen aktiivisuutta. Lisäksi ubikitinaa- Topo I johtaa sen proteolyysiä [44], [45]. Määrittää reitin, jolla

M. fermentansin

vaikuttaa topoisomeraasi I, ensin tutkineet vaikutusta poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) estäjä -3-aminobentsamidin (3AB) on Topo I toimintaa, yksin ja koska esikäsittelyä

M. fermentansin

infektio. MCF7-soluja esi-inkuboitiin 3AB eri pitoisuuksina (1-3 mM) 1,5 tunnin ajan ja sen jälkeen

M. fermentansin

infektio (MOI 10

3CFU /solu) ja inkuboitu vielä 6 tuntia. Nuclear uute valmistettiin ja analysoitiin Topo I toimintaa edellä kuvatulla tavalla. Tulokset Kuviossa 5A-B esittävät, että esikäsittely 3AB esti

M. fermentansin

indusoimaan väheneminen Topo I toimintaa. Hoito infektoimattomien solujen 3AB varten ilmoitettuun aikaan ei vaikuttanut solujen Topo I aktiivisuutta (kuvio 5A, B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin U-251-solut (kuvio S2 A-B).

MCF7-soluja esi-inkuboitiin 3-aminobentsamidin (3AB) 1 tunnin ajan eri pitoisuuksilla ja sen jälkeen

M. fermentansin

infektio (MOI 10

3 CFU /solu) vielä 6 tuntia. Yhteensä ydin- proteiinin (12,5 ng) lisättiin tiettyyn reaktioseokseen Topo I Reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (A) ja kvantifiointi Topo I aktiivisuuden suoritettiin (B). Symbolit: R ja S ovat rento ja superkierteisen muodon pUC19 DNA, vastaavasti, Topo- proteiinia ei lisätty reaktioseokseen

t

-testi: *

p

0,05, * *

p

0,01, ***

p

0,005.

5. MEK Inhibitor esti Mycoplasma aiheuttama vähennys Topo I Toiminta ja ERK 1/2: n fosforylaation

Viimeaikaiset raportit osoittivat, että PARP-1 fosforyloituu ERK [28]. Vaikutus Elävien

M. fermentansin

on MAPK yleensä ollut tutkittu perusteellisesti. Useimmat tutkimuksista koskien

M. fermentansin

ja MAPK suoritettiin käyttämällä mycoplasmal tuotteita tai lämpöinaktivoitua Mycoplasma (HIM). Kuitenkin muutamia tutkimukset osoittivat, että infektion solujen eri Mycoplasma voi johtaa ERK-fosforylaatio [11], [17], [30]. Tässä tutkimuksessa tutkittiin, mikä vaikutus MEK estäjän PD-98059 on Topo I toimintaa, yksin tai ennen tartunnan

M. fermentansin

. MCF7 ja U-251-soluja esi-inkuboitiin PD 1,5 tuntia, jonka pitoisuus on 25 uM, jota seuraa

M. fermentansin

infektio (MOI 10

3CFU /solu) ja inkuboitu vielä 6 tuntia. Nuclear uute valmistettiin ja analysoitiin Topo I aktiivisuuden ja fosforylaation ERK käyttäen Western blot-analyysi erityisiä anti p-ERK 1/2 vasta-aine. Tulokset osoittivat, että lisäämällä MEK inhibiittorin Topo I reaktio ei vaikuta Topo I aktiivisuutta (kuvio 6A, B), ja sen sijaan, solujen käsittely inhibiittorin (PD) esti

M. fermentans-

aiheuttama väheneminen Topo I aktiivisuuden (kuvio 3A, B U-251-solut). Lisäksi olemme havainneet, että määrä p-ERK1 /2 lisääntynyt infektoituneissa soluissa (kuvio 6C varten MCF7-soluissa ja kuvio S3 C U-251), kun taas esikäsittely PD esti kasvusta. Taso koko ERK ei vaikuttanut eri hoitoja (kuvio 6C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen Topo I aktiivisuus

M. fermentans-

infektoiduissa soluissa välittää MAPK signalointi.

MCF7-soluja esi-inkuboitiin MEK estäjien (PD) 1 tunnin ajan, jonka pitoisuus on 25 uM, jota seuraa

M. fermentansin

infektio (MOI 10

3CFU /solu) vielä 6 tuntia. Yhteensä ydin- proteiinin (12,5 ng) lisättiin tiettyyn reaktioseokseen Topo I Reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (A) ja Topo I aktiivisuus kvantitoitiin (B). Fosforyloidun ERK 1/2 proteiini tasolla MCF7-uute tutkittiin Western blot-analyysi (C). Symbolit: R ja S ovat rento ja superkierteisen muodon pUC19 DNA, vastaavasti, Topo- proteiinia ei lisätty reaktioseokseen

t

-testi: ***

p

0,005 .

6.

M. fermentansin

Infektio Lisääntynyt Poly-ADP-ribosylaatiota Topo I johdetut MCF7 Cells

PARP-1 säätelee Topo I aktiivisuus ADP-ribosylaatio entsyymin proteiini [46]. Sen tutkimiseksi, onko tartunnan

M. fermentansin

indusoi Topo I muutokseen, PARP, Topo I-proteiini immunosaostettiin anti-Topo I-vasta-aineita, jotka ovat peräisin skleroderma (SC) potilaan seerumia [47] ja analysoitiin Western blot käyttäen anti-Poly-ADP-riboosi monoklonaalinen vasta-aine (kuvio 7A).